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Engineering

iSCAT माइक्रोस्कोपी के माध्यम से कोशिकाओं रहने से स्रावित एकल प्रोटीन की लेबल-मुक्त इमेजिंग

Published: November 20, 2018 doi: 10.3791/58486
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 4, 4, 1,3
1Max Planck Institute for the Science of Light (MPL), 2Area of Scientific Learning, Milligan College, 3Department of Physics, Friedrich Alexander University Erlangen-Nuremberg, 4Department of Internal Medicine 5, Hematology and Oncology, Friedrich Alexander University Erlangen-Nuremberg (FAU), University Hospital Erlangen

Summary

हम एक लेबल के वास्तविक समय ऑप्टिकल पता लगाने के लिए मौजूद है के रूप में वे कोशिकाओं के रहने से गुप्त हैं । इस interferometric कैटरिंग (iSCAT) माइक्रोस्कोपी पर आधारित है, जो विभिन्न जैविक प्रणालियों और विन्यास की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है.

Abstract

हम interferometric कैटरिंग (iSCAT) माइक्रोस्कोपी, वास्तविक समय में व्यक्तिगत जीवित कोशिकाओं से स्रावित एकल लेबल वाले प्रोटीन का पता लगाने में सक्षम एक विधि का प्रदर्शन. इस प्रोटोकॉल में, हम एक iSCAT माइक्रोस्कोप का एहसास करने के लिए बुनियादी कदम कवर और अध्ययन के तहत एक सेल की व्यवहार्यता पर नजर रखने के लिए अतिरिक्त इमेजिंग चैनलों के साथ पूरक । इस के बाद, हम एक प्रोटीन के वास्तविक समय का पता लगाने के लिए विधि का उपयोग के रूप में वे एक जीवित कोशिका जो हम एक अमर बी-सेल लाइन (Laz388) के साथ प्रदर्शन से स्रावित कर रहे हैं । आवश्यक कदम माइक्रोस्कोप और नमूना के रूप में अच्छी तरह से दर्ज आंकड़ों के विश्लेषण की तैयारी के विषय में चर्चा कर रहे हैं । वीडियो प्रोटोकॉल दर्शाता है कि iSCAT माइक्रोस्कोपी एकल-अणु स्तर पर स्राव का अध्ययन करने के लिए एक सरल विधि प्रदान करता है ।

Introduction

स्रावित प्रोटीन विभिन्न शारीरिक प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं1. इस वजह से, वे नियमित रूप से एक सामूहिक पहनावा (प्रोटियोमिक्) के रूप में या व्यक्तिगत संस्थाओं2,3के रूप में अध्ययन कर रहे हैं । प्रोटियोमिक् परंपरागत रूप से उदाहरण के माध्यम से एक विशेष रूप से जैविक प्रणाली में मौजूद प्रोटीन के पूरे सेट की जांच, एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा), प्रवाह cytometry, या मास स्पेक्ट्रोमेट्री4,5, 6. एक प्रोटीन, दूसरी ओर, आम तौर पर तकनीक है कि प्रतिदीप्ति7,8, plasmonics9,10, या क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन11 पर आधारित है की एक किस्म का उपयोग कर पाए जाते है माइक्रोस्कोप्स. इन तकनीकों के सभी जटिल उपकरणों का उपयोग करें, लेबल, या दोनों और अक्सर गतिशीलता जानकारी की कमी के रूप में वे केवल अध्ययन के तहत प्रणाली के बारे में दीर्घकालिक जानकारी देने ।

यहां हम iSCAT12का उपयोग करें,13 सूक्ष्म उप दूसरे लौकिक संकल्प14के साथ व्यक्तिगत स्रावी प्रोटीन भावना । महत्वपूर्ण बात, तकनीक का पता लगाता है कमजोर बिखरे हुए संकेत हर प्रोटीन12,14के लिए आंतरिक । प्रकाश की राशि है कि एक छोटा सा कण अपनी ध्रुवीकरण के साथ तराजू बिखर जाती है । यह मानते हुए कि एक प्रोटीन के आकार एक प्रभावी तितर बितर क्षेत्र14,15,16द्वारा अनुमानित किया जा सकता है, और है कि अलग प्रोटीन बहुत ही अपवर्तन सूचकांक है, मापा संकेत सीधे हो सकता है आणविक वजन (मेगावाट) प्रोटीन के लिए जुड़ा हुआ है । संदर्भ माप द्वारा आणविक भार बनाम iSCAT कंट्रास्ट के अनुभवजंय अंशांकन एक अलग आकार के प्रोटीन भेद करने के लिए अनुमति देता है । iSCAT प्रयोगों आसानी से प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी17,18, immunosorbent रिएजेंट, साथ ही फ्लोरोसेंट या तितर बितर लेबल14 ब्याज की किसी भी प्रोटीन का एक विशिष्ट का पता लगाने के लिए अनुमति देने के द्वारा पूरित किया जा सकता , 17 , 19. शी.

सिद्धांत रूप में, एक माध्यमिक संदर्भ लहर के साथ मिश्रण interferometric के माध्यम से एक प्रोटीन कमजोर बिखरे हुए प्रकाश बढ़ाना द्वारा iSCAT कार्य करता है । एक iSCAT माइक्रोस्कोप मेंEquation 1पता लगाया तीव्रता () द्वारा वर्णित है

Equation 2

जहां Equation 3 घटना की तीव्रता है, Equation 4 संदर्भ लहर के योगदान के लिए एक गुणांक है, Equation 5 अध्ययन के तहत नैनो-वस्तु की तितर बितर ताकत का प्रतीक है, और Equation 6 बिखरे हुए और संदर्भ के बीच चरण बदलाव है लहरें१४. या तो संचारित या वापस परिलक्षित घटना प्रकाश आमतौर पर एक संदर्भ की लहर है, जहां transmissivity या नमूना Equation 7 चैंबर के भावना, क्रमशः के लिए प्रत्येक मामले में खातों के रूप में प्रयोग किया जाता है । शब्द Equation 8 प्रोटीन तितर बितर पार अनुभाग के लिए आनुपातिक है और पार अवधि की तुलना में उपेक्षित किया जा सकता है । इस प्रकार, Equation 9 पूर्ण विनाशकारी हस्तक्षेप के लिए स्थापित करने, पता लगाया प्रकाश Equation 10 जहां Equation 11 संदर्भ तीव्रता है और Equation 12 हस्तक्षेप तीव्रता है द्वारा दिया जाता है ।

iSCAT माइक्रोस्कोपी एकल अणु स्तर पर जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट विधि प्रदान करता है । एक उदाहरण के रूप में, हम Laz388 कोशिकाओं की जांच-एक Epstein-बर्र वायरस (EBV) बी लिम्फोसाइट सेल लाइन20,21 बदल-वे जैसे आईजीजी एंटीबॉडी16के रूप में प्रोटीन स्रावित । हालांकि, विधि सामांय है और अंय जैविक प्रणालियों की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है । iSCAT स्वाभाविक रूप से विशिष्ट है और किसी भी प्रोटीन या nanoparticle का पता लगा सकते है या यह विशिष्ट या मल्टीप्लेक्स का पता लगाने के लिए आम सतह functionalization तरीकों के साथ बढ़ाया जा सकता है । अपनी सादगी और इस तरह के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के रूप में अन्य ऑप्टिकल तकनीक, के साथ संयुक्त होने की क्षमता, iSCAT सेल जीव विज्ञान में एक मूल्यवान पूरक उपकरण बनाने.

Protocol

चेतावनी: कृपया सभी प्रासंगिक सामग्री सुरक्षा डाटा शीट (MSDS) किसी भी रसायनों का उपयोग करने से पहले पढ़ें, सभी उपयुक्त सुरक्षा प्रथाओं का निरीक्षण, और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनते है (लेजर सुरक्षा चश्मे, नेत्र सुरक्षा, दस्ताने, प्रयोगशाला कोट) के रूप में की जरूरत है ।

1. iSCAT माइक्रोस्कोप का निर्माण16,18

नोट: iSCAT माइक्रोस्कोप आमतौर पर एक संशोधित औंधा माइक्रोस्कोप सेटअप के होते हैं. संक्षेप में, एक लेज़र एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर (ना) उद्देश्य और एक इमेजिंग लेंस के पीछे फोकल विमान पर ध्यान केंद्रित करने के लिए एक कैमरा चिप पर है कण पीठ बिखरे प्रकाश ध्यान केंद्रित किया जाता है । सामांय में, इस व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप खरोंच से बनाया जा सकता है या एक मौजूदा औंधा माइक्रोस्कोप पर आधारित है । यह प्रोटोकॉल सेटअप को महसूस करने के लिए आवश्यक चरणों को कवर करता है, जबकि उपयोग किए गए हार्डवेयर में परिवर्तन संभव है । एक iSCAT माइक्रोस्कोप के विधानसभा का एक अधिक विस्तृत विवरण अर्रोयो एट अल के काम में पाया जा सकता है । 18.

चेतावनी: एक iSCAT माइक्रोस्कोप कक्षा चतुर्थ लेजर प्रकाश स्रोत के लिए एक वर्ग IIIB शामिल है । उपयुक्त आंख संरक्षण आवश्यक है जब कोडांतरण और माइक्रोस्कोप प्रकाशिकी संरेखित । माइक्रोस्कोप विधानसभा के दौरान, सुनिश्चित करें कि लेजर बीम पथ सीधे रहता है और नए ऑप्टिकल घटकों के रूप में जोड़ दिया जाता है नहीं है ।

  1. माइक्रोस्कोप का प्रदीप्ति पथ स्थापित करें ।
    1. एक नम ऑप्टिकल मेज और एक कठोर धातु ब्लॉक का उपयोग करना, एक खुर्दबीन नमूना चरण18 है कि एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर (ना) उद्देश्य (100X/1.46 ना) और एक अनुवाद इकाई है कि पार्श्व नमूना अनुवाद के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ध्यान के परिवर्तन के लिए अनुमति देता है का निर्माण उद्देश्य के लिए स्थिति ।
      नोट: एकल प्रोटीन का पता लगाने की सीमा पर एक iSCAT माइक्रोस्कोप के आपरेशन अत्यधिक बाहरी कंपन करने के लिए अतिसंवेदनशील है । सभी पक्षों से नमूना का समर्थन करता है कि एक centrosymmetric पीजो मंच अन्यथा फोकल और पार्श्व स्थिरता समझौता होगा कि नमूना के ध्वनिक उत्तेजना सीमित करने के लिए सिफारिश की है. चित्रा 1 पीजो अनुवाद इकाई और उद्देश्य सहित एक उपयुक्त नमूना चरण, दिखाता है । इसके अलावा, यह है कि बड़े पैमाने पर और स्थिर mounts निंनलिखित चरणों में चर्चा की सभी ऑप्टिकल घटकों के लिए उपयोग किया जाता है की सिफारिश की है । ऐसे घटक वाणिज्यिक प्रकाशिकी आपूर्तिकर्ताओं से आसानी से उपलब्ध हैं ।
    2. एक ५० सेमी फोकल लंबाई स्वेटर लेंस (वाइड फील्ड लेंस) और एक ४५ ° (ऊर्ध्वाधर) युग्मन दर्पण का प्रयोग करने के लिए एक डायोड लेजर के प्रकाश तरंग दैर्ध्य ४४५ एनएम पर उद्देश्य के वापस फोकल विमान पर ध्यान केंद्रित । इस उद्देश्य के आगे ध्यान केंद्रित में एक collimated बीम बनाता है और iSCAT रोशनी स्रोत बन जाएगा । यदि आवश्यक हो, एक 30 µm pinhole या एकल मोड फाइबर के माध्यम से विशेष रूप से ५० सेमी लेंस से पहले लेजर फिल्टर ।
    3. उद्देश्य के लिए विसर्जन तेल की एक छोटी बूंद लागू करें और माइक्रोस्कोप मंच के नमूना विमान में एक गिलास coverslip जगह है । यह एक बीम कि इमेजिंग उद्देश्य के माध्यम से वापस नीचे दर्शाता है में परिणाम होगा ।
      नोट: प्रतिबिंब नमूना coverslip की ऊपरी सतह पर हवा-गिलास इंटरफेस से उठता है और iSCAT संदर्भ बीम के लिए आधार के रूप में काम करेगा । coverslip की सतह पर अवशिष्ट गंदगी या धूल तितर बितर बिंदु सूत्रों, जो अगले चरणों में इमेजिंग उद्देश्य का सही ध्यान केंद्रित करने में सहायता के लिए वृद्धि दे देंगे ।
      चेतावनी: लेजर प्रकाश के बहुमत coverslip के माध्यम से पहुंचाता है और सीधे उद्देश्य से यात्रा । एक अपारदर्शी specular विसारक प्लेस (जैसे, एक कागज कार्ड) coverslip ऊपर लेजर प्रकाश से चोट के जोखिम को कम करने के लिए ।

Figure 1
चित्रा 1: iSCAT नमूना चरण । तस्वीर बड़े पैमाने पर एल्यूमीनियम ब्लॉक जिस पर पीजो अनुवाद इकाई (काला) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से केंद्रित 100x उद्देश्य घुड़सवार है दिखाता है । 3-अक्ष पीजो चरण उद्देश्य के फोकल विमान में नमूना की सटीक स्थिति के लिए अनुमति देता है । मोटे ध्यान केंद्रित एक लड़ी पिरोया ट्यूब जिस पर उद्देश्य (चित्रित नहीं) मुहिम शुरू की है घूर्णन द्वारा किया जाता है । ब्लॉक ४५ ° युग्मन दर्पण के ऊपर चार इस्पात कुरसी के साथ ऑप्टिकल मेज पर तैनात है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. माइक्रोस्कोप के इमेजिंग पथ की स्थापना की ।
    1. परिचय एक antireflection (एआर)-लेपित बीम अलगानेवाला (७०% प्रतिबिंब, 30% संचरण) एक ४५ ° कोण घटना बीम के सापेक्ष में, और व्यापक क्षेत्र लेंस के बाद लगभग 10 सेमी । लेजर स्रोत की ओर एआर कोटिंग को इंगित । यह घटना बीम पहुंचाता है, और घटना बीम करने के लिए एक ९० ° कोण पर संदर्भ और बिखरे हुए मुस्कराते हुए दर्शाता है ।
      नोट: AR-लेपित और/या कील बीम विभाजन महत्वपूर्ण भूत के रूप में सिफारिश कर रहे है और फ्रिंज प्रभाव हो सकता है जब बीम बंटवारे cubes, या uncoat planar बीम विभाजन का उपयोग कर । अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें । यदि वांछित, बीम अलगानेवाला के पीछे की ओर से उत्पंन किसी भी अवांछित प्रतिबिंबित बीम एक आईरिस डायाफ्राम के उपयोग के द्वारा अवरुद्ध किया जा सकता है ।
    2. एक मोटी बीम अलगानेवाला इतना है कि लेजर सीधे अब और उद्देश्य में प्रवेश नहीं हो सकता है एक महत्वपूर्ण बीम विस्थापन परिचय होगा । यदि आवश्यक हो, इस उद्देश्य के माध्यम से सही प्रचार सुनिश्चित करने के लिए बीम अलगानेवाला से पहले लेजर बीम पथ फिर से संरेखित करें ।
      नोट: बीम अलगानेवाला भी व्यापक क्षेत्र लेंस से पहले जोड़ा जा सकता है और माइक्रोस्कोप मंच (1.1.2 कदम में) तैनात है, ताकि बीम बाद में विस्थापित नहीं किया जाएगा ।
    3. इस बिंदु पर, इंटरफेरोमीटर के इमेजिंग हाथ ध्यान केंद्रित करने और सुनिश्चित करें कि नमूना विमान और कैमरा parfocal हैं । एक स्थान पर एक गुफा f =-४५ सेमी लेंस घटना बीम पथ में व्यापक क्षेत्र लेंस के बाद एक स्थान पर 5 सेमी । यह एक collimated उद्देश्य के वापस एपर्चर में प्रवेश बीम में परिणाम होगा ।
    4. इंटरफेरोमीटर के परिलक्षित हाथ में रखा एक स्क्रीन के साथ, मोटे फोकल स्थिति को खोजने के लिए ऊर्ध्वाधर दिशा में उद्देश्य चाल । उद्देश्य ध्यान में है जब स्क्रीन मार बीम collimated है ।
      नोट: चित्रा 2 इस प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध दिखाता है ।
    5. दोनों एफ =-४५ सेमी लेंस और स्क्रीन जब मोटे ध्यान केंद्रित पूरा हो गया है निकालें ।
      नोट: बजाय एक नकारात्मक फोकल लंबाई लेंस का उपयोग कर के, व्यापक क्षेत्र लेंस ही एक जंगम माउंट पर रखा जा सकता है और इस कदम के लिए बीम पथ के बाहर स्थानांतरित कर दिया । हालांकि, सबसे स्थिर माइक्रोस्कोप विन्यास को प्राप्त करने के लिए, यह एक निश्चित स्थिति में व्यापक क्षेत्र लेंस पकड़ करने के लिए सिफारिश की है.
    6. एक दूसरे एफ = ५० सेमी स्वेटर लेंस के लिए बिखरे हुए प्रकाश ध्यान और एक CMOS कैमरे के संवेदक पर प्रतिबिंबित प्रकाश collimate जोड़ें । सुनिश्चित करें कि लेंस के पीछे फोकल विमान से ५० सेमी रखा है ताकि उद्देश्य के रूप में फिर से संदर्भ बीम collimate और बिखरे हुए प्रकाश ध्यान केंद्रित ।
    7. जगह CMOS चिप ५० cm से दूर च = ५० सेमी लेंस और स्थिति बीम सीधे चिप के बीच पर ।
      नोट: निम्न पैरामीटर्स विशेष रूप से इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाते हैं । लेजर के उत्पादन शक्ति (तरंग दैर्ध्य ४४५ एनएम) १०० मेगावाट के लिए सेट है । Pinhole और बीम अलगानेवाला संचरित प्रकाश क्षीण करना इतना है कि प्रभावी उद्देश्य में प्रवेश शक्ति के बारे में 9 मेगावाट है । 6 µm के लिए नमूना स्थिति मात्रा पर बीम व्यास । इस्तेमाल किया इमेजिंग लेंस के साथ, प्रणाली के प्रभावी इज़ाफ़ा 300x के बारे में है । CMOS चिप पर छवि के आकार के प्रबुद्ध क्षेत्र के भीतर १२८ × १२८ पिक्सल के लिए सेट है, लगभग 5 × 5 µm2के देखने के एक क्षेत्र में जिसके परिणामस्वरूप । चित्रा 3 पूरी तरह से इकट्ठे iSCAT माइक्रोस्कोप की एक योजनाबद्ध से पता चलता है.

Figure 2
चित्रा 2: मोटे iSCAT माइक्रोस्कोप के ध्यान केंद्रित । योजनाबद्ध प्रकाशिकी की व्यवस्था को ध्यान में प्रणाली लाने में मदद दिखाता है । किरण अलगानेवाला (70/30 बी एस) की एआर-लेपित पीठ की ओर लाल रंग में चिह्नित है । महत्वपूर्ण दूरियां हरे रंग में उपलब्ध कराई गई हैं । इस्तेमाल किया लेंस के फोकल लंबाई (एफ) चिह्नित हैं । नीले डैश्ड बॉक्स में घटक चरणों 1.2.6-1.2.7 में जोड़े जाते हैं । इस गुफा लेंस (converging iSCAT बीम फिर से collimate के लिए इस्तेमाल किया) और स्क्रीन बाद में हटा रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: iSCAT माइक्रोस्कोप । योजनाबद्ध पूरी तरह से इकट्ठे iSCAT माइक्रोस्कोप से पता चलता है. किरण अलगानेवाला (70/30 बी एस) की एआर-लेपित पीठ की ओर लाल रंग में चिह्नित है । महत्वपूर्ण दूरियां हरे रंग में उपलब्ध कराई गई हैं । इस्तेमाल किया लेंस के फोकल लंबाई (एफ) चिह्नित हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. अतिरिक्त इमेजिंग चैनल सेट करें ।
    नोट: इस अनुभाग उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के माध्यम से iSCAT लेजर आसपास के एक बड़े क्षेत्र के अवलोकन के लिए अनुमति देता है कि माइक्रोस्कोप के लिए एक और इमेजिंग पथ कहते हैं, और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से सेल व्यवहार्यता की निगरानी करने के लिए.
    1. युगल एक लंबे समय से काम कर दूरी 20X/0.4 ना उद्देश्य में एक एलईडी लाइट स्रोत (लगभग ५०० एनएम < λ < ५८० एनएम) के उत्पादन, और पर एलईडी उत्पादन की ध्यान केंद्रित करने और पार्श्व स्थिति के लिए अनुमति नमूना चैंबर के ऊपर यांत्रिक घटकों को स्थापित नमूना.
      1. यह सुनिश्चित करें कि LED के आउटपुट स्पेक्ट्रम में सेल डेथ मार्कर (propidium आयोडाइड (PI)) की उत्तेजना रेंज शामिल है और इसके प्रतिदीप्ति (λ > ६०० एनएम) के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है । यदि आवश्यक हो तो ऑप्टिकल फ़िल्टर्स का उपयोग करें.
    2. ऊपरी उद्देश्य को बाद में ले जाएं ताकि ऊपरी (वाइड-फील्ड) और लोअर (iSCAT) उद्देश्य collinear हों । यह कम उद्देश्य के तहत एक स्क्रीन रखने और स्क्रीन पर संचारित एलईडी प्रकाश की तीव्रता को अधिकतम करने के द्वारा निर्धारित किया जाता है । एक λ प्लेस = ५५० एनएम शॉर्ट-पास dichroic मिरर (SPDM) iSCAT लेजर पथ से संचारित एलईडी प्रकाश विभाजित करने के लिए ।
    3. एक 8% चिंतनशील के साथ दो चैनलों में इस बीम भाजित/92% transmissive बीम अलगानेवाला (बी एस) । ९२% पथ प्रतिदीप्ति चैनल है और 8% पथ ब्राइट-फील्ड इमेजिंग के लिए उपयोग किया जाता है ।
    4. छवि उज्ज्वल क्षेत्र चैनल एक CMOS कैमरा पर एक एफ = 5 सेमी achromatic नक़ल लेंस का उपयोग कर ।
    5. छवि एक अलग CMOS कैमरे पर प्रतिदीप्ति चैनल एक एफ = 5 सेमी achromatic नक़ल लेंस और एक λ = ६०० एनएम लंबे समय से गुजारें फ़िल्टर का उपयोग करने के लिए उत्तेजना प्रकाश ब्लॉक । चित्रा 4a सभी इमेजिंग चैनलों सहित पूरी तरह से इकट्ठे माइक्रोस्कोप की एक योजनाबद्ध से पता चलता है.

Figure 4
चित्रा 4: एकल कोशिकाओं द्वारा स्रावित प्रोटीन की iSCAT माइक्रोस्कोपी. (क) इस प्रोटोकॉल में वर्णित माइक्रोस्कोप की योजनाबद्ध । अधिक जानकारी के लिए अनुभाग 1 देखें । संक्षिप्त: एलईडी, प्रकाश उत्सर्जक डायोड; SPF, शॉर्ट-पास फ़िल्टर; obj, उद्देश; SPDM, शॉर्ट-पास dichroic मिरर; बी एस, बीम अलगानेवाला; LPF, लंबे समय से गुजारें फिल्टर; BF, उज्ज्वल क्षेत्र; fluor, प्रतिदीप्ति; C1-C3, कैमरा 1-3. (ख) उज्ज्वल एक एकल Laz388 सेल के क्षेत्र की छवि के बारे में 4 µm देखने के iSCAT क्षेत्र से दूर (एक सफेद वर्ग द्वारा चित्रित) । कैमरा C3, स्केल बार द्वारा ली गई छवि: 10 µm. (c) एक सफेद वृत्त द्वारा चिह्नित कक्ष की स्थिति के साथ (b) में दर्शाए गए समान क्षेत्र की प्रतिदीप्ति छवि । प्रतिदीप्ति के अभाव इंगित करता है कि कोशिका व्यवहार्य है । कैमरा C2 द्वारा ली गई छवि, स्केल बार: 10 µm. (d) ८० µs एक्सपोज़र समय के साथ Raw iSCAT कैमरा छवि स्नैपशॉट. कैमरा C1 द्वारा ली गई छवि । (ङ) चर्चा खंड में वर्णित के अनुसार spatiotemporal पृष्ठभूमि घटाव के बाद उसी क्षेत्र की iSCAT छवि । छवि १००० अनुक्रमिक कच्चे फ्रेम पर एकीकृत किया गया था (डी) ४०० एमएस के एक अंतिम फ्रेम समय के साथ और कांच coverslip की सतह किसी न किसी को पता चलता है । (च) इसी अंतर iSCAT छवि है कि coverslip पर 2 प्रोटीन की बाध्यकारी घटना से पता चलता है । छवि दो लगातार फ़िल्टर (ई) छवियों को घटाकर द्वारा निर्माण किया गया था । (d), (e), और (f): 1 µm में स्केल पट्टियां । यह आंकड़ा मैकडॉनल्ड्स, मध्यप्रदेश एट अल से अनुकूलित किया गया है । 16. कॉपीराइट २०१८ अमेरिकन केमिकल सोसायटी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. कंप्यूटर और सॉफ़्टवेयर सेट करें ।
    1. सभी कैमरों को एक कंप्यूटर से कनेक्ट करें । संबंधित ड्राइवर संकुल स्थापित करें और उनके नियंत्रण के लिए सॉफ्टवेयर प्राप्त/
      नोट: उपयुक्त हार्डवेयर उच्च गति अधिग्रहण के लिए आवश्यक है । न्यूनतम, एक बहु-कोर प्रोसेसर, 16 GB RAM, एक फ़्रेम धरनेवाला कार्ड, और डेटा संग्रहण के लिए एक ठोस स्थिति डिस्क अनुशंसित है ।
    2. CMOS कैमरे पर iSCAT छवि का निरीक्षण और यह सुनिश्चित करें कि यह कांच coverslip पर एक अवशिष्ट धूल या गंदगी कण खोजने के द्वारा ध्यान में है । सत्यापित करें कि कण की छवि एक प्रचलन सममित बिंदु स्प्रेड फ़ंक्शन (पीएसएफ) है ।
      नोट: एक गैर के लिए मुख्य कारण-परिपत्र सममित पीएसएफ है कि लेजर बीम उद्देश्य सीधे प्रवेश नहीं करता है, लेकिन ऑप्टिकल धुरी के संबंध में एक छोटे से कोण पर । यह कोण और ४५ ° युग्मन दर्पण के साथ घटना बीम की स्थिति का समायोजन करके सही है ।
    3. उज्ज्वल क्षेत्र और प्रतिदीप्ति चैनलों की कैमरा छवियों की तुलना करें । सुनिश्चित करें कि दोनों फोकस में हैं और उसी क्षेत्र को प्रदर्शित करते हैं । सत्यापित करें कि iSCAT लेजर की स्थिति लगभग छवि के केंद्र में है और बाद में संदर्भ के लिए अपनी स्थिति का ध्यान रखना । चित्रा 4b देखें- ठेठ कैमरा छवियों के लिए 4f ।
      नोट: दो चैनलों का ध्यान लगाने के लिए एक सेल नमूना या फ्लोरोसेंट मोतियों का प्रयोग करें । अस्थाई रूप से प्रतिदीप्ति लंबी पास फ़िल्टर सिस्टम को समायोजित करने के लिए निकालें । कोशिकाओं के पारंपरिक इमेजिंग के लिए ध्यान केंद्रित करने के लिए थोड़ा iSCAT फोकल विमान से अधिक की जरूरत है । उद्देश्य चलती बिना इस के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए, दो संबंधित एफ = 5 सेमी लेंस के ध्यान में अपने पदों से कैमरे विस्थापित ।
    4. आवश्यक कैमरा पैरामीटर सेट करें । एक निश्चित फ्रेम दर का उपयोग करें और सॉफ्टवेयर लाभ और सुधार उपकरण को निष्क्रिय ।
      नोट: निम्न पैरामीटर्स का उपयोग किया जाता है: iSCAT कैमरा ८० µs की एक जोखिम समय के साथ प्रति सेकंड (एफपीएस) ५००० फ्रेम करने के लिए सेट है । जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, छवि आकार १२८ × १२८ पिक्सल है । दोनों उज्ज्वल क्षेत्र और प्रतिदीप्ति कैमरों पूर्ण फ्रेम आकार (१२८० × १०२४ पिक्सल) में काम करते हैं । उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग एक 20 एमएस जोखिम समय के साथ किया जाता है । प्रतिदीप्ति कैमरा ७५० एमएस जोखिम समय के लिए सेट है, और लगातार 5 फ्रेम एक अंतिम छवि बनाने के लिए जमा हो जाती है । उज्ज्वल क्षेत्र और प्रतिदीप्ति छवियों तय 20 एस समय अंतराल पर अधिग्रहीत कर रहे हैं ।

2. प्रयोग की तैयारी

  1. शेयर माइक्रोस्कोपी मीडियम तैयारकरें.
    1. HEPES बफर सॉल्यूशन के 25 मिलीलीटर जोड़ें (1 मॉल/एल) RPMI १६४० माध्यम के ९७५ मिलीलीटर के लिए 25 mmol/l HEPES समाधान के अंतिम 1 एल प्राप्त करने के लिए । वैकल्पिक रूप से, HEPES के साथ एक बफर माध्यम का उपयोग पहले से ही शामिल है ।
      नोट: HEPES परिवेश स्थितियों में एक माप के दौरान माध्यम के पीएच मान को बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है (जैसे, एक मशीन के बाहर और लगातार सह2 आपूर्ति के बिना).
    2. एक प्रयोग के लिए आवश्यक समाधान की एक aliquot ले लो और यह कमरे के तापमान को गर्म करते हैं । मध्यम के 2 मिलीलीटर पर्याप्त है । शेष स्टॉक समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें ।
  2. माइक्रोस्कोप cuvette तैयार करें ।
    नोट: निंन चरणों का वर्णन एक कस्टम निर्मित नमूना एक एल्यूमीनियम आधार प्लेट और एक एक्रिलिक cuvette डिश है कि दोनों सुधार coverslip और यह piezoelectric 3d स्थान के लिए जोड़ों से मिलकर धारक के लिए प्रक्रिया का विवरण । एक गिलास नीचे के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बाँझ संस्कृति व्यंजन भी इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    नोट: चित्रा 5 कस्टम निर्मित नमूना धारक की तस्वीरें दिखाता है ।
    1. एक नया माइक्रोस्कोपी coverslip लें और उसे पानी (DI-water) और इथेनॉल के साथ कुल्ला करें । एयर नाइट्रोजन या दबाव हवा के साथ स्लाइड सूखी ।
    2. एक ऑक्सीजन प्लाज्मा वातावरण में coverslip साफ (०.३ mbar गैस दबाव) 10 मिनट के लिए ५०० W आरएफ पावर में । यह सतह से सभी कार्बनिक अशुद्धियों को हटा ।
    3. यह ०.२ मॉल में विसर्जित करके ऐक्रेलिक cuvette डिश साफ/एल NaOH समाधान के लिए DI पानी के साथ लगभग 10 मिनट कुल्ला ।
    4. नमूना धारक को इकट्ठा करने और प्रयोग में जरूरत तक एक प्लास्टिक पेट्री डिश के साथ कवर किया ।

Figure 5
चित्रा 5: कस्टम निर्मित नमूना धारक । (क) नमूना धारक अवयव: (१) एक्रिलिक cuvette डिश; (2) एल्यूमिनियम बेस प्लेट; (3) शिकंजा पकड़े; (4) सिलिकॉन हे-रिंग; (5) coverslip । (ख) पूरी तरह से नमूना धारक इकट्ठे हुए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. माइक्रोस्कोप तैयार करें ।
    1. iSCAT दीप्ति लेजर पर मुड़ें, उज्ज्वल-क्षेत्र/प्रतिदीप्ति रोशनी एलईडी, कैमरा, और अधिग्रहण कंप्यूटर/ उद्देश्य से पहले एक स्थान पर लेजर बीम ब्लॉक ।
    2. यह सुनिश्चित करें कि 100X/1.46 ना उद्देश्य साफ है । यदि नहीं, तो उपयोग लेंस पोंछे और इथेनॉल सफाई के लिए निर्माता दिशानिर्देश के अनुसार उद्देश्य साफ ।
    3. माइक्रोस्कोप उद्देश्य पर विसर्जन तेल की एक बूंद लागू करें ।
    4. नमूना धारक ले लो (२.२ धारा में इकट्ठे) और ध्यान से यह iSCAT माइक्रोस्कोप के पीजो मंच पर माउंट इतना है कि नमूना coverslip माइक्रोस्कोप उद्देश्य पर केंद्रित है । ध्यान और सावधान रहो ताकि उद्देश्य लेंस को नुकसान नहीं है । यह सुनिश्चित करना है कि निर्माता अधिकतम टोक़ से अधिक नहीं है, जबकि अंगूठे शिकंजा के साथ piezoelectric स्थान के लिए इकाई जकड़ना ।
    5. cuvette में स्टॉक माइक्रोस्कोपी मीडियम (धारा २.१ में तैयार.) की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    6. propidium आयोडाइड के 2 बूंदें एक सेल मौत मार्कर16,22के रूप में मध्यम करने के लिए दाग जोड़ें ।
    7. लेजर को अनब्लॉक करें और सिस्टम को फोकस में लाएं । सबसे पहले, सत्यापित करें कि उद्देश्य coverslip से सही दूरी पर स्थित है 1.2.3 कदम दोहरा कर । 1.2.5. (चित्रा 2) । फिर, ठीक धुन z पीजो चरण के अक्ष के साथ ध्यान केंद्रित ।
    8. पुष्टि करें कि प्रकाश स्रोत, कैमरा, और सॉफ़्टवेयर के लिए सभी सेटिंग्स ठीक से सेट की गई हैं । इसमें लेज़र पावर, LED तीव्रता, कैमरा फ़्रेम दर, कैमरा एक्सपोज़र समय, या सॉफ़्टवेयर की बचत पथ जैसे पैरामीटर्स शामिल हैं ।
      नोट: उच्च फ़्रेम दरों पर वीडियो सहेजना बड़ी फ़ाइल आकार का उत्पादन कर सकते हैं । कंप्यूटर पर पर्याप्त मुक्त डिस्क स्थान सुनिश्चित करें ।
    9. लेजर बीम फिर से ब्लॉक । माइक्रोस्कोप अब एक प्रयोग के लिए तैयार है ।
  2. कक्षों को तैयार करें ।
    नोट: Laz388 कोशिकाओं20 RPMI १६४० मध्यम में 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS), अमीनो एसिड, पाइरूवेट, और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक है । कोशिकाओं ३७ ° c और 5% CO2 पर है और विभाजित कर रहे है और ताजा माध्यम के साथ प्रदान की हर 2-3 दिन23।
    1. मशीन और महाप्राण लगभग 1 x 106 कोशिकाओं से युक्त माध्यम से सेल संस्कृति कुप्पी ले लो । सही मात्रा निर्धारित करने के लिए, एक hemocytometer के उपयोग द्वारा कोशिका संस्कृति की एकाग्रता को बढ़ाता है ।
    2. कमरे के तापमान पर RPMI १६४० मध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ सेल समाधान मिश्रण और 7 मिनट के लिए ३०० x g पर नमूना केंद्रापसारक ।
    3. ध्यान से निकालने और supernatant को त्यागें, जबकि सुनिश्चित करना है कि केंद्रित कोशिकाओं की गोली परेशान रहता है ।
    4. दोहराएँ चरण 2.4.2. 2.4.3. कोशिकाओं के केंद्रित गोली के साथ ।
    5. ०.५ मिलीलीटर स्टॉक माइक्रोस्कोपी मध्यम (धारा २.१ में तैयार.) में कोशिकाओं को फिर से निलंबित और तुरंत एक प्रयोग में उन्हें इस्तेमाल करते हैं ।

3. स्रावित कोशिकाओं की iSCAT माइक्रोस्कोपी

  1. सुनिश्चित करें कि लेजर बीम सीधे iSCAT लेजर प्रकाश को उजागर किया जा रहा से कोशिकाओं को रोकने के लिए अवरुद्ध है ।
  2. कोशिकाओं के नमूने cuvette में इंजेक्ट ।
    1. लगभग सेल नमूने के 3 µ एल इंजेक्षन (धारा २.४ में तैयार.) थोड़ा बंद नमूना cuvette में केंद्र । धीरे coverslip को पिपेट टिप स्पर्श और धीरे से सेल समाधान इंजेक्षन । कक्षों को coverslip पर व्यवस्थित करने की अनुमति दें ।
      नोट: छोटे वॉल्यूम पिपेट टिप्स (10 µ l) या लंबे, लचीले जेल-लोडिंग टिप्स का उपयोग करें ।
    2. सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं के घनत्व लगभग ५०० µm प्रति कक्ष 1 से नीचे है ² ताकि एकल कोशिका माप iSCAT लेजर आसपास के क्षेत्र में कई कोशिकाओं से प्रभावित नहीं कर रहे हैं ।
    3. यदि कक्षों की संख्या बहुत कम है, तो चरण 3.2.1 दोहराएं । जब तक कि पर्याप्त संख्या में उपलब्ध न हो ।
    4. कोशिकाओं की कवरेज बहुत घना है, तो coverslip भर में कोशिकाओं को फैलाने के लिए अतिरिक्त माइक्रोस्कोपी माध्यम के लगभग 20 µ एल के एक इंजेक्शन का उपयोग करें ।
  3. पीजो स्थान का उपयोग कर, नमूना बाद में एक कक्ष बंद (लगभग 10 µm) iSCAT फ़ील्ड को देखने के लिए स्थान के लिए ले जाएँ । सुनिश्चित करें कि कक्ष iSCAT फ़ील्ड देखने के ४४५ एनएम लेजर प्रकाश करने के लिए प्रत्यक्ष प्रदर्शन के रूप में प्रवेश नहीं करता है सेल के लिए हानिकारक हो सकता है ।
  4. कक्ष की व्यवहार्यता25को ढूंढने और सत्यापित करने के लिए ब्राइट-फील्ड और प्रतिदीप्ति छवियों का उपयोग करें ।
    नोट: एक व्यवहार्य कोशिका उज्ज्वल क्षेत्र छवि में एक गोल आकार है और फ्लोरोसेंट नहीं है, जबकि कोशिका मृत्यु मजबूत प्रतिदीप्ति सेल22के अंदर propidium आयोडाइड की उपस्थिति से उत्पंन होने वाले संकेतों से संकेत दिया है ।
  5. iSCAT लेजर बीम अनब्लॉक और यह सुनिश्चित करें कि coverslip सतह ध्यान में अभी भी है । अलगाव तालिका परिवेश परिवेश से बहाव और ध्वनिक युग्मन को कम करने के लिए बंद करना ।
    नोट: बाद भारी ऑप्टिकल पर्दे या एक्रिलिक पैनल ऑप्टिकल टेबल आसपास के साथ पूरा किया है ।
  6. iSCAT, चमकीले क्षेत्र, और प्रतिदीप्ति कैमरों से छवियों को प्राप्त करके माप शुरू करते हैं । स्वचालित और सॉफ्टवेयर के माध्यम से प्रक्रिया को नियंत्रित करने के लिए प्रयोगात्मक दक्षता को अधिकतम । आवधिक रूप से सेल की व्यवहार्यता और प्रणाली के ध्यान की जांच करें ।
    नोट: लेजर तीव्रता, ऑप्टिकल उपकरणों पर निर्भर करता है, और कैमरे के जोखिम समय सेटिंग्स, iSCAT लेजर प्रतिदीप्ति कैमरे के साथ हस्तक्षेप हो सकता है । यह व्यवहार स्वीकार्य है, तो iSCAT लेज़र प्रतिदीप्ति छवि प्राप्ति के दौरान अस्थाई रूप से बंद करने पर विचार करें ।

4. डेटा विश्लेषण

नोट: प्रयोगात्मक डेटा स्वाभाविक शोर है, और iSCAT छवियों अलग नहीं कर रहे हैं. एक ठेठ iSCAT माप में शोर के कई स्रोत हैं, घटना प्रकाश स्रोत में wavefront विकृतियों सहित, coverslip की सतह किसी न किसी, और कैमरा शोर. नीचे दिए गए अनुभाग में कुछ तरीके है जिसमें इन शोर स्रोतों पोस्ट प्रोसेसिंग के माध्यम से उपचारात्मक है प्रस्तुत करता है । इसके अतिरिक्त, पार्श्व यांत्रिक instabilities सेटअप नेतृत्व के लिए शोर डेटा और तदनुसार संबोधित किया जाना चाहिए, के रूप में नीचे चर्चा अनुभाग में वर्णित है । वर्णित विश्लेषण कस्टम MATLAB लिपियों के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं ।

  1. उच्च स्थानिक आवृत्तियों शामिल नहीं है कि एक दो आयामी रूपान्तर फिल्टर के साथ कच्चे डेटा को छानने से कैमरा शोर को कम करें. फिल्टर के आकार के लिए विशिष्ट प्रयोगात्मक विंयास फिट समायोजित करने की जरूरत है (ज्यादातर प्रणाली के संख्यात्मक एपर्चर द्वारा निर्धारित) ।
    नोट: ऑप्टिकल प्रणाली से उच्च स्थानिक आवृत्तियों के साथ छवि में सुविधाओं बाहरी स्रोतों से शुरू (जैसे कैमरा पढ़ने के शोर के रूप में) और उपेक्षित किया जा सकता है.
  2. iSCAT कंट्रास्ट करने के लिए कच्चे कैमरे की गिनती से छवियों को परिवर्तित ।
    नोट: कैमरा द्वारा पता लगाया संकेत है Equation 13 । iSCAT Equation 14 विपरीत जहां Equation 15 संदर्भ प्रकाश की तीव्रता है के रूप में परिभाषित किया गया है, इस मामले में भाग coverslip द्वारा परिलक्षित होता Equation 16 है, और के Equation 15 बीच हस्तक्षेप और बिखरेEquation 17हुए तीव्रता () है ।
    1. में संकेत अलग Equation 16 और Equation 15 विशेष फ्रेम जिसमें ब्याज के कणों मौजूद नहीं है की लौकिक मतलब कंप्यूटिंग द्वारा । परिणामी छवि संदर्भ संकेत Equation 15 प्रदान करता है ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, एक सक्रिय पृष्ठभूमि घटाव कदम के रूप में नीचे चर्चा में वर्णित किया जा सकता है ।
    2. Equation 18 12,14,16के अनुसार कंट्रास्ट परिकलित करें ।
  3. इसके उत्तराधिकारी से प्रत्येक लगातार फ्रेम घटाकर एक रोलिंग विभेदक छवि बनाएं ।
    नोट: coverslip और wavefront विकृति की सतह किसी न किसी से अवशिष्ट संकेतों को प्रभावी ढंग से इस कदम में हटा रहे है के रूप में वे लगातार फ्रेम के भीतर लगातार कर रहे हैं । रोलिंग अंतर इन अवशिष्ट संकेतों को हटा, केवल प्रोटीन bindings है कि एक फ्रेम से अगले करने के लिए हो जा । यह लंबी अवधि के नमूने के बहाव के प्रति संवेदनशील नहीं है के रूप में इस गतिशील पृष्ठभूमि घटाव लाभप्रद है ।
  4. एक चोटी की मांग एल्गोरिथ्म का पता लगाने और प्रत्येक फ्रेम के लिए एक एकल कणों सूचकांक और उनके विशिष्ट विपरीत और स्थिति निर्धारित लागू होते हैं ।
  5. प्रोटीन बाध्यकारी घटनाओं के हिस्टोग्राम बनाने के लिए चरण ४.४ में एकत्र की गई जानकारी का उपयोग करें और ज्ञात प्रोटीन नमूनों से संकलित एक अंशांकन वक्र के माध्यम से प्रोटीन द्रव्यमान के लिए उनके निकाले गए विरोधाभासों से संबंधित हैं14,24.

Representative Results

एक iSCAT माइक्रोस्कोप की एक योजनाबद्ध चित्र 4aमें दिखाया गया है. प्रतिनिधि उज्ज्वल-क्षेत्र, प्रतिदीप्ति, और कच्चे iSCAT छवियों चित्रा 4b, 4c, और 4d, क्रमशः16में दिखाए जाते हैं । चित्रा 4e और 4f पृष्ठभूमि हटाने और अंतर पोस्ट प्रोसेसिंग के परिणाम दिखाएँ; चित्रा 4fमें विवर्तन-सीमित स्थानों के रूप में दो adsorbed प्रोटीन दिखाई दे रहे हैं । चित्रा 6 १२५ एस के पाठ्यक्रम पर पता चला प्रोटीन का हिस्टोग्राम दिखाता है । इन आंकड़ों पर कब्जा कर लिया छवियों के लिए एक चोटी की मांग एल्गोरिथ्म लागू करने के लिए बाध्यकारी घटनाओं गिनती और उनके विपरीत16catalog द्वारा प्राप्त किए गए थे । ५०३ प्रोटीन की कुल संख्या का पता लगाया गया ।

अगला, स्रावित प्रजातियों संदर्भ माप के साथ तुलना द्वारा पहचाने जाते हैं शुद्ध प्रोटीन समाधान पर बाहर किए गए, या कार्यात्मक ग्लास सतहों के साथ अतिरिक्त माप के माध्यम से14,16. iSCAT डेटा, इस प्रकार, सीधे एक दूसरे स्केल16पर सेलुलर स्राव गतिशीलता कल्पना । एक उदाहरण के रूप में, हमने पहले पाया है कि आईजीजी एंटीबॉडी Laz388 secretome के एक प्रमुख अंश हैं और सेल से सीए की दर से जारी कर रहे हैं । १०० अणुओं प्रति सेकंड16. इसके अतिरिक्त, १०० केडीए-१००० केडीए की श्रेणी में फैले अन्य कणों को16कोशिकाओं द्वारा स्रावित किया जाता है. वर्णित विधि आगे कार्यरत हो सकते हैं , उदाहरण के लिए, एक सेल16आसपास के स्राव के स्थानिक एकाग्रता ढाल की जांच, या सेलुलर lysis16के लौकिक गतिशीलता निर्धारित करने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: एक एकल Laz388 कोशिका द्वारा स्रावित प्रोटीन की ठहराव. हिस्टोग्राम पता चलता है प्रोटीन की एक समय अवधि के दौरान १२५ s । कंट्रास्ट मान 1 x 10-4 कंट्रास्ट डिब्बे (नीली पट्टियां) में संचित होते हैं । इस माप के दौरान कुल ५०३ व्यक्ति प्रोटीन की गणना की गई । प्रयोग 10 बार इसी तरह के परिणामों के साथ दोहराया गया था । यह आंकड़ा मैकडॉनल्ड्स, मध्यप्रदेश एट अल से अनुकूलित किया गया है । 16. कॉपीराइट २०१८ अमेरिकन केमिकल सोसायटी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

उपयोगी iSCAT डेटा प्राप्त करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक coverslip सतह पर सही फोकल स्थिति को खोजने की क्षमता है, और, इसके अलावा, समय की लंबी अवधि के लिए इस स्थिति को पकड़ने के लिए । ऐसा करने में विफल व्यापक PSFs, कमजोर iSCAT संकेतों में परिणाम होगा, और बहाव-गतिशीलता विश्लेषण में जुड़े कलाकृतियों । यह पता चला है कि एक साफ, नंगे coverslip सतह पर फोकल विमान ढूंढना एक आसान काम नहीं है के रूप में सतह सुविधाओं के बड़े संदर्भ बीम पृष्ठभूमि के खिलाफ दिखाई नहीं दे रहे है ( चित्रा 4dदेखें) ।

कच्चे iSCAT छवियों अक्सर उत्तेजना स्रोत में wavefront अशुद्धियों से उठता है कि पृष्ठभूमि संकेतों से छिप जाते हैं, और सही इमेजिंग विमान को खोजने के लिए एक की क्षमता में बाधा कर सकते हैं । सक्रिय wavefront घटाव इस मुद्दे को दरकिनार और बाद में एक माप16के दौरान iSCAT ध्यान की निगरानी करने के लिए एक उपयोगी तरीका है । इस को पूरा करने का एक तरीका स्थानिक नमूना मॉडुलन के माध्यम से है । संक्षेप में, एक समारोह जनरेटर लागू आवृत्ति (२९० एनएम आयाम) पर एक स्थानिक नमूना मॉडुलन में जिसके परिणामस्वरूप, पीजो चरण के बाहरी नियंत्रण बंदरगाह के लिए एक ५० हर्ट्ज वर्ग तरंग लागू होता है. तुल्यकालिक कैमरा अधिग्रहण एक ही स्रोत से शुरू हो रहे हैं, और, जब ताला सिद्धांतों में, एक wavefront-क्षतिपूर्ति छवि14,16में परिणाम के माध्यम से संयुक्त । परिणामस्वरूप छवि आमतौर पर coverslip (चित्रा 4e) की सतह किसी न किसी प्रकार से पता चलता है । छोटे सुविधाओं की सफाई के बाद कांच पर शेष ध्यान में माइक्रोस्कोप लाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस सक्रिय पृष्ठभूमि घटाव चरण के लिए उपयोग किए गए पैरामीटर्स फ़्रेम दर, एक्सपोज़र समय या हार्डवेयर के अनुसार परिवर्तित किए जा सकते हैं ।

जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, iSCAT सेटअप (step 1.2.1.) में एक उच्च गुणवत्ता बीम अलगानेवाला के उपयोग की सिफारिश की है, भूत या पतली planar बीम बंटवारे से उत्पंन होने वाले हस्तक्षेप की तरह इमेजिंग कलाकृतियों छवि को प्रभावित करेगा और माप परेशान । चित्रा 7 एक उच्च गुणवत्ता और कम गुणवत्ता बीम अलगानेवाला के बीच एक तुलना से पता चलता है । दोनों कच्चे iSCAT छवियों coverslip कुछ अवशिष्ट कणों से युक्त पर एक ही क्षेत्र दिखा । एक ही iSCAT सेटअप दोनों छवियों को पकड़ने के लिए इस्तेमाल किया गया था, केवल बीम अलगानेवाला विमर्श किया गया था । चित्रा 7a एक मोटा (5 मिमी), AR-लेपित, और कील बीम अलगानेवाला के उपयोग से कैमरे पर गठित छवि से पता चलता है । कील डिजाइन के कारण, बीम अलगानेवाला के पीछे की सतह से प्रतिबिंबित बीम विरोधी है-सामने सतह से उत्पंन प्रतिबिंब के समानांतर और उद्देश्य में प्रवेश नहीं है । कोई हस्तक्षेप कलाकृतियों हो । चित्रा 7b नमूना पर देखने का एक ही क्षेत्र से पता चलता है, लेकिन इस बार एक पतले (1 मिमी) planar बीम अलगानेवाला इस्तेमाल किया गया था । सामने से दो प्रतिबिंब और वापस बीम अलगानेवाला की सतहों समानांतर और कैमरे के लिए प्रचार कर रहे हैं । हस्तक्षेप कलाकृतियों स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं ।

Figure 7
चित्रा 7: उच्च और कम गुणवत्ता वाले बीम बंटवारे के साथ उत्पादित iSCAT छवियों की तुलना. (क) एक 5 मिमी मोटी, ए. आर.-लेपित, और कील बीम अलगानेवाला के उपयोग से कच्चे iSCAT छवि परिणामस्वरूप । (ख) एक 1 मिमी मोटी planar बीम अलगानेवाला के उपयोग से एक ही क्षेत्र के कच्चे iSCAT छवि परिणामस्वरूप । दोनों बीम बंटवारे एक ही विभाजन अनुपात (५०% प्रतिबिंब, ५०% संचरण) है । हस्तक्षेप Fresnel प्रतिबिंब से उत्पंन कलाकृतियों स्पष्ट रूप से 1 मिमी मोटी planar बीम अलगानेवाला के साथ उत्पादित छवि में मनाया जाता है । स्केल बार्स: 2 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

इस प्रोटोकॉल में हम iSCAT के लिए एक व्यापक क्षेत्र रोशनी योजना का वर्णन के रूप में यह तेजी से है, आसानी से एहसास है और एक बड़े क्षेत्र14पर समानांतर संवेदन के लिए अनुमति देता है । एक अंय आम दृष्टिकोण को acousto ऑप्टिक deflectors (AODs) का उपयोग करें और नमूना12,17भर में एक फोकल बीम स्कैन है । इस दृष्टिकोण उच्च गुणवत्ता wavefronts के लिए की आवश्यकता से बचा जाता है, लेकिन पारंपरिक व्यापक क्षेत्र इमेजिंग से अधिक प्रयोग जटिल है । इसके अलावा, फोकल रोशनी की गति AODs के द्वारा सीमित है । वांछित प्रयोगात्मक मापदंडों पर निर्भर करता है, या तो फोकल या व्यापक क्षेत्र रोशनी योजनाओं, सिद्धांत रूप में कर सकते हैं, एक जीवित कोशिकाओं से स्रावित प्रोटीन का पता लगाने के लिए उपयोग किया जा ।

के रूप में प्रोटोकॉल भर में चर्चा की, यह माइक्रोस्कोप के नमूना चरण में पार्श्व यांत्रिक उतार चढ़ाव को कम करने के लिए आवश्यक है. यहां तक कि नमूने की स्थिति में नैनोमीटर विचलन लगातार कैमरा फ्रेम में बदलाव के लिए नेतृत्व और अंतर छवि में महत्वपूर्ण बाहरी शोर पैदा कर सकता है । इसलिए यह एक यांत्रिक स्थिर माइक्रोस्कोप चरण और एक नम ऑप्टिकल तालिका (1.1.1 कदम.) का उपयोग करने के लिए और एक प्रयोग के दौरान ऑप्टिकल पर्दे या पैनलों के साथ सेटअप को कवर करने की सिफारिश की है (३.५ कदम.) ।

एक सक्रिय ध्यान स्थिरीकरण योजना भी दीर्घकालिक माप के लिए विचार किया जा सकता है । इस दृष्टिकोण में, एक दूसरे लेजर कुल आंतरिक प्रतिबिंब (तिर) व्यवस्था में माइक्रोस्कोप में शामिल है, और बाद में एक वृत्त का चक्र photodiode पर छवि । प्रणाली के ध्यान में परिवर्तन का चक्र डायोड पर तिर लेजर स्थान के पार्श्व विस्थापनों में अनुवाद, जो तब पीजो चरण26के z-अक्ष को नियंत्रित करने के लिए एक सक्रिय प्रतिक्रिया पाश में इस्तेमाल किया जा सकता है । दीर्घकालिक ऊर्ध्वाधर बहाव प्रभाव इस प्रकार समाप्त कर रहे हैं ।

कई संशोधनों और विस्तार प्रस्तुत तकनीक के लिए लागू किया जा सकता है विशिष्ट प्रयोगात्मक आवश्यकताओं का पता । उदाहरण के लिए, वाणिज्यिक माइक्रोस्कोप स्टेज मशीन उपलब्ध है कि आसानी से कोशिकाओं के दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए iSCAT माइक्रोस्कोप में शामिल किया जा सकता है । अंय तकनीकों को भी इस तरह के फोकल या तिर प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी17के रूप में iSCAT इमेजिंग, पूरक लागू किया जा सकता है । अध्ययन के तहत प्रणाली पर अनुकूलन करने के लिए, iSCAT स्राव मापन इस तरह के DMEM या DPBS के रूप में अन्य सेल मीडिया में किया जा सकता है, तथापि, यह लेजर प्रकाश के अवशोषण के कारण प्रयोग परेशान कर सकते हैं के रूप में पीएच संकेतक phenol लाल बचा जाना चाहिए. इसके अतिरिक्त, भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) या मानव प्लेटलेट lysate (एचपीएल) की तरह की खुराक प्रोटीन है कि iSCAT का पता लगाने के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । प्रयोग की वांछित संवेदनशीलता के आधार पर, इन की खुराक सूक्ष्म माध्यम से बाहर रखा जाना चाहिए ।

iSCAT प्रकाश तितर बितर करने के लिए एक analyte की क्षमता पर निर्भर करता है-एक संपत्ति है कि सभी प्रोटीन के लिए आंतरिक है-और इस प्रकार स्वाभाविक है विशिष्ट । फिर भी, विशिष्टता के कुछ अंश के रूप में संभव है iSCAT संकेत पैमाने पर प्रोटीन के साथ रैखिक द्रव्यमान14,27,28. यह ऐसे गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) और फाइब्रिनोजेन14,27,28के रूप में मानक प्रोटीन नमूनों, का उपयोग कर एक iSCAT प्रणाली के अंशांकन के लिए अनुमति देता है । वास्तव में, बहुत हाल ही में, युवा एट अल । 28 Piliarik और Sandoghdar14 के काम पर बढ़ा दिया है और पता चला है कि iSCAT के रूप में छोटे के रूप में प्रोटीन के आणविक वजन का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता streptavidin (५३ केडीए) 19 केडीए के सामूहिक संकल्प के साथ और लगभग 5 केडीए की सटीकता. कई पारंपरिक दृष्टिकोण आगे विशिष्टता के एक अतिरिक्त स्तर प्रदान करके iSCAT पूरक कर सकते हैं । एक उदाहरण के रूप में, एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा), और/या अंय सतह संशोधनों, प्रोटीन बाध्यकारी घटनाओं को प्रतिबंधित इतना है कि केवल लक्ष्य प्रोटीन16का पता चला है ।

इस प्रोटोकॉल में, हम वर्णित कैसे iSCAT माइक्रोस्कोप उपदूसरा लौकिक संकल्प16के साथ एकल प्रोटीन स्तर पर सेलुलर स्राव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । तकनीक सामान्य है और किसी भी व्यावसायिक या घर पर निर्मित माइक्रोस्कोप पर कार्यान्वित किया जा सकता है. एकल अणु प्रतिदीप्ति दृष्टिकोण के विपरीत, विधि photobleaching या निमिष प्रभाव से पीड़ित नहीं है, लेकिन यह अभी भी एकल प्रोटीन संवेदनशीलता को प्राप्त करता है । इन सुविधाओं iSCAT के क्षेत्र में एक शक्तिशाली उपकरण बनाने के संवेदन और माइक्रोस्कोपी । भविष्य अनुप्रयोगों ऐसे उत्तेजना या सेलुलर संचार के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के रूप में elucidating जटिल सेलुलर बातचीत पर ध्यान दिया जाएगा ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम मैक्स प्लैंक सोसायटी, एक अलेक्जेंडर-वॉन-पीरु प्रोफेसर, और ड्यूश Forschungsgemeinschaft (सीआरसी ११८१) द्वारा समर्थित किया गया था । हम Laz388 कोशिकाओं और उपयोगी विचार विमर्श के लिए प्रदान करने के लिए Universitätsklinikum Erlangen पर Stefanie Schaffer धंयवाद । हम MPL पर सिमोन Ihloff और maksim द्वारा श्वाब तकनीकी सहायता के लिए धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Item/Device
100x / 1.46 NA objective Zeiss 420792-9800-000 alpha Plan Apochromat oil immersion
20x / 0.4 NA objective Leica 566049 N Plan
Piezo Stage PI P-517k020 3-axis stage with 100x100x10µm range
Diode laser (445 nm) Lasertack PD-01236
Optics/Optomechanics Thorlabs/Newport - lenses, mirrors, posts, mounts
Pinhole Thorlabs P30H
LED light source Thorlabs MCWHL5
Shortpass filter (580 nm) Omega Optical 580SP to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation
Longpass filter (500 nm) Thorlabs FEL0500 to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation
70R/30T beam splitter Newport 20Q20BS.1
Economy beam splitter Thorlabs EBS1 used for the comparison of fringe effects
Wedged plate beam splitter Thorlabs BSW26 used for the comparison of fringe effects
Shortpass dichroic mirror (550 nm) Edmund Optics 66249
8R/92T beam splitter Thorlabs BP108
CMOS camera Photonfocus MV1-D1024E-160-CL for iSCAT aquisition
CMOS cameras Mightex SCE-B013-U for bright field / fluorescence aquisition
Longpass filter (600 nm) Thorlabs FELH0600
Computer Fujitsu Siemens  - Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD
Acquisition Software LabVIEW - LabVIEW 2016 Suite
Analysis Software Matlab - Matlab 2014 Suite
Plasma Cleaner Diener Diener pico
Incubator Binder Model CB
Centrifuge Eppendorf 5810R
Reagent/Material
RPMI 1640 medium Gibco 11835063 without phenol red
HEPES Buffer Solution (1M) Sigma Aldrich 59205C
Cover slides Marienfeld 107052
Glass bottom culture dishes ibidi 81158
Fluorescent Microspheres Invitrogen F8821 used for calibration
Immersol immersion oil Zeiss 444960
Propidium iodide stain Invitrogen R37108
Small pipette tips Eppendorf 30075005
Flexible pipette tips Eppendorf 5242956003
Ethanol, 99.8% Fisher Scientific E/0650DF/15
Sodium hydroxide, pellets Sigma Aldrich 221465 for preparing 0.2M NaOH solution

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References

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इंजीनियरिंग अंक १४१ iSCAT लेबल मुक्त एकल प्रोटीन सेलुलर स्राव इमेजिंग कैटरिंग गतिशीलता वास्तविक समय
iSCAT माइक्रोस्कोपी के माध्यम से कोशिकाओं रहने से स्रावित एकल प्रोटीन की लेबल-मुक्त इमेजिंग
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Gemeinhardt, A., McDonald, M. P., König, K., Aigner, M., Mackensen, A., Sandoghdar, V. Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy. J. Vis. Exp. (141), e58486, doi:10.3791/58486 (2018).

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