Summary
هنا نقدم بروتوكولات مفصلة لإدارة المضادات الحيوية عن طريق الفم للفئران، وجمع عينات البراز، واستخراج الحمض النووي والتحديد الكمي للبكتيريا البراز من قبكر.
Abstract
الحجمية القناة الهضمية لها تأثير مركزي على صحة الإنسان. ديسبيوسيس الميكروبية يرتبط مع العديد من إيمونوباثولوجيس الشائعة مثل مرض التهاب الأمعاء والربو والتهاب المفاصل. وبالتالي، فهم الآليات التي يقوم عليها النظام المناعي الحجمية الحديث المتبادل من الأهمية بمكان. إدارة المضادات الحيوية، بينما تساعد إزالة مسببات المرض، يدفع أيضا تغييرات جذرية في حجم وتكوين المجتمعات البكتيرية المعوية التي يمكن أن يكون لها تأثير على صحة الإنسان. العلاج بالمضادات الحيوية في الفئران يجمل أثر والتغيرات الطويلة الأجل في الحجمية البشرية من المرضى المعالجة المضادات الحيوية، ويمكن التحقيق في الروابط آليا بين التغيرات في المجتمعات الميكروبية ووظيفة الخلايا المناعية. في حين قد وصفت عدة أساليب للعلاج بالمضادات الحيوية من الفئران، بعضهم حمل الجفاف الحاد وفقدان الوزن تعقيد تفسير البيانات. هنا، نحن نقدم اثنين من البروتوكولات للفم المضادات الحيوية التي يمكن أن تستخدم لعلاج طويل الأجل للفئران دون حمل الوزن الرئيسية. هذه البروتوكولات تجعل استخدام مزيج من المضادات الحيوية التي تستهدف كل إيجابية وسلبية الغرام البكتيريا ويمكن أن تقدم أما libitum الإعلانية في مياه الشرب أو بواسطة تزقيمية الشفوي. وعلاوة على ذلك، يصف لنا طريقة للتحديد الكمي للكثافة الميكروبية في عينات البراز من قبكر التي يمكن استخدامها للتحقق من فعالية العلاج المضادات الحيوية. ويوفر الجمع بين هذين النهجين منهجية يمكن الاعتماد عليها للتلاعب الحجمية المعوية، ودراسة آثار العلاج بالمضادات الحيوية في الفئران.
Introduction
الغشاء المخاطي المعدي المعوي الثدييات هي بيئة فريدة من نوعها من استعمر خليط معقدة للغاية من الكائنات المجهرية التي تنشئ علاقة المنفعة المتبادلة مع البلد المضيف. يشمل نظام الدفاع مخاطية الأمعاء طبقة الظهارة وعدد كبير من الخلايا المناعية التي تقيد commensals داخل الأمعاء بينما الحفاظ على العدد والتنوع. على العكس من ذلك، commensal الكائنات المطلوبة لتطوير نظام المناعة تعمل بكامل طاقتها. بينما التفاعلات بين المضيف والبكتيريا كومينسال عادة مفيدة، أصبح من الواضح بشكل متزايد أن الحديث المتبادل المناعي-الحجمية dysregulated يمكن لصالح تطوير الأمراض المزمنة التحريضية، مثل الأمعاء أسينفلاماتوري المرض أو التهاب المفاصل أو الربو1،2.
ويمكن تغيير الحجمية القناة الهضمية بعوامل مختلفة، ولكن ربما هي أهم التغييرات الناجمة عن العلاج بالمضادات الحيوية أن يغير شدة كل من حجم وتكوين المجتمعات البكتيرية3،4. في حين لا مراء فيها فوائد المضادات الحيوية لعلاج العدوى، يمكنك أيضا تعديل التغييرات الحجمية الناجمة عن التعرض للمضادات الحيوية في البشر الدفاعات المناعية التي يمكن أن تؤدي إلى آثار ضارة بالصحة. على سبيل المثال، ارتبط العلاج بالمضادات الحيوية في البشر إلى زيادة خطر المطثيّةالعسيرة-الناجمة عن الإسهال والربو وأنواع معينة من السرطان3. العلاج بالمضادات الحيوية في الفئران ويجمل بالأثر وتغييرات طويلة الأجل وجدت في المجتمعات المحلية الغريزي للمرضى المعالجة بالمضادات الحيوية، وقد مكن التحقيق في الروابط آليا بين التغيرات في المجتمعات الميكروبية ووظيفة الخلايا المناعية. ومع ذلك، أظهرت عدة تقارير أن الإدارة من المضادات الحيوية في مياه الشرب إعلانية libitum النتائج في فقدان الوزن ملحوظ جداً كما الفئران الامتناع عن مياه الشرب، ويفترض أنه سبب لها طعم كريهة5،6. وهكذا، في هذه النماذج الجفاف الشديدة المصاحبة لإدارة المضادات الحيوية عن طريق الفم قد يؤدي إلى تعقيد تفسير تجارب تهدف إلى التعرف على تأثير العلاج بالمضادات الحيوية في وظيفة الخلايا المناعية.
يمكن استخدام العديد من الطرق لاستكشاف حجم وتكوين المجتمعات الميكروبية في الأمعاء المقصورة7. الجيل القادم يسلسل تقنيات قدمت بيانات لا تقدر بثمن في هذه المسألة8، بيد أن هذه الأساليب ليست باهظة الثمن نسبيا وتتطلب تحليلات الخبراء بيوينفورماتيك لتفسير البيانات. من ناحية أخرى، تسمح الثقافة التقليدية الميكروبيولوجية أساليب الكشف عن الأنواع البكتيرية، ولكن لديهم حساسية منخفضة وجزء كبير من البكتيريا كومينسال (لا سيما اللاهوائيات) من الصعب جداً أو من المستحيل زراعتها مع الأساليب المتاحة حاليا8. الكمية بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (qPCR) تقنيات تستخدم متزايد للقياس الكمي، وتحديد أنواع الجراثيم البرازية، كما أنها توفر تدبيرا مستقلاً عن ثقافة سريعة وموثوق بها من مجموع الحمولة الميكروبية. وبناء على ذلك، أثبتت qPCR أساليب مفيدة لدراسة التغيرات في الحجمية المرتبطة مع التقدم في العمر، أو مع تطور العديد من الأمراض بما فيها التهاب الأمعاء المرض9،10. وتمشيا مع هذا، توفير أساليب qPCR نهج سريعة وفعالة من حيث التكلفة للتحقق من تأثير العلاجات المختلفة (بما في ذلك المضادات الحيوية) في البراز البكتيرية الأحمال والحجمية تكوين10،،من1112.
هنا، نحن نقدم مفصل خطوة بخطوة للبروتوكولين متميزة لإدارة المضادات الحيوية عن طريق الفم للفئران، وجمع عينات البراز، واستخراج الحمض النووي، وإعداد المعايير والقياس الكمي للبكتريا في عينات البراز قبل قبكر. توفر هذه البروتوكولات طريقة موثوقة للتلاعب الحجمية المعوية في الفئران ودراسة آثار العلاج بالمضادات الحيوية في التوازن المعوية، والمرض.
Protocol
أجريت التجارب الموضحة هنا باستخدام 6-8 أسابيع الإبقاء على الفئران (C57BL6/ي) البرية من نوع قديم في منشأة (منتدى جنوب المحيط الهادئ) ممرض محددة مجاناً. بموافقة جميع التجارب على الحيوانات في كلية بلندن الملك، وفرانسيس كريك معهد الرعاية الحيوانية وهيئة المراجعة الأخلاقية ووزارة الداخلية في المملكة المتحدة. قبل البدء في أي إجراء للحيوان، ضمان الحصول على الأذونات المناسبة من خلال المؤسسة/منظمة محلية.
1-الإدارة من المضادات الحيوية
ملاحظة: يتم توفير اثنين من الطرق البديلة للعلاج بالمضادات الحيوية: تزقيمية شفوي (الخطوة 1، 1) والإدارة من المضادات الحيوية عن طريق مياه الشرب (الخطوة 1، 2).
- تزقيمية الشفوي
- إعداد مخزون من المضادات الحيوية الفردية بتذويب لهم في الماء يعقم في التركيزات التالية: الأمبيسلّين في 100 ملغ/مل، الجنتاميسين في 100 ملغ/مل، النيوميسين على 100 ملغ/مل، ميترونيدازول في 10 ملغ/مل وفانكومايسين في 100 ملغ/مل. تصفية تعقيمها باستخدام عامل تصفية 0.45 ميكرومتر. قاسمة ومخزن في-20 درجة مئوية.
- إعداد مزيج من المضادات الحيوية بمزج المخزونات أعد أعلاه. لوحدة تخزين 1 مل مزيج 50 ميليلتر من الأمبيسلّين (5 ملغ/مل النهائي)، 50 ميليلتر من الجنتاميسين (5 ملغ/مل النهائي)، 50 ميليلتر من النيوميسين (5 ملغ/مل النهائي)، 500 ميليلتر من ميترونيدازول (5 ملغ/مل النهائي)، 25 ميليلتر من الفانكوميسين (2.5 ملغ/مل النهائي) و 325 ميليلتر من الماء. إعداد الطازجة كوكتيل قبل الاستخدام.
- تحميل ميكس المضادات الحيوية في محقن معقم 1 مل وإصلاحها إبرة تزقيمية قياس مناسبة (20 ز للفئران ز 15 – 20) أثناء إزالة أي فقاعات.
- تزقيمية الفئران مع 200 ميليلتر من مزيج المضادات الحيوية.
- الاستيلاء على الجلد على الكتف الماوس بحزم، وتمتد في الرأس والرقبة تصويب المريء. توجيه الكرة-غيض إبرة التغذية على طول سقف الفم ونحو الجزء الخلفي من البلعوم. ثم بلطف تمر أسفل إلى المريء وحقن الحل 200 ميكروليتر.
- إدارة مرة كوكتيل المضادات الحيوية يوميا طوال فترة التجربة.
- المضادات الحيوية في مياه الشرب
تنبيه: ترصد بدقة وزن الماوس يوميا للاسبوعين الأولين من إدارة المضادات الحيوية في مياه الشرب.- إعداد مزيج من المضادات الحيوية بحل ما يلي في 1 لتر ماء يعقم: 1 غ الأمبيسلّين (1 غرام/لتر النهائي)، 1 غرام النيوميسين (1 غرام/لتر النهائي)، 1 غرام ميترونيدازول (1 غرام/لتر النهائي)، 0.5 ز الفانكوميسين (0.5 غرام/لتر النهائية) وكيس 8 (0.75 ز في كل) من اصطناعية التحلية (60 غرام/لتر النهائي). هزة حتى يذوب. مخزن في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يتم إضافة التحلية إخفاء النكهة من المضادات الحيوية ومنع الجفاف الفئران. في حين قد يعمل العديد من العلامات التجارية التحلية، قد يكون التركيز النهائي المطلوب مختلفة لكل علامة تجارية محددة. - تعبئة كوكتيل المضادات الحيوية في زجاجة ماء (~ 100 مل/زجاجة) ووضع الزجاجة في قفص ماوس.
ملاحظة: استخدم زجاجات البنى أو تغطية الزجاجات مع إحباط لحماية المضادات الحيوية من الضوء. - محل كوكتيل المضادات الحيوية مع المخزون الطازج مرتين في أسبوع لمدة التجربة.
- إعداد مزيج من المضادات الحيوية بحل ما يلي في 1 لتر ماء يعقم: 1 غ الأمبيسلّين (1 غرام/لتر النهائي)، 1 غرام النيوميسين (1 غرام/لتر النهائي)، 1 غرام ميترونيدازول (1 غرام/لتر النهائي)، 0.5 ز الفانكوميسين (0.5 غرام/لتر النهائية) وكيس 8 (0.75 ز في كل) من اصطناعية التحلية (60 غرام/لتر النهائي). هزة حتى يذوب. مخزن في 4 درجات مئوية.
2-جمع عينات البراز من البراز، ومحتوى الدقاق، والجدار الدقاق
- تزن وتسمية 2 مل يعقم أنابيب لجمع العينات.
- لجمع عينات البراز الطازج، ضع الماوس كل في ريسترينير وجمع الكريات البراز من فتحه الشرج في أنبوب جمع مباشرة.
ملاحظة: عينات يمكن أيضا الحصول على وضع الفئران في قفص يعقم نظيفة، وجمع عينات من البراز مع الملقط المعقم نظيفة. - Euthanize الفئران مع CO2 الخنق متبوعاً بخلع عنق الرحم.
- يقع على عاتق ذبيحة ماوس البطن مكشوف تماما ورذاذ منطقة البطن مع الإيثانول 70%.
- باستخدام الملقط المعقم ومقص، جعل شق عرضية في البطن لكشف الصفاق دون الأضرار بأي من الأنسجة الداخلية. رفع الصفاق وشق لفضح الأمعاء.
- إزالة الأمعاء (من نقطتين للمعدة) مع ملقط ومقص ووضعه في طبق بتري معقم.
- استخدام الملقط لندف الأمعاء الدقيقة (SI) بعيداً عن الشرايين المساريقي العلوي والدهون بعناية. تمديد الأمعاء ووضعه على مسح مختبر نظيفة.
- مع مسطرة، قياس وقص 4 سم الدقاق القاصي من الدولية الاشتراكية (الجزء الأقرب إلى الأعور). قطع وتجاهل 1 سم الأمعاء الدانية للأعور. وسوف يكون هناك جزء 3 سم من الدقاق اليسار التي ستستخدم لجمع البكتريا المعوية.
- عقد الجزء الدقاق (3 سم) عبر أنبوب 2 مل عقيمة. جمع محتوى الأمعاء قبل القذف مباشرة في الأمعاء وكوليتينج العينة في الأنبوب. وسيكون هذا النموذج البكتيريا من محتوى الدقاق.
- إعداد حقنه 20 مل مع الفوسفات الباردة مخزنة المالحة (PBS) ومسح الجزء الدقاق (تجاهل-التدفق عبر).
- ضع الجزء الدقاق على منشفة ورقية نظيفة وفتحه طوليا مع المقص.
- تتخلص من داخل الجدار الدقاق مع مشرط.
- جمع أي البكتيريا على دون مشرط بالغسيل مشرط مع 1 مل من برنامج تلفزيوني عبر أنبوب تنظيف أجهزة الطرد مركزي. تدور في 8,000 × ز لمدة 5 دقائق لبيليه البكتيريا وتجاهل المادة طافية. سوف تحتوي هذه العينة على البكتيريا من الجدار الدقاق.
ملاحظة: يمكن تجميد عينات البراز من البراز، ومحتوى الدقاق والجدار وتخزينها في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام. - تزن هذه الأنابيب التي تحتوي على العينات من البراز والدقاق المحتوى، وطرح الوزن من أنابيب فارغة (من الخطوة 2، 1) للحصول على وزن البراز في كل عينة.
- استخراج الحمض النووي البكتيرية من البراز ومحتوى الدقاق الدقاق الجدار العينات باستخدام أدوات متوفرة تجارياً. تخزين عينات الحمض النووي من-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
3-تحديد مقدار "الحجمية الأمعاء" قبل قبكر
ملاحظة: يتضمن هذا الإجراء وتوليد معيار (الخطوة 3.1) وطريقة التشكيل qPCR لعينات قياسية والبراز (الخطوة 3، 2)
- جيل معيار قبكر
- استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتضخيم الجين الرنا الريباسي 16S من الحمض النووي المستخرج من ثقافة بكتيرية باستخدام الكواشف13 وبكر الشروط المفصلة في الجدول 1.
- تشغيل المنتج بكر على 1.5% [اغروس] هلام وتنقية الفرقة الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي متاحة تجارياً.
- اضطر في تنقية الحمض النووي جزء استخدام استنساخ كيت (انظر الجدول للمواد، واستخدام ناقل التي تحتوي على علامات المقاومة للمضادات الحيوية والانصهار الجينات β-جالاكتوسيداسي (لاكز) لاختيار مستعمرة أبيض وأزرق) وتحويل DH10 المختصة كولاي اتباع إرشادات الشركة المصنعة. لوحة التحويل على الأمبيسلّين (100 ميكروغرام/مل)، X-غال (20 ميكروغرام/مل) بيرتاني لوريا (رطل) أجار لوحات (10 غرام/لتر تريبتوني، 5 غ/لتر مستخرج الخميرة، 10 غرام/لتر كلوريد الصوديوم، 15 غرام/لتر أجار). تبني بين عشية وضحاها (O/N) عند 37 درجة مئوية.
- حدد مستعمرة واحد إيجابية (أبيض) من اللوحة. تطعيم أنه في 5 مل مرق LB التي تحتوي على 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين واحتضان O/N في 37 درجة مئوية، تهز 250 لفة في الدقيقة.
- من ثقافة O/N، عزل وتنقية بلازميد استخدام مجموعة مينيبريب تجارية وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
ملاحظة: من المهم أن تسلسل إدراج بلازميد في هذه المرحلة، للتأكد من أن بلازميد يحتوي على نسخة واحدة فقط من الجين الرنا الريباسي 16S وتحديد طوله في زوج قاعدي (bp). - لينيريزي بلازميد مع إنزيم التقييد الذي يقطع بلازميد مرة واحدة فقط.
- تنقية بلازميد خطية باستخدام مجموعة أدوات متوفرة تجارياً.
- تحديد تركيز بلازميد عن طريق قياس امتصاص في 260 نيوتن متر باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
- حساب عدد بلازميد نسخة/ميليلتر من العينة باستخدام الصيغة التالية14:
عدد النسخ = (المبلغ * 6.022 × 1023)/(طول * 1 × 109 * 650)
حيث أن المبلغ هو تركيز الحمض النووي التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.1.8 (في نانوغرام/ميليلتر)؛ و الطول هو الطول الإجمالي بلازميد (مع الإدراج) في شركة بريتيش بتروليوم. سيتم الحصول على عدد من النسخ كنسخة/ميليلتر.
ملاحظة: هناك أدوات الإنترنت استناداً إلى الصيغة المذكورة أعلاه التي تمكن من السهل حساب عدد النسخ بلازميد. - قاسمة ومخزن القياسية حسب الحاجة في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- qPCR لعينات البراز ومعيار
- ذوبان الجليد qPCR القياسية (من الخطوة 3.1.10) وعينات البراز الحمض النووي (من الخطوة 2.15) الكواشف qPCR (من مجموعة أدوات متوفرة تجارياً) على الجليد.
ملاحظة: تشمل qPCR والكواشف المستخدمة في هذا المثال "الأخضر سيبر" qPCR رد فعل مزيج والإشعال إلى الأمام وعكس (الجدول 2). - يضعف المعيار في الماء المعقم خالية من الحمض النووي في مجموعة من 107 إلى 102 نسخة/ميليلتر (مثلاً، 1/5 المسلسل تخفيف من 107 إلى 6.4 × 102 نسخة/ميليلتر). تمييع عينة البراز الحمض النووي إلى 1/2، 1/5، 1/10.
- جعل فعل مزيج رئيسي للعدد الإجمالي لردود فعل زائد 1 (الجدول 2).
- مزيج 30 ميليلتر من مزيج الرئيسي و 5 ميليلتر من القالب (معيار أو عينة أو المياه من أجل مراقبة سلبية)
- إضافة 10 ميليلتر من هذا المزيج لكل بئر في صفيحة قبكر ضوئية 384-جيدا. أداء كل رد فعل في ثلاث نسخ.
- ختم المكان قبكر والطرد المركزي بإيجاز وتحميل لوحة على آلة qPCR المبرمجة مع ركوب الدراجات الشروط التالية: 95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة تليها دورات 40 من 95 درجة مئوية عن 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
- الحصول على قيم جر للمعيار والعينات.
- إنشاء منحنى قياسي برسم القيم جر للمعايير مقابل لوغاريتم عدد نسخ بلازميد (المحسوبة في الخطوة 3.1.9). أداء مباشر انحدار المنحنى القياسي.
- حساب الأرقام نسخة المتاشب 16S لعينات البراز بالتحريف جر القيم (التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.2.2) في المنحنى القياسي.
ملاحظة: 16S المتاشب نسخ الأرقام لكل عينة ينبغي تصحيح النظر في عامل تخفيف العينة (كما أعد الخطوة 3.2.2)، الأحماض النووية الحجم النهائي التي كانت التيد (في الخطوة 2.15) والكمية عينات البراز (المحسوبة في الخطوة 2، 14) للحصول على نسخ الجينات لكل غرام من البراز.
- ذوبان الجليد qPCR القياسية (من الخطوة 3.1.10) وعينات البراز الحمض النووي (من الخطوة 2.15) الكواشف qPCR (من مجموعة أدوات متوفرة تجارياً) على الجليد.
Representative Results
هنا نقدم البروتوكولين البديلة للعلاج بالمضادات الحيوية عن طريق الفم للفئران. الشكل 1 يبين النسبة المئوية لوزن الجسم (المتصلة بوزن خط الأساس الأصلي لكل الحيوانات) في الفئران العلاج بالمضادات الحيوية الشفوية تزقيمية مدتها (أحمر) أو في مياه الشرب (أزرق) لمدة 10 أيام متتالية. يتم العثور على لا الوزن ملحوظ في الفئران التي تتلقى المضادات الحيوية بالفم تزقيمية مدتها. ومع ذلك، عند الفئران تعامل مع المضادات الحيوية libitum الإعلانية في مياه الشرب، إنقاص الوزن (~ 10%) خلال الأيام القليلة الأولى من الصادات، ولكنها استرداد زيادة الوزن الطبيعي بعد ذلك (الشكل 1). ومع ذلك، حوالي يمكن أن تصل إلى 5-10% فئران تلقي المضادات الحيوية في مياه الشرب > 20% الوزن خلال الأسبوع الأول من العلاج، وفي هذه الحالة هي euthanized.
التحديد الكمي للبكتريا في عينات البراز يتطلب استخدام منحنى القياسية الكافية التي يتم الحصول عليها بالتآمر في سجل عدد النسخ للمعيار (المحسوبة في الخطوة 3.2.2) مقابل جر القيم التي تم الحصول عليها من قبكر (الخطوة 3.2.7). يظهر الشكل 2 أ مثال ممثل من منحنى قياسي الذي يفي بمعايير الأداء المنحنى المعياري بقيمة2 R 0.99827، منحدر من-3.09 ومن كفاءة ((-1 + 10^(-1/slope))*100) بنسبة 110%. R2 القيم 0.99 والكفاءة PCR ضمن المجموعة من 90 إلى 110% المفضلة. ضمن نطاق الخطي، يتيح معادلة تحليل الانحدار الكمي لوفرة المتاشب 16S في عينات البراز. ويبين الشكل 2B عدد النسخ المتاشب 16S في البراز البراز ومحتوى SI SI الجدار. وترد بيانات في الشكل 2B ك 16S المتاشب نسخ/ز من عينات البراز البراز البراز ومحتوى SI. ترد البيانات للجدار SI، كإجمالي عدد النسخ المتاشب 16S التي تم الحصول عليها من البكتيريا المستردة من 3 سم الجدار SI (كما كمية ابتداء من المواد صغير جداً للحصول على وزن دقيق).
لتقييم تأثير المضادات الحيوية على كثافة البكتريا في عينات البراز، الفئران كانت العلاج بالمضادات الحيوية بالفم تزقيمية مدتها يوميا لمدة 10 أيام (الأيام 1 إلى 10) وتم جمع عينات البراز قبل (يوم 0)، في نقاط زمنية مختلفة خلال (العلاج بالمضادات الحيوية أيام 5 و 10)، و 7 أيام بعد إيقاف الصادات (يوم 17؛ الشكل 3 ألف). كما هو موضح في الشكل 3، العلاج بالمضادات الحيوية يستحث انخفاضا قويا في عدد 16S المتاشب نسخ/غرام من البراز التي تم اكتشافها في أيام 5 و 10، بينما كثافة البكتريا في البراز استردادها إلى مستوياتها العادية (مماثلة لما قبل المعالجة) بعد أسبوع 1 تم إيقاف الصادات (يوم 17).
رقم 1: الإدارة من المضادات الحيوية- تلقت الفئران المضادات الحيوية الشفوية تزقيمية مدتها (أحمر) أو في مياه الشرب (أزرق) لمدة 10 أيام متتالية. رسم يبين أوزان الفئران طوال مدة هذه التجارب بالنسبة إلى الوزن الأصلي قبل الصادات (يوم 0). يتم عرض البيانات كمتوسط ± sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: 16S الرنا الريباسي الجينات qPCR التضخيم من المعايير وعينات البراز. (أ) انحدار خطي من المنحنى المعياري مع واصفات المنحنى المعياري. (ب) حساب وفرة الجينات من عينات البراز. يتم عرض البيانات كمتوسط ± sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: البكتيريا البراز أثناء العلاج بالمضادات الحيوية. التخطيطي (أ) الجدول الزمني الصادات تزقيمية شفوي (Ab) وجمع العينات كما يصور مع *. (ب) 16S المتاشب نسخ كل غرام من البراز في عينات البراز من الفئران التي تم جمعها في الأيام المشار إليها. يتم عرض البيانات كمتوسط ± sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| كاشف | وحدة التخزين | |
| الحمض النووي | ميليلتر 8 | |
| المخزن المؤقت 10 X | 2 ميليلتر | |
| دنتبس (10 مم) | ميليلتر 0.4 | |
| Eubacteria-و التمهيدي (10 مم) | 1 ميليلتر | |
| Eubacteria-R التمهيدي (10 مم) | 1 ميليلتر | |
| تق بوليميراسي | ميليلتر 0.2 | |
| ح2س | ميليلتر 7.4 | |
| الحجم الإجمالي | 20 ميليلتر | |
| تسلسلات التمهيدي | ||
| Eubacteria-و التمهيدي | أكتككتاكججاجكاجكاجت 3 '5' | |
| Eubacteria-R التمهيدي | أتاككجكجكتجكتجك 3 '5' | |
| شروط ركوب الدراجات | ||
| درجة الحرارة | الوقت | دورات |
| 94 درجة مئوية | 5 دقيقة | س 1 |
| 94 درجة مئوية | 30 s | 30 x |
| 60 درجة مئوية | 30 s | 30 x |
| 72 درجة مئوية | 1 دقيقة | 30 x |
| 72 درجة مئوية | 5 دقيقة | س 1 |
| 4 درجة مئوية | ∞ | س 1 |
الجدول 1: بكر الكواشف والشروط- ويوفر هذا الجدول الكواشف وظروف ركوب PCR لتضخيم الجينات الرنا الريباسي 16S من ثقافة البكتيرية لجيل معيار لاستخدامها في فحوصات qPCR. تسلسلات التمهيدي أصلاً نشرت كروجلوف et al. 13.
| كاشف | وحدة التخزين |
| الأخضر سيبر مزيج الرئيسي (2x) | ميليلتر 17.5 |
| Eubacteria-و التمهيدي (10 مم) | ميليلتر 0.7 |
| Eubacteria-R التمهيدي (10 مم) | ميليلتر 0.7 |
| ح2س | 11.1 ميليلتر |
الجدول 2: مزيج الرئيسي قبكر- وحدات التخزين سيظهر (الحجم النهائي 35 ميليلتر) على عينة واحدة ليتم تشغيلها في ثلاث نسخ (10 ميليلتر في كل) على لوحة qPCR 384-جيدا (في حساب إضافي للخطأ بيبيتينج 5 ميليلتر). قد يكون الارتقاء بالمبلغ وفقا لعدد العينات تحليلها.
Discussion
هنا نقدم البروتوكولات التجريبية للإدارة عن طريق الفم من المضادات الحيوية للفئران والتحديد الكمي للبكتيريا البراز من قبكر. المزيج من المضادات الحيوية المستخدمة في هذه الأهداف البروتوكول (التي تحتوي على النيوميسين، مترونيدازول الأمبيسلّين والجنتاميسين فانكومايسين) البكتيريا سواء كانت إيجابية أو سلبية الغرام، تقدم نشاط جراثيم ضد طائفة كاملة من البكتيريا. تزقيمية الشفوي والإدارة من المضادات الحيوية في مياه الشرب إلى حد كبير تقليل البكتيريا البراز تحميل5،،من612. وعلاوة على ذلك، كل العلاجات تأثيراً عميقا على النمط الظاهري للفئران كما أنها تضع العديد من الخصائص النموذجية من الفئران جرثومة مجاناً بما في ذلك حجم الطحال المخفضة والاعور الموسع. ربما قد يتوقف اختيار أسلوب معين الصادات على طول التجربة كما يتطلب الأسلوب تزقيمية الشفوي الإدارة اليومية للمضادات الحيوية، كونها كثيفة العمالة أكثر وربما يسبب المزيد من عدم الراحة الحيوانات في الأجل الطويل.
للإدارة من المضادات الحيوية في مياه الشرب، يجب توخي الحذر مع إضافة التحلية إلى خليط المضادات الحيوية وهذا عامل حاسم للحفاظ على الفئران من الجفاف. وقد أظهرت عدة مجموعات كيف الإدارة من المضادات الحيوية في مياه الشرب (بدون إضافة مادة التحلية) يؤدي إلى فقدان الوزن الشديد والسريع جداً مع جميع الفئران فقدان أكثر من 20% وزن الجسم الأولية خلال الأيام القليلة الأولى من تجربة5 , 6-لدينا بروتوكول، استخدام التحلية المستندة إلى سكري كافية لإخفاء طعم المضادات الحيوية في الماء وفقدان الوزن في الأيام القليلة الأولى بعد الصادات الفئران على ما يبدو، ولكن استعادت أوزانها بسرعة بعد ذلك ( الشكل 1). ومع ذلك، في تجاربنا 5-10% فئران لا تزال تصل إلى نقطة النهاية البشرية من > فقدان 20 ٪ من خط الأساس وزن جسم ويلزم أن يكون euthanized. لدينا أيضا اختبار المحليات على أساس sucralose التي فشلت تماما لمنع التجفاف الفئران (100% فئران فقدت > 20% وزن) بينما مؤلفين آخرين قد نشرت إخفاقات مماثلة للمحليات على أساس aspartame5،6. ويضاف إلى ذلك، السن والخلفية الوراثية والحالة الصحية العامة للفئران المستخدمة للتجارب ينبغي النظر، كما أنها قد تؤثر على الوزن ورفاه الحيوان أثناء العلاج بالمضادات الحيوية. وبالتالي، ينبغي إجراء رصد دقيق لوزن الفئران والحالة الصحية العامة يوميا خلال الأسبوعين الأولين من إدارة المضادات الحيوية عن طريق الفم.
توفير أساليب qPCR نهج سريعة وفعالة من حيث التكلفة للتحديد الكمي الرنا الريباسي 16S في عينات البراز. ومع ذلك، ينبغي النظر في بعض القيود فيما يتعلق بهذه التقنية بما في ذلك: أنا) الحاجة إلى معيار عالية الجودة يمكن الاعتماد عليها؛ ثانيا) على التصميم وكفاءة الإشعال قبكر؛ ثالثا) حقيقة أن الكائنات الحية الدقيقة قد يكون إعداد نسخ مختلفة من الجينات الرنا الريباسي 16S، ومن ثم نسخ الجينات قد لا مباشرة تساوي الخلية التهم15. ومع ذلك، قبكر هو أسلوب قوي والحساسة التي تتيح التحليل السريع لعينات البراز. يمكن أن يكون هذا الأسلوب مفيداً بشكل خاص بسرعة التحقق من تأثير العلاجات المختلفة (بما في ذلك المضادات الحيوية) في البراز البكتيرية الأحمال هنا مفصلة. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن نقدم على بروتوكول للتحديد الكمي مجموع 16S الرنا الريباسي، هذا الأسلوب يمكن أن تتكيف بسهولة (عن طريق تصميم كبسولة تفجير محددة16) تمكين تحديد الأصناف البكتيرية الفردية، وبالتالي توفير كل الكمية و الحصول على معلومات نوعية عن حجم ميكروبيومي وتكوينها.
وباختصار، لقد قدمنا البروتوكولين للعلاج بالمضادات الحيوية عن طريق الفم من الفئران وطريقة qPCR لقياس التغيرات المستحثة بالمضادات الحيوية في البكتيريا البراز. على الرغم من أن هذه البروتوكولات يمكن كذلك الأمثل وجنبا إلى جنب مع النهج الأخرى وفقا للاحتياجات الفردية التجريبية، أنها قد تخدم كأدوات سريعة وفعالة من حيث التكلفة وموثوق بها للتلاعب الحجمية المعوية موريني ودراسة الآثار للعلاج بالمضادات الحيوية في التوازن المعوية، والمرض.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل "مجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة" (منحة للجريدة السيد/L008157/1)؛ الملكية الأردنية وأيده "زمالة ماري كوري الأوروبي" (H2020-مسكاً-لو-2015-703639)؛ P.M.B. وكان يدعمها منحة من مجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة وكلية لندن الدكتوراه التدريب الشراكة الملك في "علوم الطب الحيوي" (MR/N013700/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich (Merck) | A9518 | |
| Neomycnin trisulfate salt hydrate | Sigma-Aldrich (Merck) | N1876 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich (Merck) | M3761 | |
| Vancomycin hydrochloride | Sigma-Aldrich (Merck) | V2002 | |
| Gentamicin sulfate salt | Sigma-Aldrich (Merck) | G3632 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich (Merck) | T7293 | |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich (Merck) | Y1625 | |
| NaCL | Sigma-Aldrich (Merck) | S7653 | |
| Sweetener Sweet'n Low | Sweet'N Low | Available in the UK from Amazon.co.uk | |
| X-Gal (5-brom-4-chloro-3-indoyl B-D-galactopyranoside) | Fisher scientific | 10234923 | |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 10010023 | |
| Ultrapure Agarose | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | 16500500 | |
| RT-PCR grade water | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | AM9935 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725124 | with ROX |
| TOPO TA cloningTM for sequencing | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | 450030 | |
| QIAamp fast DNA Stool mini kit | Qiagen | 51604 | |
| QIAprep spin Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Syringe filter 0.45 µm | Fisher scientific | 10460031 | |
| Swann-MortonTM Carbon steel sterile scalpel blades | Fisher scientific | 11792724 | |
| Syringe (1 mL) | BD Plastipak | 303172 | |
| Syringe (20 mL) | BD Plastipak | 300613 | |
| 1.5 mL Crystal clear microcentriguge tube | StarLab | E1415-1500 | |
| 2 mL Ultra high recovery microcentrifuge tube | StarLab | I1420-2600 | |
| Oral dosing needles 20 G x 38 mm curved (pk/3) | Vet-Tech | DE008A | |
| Sterilin petri dish 50 mm | Scientific Laboratory Supplies | PET2020 | |
| Absolute qPCR plate seals | Thermo Fisher Scientific | AB1170 | |
| MicroAmpTM optical 384-well plate | Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) | 4309849 | |
| ViiA7TM 7 real-time PCR system with 384-well block | Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) | 4453536 | |
| Spectrophotometer (Nanodrop 1000) | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | |
| Labnet Prism microcentrifuge | Labnet | C2500 | |
| MultiGene Optimax Thermal cycler | Labnet | TC9610 |
References
- Belkaid, Y., Hand, T. W. Role of the microbiota in immunity and inflammation. Cell. 157 (1), 121-141 (2014).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).
- Ubeda, C., Pamer, E. G. Antibiotics, microbiota, and immune defense. Trends in Immunology. 33 (9), 459-466 (2012).
- Dethlefsen, L., Huse, S., Sogin, M. L., Relman, D. A. The pervasive effects of an antibiotic on the human gut microbiota, as revealed by deep 16S rRNA sequencing. PLoS Biology. 6 (11), e280 (2008).
- Reikvam, D. H., et al. Depletion of murine intestinal microbiota: effects on gut mucosa and epithelial gene expression. PLoS One. 6 (3), e17996 (2011).
- Hill, D. A., et al. Metagenomic analyses reveal antibiotic-induced temporal and spatial changes in intestinal microbiota with associated alterations in immune cell homeostasis. Mucosal Immunology. 3 (2), 148-158 (2010).
- Fraher, M. H., O'Toole, P. W., Quigley, E. M. Techniques used to characterize the gut microbiota: a guide for the clinician. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (6), 312-322 (2012).
- Eckburg, P. B., et al. Diversity of the human intestinal microbial flora. Science. 308 (5728), 1635-1638 (2005).
- Sokol, H., et al. Low counts of Fecalibacterium prausnitzii in colitis microbiota. Inflammatiry Bowel Diseases. 15 (8), 1183-1189 (2009).
- Bartosch, S., Fite, A., Macfarlane, G. T., McMurdo, M. E. Characterization of bacterial communities in feces from healthy elderly volunteers and hospitalized elderly patients by using real-time PCR and effects of antibiotic treatment on the fecal microbiota. Applied Environmental Microbiology. 70 (6), 3575-3581 (2004).
- Ubeda, C., et al. Vancomycin-resistant Enterococcus domination of intestinal microbiota is enabled by antibiotic treatment in mice and precedes bloodstream invasion in humans. Journal of Clinical Investigation. 120 (12), 4332-4341 (2010).
- Saez de Guinoa, J., et al. CD1d-mediated lipid presentation by CD11c(+) cells regulates intestinal homeostasis. EMBO Journal. 37 (5), (2018).
- Kruglov, A. A., et al. Nonredundant function of soluble LTalpha3 produced by innate lymphoid cells in intestinal homeostasis. Science. 342 (6163), 1243-1246 (2013).
- Wilhelm, J., Pingoud, A., Hahn, M. Real-time PCR-based method for the estimation of genome sizes. Nucleic Acids Research. 31 (10), e56 (2003).
- Kembel, S. W., Wu, M., Eisen, J. A., Green, J. L. Incorporating 16S gene copy number information improves estimates of microbial diversity and abundance. PLoS Computational Biology. 8 (10), e1002743 (2012).
- Yang, Y. W., et al. Use of 16S rRNA Gene-Targeted Group-Specific Primers for Real-Time PCR Analysis of Predominant Bacteria in Mouse Feces. Applied Environmental Microbiology. 81 (19), 6749-6756 (2015).
