Summary
선물이 단일 레이블이 없는 단백질의 실시간 광학 탐지에 대 한 프로토콜으로 그들은 살아있는 세포에서 분 비 됩니다. 이 간섭 산란 (iSCAT) 현미경 검사 법, 다양 한 다른 생물 학적 시스템 및 구성에 적용 될 수 있는 기반으로 합니다.
Abstract
간섭 산란 (iSCAT) 현미경 검사 법, 실시간으로 개별 살아있는 세포에서 분 비 하는 단일 레이블 없는 단백질을 검출 하는 방법 설명 합니다. 이 프로토콜에서 우리는 기본적인 단계를 iSCAT 현미경을 실현 하 고 추가적인 이미징 채널 모니터링 연구에서 세포의 생존 능력을 보완을 커버. 이것 다음, 사용 방법을 단일 단백질의 실시간 탐지에 대 한 그들은 우리는 불멸 하 게 B-세포 선 (Laz388)으로 설명 하는 살아있는 세포에서 분 비 합니다. 현미경 및 샘플의 준비 뿐만 아니라 기록 된 데이터의 분석에 관한 필요한 단계는 설명 합니다. 비디오 프로토콜 그 iSCAT 현미경 검사 법은 단일 분자 수준에서 분 비 공부를 간단한 방법을 제공 하는 방법을 보여 줍니다.
Introduction
분 비 단백질은 다양 한 생리 적 프로세스1에 중요 한 역할을 한다. 이 때문에, 그들은 정기적으로 집단 앙상블 (proteomics) 또는 개별 엔터티2,3공부는. Proteomics는 전통적으로 예를 들어, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험 (ELISA), cytometry, 또는 질량 분석4,5, 특정 생물 학적 시스템에 존재 하는 단백질의 전체 집합을 조사 6. 단일 단백질, 다른 한편으로, 일반적으로 감지 다양 한 형광7,8, 염료9,10또는 저온 전자11 을 기반으로 하는 기법을 사용 하 여 microscopies입니다. 이러한 모든 기술 복잡 한 악기, 라벨, 또는 둘 다 사용 하 고 부족 한 역학 정보로만 연구 시스템에 대 한 장기적인 정보 제공.
여기 iSCAT12,13 현미경 감각 개별 분 비 단백질을 사용 하 여 초 시간적 해상도14. 중요 한 것은, 기술은 모든 단백질12,14본질적인 약한 흩어져 신호를 감지합니다. 작은 bioparticle 없앤다는 빛 양을 그것의 polarizability와 함께 확장 됩니다. 가정 하는 단백질의 형태를 다른 한 효과적인 분산 영역14,15,16, 그리고 그에 의해 접근 수 있습니다. 단백질 매우 비슷한 굴절율, 측정된 된 신호는 직접 수 단백질의 분자량 (MW)에 연결합니다. ISCAT 대비 대 분자량의 측정 기준에 의해 경험적 교정 다양 한 크기의 단백질을 구별할 수 있습니다. iSCAT 실험 쉽게 관심14 의 어떤 단백질의 특정 검색에 대 한 있도록 형광 또는 비 산 레이블 뿐만 아니라 형광 현미경 검사 법17,18, immunosorbent 시 약, 보충 될 수 있다 , 17 , 19.
원칙적으로, iSCAT 보조 참조 파와 간섭 혼합을 통해 단백질의 약한 흩어져 빛을 증폭 하 여 작동 합니다. 검색 된 강도 (
)는 iSCAT에서 현미경에 의해 설명
어디 
사건 강도 
참조 웨이브의 기여에 대 한 계수는 
연구, 나노-개체의 산란 강도 의미와 
는 흩어져 사이 상전이 고 참조 파도14. 두 전송 또는 다시 반영 사건 빛 일반적으로 각각의 경우에 기준 파로 사용 
투과율 또는 반사율 샘플 챔버의 각각 차지. 기간 
단백질의 비 산 크로스 섹션에 비례 하 고 크로스 기간에 비해 무시 될 수 있습니다. 따라서, 설정 
완전 한 파괴 간섭에 대 한 감지 된 빛에 의해 주어진 다 
어디 
참조 강도 및 
간섭 강도.
iSCAT 현미경 단일 분자 수준에 생물학 과정을 공부 하는 우수한 방법을 제공 합니다. 예를 들어, 우리는 Laz388 세포를 조사-엡 스타인-바 바이러스 (EBV) 변형 B 림프 구 세포 선20,21 -로 그들은 IgG 항 체16같은 단백질을 분 비. 그러나, 메서드는 일반 이며 다양 한 다른 생물 학적 시스템에 적용할 수 있습니다. iSCAT은 기본적으로 특정 어떤 단백질을 검출할 수 있다 또는 나노 또는 특정 또는 다중화 검출에 대 한 일반적인 표면 기능화 방법으로 확장할 수 있습니다. 그것의 간명 및 형광 현미경 검사 법, 같은 다른 광학 기술로 결합 될 수 확인 iSCAT 유용한 무료 도구 세포 생물학.
Protocol
주의: 어떤 화학 물질을 사용 하기 전에 모든 관련 물질 안전 데이터 시트 (MSDS)를 읽어 보시기 바랍니다, 모든 적절 한 안전 관행을 관찰 하 고 필요에 따라 개인 보호 장비 (레이저 안전 고글, 눈 보호, 장갑, 실험실 코트)를 착용.
1. 건물 현미경16,18 iSCAT
참고: iSCAT 현미경은 일반적으로 수정 된 거꾸로 한 현미경 설치의 구성 됩니다. 간단히, 레이저는 높은 수 가늠 구멍 (NA) 목표의 후 초점면에 초점을 맞추고와 이미징 렌즈 카메라 칩에 입자의 다시 흩어져 빛을 집중 하는 데 사용 됩니다. 일반적으로, 넓은 필드 현미경이 처음부터 건설 수 있습니다 또는 기존 거꾸로 현미경 기반. 이 프로토콜에 사용 되는 하드웨어 변경이 가능한 하는 동안 설치, 실현 하기 위해 필수적인 단계를 다루고 있습니다. ISCAT 현미경의 어셈블리에 대 한 더 자세한 설명은 아로요 외 의 작품에서 찾을 수 있습니다. 18.
주의: iSCAT 현미경 클래스 IIIB 클래스 4 레이저 광원을 포함 한다. 적절 한 눈 보호 조립 하 고 현미경 광학 정렬 때 필요 하다. 현미경을 조립 하는 동안 레이저 빔 경로 스트레이트 남아 추가 되는 새로운 광학 구성 요소를 반사 하지는 있는지 확인 합니다.
-
현미경의 조명 경로를 설정 합니다.
- 현미경 샘플 단계18 높은 수 가늠 구멍 (NA) 목표를 통합 구축 감쇠 광학 테이블과 엄밀한 금속 블록을 사용 하 여 (100 X 1.46 / 없음) 및 초점의 변화 뿐 아니라 측면 샘플 번역을 허용 하는 번역 단위 목표에 대 한 위치입니다.
참고: 단일 단백질 검출 한계에 iSCAT 현미경의 작업은 외부 진동에 매우 취약 합니다. 모든 면에서 샘플을 지 원하는 centrosymmetric 압 전 단계 그렇지 않으면 초점 및 측면 안정성을 손상 할 것입니다 샘플의 음향 업무가 제한 하는 것이 좋습니다. 그림 1 압 전 번역 단위 및 목표를 포함 하 여 적합 한 샘플 단계를 보여 줍니다. 또한, 다음 단계에서 설명 하는 모든 광학 구성 요소에 대 한 대규모 및 안정적인 마운트 사용 됩니다 것이 좋습니다. 이러한 구성 요소 상용 광학 공급 업체에서 쉽게 사용할 수 있습니다. - 50 cm 초점 거리 내의 렌즈 (렌즈 넓은 필드)와 45 ° (수직) 파장 445 nm는 목표의 후 초점면에 다이오드 레이저의 빛을 초점 거울 커플링을 사용 합니다. 이 조명을된 빔 목표의 앞으로 초점에 만들고 iSCAT 조명 소스 될 것입니다. 필요한 경우, 공간 30 µ m 작은 구멍 또는 단일 모드 광섬유를 통해 50 cm 렌즈 이전 레이저를 필터링 합니다.
- 목표를 침수 오일의 방울을 적용 하 고 유리 coverslip 현미경 무대의 샘플 평면에 배치. 이 영상 목표를 통해 다시 반영 하는 빔 발생 합니다.
참고: 반사 샘플 coverslip의 상부 표면에서 공기 유리 인터페이스에서 발생 하 고 iSCAT 참조 빔에 대 한 기준으로 될 것입니다. 잔여 먼지 또는 먼지는 coverslip의 표면에 산란 포인트 소스 다음 단계에서 이미징 목표의 정확한 초점에 원조를 증가 줄 것 이다.
주의: 레이저 빛의 대다수는 coverslip 통해 전송 하며 똑바로 목표에서. 불투명 한 반사 기관총을 배치 (예., 종이 카드) 레이저 빛에서 상해의 위험을 최소화 하는 coverslip 위에.
- 현미경 샘플 단계18 높은 수 가늠 구멍 (NA) 목표를 통합 구축 감쇠 광학 테이블과 엄밀한 금속 블록을 사용 하 여 (100 X 1.46 / 없음) 및 초점의 변화 뿐 아니라 측면 샘플 번역을 허용 하는 번역 단위 목표에 대 한 위치입니다.
그림 1: iSCAT 샘플 단. 사진은에 압 전 번역 단위 (블랙) 중심으로 100 뿐만 아니라 마운트되어 대규모 알루미늄 블록 목표 x. 3 축 압 전 단계는 목표의 초점면에 샘플의 정확한 위치에 대 한 수 있습니다. 조 악한 초점 (묘사 되지) 목적은 탑재 스레드 튜브를 회전 하 여 실시 됩니다. 블록은 45 ° 커플링 거울 위에 4 개의 강철 받침대는 광학 테이블에 배치 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
-
현미경의 이미지 경로를 설정 합니다.
- 반사 방지 (AR) 소개-넓은 필드 렌즈 후 입사 빔, 그리고 대략 10 cm를 기준으로 45 ° 각도로 빔 스플리터 (70% 반영, 30% 전송) 코팅. 포인트 레이저 소스 쪽으로 아칸소 코팅입니다. 이 입사 빔 전송 참조를 반영 하 고 빔 입사 빔에 90 ° 각도로 흩어져.
참고: 아칸소 코팅 및 근육 빔 스플리터는 권장 상당한 고스팅 및 프린지 효과 빔 분할 큐브, 또는 코팅된 평면 빔 스플리터를 사용 하는 경우 발생할 수 있습니다. 자세한 내용은 토론 을 참조 하십시오. 원하는 경우, 모든 원치 않는 반사 빔 빔 스플리터의 뒷면에서 발생 하는 홍 채 격 막의 사용에 의해 차단 수 있습니다. - 두꺼운 빔 스플리터 레이저를 똑바로 더 이상 목적을 입력할 수 있도록 중요 한 빔 변위를 소개 합니다. 필요한 경우 레이저 빔 경로 목표를 통해 올바른 전파 되도록 빔 스플리터 전에 재개.
참고: 빔 스플리터 넓은 필드 렌즈 전에 추가할 수 있습니다 또한 고 현미경 단계 배치 됩니다 (에서 단계 1.1.2.), 빔 나중 전치 하지 것입니다. - 이 시점에서,는 간섭계의 이미징 팔을 집중 하 고 샘플 비행기와 카메라 parfocal 되는지 확인 하십시오. 장소는 오목 f = 5cm 위치에서-45 cm 렌즈 넓은 필드 렌즈 사고 빔 경로에 후. 이 목표의 다시 조리개를 입력 조명을된 빔 발생 합니다.
- 화면 반사는 간섭계 팔에 배치, 조 악한 초점 위치를 찾을 수 수직 방향으로 목표를 이동 합니다. 목표는 화면을 타격 하는 빔 조명을 때 초점에서입니다.
참고: 그림 2 는이 과정의 회로도 보여준다. - 모두 f 제거 완료 되 면 조 악한 초점-45 cm 렌즈와 화면을 =.
참고: 부정적인 초점 거리 렌즈를 사용 하 여, 대신 넓은 필드 렌즈 자체 수 있습니다 이동식 마운트에 배치 되며,이 단계를 위한 빔 경로에서 이동. 그러나, 가장 안정적인 현미경 구성 달성 하기 위해, 그것 것이 좋습니다 고정된 위치에 넓은 필드 렌즈를. - 두 번째 f 추가 = 50cm 내의 렌즈 흩어져 빛을 집중 하 고 CMOS 카메라의 센서에 반사 된 빛을 당기기. 렌즈 다시 참조 빔 당기기 위하여 흩어져 빛을 초점 목표의 후 초점면에서 50cm 배치 됩니다 확인 하십시오.
- 장소는 CMOS 칩 f에서 50 cm = 50 cm 렌즈 및 직접 칩의 중간에 광속.
참고: 다음 매개 변수는 일반적으로 영상에 대 한 사용 됩니다. 레이저 (파장 445 nm)의 출력을 100으로 설정 됩니다 mW. 작은 구멍 및 빔 스플리터 전송된 빛 감소 목표 입력 효과적인 파워는 약 9 mW. 샘플 위치에 빔 직경 6 µ m에 도달 한다. 사용 된 이미징 렌즈 시스템의 효과적인 확대 약 300 x입니다. CMOS 칩에 있는 이미지의 크기는 128 × 128 픽셀 약 5 × 5 µ m2의 시야에 따른 조명된 영역 내에서 설정 됩니다. 그림 3 은 완벽 하 게 조립된 iSCAT 현미경의 회로도 보여준다.
- 반사 방지 (AR) 소개-넓은 필드 렌즈 후 입사 빔, 그리고 대략 10 cm를 기준으로 45 ° 각도로 빔 스플리터 (70% 반영, 30% 전송) 코팅. 포인트 레이저 소스 쪽으로 아칸소 코팅입니다. 이 입사 빔 전송 참조를 반영 하 고 빔 입사 빔에 90 ° 각도로 흩어져.
그림 2: iSCAT 현미경의 조 악한 초점. 회로도에 초점 시스템을가지고 있도록 광학의 배치를 보여 줍니다. AR 코팅의 뒷면 빔 스플리터 (70/30 학사) 빨간색으로 표시 됩니다. 중요 한 거리는 녹색에 제공 됩니다. 사용 렌즈의 초점 길이 (f) 표시 됩니다. 파란색 점선된 상자에 구성 요소 단계 1.2.6-1.2.7 추가 되었습니다. (다시 수렴 iSCAT 빔 당기기를 사용 하는) 오목 렌즈와 화면 나중에 제거 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: iSCAT 현미경. 회로도 완전히 조립된 iSCAT 현미경을 보여 줍니다. AR 코팅의 뒷면 빔 스플리터 (70/30 학사) 빨간색으로 표시 됩니다. 중요 한 거리는 녹색에 제공 됩니다. 사용 렌즈의 초점 길이 (f) 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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추가 영상 채널을 설정 합니다.
참고:이 섹션의 iSCAT 레이저 형광 현미경을 통해 세포 생존 능력을 모니터링 하 고 밝은 분야 현미경 검사 법을 통해 주변 넓은 지역 관측을 허용 하는 현미경을 다른 이미지 경로 추가 합니다.- 부부는 LED 광원의 출력 (약 500 nm < λ < 580 nm) 긴으로 거리 20 X / 0.4 나 목표, 노력 하 고 측면에 LED 출력의 위치와 초점을 허용 하는 샘플 챔버 위에 기계적 구성 요소를 설치를 샘플입니다.
- LED의 스펙트럼 세포 죽음 마커 (propidium 요오드 화물 (PI))의 구동 범위를 커버 하 고 그것의 형광 (λ > 600 nm)을 방해 하지 않는 출력을 확인 합니다. 광학 필터를 사용 하 여 필요한 경우.
- 위 (와이드-필드)와 더 낮은 (iSCAT) 목표는 동일 선상 되도록 위 목표를 옆으로 이동 합니다. 이것은 더 낮은 목표 아래 화면을 배치 하 고 화면에 전송 된 LED 빛의 강도 극대화 하 여 결정 됩니다. 장소는 λ = 550 nm 짧은 패스 dichroic 거울 (SPDM) 전송된 LED iSCAT 레이저 경로에서 빛을 분할.
- 이 빔 8 %reflective/92% 투과 빔 스플리터 (BS)와 두 개의 채널로 분할. 92% 경로 형광 채널 이며 8% 경로 밝은 필드 이미징에 사용 됩니다.
- F를 사용 하 여 CMOS 카메라에 밝은 필드 채널 이미지 = 5 cm 무색 남자 용 상의 렌즈.
- 이미지는 f를 사용 하 여 별도 CMOS 카메라에 형광 채널 5 c m 무색 남자 용 상의 렌즈와는 λ = = 여기 빛을 차단 하려면 600 nm 긴 통과 필터. 그림 4a 모든 이미징 채널을 포함 하 여 완벽 하 게 조립된 현미경의 회로도 보여준다.
- 부부는 LED 광원의 출력 (약 500 nm < λ < 580 nm) 긴으로 거리 20 X / 0.4 나 목표, 노력 하 고 측면에 LED 출력의 위치와 초점을 허용 하는 샘플 챔버 위에 기계적 구성 요소를 설치를 샘플입니다.
그림 4: 단일 세포에서 분 비 하는 단백질의 iSCAT 현미경 검사 법. (a) 프로토콜에서 설명 하는 현미경의 도식. 자세한 내용은 섹션 1을 참조. 약어: LED, 발광 다이오드; SPF, 짧은 패스 필터; obj, 목표; SPDM, 짧은 패스 dichroic 거울; BS, 빔 스플리터; LPF, 긴 패스 필터; BF, 밝은-필드; 형 석, 형광; C1-C3, 카메라 1-3 (b) 밝은 필드 이미지는 단일의 Laz388 iSCAT 보기 (흰색 사각형으로 표시)에서 약 4 µ m 세포. C3, 카메라로 찍은 이미지 스케일 바: 10 µ m. (c) 형광 이미지는 셀의 위치와 (b)에 표시 된 동일한 영역의 흰색 원으로 표시. 형광의 부재는 휴대 가능한 임을 나타냅니다. C2, 카메라로 찍은 이미지 스케일 바: 10 µ m. (d) 원시 iSCAT 카메라 이미지 스냅샷 80 µs 노출 시간. C1 카메라로 찍은 이미지. (e) iSCAT 이미지 spatiotemporal 배경 빼기 토론 섹션에 설명 된 대로 후 같은 지역입니다. 이미지는 프레임에 걸쳐 1000 순차 원시 (d) 최종 프레임 시간 400 ms의 통합 했다 고 밝혀 유리 coverslip의 표면 거칠기. (f) 해당 차동 iSCAT 이미지는 coverslip에 2 단백질의 바인딩 이벤트를 보여 줍니다. 이미지는 두 개의 연속 필터링 된 이미지 (e)를 빼서 건설 되었다. (D)에 바 확장 (e), 그리고 (f): 1 µ m. 이 그림에서 맥도날드, M.P. 외 적응 되었습니다. 16. 저작권 2018 미국 화학 사회. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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컴퓨터 및 소프트웨어를 설정 합니다.
- 모든 카메라를 컴퓨터에 연결 합니다. 해당 드라이버 패키지를 설치 하 고 그들의 통제를 위한 소프트웨어 얻기/쓰기.
참고: 적합 한 하드웨어는 고속 인수에 필요한. 최소한, 멀티 코어 프로세서, 16GB의 RAM, 프레임 그래버 카드와 데이터 저장을 위한 고체 디스크 것이 좋습니다. - CMOS 카메라에 iSCAT 이미지를 관찰 하 고 그것이 초점에서 유리 coverslip에 잔여 먼지 또는 먼지 입자를 찾는 하 여 확인 합니다. 입자의 이미지는 원형 대칭 지점 확산 기능 (PSF) 인지 확인 합니다.
참고: 비 원형 대칭 PSF에 대 한 주요 이유는 바로 하지만 광 축에 대해 작은 각도에서 레이저 빔을 목표를 입력 하지 않습니다. 이것은 각도 45 ° 커플링 미러 입사 광선의 위치를 조정 하 여 수정 되었습니다. - 밝은 분야 및 형광 채널의 카메라 이미지를 비교 합니다. 둘 다 초점에와 같은 영역을 표시 확인 하십시오. ISCAT 레이저의 위치는 이미지의 중심에서 약 인지 확인 하 고 나중에 참조할 수에 대 한 위치로의 숙지 합니다. 일반적인 카메라 이미지 그림 4b-4 층을 참조 하십시오.
참고: 셀 샘플 또는 형광 구슬 두 채널의 초점을 찾는 데 사용 합니다. 일시적으로 시스템을 조정 하려면 형광 롱 패스 필터를 제거 합니다. 셀의 기존 이미징에 대 한 초점은 iSCAT 초점면 보다 약간 높이 필요가 있다. 목표를 이동 하지 않고이 대 한 보상, 2 개의 각각 f의 초점에 그들의 위치에서 카메라를 치환 = 5 cm 렌즈. - 필요한 카메라 매개 변수를 설정 합니다. 고정된 프레임 속도 사용 하 고 소프트웨어 이득 및 수정 도구를 사용 하지 않도록.
참고: 다음 매개 변수는 사용: iSCAT 카메라 80 µs의 노출 시간 5000 초당 프레임 (fps)로 설정 됩니다. 위에서 설명 했 듯이, 이미지 크기는 128 × 128 픽셀입니다. 밝은 분야와 형광 둘 다 카메라는 풀 프레임 크기 (1280 × 1024 픽셀)에서 작동합니다. 브라이트 필드 이미징 20 ms 노출 시간으로 수행 됩니다. 형광 카메라 750 ms 노출 시간으로 설정 되 고 5 연속 프레임 한 최종 이미지 누적 됩니다. 브라이트 필드 및 형광 이미지는 고정 20 s 시간 간격 획득 됩니다.
- 모든 카메라를 컴퓨터에 연결 합니다. 해당 드라이버 패키지를 설치 하 고 그들의 통제를 위한 소프트웨어 얻기/쓰기.
2입니다. 실험의 준비
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준비 재고 현미경 매체입니다.
- HEPES 버퍼 솔루션의 25 mL를 추가 (1 mol/L) 25 mmol/L HEPES 솔루션의 최종 1 L를 RPMI 1640 매체의 975 ml. 또는 버퍼 매체를 사용 하 여 이미 포함 HEPES와.
참고: HEPES는 주변 조건 (예를 들어, 인큐베이터 외부와 지속적인 공동2 공급 없이)에서 측정 하는 동안 매체의 pH 값을 유지 하는 데 사용 됩니다. - 실험에 필요한 솔루션의 약 수를 받아 고 실 온까지 따뜻하게 하자. 중간의 2 개 mL는 충분 합니다. 4 ° c.에 남은 재고 솔루션을 유지
- HEPES 버퍼 솔루션의 25 mL를 추가 (1 mol/L) 25 mmol/L HEPES 솔루션의 최종 1 L를 RPMI 1640 매체의 975 ml. 또는 버퍼 매체를 사용 하 여 이미 포함 HEPES와.
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현미경 베트를 준비 합니다.
참고: 다음 단계는 알루미늄 베이스 플레이트와 아크릴 멧 요리 하는 coverslip 수정 고 압 전 3D 포지 셔 너 커플 구성 된 사용자 샘플 홀더를 위한 절차를 설명 합니다. 유리 바닥으로 상업적으로 사용 가능한 무 균 문화 요리 또한 사용할 수 있습니다.
참고: 그림 5 에서는 사용자 샘플 홀더의 사진.- 새로운 현미경 coverslip 고 이온된 수 (디-물)과 에탄올으로 그것을 씻어. 공기 건조 질소 또는 가압된 공기 슬라이드.
- 500 W RF 전력에서 10 분 동안 산소 플라즈마 분위기 (0.3 mbar 가스 압력)에 coverslip 청소. 이 표면에서 모든 유기 불순물을 제거합니다.
- 0.2 mol/L NaOH 솔루션 디 물으로 약 10 분 린스에에서 그것을 immersing 하 여 아크릴 베트 접시를 청소 하십시오.
- 샘플 홀더를 조립 하 고 플라스틱 페 트리 접시 실험에 필요한 때까지 그것을 커버.
그림 5: 사용자 샘플 홀더. (a) 샘플 홀더 구성 요소: (1) 아크릴 베트 접시; (2) 알루미늄 베이스 플레이트; (3) 지주 나사; (4) 실리콘 o-링; (5) coverslip입니다. (b) 완전히 샘플 홀더를 조립. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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현미경을 준비 합니다.
- ISCAT 조명 레이저, 밝은-필드/형광 조명 LED, 카메라, 및 수집 컴퓨터/소프트웨어 설정. 목적은 전에 위치에 레이저 광선을 차단 합니다.
- 100 X 확인 / 1.46 나 목적은 깨끗 한. 그렇지 않으면, 렌즈 청소 잎사귀와 에탄올을 사용 하 여 제조 업체의 지침에 따라 목표를 청소.
- 현미경 목표에 집중 오일 한 방울을 적용 합니다.
- (섹션 2.2에에서 조립) 샘플 홀더를 신중 하 게 그것을 마운트 iSCAT 현미경의 압 전 단계에 샘플 coverslip 현미경 목표에 중심을. 세심 하 고 그래서으로 손상 되지 않도록 주의 렌즈를 수 있습니다. 압 전 포지 셔 너 제조업체 지정 최대 토크를 초과 하면서 엄지 나사를 조이십시오.
- 고 멧으로 재고 현미경 매체 (섹션 2.1에서에서 준비.)의 1 mL를 추가 합니다.
- 세포 죽음의 표식16,22로 매체 propidium 요오드 화물 얼룩의 2 방울을 추가 합니다.
- 레이저를 차단 하 고 초점을 시스템을가지고. 먼저, 1.2.3 단계를 반복 하 여 목표는 coverslip에서 정확한 거리에 배치 됩니다 확인 합니다. -1.2.5. (그림 2)입니다. 다음, 압 전 무대의 z 축과 초점 미세 조정.
- 광원, 카메라 및 소프트웨어에 대 한 모든 설정이 올바르게 설정 되었는지 확인 합니다. 레이저 파워, LED 휘도, 카메라 프레임 속도, 카메라 노출 시간, 또는 경로 저장 하는 소프트웨어 같은 매개 변수가 포함 됩니다.
참고: 높은 프레임 속도에서 동영상을 저장 크기가 큰 파일을 생성할 수 있습니다. 컴퓨터에 충분 한 여유 공간이 있는지 확인 합니다. - 다시 레이저 광선을 차단 합니다. 현미경은 이제 실험에 대 한 준비.
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셀을 준비 합니다.
참고: Laz388 셀20 는 RPMI 1640 매체와 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 아미노산, pyruvate, 항생제 보충으로 경작 된 셀에서 37 ° C, 5% CO2 알을 품는 분할 하 고 모든 2-3 일23신선한 매체와 함께 제공 되는.- 인큐베이터에서 세포 배양 플라스 크를 약 1 x 106 셀을 포함 하는 매체를 발음. 올바른 볼륨 확인 하려면 세포 배양의 농도 hemocytometer의 사용에 의해 계량.
- 실 온에서 RPMI 1640 매체의 10 mL와 함께 셀 솔루션을 혼합 하 고 원심 7 분 x 300g에서 샘플.
- 신중 하 게 추출 하 고 집중된 셀의 펠 릿 그대로 유지 하면서는 상쾌한 삭제.
- 2.4.2 단계를 반복 합니다. -2.4.3. 와 셀의 집중된 펠 릿.
- 다시 셀 (섹션 2.1에서에서 준비.) 0.5 mL 재고 현미경 중간에 중단 하 고 즉시 실험에 그들을 사용 하 여.
3입니다. iSCAT 은닉 세포의 현미경 검사 법
- 레이저 빔 셀 iSCAT 레이저 빛에 직접 노출 되지 않도록 차단 되어 있는지 확인 합니다.
- 샘플 베트에 셀을 삽입할.
- 샘플 베트로 셀 샘플 (에 준비 된 섹션 2.4.) 약간 오프 센터의 약 3 µ L를 주사. 부드럽게 하는 coverslip 피 펫 팁 및 셀 솔루션을 천천히 주입. coverslip에 셀 수 있습니다.
참고: 작은 양 피 펫 팁 (10 µ L) 또는 긴, 유연한 젤 로드 팁을 사용 합니다. - 단일 셀 측정 하지 iSCAT 레이저 주변 지역에 있는 여러 세포에 의해 영향을 수 있도록 셀의 밀도 500 µm² 당 약 1 셀 아래 인지 확인 합니다.
- 셀 수가 너무 낮게, 반복 단계 3.2.1 인 경우에. 충분 한 수 수까지.
- 셀의 범위 너무 조밀한 경우에, 추가 현미경 매체의 약 20 µ L의 주사를 사용 하 여 셀에 coverslip 걸쳐 분산.
- 샘플 베트로 셀 샘플 (에 준비 된 섹션 2.4.) 약간 오프 센터의 약 3 µ L를 주사. 부드럽게 하는 coverslip 피 펫 팁 및 셀 솔루션을 천천히 주입. coverslip에 셀 수 있습니다.
- 압 전 위치 확인을 사용 하 여 샘플 셀 가까이 (약 10 µ m) 보기의 iSCAT 필드에 위치를 옆으로 이동 합니다. 445 nm 레이저 빛을 직접 노출 셀에 대 한 유해 될 수 있습니다 셀 보기의 iSCAT 필드를 입력 하지 않습니다 확인 합니다.
- 밝은 분야 및 형광 이미지를 사용 하 여 셀의 생존25를 확인 하는데.
참고: 가능한 셀 둥근 모양 밝은 필드 이미지에 있으며 반면 세포 죽음 셀22내부 propidium 요오드 화물의 존재에서 발생 하는 강한 형광 신호에 의해 형광, 아니다. - ISCAT 레이저 광선을 차단 하 고 여전히 초점에에서 coverslip 표면 인지 확인. 드리프트와 주변 환경에서 음향 결합을 최소화 하기 위해 절연 테이블을 묶습니다.
참고: 후자는 수행 무거운 광 커튼 또는 광학 테이블을 둘러싼 아크릴 패널. - ISCAT, 밝은-필드, 및 형광 카메라에서 이미지를 획득 하 여 측정을 시작 합니다. 자동화 하 고 실험의 효율을 극대화 하는 소프트웨어를 통해 프로세스를 제어 합니다. 주기적으로 세포의 생존 능력 및 시스템의 초점을 확인 합니다.
참고: 레이저 강도, 광학 부품 및 카메라의 노출 시간 설정에 따라 iSCAT 레이저 형광 카메라와 함께 방해 수 있습니다. 이 동작을 관찰 하는 경우에 iSCAT 레이저 형광 이미지 인수 동안 일시적으로 폐쇄 하는 것이 좋습니다.
4. 데이터 분석
참고: 실험 데이터는 본질적으로 시끄러운 그리고 iSCAT 이미지는 다르다. 사고 광원, coverslip, 노이즈와 카메라의 표면 거칠기에 파면 왜곡을 포함 한 일반적인 iSCAT 측정 잡음의 여러 소스가 있습니다. 아래 섹션에서는 이러한 잡음 소스 후 처리를 통해 해결 하는 몇 가지 방법이 합니다. 또한, 설치의 측면 기계적인 불안정성 이어질 시끄러운 데이터와 토론 섹션 아래에 설명 된 대로 따라 해결 되어야 합니다. 기술된 분석 사용자 지정 MATLAB 스크립트 수행 됩니다.
- 높은 공간 주파수를 제외 하는 2 차원 푸리에 필터와 원시 데이터를 필터링 하 여 카메라 노이즈를 최소화 합니다. 필터의 크기 (주로 시스템의 숫자 조리개에 의해 결정 되는) 실험적인 구성에 맞게 조정 될 필요가 있다.
참고: 광학 시스템 보다 더 높은 공간 주파수와 이미지에서 기능 (카메라 읽어 잡음)과 같은 외부 소스에서 발생 한 고 무시 될 수 있습니다. - ISCAT 대비 원시 카메라 카운트에서 이미지를 변환 합니다.
참고: 카메라에 의해 감지 신호는
. iSCAT 대비로 정의 됩니다 
어디 
참조 빛의 강도 coverslip로 부분 반영 하는 경우에 그리고 
사이 방해는 및 흩어져 강도 (
).- 으로 신호를 분리 와 는 관심의 입자는 존재 하는 특정 프레임의 시간 평균을 계산 하 여. 결과 이미지는 기준 신호를 제공 한다 .
참고: 또는, 활성 배경 빼기 단계를 수행할 수 있습니다 아래의 토론에 설명 된 대로. - 에 따라 대비를 계산
12,,1416.
- 으로 신호를 분리
- 그것의 후임에서 각 연속 프레임을 빼서 롤링 차동 이미지를 만듭니다.
참고: 잔여 신호는 coverslip의 표면 거칠기에서 그리고 연속 프레임 내의 일정으로 파면 왜곡 효과적으로이 단계에서 제거 됩니다. 롤링 차동 떠나 다음 한 프레임에서 발생 하는 단백질 바인딩만이 잔여 신호를 제거 합니다. 이 동적 배경 빼기는 유익한 장기 샘플 드리프트를 구분 하지 않습니다. - 감지 하 고 각 프레임에 대 한 단일 입자를 색인 그들의 특정 대조 및 위치 결정 피크 찾는 알고리즘을 적용 합니다.
- 4.4 단계에서 수집 된 정보를 사용 하 여 단백질 바인딩 이벤트의 히스토그램을 만들고 단백질 질량 알려진된 단백질 샘플14,24에서 컴파일된 보정 곡선을 통해 그들의 추출 된 대조 관계.
. iSCAT 대비로 정의 됩니다 
어디 
참조 빛의 강도 coverslip로 부분 반영 하는 경우에 그리고 
사이 방해는 
).
12,,1416.Representative Results
ISCAT 현미경의 회로도 그림 4a에 표시 됩니다. 대표적인 밝은 필드, 형광, 및 원시 iSCAT 이미지 그림 4b, 4c, 4d, 각각16에 표시 됩니다. 배경 제거 및 차동 게시물 처리;의 결과 표시 하는 그림 4e 및 4f 2 흡착된 단백질 그림 4 층관광 명소 회절 제한으로 볼 수 있습니다. 그림 6 125의 과정을 통해 검색 된 단백질의 히스토그램은 s. 이러한 데이터 바인딩 이벤트를 계산 하 고 그들의 대비16카탈로그를 캡처한 이미지에 피크 찾는 알고리즘을 적용 하 여 얻은 했다. 503 단백질의 총 수를 발견 했다.
다음, 분 비 종 순화 된 단백질 솔루션, 또는 기능성된 유리 표면14,16추가 측정을 통해 실시 기준 측정 비교해보면 식별 됩니다. ISCAT 데이터 따라서, 직접 웨이크업하 규모16에 세포 분 비 역학을 시각화. 예를 들어, 우리는 이전 발견 IgG 항 체 Laz388 secretome의 주요 일부와 두 번째16당 ca. 100 분자의 비율로 셀에서 해제 됩니다. 또한, 100 kDa-1000 kDa의 범위를 확장 하는 다른 입자는 세포16에 의해 은닉 된다. 설명된 방법 추가 고용 예를 들어, 셀16주변 분 비의 공간 농도 기온 변화도 조사 하거나 세포 세포의 용 해16의 일시적인 역동성 결정 될 수 있습니다.
그림 6: 단일 Laz388 세포에 의해 분 비 단백질의 정량화. 히스토그램의 125 s. 값 1 x 10-4 대비 쓰레기통 (파란색 막대)에 누적 되는 기간 동안 검색 된 단백질을 보여줍니다. 503 개별 단백질의 총이이 측정 하는 동안 계산 했다. 실험은 유사한 결과 10 번 반복 되었다. 이 그림에서 맥도날드, M.P. 외 적응 되었습니다. 16. 저작권 2018 미국 화학 사회. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
유용한 iSCAT 데이터를 취득 하는 가장 중요 한 측면 중 하나는 coverslip 표면에 그리고, 또한, 정확한 초점 위치를 찾을 수 오랜 시간 동안이 자리를 잡아. 이렇게 하려면 실패 확대 PSFs, 약한 iSCAT 신호 및 드리프트 관련 아티팩트 역학 분석에서 발생 합니다. 그것은 밝혀 깨끗 하 고 맨 손으로 coverslip에 초점 비행기를 찾는 표면 하지 쉬운 작업 표면 특징은 큰 참조 빔 배경으로 ( 그림 4 d참조).
원시 iSCAT 이미지는 종종 여기 소스에 파면 불순물에서 발생 하 고 올바른 이미징 비행기를 찾을 수의 능력을 방해할 수 배경 신호에 의해 왜곡 됩니다. 활성 wavefront 빼기가이 문제를 회피 하 고 이후에 측정16동안 iSCAT 초점을 모니터링 하는 유용한 방법입니다. 이 한 가지 방법은 공간 샘플 변조입니다. 간단히, 함수 발생기 적용된 주파수 (290 nm 진폭)에서 공간 샘플 변조에 따른 압 전 단계의 외부 제어 포트를 50 Hz의 구형 파를 적용 합니다. 동기 카메라 인수 같은 소스에서 그리고, 자물쇠 원리, 파면 보상 이미지14,16결과 통해 결합 될 때 트리거됩니다. 결과 이미지는 일반적으로 표면 거칠기 coverslip (그림 4e)의 보여줍니다. 청소 후 유리에 남아 있는 작은 기능 초점에 현미경을가지고 사용할 수 있습니다. 프레임 속도, 노출 시간, 또는 하드웨어가 활성 배경 빼기 단계에 사용 된 매개 변수를 변경할 수 있습니다.
위에서 설명 했 듯이, iSCAT 설치 (1.2.1 단계.)에서 높은-품질 빔 스플리터를 사용 하 여 것이 좋습니다, 대충 같은 유물을 이미징 또는 얇은 평면 빔 스플리터에서 발생 하는 간섭 영향을 이미지 하 고 측정을 방해. 그림 7 높은-품질과 낮은-품질 빔 스플리터 사이 비교를 보여 줍니다. 두 원시 iSCAT 이미지 일부 잔여 입자를 포함 하는 coverslip에 동일한 영역을 표시 합니다. 동일한 iSCAT 설치는 두 이미지를 캡처하는 데 사용 되었다, 빔 스플리터만 교환 했다. 그림 7a 는 두꺼운 (5 mm), 사용 하 여 카메라에 형성 하는 이미지를 보여줍니다 아칸소 코팅, 및 근육 빔 스플리터. 근육 디자인 빔 스플리터의 뒤 표면에서 반사 된 빔 앞 표면에서 발생 하는 반사 방지 평행 이며 목표 입력 하지. 아니 간섭 유물 발생합니다. 그림 7b 샘플에 보기의 동일한 필드를 표시 하지만이 이번 얇은 (1 mm) 평면 빔 스플리터가 사용 되었다. 빔 스플리터의 정면 그리고 뒤 표면에서 두 반사 병렬 하 고 카메라에 전파. 간섭 유물 명확 하 게 볼 수 있습니다.
그림 7: 비교 iSCAT 이미지의 고품질 및 낮은 빔 스플리터와 생산. 5 m m 두께, 아칸소 코팅, 및 근육 빔 스플리터의 사용 (a) 결과 원시 iSCAT 이미지. (b) 1 m m 두꺼운 평면 빔 스플리터를 사용 하 여 동일한 영역의 결과 원시 iSCAT 이미지. 두 빔 스플리터는 동일한 분할 비율 (50% 반영, 50% 전송). 프레넬 반사에서 발생 하는 간섭 유물 1 m m 두꺼운 평면 빔 스플리터와 이미지에 명확 하 게 관찰 된다. 스케일 바: 2 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
이 프로토콜에서 우리 iSCAT에 대 한 넓은 필드 조명 체계를 설명 하는으로 그것은 빠르고, 실현 하기 쉬운 넓은 지역14이상 병렬 감지에 대 한 허용 합니다. 또 다른 일반적인 접근 acousto 광학 deflectors (AODs)를 사용 하 여 샘플12,17걸쳐 confocal 빔 스캔입니다. 이 이렇게 높은-품질 wavefronts의 필요성을 피할 수 있지만 기존의 넓은 필드 영상 보다 더 실험적으로 복잡. 또한, confocal 조명의 속도 AODs에 의해 제한 됩니다. 원하는 실험 매개 변수에 따라 어느 confocal 또는 넓은 필드 조명 계획, 원칙적, 활용할 수 있습니다 살아있는 세포에서 분 비 한 단백질을 검출 하기 위하여.
프로토콜을 통해 설명 했 듯이, 현미경의 샘플 단계에서 측면 기계적인 동요를 최소화 하기 위해 필수적입니다. 샘플의 위치에도 나노미터 편차 변화 연속 카메라 프레임에 리드 하 고 차동 이미지에 상당한 외부 잡음을 유발 수 있습니다. 따라서 기계적으로 안정 된 현미경 단계와 감쇠 광학 테이블 (단계 1.1.1.)를 사용 하 고 실험 (3.5 단계.) 동안 광 커튼 또는 패널 설치를 커버 것 좋습니다.
활성 포커스 안정화 체계는 또한 장기 측정에 대 한 간주 될 수 있습니다. 이 방법에서는, 두 번째 레이저 총 내부 반사 (사격) 배열, 현미경에 통합 이며 이후 사분면 광다이오드에 몇 군데. 시스템의 초점 변경 사분면 다이오드, 압 전 단계26의 z 축을 제어 하는 적극적인 피드백 루프에 사용할 수 있습니다에 자리 사격 레이저의 수평 변위로 번역. 장기 수직 드리프트 효과 따라서 제거 됩니다.
몇 가지 수정 및 확장 주소 특정 실험적인 요구 제시 기술에 적용할 수 있습니다. 상업적인 현미경 단계 incubators 사용할 수 있습니다 예를 들어 있는 셀의 장기 이미징 iSCAT 현미경에 통합 될 쉽게 수. 다른 기술을 iSCAT 이미징와 같은 보완을 구현할 수도 있습니다 confocal 또는 사격 형광 microscopies17. 그러나 연구, 측정 DMEM 또는 DPBS, 같은 다른 셀 미디어에서 실행 될 수 있다 iSCAT 분 비 시스템에 맞게, pH 지시자 페 놀 레드 피해 야 한다 그것은 레이저 광의 흡수 때문에 실험을 방해 수 있습니다로. 또한, 송아지 태아 혈 청 (FCS) 또는 인간 혈소판 lysate (hPL) 같은 보충 iSCAT 탐지를 방해할 수 있는 단백질을 포함. 실험의 원하는 감도 따라 현미경 매체에서 이러한 보충제를 제외 해야 합니다.
iSCAT는 분석의 수 분산형 빛에 의존-모든 단백질에 본질적인 속성-이며 따라서 본질적으로 일반적인. 그럼에도 불구 하 고, 어느 정도의 특이성 단백질 대량14,,2728와 선형 iSCAT 신호 스케일으로 가능 하다. 이 iSCAT 시스템 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 등 fibrinogen14,,2728표준 단백질 견본을 사용 하 여 교정할 수 있습니다. 사실, 아주 최근에, 젊은 외. 28 Piliarik & Sandoghdar14 의 일에 확장 그리고 19 kDa의 대량 해상도와 정확도 약 5 kDa streptavidin (53 kDa) 작은 단백질의 분자량을 결정 하는 iSCAT를 사용할 수 있습니다 나타났습니다. 여러 가지 기존의 접근 특이성의 추가 레벨을 제공 하 여 iSCAT를 보완 추가 수 있습니다. 예를 들어, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험 (ELISA), 또는 다른 표면 수정으로 대상 단백질만 검출된16되도록 단백질 바인딩 이벤트를 제한 합니다.
이 프로토콜에서 우리 웨이크업하 시간적 해상도16단일 단백질 수준에서 세포 분 비 조사 iSCAT 현미경 검사 법을 사용 하는 방법을 설명 합니다. 기술은 일반 이며 어떤 상업적 또는 집에서 만든 현미경에 구현 될 수 있습니다. 단일 분자 형광 접근 달리 메서드가 photobleaching에서 고통을 하지 않습니다 또는 점멸 효과 하지만 그것은 여전히 단일 단백질 감도 달성. 이러한 기능 바이오 센 싱 및 현미경의 분야에서 강력한 도구 iSCAT 확인합니다. 미래의 응용 프로그램 elucidating 셀룰러 통신 또는 자극에 면역 반응 등 복잡 한 세포 상호 작용에 집중할 것 이다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 맥스 플랑크 사회, 알렉산더 폰 훔볼트 교수와 도이치 가운데 (CRC 1181)에 의해 지원 되었다. 우리 감사 합니다 스테파니 Schaffer Universitätsklinikum 에를랑겐에서 제공 하는 Laz388 세포에 대 한 유용한 토론. 우리 감사 합니다 시몬 Ihloff과 막심 Schwab MPL에서 기술 지원에 대 한.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Item/Device | |||
| 100x / 1.46 NA objective | Zeiss | 420792-9800-000 | alpha Plan Apochromat oil immersion |
| 20x / 0.4 NA objective | Leica | 566049 | N Plan |
| Piezo Stage | PI | P-517k020 | 3-axis stage with 100x100x10µm range |
| Diode laser (445 nm) | Lasertack | PD-01236 | |
| Optics/Optomechanics | Thorlabs/Newport | - | lenses, mirrors, posts, mounts |
| Pinhole | Thorlabs | P30H | |
| LED light source | Thorlabs | MCWHL5 | |
| Shortpass filter (580 nm) | Omega Optical | 580SP | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
| Longpass filter (500 nm) | Thorlabs | FEL0500 | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
| 70R/30T beam splitter | Newport | 20Q20BS.1 | |
| Economy beam splitter | Thorlabs | EBS1 | used for the comparison of fringe effects |
| Wedged plate beam splitter | Thorlabs | BSW26 | used for the comparison of fringe effects |
| Shortpass dichroic mirror (550 nm) | Edmund Optics | 66249 | |
| 8R/92T beam splitter | Thorlabs | BP108 | |
| CMOS camera | Photonfocus | MV1-D1024E-160-CL | for iSCAT aquisition |
| CMOS cameras | Mightex | SCE-B013-U | for bright field / fluorescence aquisition |
| Longpass filter (600 nm) | Thorlabs | FELH0600 | |
| Computer | Fujitsu Siemens | - | Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD |
| Acquisition Software | LabVIEW | - | LabVIEW 2016 Suite |
| Analysis Software | Matlab | - | Matlab 2014 Suite |
| Plasma Cleaner | Diener | Diener pico | |
| Incubator | Binder | Model CB | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Reagent/Material | |||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11835063 | without phenol red |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Sigma Aldrich | 59205C | |
| Cover slides | Marienfeld | 107052 | |
| Glass bottom culture dishes | ibidi | 81158 | |
| Fluorescent Microspheres | Invitrogen | F8821 | used for calibration |
| Immersol immersion oil | Zeiss | 444960 | |
| Propidium iodide stain | Invitrogen | R37108 | |
| Small pipette tips | Eppendorf | 30075005 | |
| Flexible pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Ethanol, 99.8% | Fisher Scientific | E/0650DF/15 | |
| Sodium hydroxide, pellets | Sigma Aldrich | 221465 | for preparing 0.2M NaOH solution |
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