Summary
في هذه الدراسة، نقدم على بروتوكول فعال لعزل الخلايا الليمفاوية ورواية من البقع في بير (PPs)، التي يمكن أن تستخدم بعد ذلك لفحوصات الوظيفية في الجسم الحي وفي المختبر ، فضلا عن دراسات سيتوميتريك تدفق من تي جرابي مساعد وخلايا مركز جيرمنال ب.
Abstract
في مخاطية القناة الهضمية، تشكل الخلايا المناعية كيان مناعية فريدة، التي تعزز التسامح المناعي بينما وفي الوقت نفسه منح الدفاع محصنة ضد مسببات الأمراض. ومن الثابت أن البقع في بير (PPs) دوراً أساسيا في شبكة المخاطي محصنة باستضافة عدة المستجيب T وخلية بمجموعات فرعية. شريحة معينة من هذه الخلايا المستجيب، ومساعد تي الحبيبي (طفح) ومركز جيرمنال (GC) ب الخلايا هي إضفاء الطابع المهني في تنظيم الحصانة humoral. ومن ثم فإن وصف هذه المجموعات الفرعية خلية داخل المركز الصحفي من حيث التمييز بين البرنامج والخصائص الوظيفية يمكن أن توفر معلومات هامة حول حصانة المخاطي. وتحقيقا لهذه الغاية، سيكون طريقة المطبق بسهولة وكفاءة واستنساخه من اللمفاويات في معزل عن المكتب الصحفي قيمة للباحثين. في هذه الدراسة، ونحن تهدف إلى إيجاد وسيلة فعالة لعزل الخلايا الليمفاوية من المكتب الصحفي للماوس مع خلية عالية الغلة. نهجنا كشفت أن النسيج الأولية المعالجة مثل استخدام الكواشف الجهاز الهضمي والتهيج الأنسجة، فضلا عن الخلية المصبوغة الظروف واختيار لوحات جسم، يكون له تأثير كبير على نوعية وهوية لمفاوية معزولة وعلى النتائج التجريبية.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول تمكن الباحثين كفاءة عزل السكان اللمفاويات من المكتب الصحفي للسماح بتدفق استنساخه التقييم القائم على الخلوي لمجموعات فرعية تي وخلية بتركز أساسا على مجموعات فرعية خلية طفح وب GC.
Introduction
هو زينت الجهاز الهضمي كامل من البداية إلى النهاية مع شبكة اللمفاوية واسعة النطاق الذي يحتوي على الخلايا المناعية أكثر من أي جهاز في الإنسان والفأر1. بير بقع (PPs) تشكل عنصرا رئيسيا لفرع هذه المنظمة المناعية الخلوية، ما يسمى الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالقناة الهضمية (جالت)2،3في الأمعاء. داخل المركز الصحفي، آلاف ملايين مستضدات المشتقة من المواد الغذائية، الحجمية commensal ومسببات الأمراض التي يتم أخذ عينات باستمرار، وعندما تكون الاستجابات المناعية المناسبة اللازمة تجاهها المناعة المعوية وبالتالي الحفاظ على محمل التوازن. وفي هذا المعني، ذكر المكتب الصحفي يمكن أن يطلق عليه اسم "اللوزتين الأمعاء الدقيقة". ذكر المكتب الصحفي تتكون من الأقسام الفرعية الرئيسية: قبة سوبيبيثيليال (SED)، مناطق المسام ب-خلية كبيرة؛ السطحية المرتبطة جريب ظهارة (FAE) ومنطقة إينتيرفوليكولار (أي إف آر) حيث تكون خلايا تي يقع4. ويمنح هذا التقسيم الفريد من المكتب الصحفي المستجيب مختلفة تمكن الخلية مجموعات فرعية للتعاون، وبالتالي، السيلينيوم في القناة الهضمية.
ذكر المكتب الصحفي انعدام اللمفاوي الزبائ، ونظرا لهذا السبب، يجري المستضدات تنقل إلى الصحفي من الأمعاء لا عن طريق الأوعية اللمفاوية خلافا لمعظم الأجهزة اللمفاوية الأخرى. بدلاً من ذلك، الخلايا الظهارية المتخصصة الموجودة في صناديق النشاط الخاص، ما يسمى م الخلايا، المسؤولة عن نقل المستضدات لومينال إلى الصحفي5. وفي وقت لاحق، يتم انتقاؤها المستضدات المنقولة بالخلايا الجذعية (DCs) والبالعات التي تقع في منطقة قبة سوبيبيثيليال (SED) تحت6،FAE7. عملية الفرز هذه مستضد بوحدات تحكم المجال Dc في PP أمر حاسم لبدء الاستجابة المناعية التكيفية8 والجيل اللاحق من الخلايا المبيضي إيغا9.
نظراً للعبء الثقيل مستضدي من كومينسال النباتات والمواد الغذائية، المضيف الصحفي اندوجينوسلي المنشط المستجيب T وخلية بمجموعات فرعية في وفرة كبيرة مثل طفح وب GC إيغا+ الخلايا10، مما يوحي بأن المكتب الصحفي تمثيل موقع للمناعة النشطة 11من الاستجابة. كشف ليصل إلى 20-25% طفح خلايا CD4 مجموع+ تي الخلية المقصورة ويصل إلى 10 – 15% ب GC الخلايا داخل الخلايا ب المجموع هو ممكن في المكتب الصحفي لجمعها من الفئران C57BL/6 الشباب المطعمين12. خلافا لسائر أنواع الخلايا مساعد تي (أي.، Th1، Th2، خلايا Th17)، تظهر الخلايا طفح انتحاء فريدة من نوعها في المسام خلية باساسا بسبب التعبير CXCR5، الذي يعزز طفح الخلية صاروخ موجه على طول التدرج CXCL1313. في مناطق المسام خلية ب PPs، حمل الخلايا طفح جزئ تبديل فئة إيغا وهايبرموتيشن جسدية في تنشيط الخلايا ب من التي تميز عالية تقارب إيغا إنتاج خلايا14. وفي وقت لاحق، هذه الخلايا البلازما إفراز جسم تهاجر إلى بروبريا الصفيحة (ليرة لبنانية) وتنظيم التوازن المناعي في الأمعاء10.
تحديد وتوصيف طفح وب GC السكان خلية داخل المركز الصحفي قد تمكن الباحثين من التحقيق في ديناميات خلطيه الاستجابات المناعية تحت ظروف حالة ثابتة دون الحاجة إلى نماذج التحصين مضيعة للوقت تستخدم تقليديا في "ب" طفح-GC خلية الدراسات15،16،،من1718. تحليل الخلايا طفح داخل المكتب الصحفي غير مباشرة كمجموعات فرعية خلية أخرى. وتشمل التحديات التقنية تحديد الأنسجة مثالية إعداد الشروط، سطح جسم-علامة الجمع، فضلا عن تحديد الضوابط المناسبة الإيجابية والسلبية. حقول البحث طفح و PP يحمل تقلبات كبيرة من حيث الإجراءات التجريبية وهي أبعد ما تكون عن منح توافق في آراء وضع بروتوكولات موحدة لأسباب عدة. أولاً، يميل كل خلية فرعية داخل المكتب الصحفي خلطات متأثرة بظروف إعداد الأنسجة التي تحتاج إلى مزيد من التعديلات في طريقة فرعية محددة خلية. ثانيا، هناك اختلاف كبير بين طرق الإبلاغ عنها فيما يتعلق بتفاصيل إعداد الخلية من "لالصحفي. الثالثة"، العدد الدراسات المقارنة على أساس بروتوكول التحقيق تقنيات إعداد الأنسجة مثالية والظروف التجريبية PP وطفح البحث محدودا نوعا ما.
الدراسات الحالية المستندة إلى بروتوكول اقترح PP خلية إعداد19،20،21،22 لم تكن طفح-أو GC المنحى الخلية ب. وعلاوة على ذلك، تم العثور على بعض شروط إعداد الأنسجة الموصى بها للصحفي19،20 مثل الهضم المستندة إلى كولاجيناز تؤثر على نتائج تحديد الهوية طفح بالتدفق الخلوي سلبا على18. وعلى هذا الأساس، نحن مسبب أن بروتوكولا الأمثل وموحد وقابل لإعادة الإنتاج التي يمكن استخدامها لدراسة ديناميات خلية طفح وب GC داخل المكتب الصحفي قيمة بالنسبة للمحققين الذين يعملون على هذا الموضوع. هذه الحاجة أعطانا الحافز لتوليد بروتوكولا محسنة وحديثة لعزل وتوصيف لمفاوية PP ناعما محسن لاسترداد الخلوي وصلاحية وكفاءة لتدفق سيتوميتريك توصيف عدة تي وب مجموعات فرعية من الخلية. نحن تهدف أيضا إلى استبعاد عدة خطوات إعداد شاقة اقترح في البروتوكولات السابقة، وبالتالي الحد من التلاعب المطلوب والوقت لإعداد الخلايا والأنسجة من المكتب الصحفي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت جميع الدراسات والتجارب المبينة في هذا البروتوكول بموجب المبادئ التوجيهية وفقا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (IACUC) من بيت إسرائيل ديكونيس الطبي.
1-تصميم الإعداد التجريبية والمجموعات الماوس
- (اختياري) شارك بيت الفئران التجريبية لتيسير انتقال أفقي للقناة الهضمية الحجمية بين الفئران التجريبية، والحد من التقلبات غير محددة داخل الخلايا اللمفية PP. بالإضافة إلى ذلك، استخدام عناصر تحكم ليتيرماتي من نفس الجنس للحد من التقلبات.
2-الجراحي وخطوات إعداد الأنسجة:
- الاستئصال الجراحي للامعاء (SI)
- Euthanize الفئران استخدام الخنق2 CO أو أي طريقة مناظرة أقرته لجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية.
- نقل الماوس إلى منطقة مخصصة للاستئصال الجراحي. وضع المؤخر لأسفل وتطهير البطن مع الإيثانول 70%. القيام فتح البطن بقطع الجلد البطن والصفاق على طول خط الوسط من العانة إلى القفص الصدري مما فتح التجويف الصفاقى.
ملاحظة: تنفيذ الشق الأول على مساحة صغيرة نسبيا من الجلد لتجنب اختراق التجويف الصفاقى وإلحاق أضرار بالانسجة المعوية. مواصلة الختان حتى الحدود التشريحية المرجوة. - تحديد الأعور، الذي هو معلما مثاليا للكشف عن الدقاق المحطة الطرفية، الذي يشكل الجزء الأعلى من الأمعاء الدقيقة.
ملاحظة: يوجد الأعور عادة في الجانب الأيسر السفلي من البطن الماوس. - تحديد تقاطع إيليوكايكال وجعل خفض هذا المستوى القاصي كما قدر الإمكان فصل الأعور الأمعاء. في جميع أنحاء الخطوات المقبلة، تجنب الاتصال الجسدي المفرط مع جدار الأمعاء للصحفي هشة تنهار بسهولة عند اللمس.
- إزالة بلطف الأمعاء الدقيقة أكمله حتى مصرة البواب بقطع مساريق استخدام مقص. تحديد نقطة التقاء بين بواب والاثني عشر، وقص العفج على هذا المستوى، مما يؤدي إلى إكمال مفرزة من الأمعاء الدقيقة من تجويف البطن.
ملاحظة: (ط) تجنب فرط كهذا قد يسبب تمزق جدار الأمعاء. (ثانيا) إذا كان المطلوب هو عزل اللمفاويات ليرة لبنانية بالإضافة إلى الخلايا الليمفاوية PP، من الضروري إزالة كاملة من الدهون المساريقي العلوي. بيد لعزل PP فقط، تبقى الدهون المساريقي العلوي يمكن أن توفر بعض الفوائد خلال الخطوات العزل؛ ولذلك، ينبغي الحفاظ عليها. - مكان فصل الأمعاء الصغيرة في لوحة 6-بئر مليئة ربمي الباردة + 10% مصل بقرى الجنين (FBS) ولطف تحرض الأنسجة يدوياً حتى جميع شرائح المعوية مغمورة في وسائط الإعلام الباردة. المحافظة على الأنسجة على الجليد في جميع أنحاء الخطوات المقبلة.
- بعد تشريح العدد المطلوب من الأمعاء الصغيرة الماوس، انتقل إلى الختان PP من الأمعاء الصغيرة التي تم جمعها.
- الاستئصال الجراحي للصحفي، وإعداد تعليق خلية مفردة:
- بلطف نقل الأمعاء على منشفة ورقية التي تجتاح الدهون المساريقي العلوي باستخدام الملقط والجانب المساريقي العلوي تواجه منشفة ورقية. ترطيب الجزء معوي كامل مع الباردة ربمي + 10% FBS لتجنب جفاف الأنسجة والالتصاق.
ملاحظة: المتبقية الدهون المساريقي العلوي يمكن أن تكون مفيدة في هذه المرحلة نظراً لشرائح الأنسجة الدهنية في موقع سي المساريقي العلوي سوف تتمسك بمنشفة ورقية حفظ الموقع المساريقي العلوي المضادة مواجهة. - تحديد الصحفي، الذي يظهر كمجاميع متعددة لوبولاتيد الأبيض في شكل "قرنبيط-مثل" على الجانب مضادة المساريقي العلوي لجدار الأمعاء.
ملاحظة: لا يوصي فلاشينغ مضمون لومينال حتى هي اقتطعت الصحفي جميع. إفراغ محتوى لومينال قد يتسبب في انهيار المركز الصحفي وسيمنع تباين اللون بين الصحفي وجدار الأمعاء، ومفيدة جداً لتحديد الهوية البصرية للمركز الصحفي. - بعد تحديد المركز الصحفي في الجهة المضادة المساريقي العلوي، مكان مقص منحنى نهاية العمليات الجراحية على الصحفي (منحنى ينبغي مواجهة) تقييد PP من الحدود البعيدة والقريبة.
اختياري: دفع PP بلطف نحو ريش مقص باستخدام الإصبع. هذه المناورة سيؤدي إلى استبعاد أفضل غير PP الأنسجة المحيطة. المكوس الصحفي بلطف، باستثناء الأنسجة المعوية المحيطة.
ملاحظة: (ط) هذه الخطوة أمر حاسم للحصول على PP خلية الغلة القصوى مع التقليل من تلوث الخلية المجاورة المقصورات المعوية مثل ليرة لبنانية وظهاره الأمعاء، وأيضا غنية بالخلايا T. (ثانيا) من أحد SI اقتطعت من الماوس C57BL/6، يمكن جمعها الصحفي 5-10 (متوسط الحجم، لوبولاتيد متعددة). بهدف المركز الصحفي حتى أصغر (لا لوبولاتيد متعددة)، جمع يصل إلى الصحفي 12-13 للماوس (C57BL/6) من الممكن استخدام هذا البروتوكول. - نقل الصحفي قصت لوح زراعة الأنسجة 12-بئر مليئة بالجليد ربمي + 10% FBS وحافظت على الجليد باستخدام الملقط أو المقص الجراحي منحنية.
ملاحظة: (ط) فورا بعد الختان للمركز الصحفي، مخاط ومحتوى الأمعاء على سطح PP يمكن تنظيفها بفرك الأنسجة بلطف في منشفة ورقية. هذه الخطوة ستساعد على تحسين جدوى لمفاوية PP. (ثانيا) بدلاً من نقل المكتب إلى لوحة، نقل إلى فصل أنابيب يمكن أيضا اعتبار تبعاً لعدد العينة الكلية. - اختياري: عند إتمام الختان PP وإيداعه لاحقاً في لوحة جيدا، عدد وحجم المكتب الصحفي لتجمع من مجموعات تجريبية مختلفة/الماوس يمكن توثيقها بالتقاط صورة للوحة زراعة الأنسجة التي تحتوي على ذكر المكتب الصحفي.
- إعداد مجموعة من أنابيب مخروطية 50 مل مليئة 25 مل ربمي + 10% FBS (استعد مسبقاً عند 37 درجة مئوية). باستخدام مقص، قطع حافة تلميح ميليلتر 1,000 من المسافة التي سوف تسمح لتطلع الصحفي مع ماصة 1 مل. نضح الصحفي مع ماصة 1 مل ونقلها من لوحة 12-جيدا زراعة الأنسجة بالأنابيب المخروطية استعداد 50 مل.
ملاحظة: استخدام تلميح جديد لكل عينة الماوس لتجنب التلوث المتبادل بين العينات. - تأمين الغطاء ووضع الأنابيب عمودياً في شاكر مداري في 37 درجة مئوية، مع التحريك المستمر في 125 – 150 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. ومن ناحية أخرى، إعداد مجموعة جديدة من أنابيب 50 مل ووضع مصفاة خلية 40 ميكرومتر على رأس كل أنبوبة، سيتم من خلالها إعداد تعليق خلية مفردة.
ملاحظة: الخطوة الانفعالات (ط) سوف إزالة الأنقاض المحتوى والمخاط والخلايا المعوية المتبقية، التي تقلل من بقاء الخلية والانتعاش لمفاوية PP إذا لم إزالتها. (ثانيا) لا تنطبق أي نوع من إنزيمات الجهاز الهضمي في الأنسجة PP لعملية الهضم يسبب خسارة هائلة في التعبير CXCR5 من سطح الخلية. - بعد الانفعالات، نقل ذكر المكتب الصحفي مصفاة خلية 40 ميكرومتر وضعت على رأس هذه الأنابيب المخروطية أعدت حديثا 50 مل. استخدام الجانب مقربة من المكبس حقنه 10 مل، بلطف تعطيل الصحفي من خلال مصفاة الخلية لتوليد تعليق خلية مفردة. شطف في المصفاة مع 15 – 20 مل من البرد ربمي + 10% FBS.
ملاحظة: (ط) قبل التصفية، اهتز الأنابيب التي تحتوي على الصحفي أفقياً. هذا يهز قصيرة ستسهل نقل الصحفي إلى مصافي الخلية. (ثانيا) باستخدام مصفاة خلية 70 ميكرومتر لعزل الخلايا المناعية غير اللمفاوية (مثلاً.، وحيدات، الضامة، وحدات تحكم المجال Dc) ينصح. - الطرد المركزي من تعليق خلية مفردة في 350-400 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
- وتجاهل المادة طافية بعناية ريسوسبيند الخلايا بتركيز 10 × 106 خلايا/مل. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير.
ملاحظة: (ط) قبل أن عد الخلايا، خلية الإجمالي لكل مجموعة الماوس PP يمكن تكون تقريبا يقدر العدد استخدام الصيغة التالية: "0.5-1 × 106 خلايا x (عدد PPs) = مجموع الخلايا". قد يكون من الضروري تخفيف المزيد مع تريبان الأزرق لخلية العد. (ثانيا) كبديل للعد اليدوي، يمكن استخدام عدادات خلية الآلي. - نقل 2-2.5 × 106 خلايا في المجلد المناسب (على سبيل المثال., 200 ميليلتر) في لوحة 96-بئر مستديرة القاع.
ملاحظة: لعينات المراقبة السلبية ولون واحد، قد يكون 0.5-1 × 106 خلايا كافية. - الطرد المركزي اللوحة في 350 غ س لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نفض الغبار اللوحة.
- تغسل الخلايا في 200 ميليلتر "تلطيخ المخزن المؤقت".
- بلطف نقل الأمعاء على منشفة ورقية التي تجتاح الدهون المساريقي العلوي باستخدام الملقط والجانب المساريقي العلوي تواجه منشفة ورقية. ترطيب الجزء معوي كامل مع الباردة ربمي + 10% FBS لتجنب جفاف الأنسجة والالتصاق.
3-سطح جسم تلطيخ
- تلوين صلاحية:
- بعد الغسيل النهائي، ريسوسبيند الخلايا في 100 ميكروليتر من صبغة الجدوى يمكن حلها المخفف في برنامج تلفزيوني (1:1، 000). احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد أو عند 4 درجة مئوية في الظلام.
ملاحظة: تلطيخ (ط) داخل الخلايا للكشف عن النسخ الرئيسية عوامل مثل Foxp3 أو Bcl-6 يتطلب تثبيت الخلايا. وفي هذه الحالة، الأصباغ البقاء غير يمكن حلها (مثلاً.، 7-عاد DAPI) لا يمكن استخدامه. (ثانيا) لتمييع صبغ صلاحية يمكن حلها، لا تستخدم أي المصبوغة من المخزن المؤقت الذي يحتوي على البروتين. الوسائط المستخدمة في هذه الخطوة يجب أن تكون خالية من البروتين. (ثالثا) استبعاد الخلايا الميتة باستخدام تلطيخ البقاء حاسم للخلايا الميتة يمكن أن يسبب صعوبات تقنية خطيرة في التحليل الخلوي التدفق التي تنبعث منها أوتوفلوريسسينسي، وربط الأجسام المضادة السطحية نونسبيسيفيكالي، الذي قد يؤدي إلى خطأ نتائج إيجابية. - تغسل الخلايا مرتين مع تلطيخ المخزن المؤقت. أجهزة الطرد المركزي في 350 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نفض الغبار اللوحة.
- بعد الغسيل النهائي، ريسوسبيند الخلايا في 100 ميكروليتر من صبغة الجدوى يمكن حلها المخفف في برنامج تلفزيوني (1:1، 000). احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد أو عند 4 درجة مئوية في الظلام.
- كتلة fc والسطحية-الطبقة الأولى:
- إعداد الحل Fc-كتلة بتمييع الأجسام المضادة-CD16/32 (1: 200) في تلطيخ المخزن المؤقت.
- ريسوسبيند الخلايا في 20 ميكروليتر من استعداد نادي كتلة الحل. احتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد.
- دون الغسيل، إضافة 80 ميكروليتر من سطح جسم كوكتيل (انظر الجدول 1 لجسم موجزة) أعد في تخفيف مناسبة. تبني على الجليد لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- تغسل مرتين عن طريق إضافة المخزن المؤقت المصبوغة المفرط. أجهزة الطرد المركزي في 350 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نفض الغبار اللوحة.
- السطح-الطبقة الثانية:
- تحضير حل Streptavidin المصبوغة بتمييع مترافق fluorochrome Streptavidin في المخزن المؤقت المصبوغة.
- بعد الغسيل النهائي، ريسوسبيند الخلايا تلطيخ الحل مع 100 ميكروليتر من ستريبتافيدين قبل المخفف (1: 100). احتضان لمدة 15 دقيقة على الأقل في الجليد في الظلام.
- تغسل مرتين تلطيخ المخزن المؤقت. أجهزة الطرد المركزي في 350 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نفض الغبار اللوحة.
اختياري: إذا تلطيخ داخل الخلايا للكشف عن خلية T التنظيمية الحبيبي هو غير مرغوب فيه، بعد الغسيل الأخير، ريسوسبيند الخلايا في 200 ميكروليتر من تلطيخ المخزن المؤقت ونقل إلى أنابيب مناسبة للحصول على البيانات في تدفق سيتوميتير. عند العينات ليست ثابتة، ينبغي إجراء الحصول على البيانات بالتدفق الخلوي داخل ح 3 – 4 للحصول على نتائج دقيقة.
4. تثبيت الخلية
- إعداد التثبيت/بيرميبيليزيشن (إصلاح/بيرم) العامل الحل باستخدام الكواشف من Foxp3/النسخ "عامل تلطيخ المخزن المؤقت تعيين". خلط جزء واحد من التثبيت/بيرميبيليزيشن التركيز مع ثلاثة أجزاء من التثبيت/permeabilization مادة إلى الحجم النهائي المطلوب.
- بعد الغسيل النهائي، ريسوسبيند الخلايا في 200 ميكروليتر من الإصلاح/بيرم العامل الحل.
- احتضان صفيحة الجليد أو عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. لا تتجاوز 20 دقيقة لهذه الخطوة. قد يقلل فترة حضانة أطول شدة استرداد الخلية.
- أجهزة الطرد المركزي في 350 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نفض الغبار اللوحة. (اختياري) بعد هذه الخطوة، يمكن تخزين خلايا ثابتة لعدة أيام في 4 درجات مئوية في تلطيخ مخزن يحتوي على ألبومين المصل البقري (BSA) أو FBS حتى اللاحقة داخل الخلايا تلطيخ أو التدفق الخلوي اقتناء.
- ريسوسبيند الخلايا في 200 ميكروليتر من بيرميبيليزيشن المخزن المؤقت (x1) الطازج المخفف مسبقاً في تنقية المياه.
- الطرد المركزي في 350 غ س لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
- أغسل مرة واحدة مع 200 ميكروليتر permeabilization المخزن المؤقت والطرد المركزي في 350 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت
5-داخل الخلايا تلطيخ
- إعداد الحل Fc-كتلة بتمييع الأجسام المضادة-CD16/32 (1: 200) في المخزن المؤقت بيرميبيليزيشن.
ملاحظة: بعد الخطوة التثبيت، الخلايا يجب الاحتفاظ في المخزن المؤقت بيرميبيليزيشن حتى نهاية عملية المصبوغة داخل الخلايا. - بعد الغسيل النهائي، ريسوسبيند الخلايا في 20 ميكروليتر من حل كتلة Fc. احتضان لمدة 10 – 15 دقيقة في RT في الظلام.
- دون الغسيل، إضافة 80 ميكروليتر من داخل الخلية جسم كوكتيل (100 ميكروليتر الحجم النهائي) المخفف مسبقاً في المخزن المؤقت بيرميبيليزيشن. احتضان لمدة 30 دقيقة في الرايت
- إضافة 100 ميكروليتر من "المخزن المؤقت بيرم"، وأجهزة الطرد المركزي في 350 غ س لمدة 5 دقائق في الرايت
- أغسل مرة واحدة مع 200 ميكروليتر permeabilization المخزن المؤقت، والطرد المركزي في ز 350 x لمدة 5 دقائق في الرايت
- بعد الغسيل النهائي، ريسوسبيند الخلايا في 200 ميكروليتر من تلطيخ المخزن المؤقت ونقل الخلايا في أنابيب مناسبة (الحجم النهائي ميكروليتر 400 في المخزن المؤقت المصبوغة) والحصول على البيانات بالتدفق الخلوي. كما يمكن تشغيل عينات الملون في لوحة 96-جيدا دون نقل إلى أنابيب إذا كان متوفراً cytometer تدفق مع خيار قارئ لوحة. هذه الخطوة يقلل من فقدان الخلية أثناء نقل الخلية.
- الحصول على حد أدنى من 5 × 105 مجموع الخلايا في سيتوميتير تدفق ليتمكن من القيام بتحليل استنساخه من طفح، معدل الخصوبة الإجمالي، فضلا عن خلايا ب GC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
على النقيض من بروتوكول سابق20، لاحظنا أن الصحفي ليست موزعة بالتساوي سي ولكن المترجمة أكثر كثافة نحو الغايات البعيدة والقريبة من الدولية الاشتراكية كما هو موضح في الشكل 1A. وأظهر تحليل تدفق سيتوميتريك، إذا اتبعت بشكل صحيح، لدينا بروتوكول يعطي سكان لمفاويات PP الذي يوضح توزيع المبعثر إلى الأمام--الجانب شبيه سبلينوسيتيس (الشكل 2 أ، ه، و 2D، ح) مع > خلية 95% صلاحية (الشكل 2 و 2 واو). خلافا لأجهزة اللمفاوية الثانوية (سلوس)، في الفئران C57BL/6 حوالي 70-80 في المائة من مجموع PP لمفاوية تتكون من خلايا ب، بينما خلايا CD4+ تي الخلايا تشكل فقط 10-15% من مجموع الخلايا الليمفاوية PP (الشكل 2 و 2 ز).
يرجى ملاحظة أن CD4+ CD19+ الخلايا إيجابية مزدوجة (DP) تشكل ≈ 1% من مجموع الخلايا الليمفاوية PP. مع بعض الاحتياطات أثناء إعداد الخلية مثل أداء Fc-كتلة ضد مستقبلات Fc خلايا ب واستثناء doublets، خلايا CD4+ CD19+ DP السكان خلية يمكن تصغير (الشكل 3 أ وب). بيد أن جزءا صغيراً الحقيبة التي لا تثبت المبعثر إلى الأمام (FSC) خصائص doublets أمر لا مفر منه وينبغي أن بوابات الخروج من البوابات T وخلية بايجابيه واحدة (الشكل 3B). كشفت النتائج التي توصلنا إليها أن الخلايا ب داخل الخلايا DP CXCR5 صريح جداً على سطحها (الشكل 3) التي يمكن أن تؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة في بوابة طفح التي يتم تعديلها استناداً إلى التعبير CXCR5 في خلايا CD4+ تي الخلايا. من ناحية أخرى، وجدنا أن GL7، علامة على تنشيط الخلايا باء، أعرب في خلايا CD4+ CD19+ DP الخلايا (الشكل 3D)، التي قد تتسبب في حدوث تداخل مع النابضة الخلية ب GC.
أمثلة للخلية طفح وب GC النابضة خوارزميات يرد في الشكل 4. ب GC خلية النابضة، نستخدم وسم GL7 مقابل CD38، الذي يعرف ب GC الخلايا ك GL7+ CD38– ب الخلايا (الشكل 4 أ-ب). وصف السلطة الوطنية الفلسطينية يمكن استخدامها بدلاً من GL723 بينما CD38 يمكن استبداله بإحدى العلامات التالية: IgD و Bcl-6 و CD95. البديل النابضة استراتيجيات للخلايا ب GC وأثبتت في S1 الشكل. ويبين نسبة الخلية ب GC في المكتب الصحفي تقلبات كبيرة في الفئران C57BL/6. ومع ذلك، مقارنة بغيرها سلس، ذكر المكتب الصحفي يكون أعلى بكثير من نسبة الخلية ب GC مع مجموعة من 2-10% من مجموع الخلايا ب ظروف حالة ثابتة. النابضة استراتيجية للخلايا طفح PP يوصف CD19– CD4+ PD-1مرحبا CXCR5+ تي الخلايا (الشكل 4 أ، ج). "ارسم حمار وحشي" وجد أن أسلوب البيان العملي أمثل لطفح النابضة كما أنه يصور PD-1مرحبا السكان أكثر حدة بالمقارنة مع الأنواع الأخرى الأرض (الشكل 4). معدل الخصوبة الإجمالي، مجموعة فرعية خلايا طفح معربا عن Foxp3، هي بوابات ك CD19– CD4+ PD-1مرحبا CXCR5+ Foxp3+ تي الخلايا (الشكل 4). مثل خلايا ب GC، الكسر خلية طفح يختلف أيضا في الأفراد المطعمين الماوس مع مجموعة من 10-20% من مجموع CD19– CD4+ PP لمفاوية. وترد تفاصيل خوارزميات النابضة بديلة للخلايا طفح في الشكل 4Eوو و الشكل S1C، دال
لتجنب الإيجابية الكاذبة بسبب تلوين الخلفية وأوتوفلوريسسينسي، ايستب عناصر تحكم أو عناصر تحكم يعادل بديلة مثل الأسفار ناقص واحد (FMO) أن يدرج في لوحة المصبوغة كعنصر تحكم سلبية لعلامات خلية طفح وب GC ( 4 الرقم-ي).
لتحسين الظروف اللازمة لإعداد الأنسجة PP، قمنا بتطوير استراتيجية تجريبية داخليا التي تسيطر عليها رواية، التي جمعت من الماوس فردية واحدة الصحفي وتجميعها بشكل منفصل حسب أصلهم التشريحية (على سبيل المثال-، والاثني عشر، لفائفي). للقيام بتجارب، الصحفي المجمعة تم تعيينها إلى مجموعات فردية حتى كل التجريبية وضمت المجموعة السيطرة على عدد متساو من الصحفي من كل منطقة التشريحية (الشكل 5A). بهذا النهج، وجدنا أن الهضم الأنزيمي المستندة إلى كولاجيناز (اختبار في 37.5 ملغ كولاجيناز الثاني أو الرابع كل 25 مل مزيج الهضم = 1.5 ملغ/مل)، الذي يستخدم عادة لعزل الخلايا اللمفاوية من الأنسجة المخاطية المختلفة، CXCR5 انخفاض كبير التعبير في PP لمفاوية (الشكل 5 (ب))، لا سيما في الخلايا طفح (5F الشكل--أنا)، بينما التعبير عن جزيئات سطحية أخرى (مثلاً.، CD19, CD4) ظلت سليمة (الشكل 5 ج-ه). الحد من الكشف عن CXCR5 كان بارزا حتى أن التعبير عن CXCR5 في خلايا طفح تعامل كولاجيناز كان لا يمكن تمييزها تقريبا من التحكم ايستب (5F الشكل--أنا). مزيد من التجارب أظهرت أن مستوى التدخل الهضم الأنزيمي مع التعبير CXCR5 تعتمد على استنساخ جسم CXCR5 المستخدمة (الشكل 6A-F). على وجه التحديد، عند العلاج الثاني كولاجيناز، كان قدرة الكشف عن استنساخ جسم CXCR5 8 2 البصر أكثر كثيرا، من قدرة الكشف عن استنساخ جسم CXCR5 L138D7 (الشكل 6A-د).
خفض الهضم الأنزيمي ليس فقط التعبير عن CXCR5 ولكن أيضا النسبة من مجموع الخلايا الليمفاوية داخل الخلايا PP كما تحددها خصائص منتدى التعاون الأمني-التعاون بين بلدان الجنوب، بينما جزء كبير من الخلايا المعزولة من هضم PPs معارضها إلى الأمام والجانب مبعثر كثافة أعلى مما PP لمفاوية (الرقم 7 ألف-ج)- حدث آثار كولاجيناز على استرداد الخلية بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 7 أ، ح-ي). زيادة الهضم الأنزيمي بقاء الخلية (الشكل 7، هاء). غير أن هذا الاستحقاق لم تكن كاوساتيفيلي مرتبطة بالهضم كولاجيناز لأنه كان يفضل الخلايا المعزولة من الصحفي بعد الانفعالات دون كولاجيناز المثل (الرقم 7F). تم تحسين الكشف عن النسخ النووية معامل Foxp3، الذي يكتسي أهمية خاصة هنا لأنه يقدر عادة أثناء عزلة طفح لتحديد الخلايا معدل الخصوبة الإجمالي، بالتحريض على 37 درجة مئوية بغض النظر عن هضم كولاجيناز (الرقم 7 ).
رقم 1: بنية العيانية وتوزيع بقع مورين بير التشريحية. (أ)-الحصول على صورة من الإثناعشرية نهاية الأمعاء الدقيقة مع المعدة. يتم الإشارة إلى اثنين من المكتب الصحفي للموقع عن كثب في العفج بالسهام السوداء. (ب)-الصحفي التي تم جمعها من أحد عشر C57BL/6 الفئران كانت مخزنة على حدة في صفيحة جيدا 12. (ج)-الصورة من المكتب الصحفي للماوس قصت الطازجة المعروضة في مصفاة خلية 40 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تدفق خوارزمية النابضة الأساسية للخلايا الليمفاوية PP وتوصيف سيتوميتريك. (أ)-قطع دوت تبين توزيع لمفاوية PP غير المثبتة حديثا معزولة على طول محاور منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب الذي يحمل التشابه الكبير إلى سبلينوسيتيس صورت في (د). (ب)-استبعاد خلايا الميتة عن طريق التعبير 7AAD. 7AAD– الخلايا تمثل الخلايا الحية. (ج)-CD19 وإيمونوفينوتيبينج على أساس خلايا CD4 خلايا تي وب بين بوابات قبل يعيش PP الخلايا. (ه-ز). تحليل لتدفق الممثل الثابتة PP لمفاوية. (ح)-خصائص تدفق الممثل سبلينوسيتيس الثابتة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: CD4+ CD19+ الخلايا إيجابية مزدوجة (DP) قضية الإيجابية الكاذبة في طفح وب GC خلية النابضة. (A). خلايا CD4+CD19+ DP أثبتت الخلايا الليمفاوية داخل الخلايا الحية في PP. (ب)-فصل DP الخلايا استناداً إلى خصائص منتدى التعاون الأمني دوبليتس ونوع. (ج،د). ويرد CXCR5 والتعبير GL7 الخلايا DP في مؤامرات الرسم البياني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: طفح الممثل وب GC الخلية الاستراتيجية النابضة. جمعت الصحفي من ماوس 3-شهر قديم ولمفاويه معزولة كما هو موضح في المقطع بروتوكول. CD19 (A) وخلايا CD4 وسم ليعيش PP لمفاوية يصور. (ب) CD38لو GL7مرحباCD19+ ب كانت بوابات الخلايا كخلايا ب GC. كانت بوابات الخلايا (ج) طفح ك CXCR5+PD-1مرحبا CD4+ الخلايا. (د) معدل الخصوبة الإجمالي الخلايا هي جزء صغير من خلايا طفح معربا عن النسخ الخاصة بخلية تنظيمية معامل Foxp3 جنبا إلى جنب مع علامات طفح وهي بوابات ك CXCR5+ PD-1مرحبا Foxp3+ CD4+ تي الخلايا. (ه-و) النابضة استراتيجية لطفح علامات السطحية المؤكدة في سبلينوسيتيس المعزولة من البويضات NP-تحصين الماوس عن طريق التعبير BCL-6. (غ-ي) يصور ضوابط fluorescence ناقص واحد (FMO) لمفتاح طفح-معدل الخصوبة الإجمالي وعلامات خلية GC. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: الهضم الأنزيمي المستندة إلى كولاجيناز يؤدي إلى انخفاض كبير في الكشف عن CXCR5- (أ) ذكر المكتب الصحفي لمن ماوس شهرا 2 الموجود في العفج (≈ 1/3 الدانية)، صائم (≈ 1/3 الأوسط) وجمعت الدقاق (≈ 1/3 القاصي) وتجميعها بشكل منفصل. ووزعت PPs المجمعة على قدم المساواة للمجموعات التجريبية. وأجرى الهضم الأنزيمي مع كولاجيناز الثاني أو الرابع بتركيز 1.5 ملغ/مل مع الإثارة لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. (ب-E) المدرج التكراري يرسم تصور التعبير عن جزيئات السطح (CXCR5، CD19، PD-1، خلايا CD4) الخلايا المعزولة من الصحفي الذي تعرضوا الهضم المستندة إلى كولاجيناز. (و--أنا) طفح النابضة داخل تديرها كولاجيناز ومجموعات مراقبة يتجلى في مؤامرات حمار وحشي. وتمثل البيانات ثلاث تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: تأثير كولاجيناز على التعبير CXCR5 أظهر اختلافاً كبيرا تبعاً لاستنساخ الأجسام المضادة-CXCR5- لمفاوية PP التي تم جمعها من ماوس عمره 6 أشهر، المجمعة والمنفصلين عن ذويهم في مختلف المجموعات فيما يتعلق بجسم استنساخ الهضم الأنزيمي ويستخدم التطبيق. (واو) نسبة الخلايا طفح هو مبين في مؤامرات حمار داخل بوابات قبل لايف، CD19– CD4+ تي الخلايا. (أ، ج و ه) الخلايا PP كانت ملطخة بجسم CXCR5 الماوس المضادة مترافق البيوتين (8 2 استنساخ)، و Streptavidin مترافق مع فلوروتشرومي BV421. (باء، دال و واو) PP الخلايا كانت ملطخة بالابتدائي مترافق ماوس المضادة CXCR5 جسم (استنساخ L138D7). (أ-ب) طفح النابضة المؤامرات من عسر الهضم PP لمفاوية. (ج-د) ذكر المكتب الصحفي ليهضم مع كولاجيناز الثاني (20 ملغ/25 مل مزيج الهضم) وتحريكها لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. وتمثل البيانات تجربتين مستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 7: الهضم المستندة إلى كولاجيناز والتحريض على 37 درجة مئوية تؤثر على بقاء الخلية، والانتعاش والكفاءة داخل الخلايا المصبوغة. وقد ضحى ماوس C57BL/6 أشهر 3؛ ذكر المكتب الصحفي جمع وتجميع كما هو موضح في الشكل 5 ألف. (أ) بعد أن تم تحريكها جمع الصحفي، الأنسجة حضور كولاجيناز الثاني (37.5 ملغ/25 مل مزيج الهضم) لمدة 10 دقائق، ويصور خصائص ثابتة PP الخلايا منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب في (أ) ويبين صلاحية تلطيخ الأرض ( د)-(ب، ه) بعد جمع الصحفي، وأبقى الأنسجة على الجليد بدون تحريض أو الهضم الأنزيمي؛ يصور خصائص ثابتة PPs الخلايا منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب في (ب) وتلطيخ البقاء هو مبين في (ه). (ج، و) وبعد جمع الصحفي، تم تحريكها الأنسجة 125-150 لفة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية وفي غياب من كولاجيناز؛ خصائص منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب، وصلاحية تلطيخ الخلايا PP الثابتة صورت (ج، و)، على التوالي. (ز) مقارنة التعبير Foxp3 في خلايا تي التنظيمية معزولة عن المكتب الصحفي لتحريكها وأوناجيتاتيد دون الإدارة كولاجيناز هو مبين في الرسم البياني مؤامرة. (ح-ي) ذكر المكتب الصحفي جمعها من ماوس C57BL/6 6 أشهر-ويعاملون بتركيزات مختلفة من كولاجيناز الثاني: 25 ملغ في 25 مل الهضم ميكس، 15 ملغ في 25 مل الهضم مزيج أو لا كولاجيناز. يصور المؤامرات منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب التي تكشف عن آثار الهضم الأنزيمي في PP خلية الإنعاش والغلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8: نموذج الجزيئي وسلسلة كاملة من الأحماض الأمينية CXCR5. (أ) سبعة-تمرير على غرار هيكل البروتين ترانسميمبراني من CXCR5. (ب) سلسلة كاملة من الأحماض الأمينية CXCR5 ويتجلى. تتم الإشارة إلى تسلسل مناطق خارج الخلية باللون الأحمر والأحماض الأمينية خارج الخلية مع روابط كيميائية حساسة كولاجيناز المفترض تظهر باللون الأصفر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| مستضد | استنساخ | فلووروتشرومي | تمييع |
| خلايا CD4 | GK1.5، RM4-5 | آسيا والمحيط الهادئ، PECy7، PerCpCy5.5، فيتك | 1: 100 |
| CD19 | 5 6 | فيتك، آسيا والمحيط الهادئ/Cy7 | 1: 100 |
| 1-شعبة المشتريات | J43 | PE ef 610 (تكساس الأحمر) | 1: 100 |
| نظام ايكوس | 15 F9، 7E.17G9 | PE | 1: 100 |
| GL7 | GL7 | بيركب/Cy5.5 | 1: 75 |
| CXCR5 | 2 8،L138D7 * | بيوتين | 01:50 |
| BCL-6 | 1 7 | PE/Cy7 | 01:50 |
| FOXP3 | فجك-16 | آسيا والمحيط الهادئ، PE | 1: 100 |
| ستريبتافيدين | - | BV421، PE | 1: 100 |
| صبغة فيكسابليفيابيليتي | - | 510(AQUA) بي | 1:1,000 |
| 7AAD | - | بيركب/Cy5.5 | 1: 500 |
| فكبلوك (CD16/32) | 2.4G2 | - | 1: 200 |
الجدول 1: موجز جسم. يتم الإشارة إلى تخفيف واستنساخ والاقتران فلوروتشرومي للأجسام المضادة ذات الصلة والأصباغ البقاء. تمييع الأمثل قد تختلف تبعاً للظروف التجريبية ونوعية الكثير من المنتج. استنساخ مترافق BV421 L138D7 الأولية في 01:20 إضعاف أظهرت قدرة الكشف عن CXCR5 قابلة للمقارنة مع 8 2 مترافق البيوتين استنساخ الساعة 01:50 إضعاف. ولذلك، يمكن استخدام L138D7 مترافق الابتدائية كبديل مترافق البيوتين 2 8 استنساخ.
الشكل 1 التكميلية (S1): بديل النابضة استراتيجيات للخلايا طفح و GC ب. (أ) يصور لمفاوية PP يعيش من 3 أشهر ماوس على خلفية C57BL/6. (ب-ج) هي بوابات الخلايا ب GC ك CD38– GL7+ (ب) وبي سي ال-6+ GL7 الخلايا+ ب (ج). (د-ه) خلايا طفح يصور ك PD-1مرحبا CXCR5+ (د) وكنظام ايكوس+CXCR5+ CD4 + "تي" الخلايا (ه). اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، يمكننا وصف بروتوكول الأمثل لتدفق سيتوميتريك توصيف الخلايا طفح وب GC. واحدة من المزايا الرئيسية لأن البروتوكول أنه يمكن عزل يصل إلى 107 (متوسط 4 – 5 × 106 خلايا) مجموع الخلايا PP من ماوس واحدة (سلالة C57BL/6) دون أي عملية الهضم. لاحظنا أن الخلية إجمالي العائد كان ارتباطاً إيجابيا مع عدد الصحفي ويمكن أن تقدر من المعادلة البسيطة التالية التي مفيدة للتخطيط التجريبية: "عد مجموع كل الماوس خلية PP = 0.5 – 1 × (عدد PP قصت الواحدة الماوس) x 106". واستكملت هذه الخلايا عالية الغلة مع بقاء الخلية المحسنة (> 95%). خلية تحسين الانتعاش وقدرتها على البقاء يسمح بإجراء تحليل سيتوميتريك تدفق لمختلف مجموعات فرعية اللمفاويات في المكتب الصحفي لاستخدام جسم متنوعة تلوين لوحات بالتوازي.
بالمقارنة مع بروتوكول عزلة PP مؤخرا نشرتها دي جيسوس وآخرون. 20 و19،التقارير السابقة21، قدم لنا بروتوكول أعلى بكثير خلية إجمالي العائد والجدوى، وعلى الرغم من عدم وجود الهضم مع كولاجيناز. على الرغم من أن قد يكون تحديد المركز الصحفي "صعبة" للمرة الأولى المحققين، منحنى التعلم لهذا البروتوكول حاد جداً، وإذا كان يتقن، لدينا أسلوب يسمح بتحديد الهوية والاستئصال الجراحي للمركز الصحفي من الأمعاء في فترة قصيرة الوقت. إذا لم يتم التوصل إلى عدد الصفحات المطلوب بعد المحاولة الأولى، فإننا نقترح تكرار الخطوة تحديد PP مع التركيز على النهاية البعيدة والقريبة من الدولية الاشتراكية. في ممارستنا، تقريبا في كل الماوس، هما الصحفي عن كثب يقع في نهاية الإثني عشر (الشكل 1A) والصحفي على الأقل 2-3 ضمن آخر 5 سم الدقاق كانت قابلة للاكتشاف.
ويمكن تلطيخ طفح أكثر تطلبا من أخرى فرعية خلية داخل المكتب، مما يتطلب عناية إضافية18. إذا غاب عن بعض الخطوات أثناء تجهيز الأنسجة والخلايا العزلة، قد تكون نتائج مضللة تماما. ومن ثم، فإننا نقترح الباحثين الالتفات إلى "النصائح" التجريبية التالية. منذ علامات خلية طفح وب GC الرئيسية مثل CXCR5 و GL7 يمكن التعبير عنها في الخلايا ب و T، من المهم لتضمين علامة خلية بفي لوحات جسم لتجنب نتائج إيجابية كاذبة بسبب CD19 تلويث+CD4 الخلايا+ DP24 ( الشكل 2). يرجى ملاحظة أن النابضة استراتيجيات تستند إلى علامات خلية T فقط سيوفر25 لا يكفي استبعاد الخلايا DP منذ هذه الخلايا أيضا شديدة التعبير عن علامات خلية T بما في ذلك CD3 (البيانات لا تظهر) وخلايا CD4. بالإضافة إلى استبعاد الخلايا DP، ينبغي التحقق من صحة نتائج التدفق الخلوي وأكدت باستخدام عناصر التحكم المناسبة السلبية (مثلاً.، ضوابط ايستب، فموس). كاذبة الإيجابية ليس فقط، بل أيضا في غير محله طفح بوابة يمكن أن يؤدي إلى نتائج خاطئة واستنتاجات. في بعض الأحيان يمكن أن تكون صعبة تكيف بوابة طفح خاصة إذا طفح خلية السكان ليست وفيرة، وبالتالي لا تظهر كفئة منفصلة من سكان في التدفق الخلوي. للالتفاف حول هذا القيد أو إضافة علامات طفح متعددة (على سبيل المثال-BCL-6، PD-1، نظام ايكوس) في جسم الفريق قد توفر فرصاً بديلة النابضة وزيادة دقة26. ولأسباب عملية، وجد BCL-6 أن علامة شارك المصبوغة مثالية للبديل طفح النابضة كما يمكن استخدامه النابضة ب GC الخلايا في الوقت نفسه16 (رقم S1C).
وعلاوة على ذلك، وجود عينة إيجابية تحكم التي تحتوي على نسبة عالية من طفح يمكن تزويد الباحثين الملاحة جيدة لوضع بوابة طفح بشكل صحيح. في تجاربنا، استخدمنا PP عينات من الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين (أقدم من 6 أشهر) كعنصر إيجابي نظراً لأننا وجدنا أن الشيخوخة يؤدي تعزيز الخلايا طفح داخل المكتب الصحفي تصل إلى 40% من مجموع خلايا CD4 خلايا+ تي في حالة ثابتة (البيانات لا تظهر). ونحن نشجع أيضا الباحثون أن الحصول على مزيد من الاهتمام بالتفاصيل التقنية لطفح تلطيخ لإلقاء نظرة على الأساليب في الكتاب البروتوكول المنشورة للخلية طفح تلطيخ18.
اختبار الفرضيات التجريبية في PP يمكن أن تكون صعبة نسبيا، وقد يتطلب عددا كبيرا جداً من الفئران كل مجموعة للوصول إلى دلالة إحصائية21. بالاستفادة من خلية عالية الغلة لدينا بروتوكول، علينا الالتفاف على هذه العقبة مع الاستراتيجيات التجريبية التالية. أولاً، نحن اقتطعت الصحفي وفرز لها بشكل منفصل حسب أصلهم التشريحية (مثلاً.، الإثناعشرية، جيجونال ولفائفي). ثم، وزعنا على قدم المساواة هذه الصحفي المجمعة في مختلف التجارب ومجموعات المراقبة. هذه الاستراتيجية التي تسيطر عليها داخليا التجريبية مكنتنا من تقليل الفرق بين الأفراد في الفئران بينما تم الحصول على كافة الخلايا من ماوس واحدة.
وعلاوة على ذلك، تقلب بين مختلف الأقسام المعوية (مثلاً.، والعفج مقابل. الدقاق)-ذكرت سابقا أن تكون كبيرة2 -منعت التجريبية ومراقبة مجموعات تتألف من عدد متساو من المكتب الصحفي لكل المنطقة التشريحية (الشكل 5A). عن طريق إجراء replicates تجارب مستقلة باستخدام نفس النهج، قمنا بتحسين موثوقية وأهمية النتائج التي توصلنا إليها. وإلى جانب القضاء على الاختلافات غير محدد، هذه المنهجية كما يساعد الفئران قطع الغيار والكاشفات والوقت.
أثناء التطوير والتحسين لدينا بروتوكول، كشفت النتائج التي توصلنا إليها أن كولاجيناز الهضم الثاني والرابع على انخفاض لافت للنظر CXCR5 التعبير (الشكل 5B) بينما الجزيئات السطحية الأخرى للكشف عن طفح وخلايا ب GC ظلت سليمة ( الشكل 5 -E) . في المبلغ عنها مؤخرا بروتوكول جوف19، أبدى كولاجيناز الثاني أن تكون فعالة جداً لعزل الخلايا اللمفاوية من الصحفي ولبس. ومع ذلك، أبلغ كولاجيناز الثاني قبل أن يكون نشاطا تريبتيك عالية، مما يؤدي إلى الانقسام ومن العديد من الجزيئات السطحية. ونظرا لها طبيعة ودية سطح جزيء27 بسبب انخفاض النشاط تريبتيك والاستخدام الأكثر شيوعاً في الأدب28،،من2930، "الرابع كولاجيناز" أيضا قد أدرجت بالإضافة إلى كولاجيناز الثاني في دراستنا والمستخدمة في التركيزات كما أوصى في هذه التقارير السابقة. تم استخدام كولاجيناز والأنزيمات يعادل قضية متناقضة في علم المناعة المخاطية بسبب الآثار غير المرغوب فيها من هضم الخلايا المناعية مثل تغيير سطح جزيء التعبير31،27.
وذكر سابقا أن استخدام أنواع مختلفة من كولاجيناز يمكن أن تتداخل مع تدفق سيتوميتريك كشف CXCR5 داخل القناة الهضمية البشرية32 ولوزه عينات18. على العكس من ذلك، أظهرت دراسات أخرى عزل الخلايا طفح وب GC من الصحفي دون استخدام collagenases24،33. ولكن حتى الآن لا يوجد نهج المقارنة قد أجريت لتقييم ما إذا كان إدراج أو استبعاد الهضم كولاجيناز يشكل الشرط الأمثل لعزل الخلايا طفح الإعراب عن CXCR5 من مورين CXCR5 الماوس لالصحفي. هو الأحماض الأمينية 374 بروتين غشائي سبعة تمر فترة طويلة مع مناطق خارج الخلية قصيرة نسبيا مقارنة بغيرها من البروتينات transmembrane مثل خلايا CD4، CD19 التي يتم التعبير عنها تماما في الخلايا اللمفاوية في المركز الصحفي (البيانات التي تم الحصول عليها من أونيبروت). في الشكل 8 أ-ب، ونموذج الجزيئي وتسلسل الأحماض الأمينية مجموع يصور CXCR5 بالماوس مع تسلسل الهدف المفترض على أساس كولاجيناز الهضم، الذي يميل إلى ننأى بروابط كيميائية بين جليكاين (الغليسين) ومحايدة الأمينية 34من الأحماض. بنية جزيئية transmembrane سبعة مجالات خارج الخلية قصيرة الناتجة قد تكون مسئولة عن صنع جزيء CXCR5 الضعيفة الهضم الأنزيمي (الشكل 8 أ). الفضول، وجدنا أن الكشف عن التعبير CXCR5 بعد العلاج كولاجيناز مرهون باستنساخ جسم المستخدمة. على الرغم من أن 8 2 واستنساخ L138D7 أظهرت أداء مماثل في المجموعة PP عسر الهضم، كما حددتها الكشف عن الكسور طفح قابلة للمقارنة، في المجموعة PP هضمها، استنساخ L138D7 كشف حوالي 3 × (≈ 9 في المائة) أعلى جزء من طفح خلايا CD4+ خلايا تي من 8 2 استنساخ (≈ 3%) (الشكل 6). يتبين من هذا الاستنتاج أن تلطيخ CXCR5 مخفضة قد تكون ثانوية بالنسبة لتكوين حانمه ثلاثي الأبعاد تم التعديل حسب النشاط الأنزيمي كولاجيناز. نتائجنا تشير إلى أنه ينبغي تجنب المستندة إلى كولاجيناز الهضم أثناء إعداد PP.
وكان التحايل تدخل الانفصال كولاجيناز مع الكشف عن جزيء CXCR5 باستثناء الخطوة الهضم. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن لبعض الأنسجة مثل ليرة لبنانية، تعطل الميكانيكية ليست كافية لعزل الخلايا وهذه الأنسجة، ويكون الهضم الأنزيمي المطلوب19. في المستقبل، من الضروري لاختبار شروط الهضم البديلة فضلا عن استنساخ جسم المتوافقة مع الهضم تجاوز هذا الحد التقني للأنسجة التي تتطلب عمليات الجهاز الهضمي الانزيمية. وحتى ذلك الحين، ستبقى تقنيات التصوير مثل الفحص المجهري fluorescence محصنة كأسلوب الاختيار للكشف عن طفح في هذه الأنسجة. بالإضافة إلى عزل الخلايا ليرة لبنانية، تتطلب عزل بعض المجموعات الفرعية الخلايا المكونة للدم مثل وحدات تحكم المجال Dc وخلايا البلازما من المكتب الصحفي الهضم الأنزيمي35. عند استخدام بروتوكول لدينا، وينبغي أن تشمل الباحثين الذين يرغبون في عزل هذه المجموعات الفرعية الخلية من المكتب الصحفي الخطوة المناسبة الهضم الأنزيمي20. تدخل ممكن من الهضم الأنزيمي مع التعبير عن علامات DC يجب أن تؤخذ في الاعتبار وينبغي أن يكون الأمثل الهضم الشروط حسب الحاجة. يمكن فصل عندما عزل الخلايا طفح وب GC هو المطلوب بالإضافة إلى مجموعة فرعية من خلية التي تتطلب كولاجيناز الهضم36، ذكر المكتب الصحفي لجمعها من كل الماوس في مجموعتين للمعالجة مع أو بدون علاج كولاجيناز في الألواح المتوازية.
آثار كولاجيناز على الخلايا الليمفاوية PP لا تقتصر على التعبير جزيء السطحية. وكشفت النتائج التي توصلنا إليها أن الهضم الأنزيمي تسبب انخفاض نسبي في نسبة اللمفاويات داخل الخلايا PP بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 7). قد يكون هذا انخفاض كسر اللمفاويات كنتيجة لإطلاق سراح كولاجيناز بوساطة من أنواع أخرى من الخلايا المكونة للدم مجموعات فرعية مثل البالعات ووحدات تحكم المجال Dc من المكتب الصحفي لأن تكون أكبر وأكثر تفصيلاً من الخلايا اللمفاوية. من الممكن أيضا أن الهضم كولاجيناز وساطة الإفراج عن الخلية المجاورة ليرة لبنانية ومقصورات للسيتولوجيا يمكن أن تسهم في تغيير الشخصية منتدى التعاون الأمني-التعاون بين بلدان الجنوب. قد يسبب هذا التلوث الخلية من المقصورات القناة الهضمية الأخرى أيضا التدخل في تحليل تدفق لمفاوية PP. وعلى هذا الأساس، تحقيق أقصى قدر من النقاء الخلية، ونحن أيضا تجنب إضافة الكواشف مثل يدتا أو القيمة التي يتم استخدامها على نطاق واسع لاستخراج الخلايا الظهارية و20من المخاط، حفظ الأنسجة إعداد الظروف الفسيولوجية و unmanipulated قدر الإمكان. وعلى الرغم من هذه الآثار السلبية الهضم الأنزيمي، اكتشفت أيضا آثار مفيدة على الخلايا الليمفاوية PP مثل تحسين التلوين داخل الخلايا وبقاء الخلية (الشكل 7-و، ز). ومع ذلك، كذلك كشفت التحليلات أن هذه الآثار ونسبت إلى عملية التحريض على 37 درجة مئوية في معزل عن الهضم الأنزيمي لأن كانت تفضل بقاء الخلية وتلطيخ Foxp3 داخل الخلايا إلى حد مقارنة عند خلايا تم تحريكها في غياب كولاجيناز. ميتشانيستيكالي، قد يكون الأثر المفيد من التحريض بسبب إزالة محتوى الأمعاء والمخاط من المكتب الصحفي تحسين.
وباختصار، لقد قمنا بوصف بروتوكول مبسط لعزل الخلايا الليمفاوية من المعزولة لالصحفي. الخلايا يمكن تكون ملطخة لتوصيف سيتوميتريك تدفق من عدة مجموعات فرعية الخلية أو يمكن أن يتعرض لفرز الخلايا واستخدمت فيما بعد في مختلف في المختبر و في فيفو الاختبارات الوظيفية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وأعلن لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر لورا شتراوس وبيتر حكيم لإجراء مناقشات مفيدة ودعم مع التدفق الخلوي التحليلات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD4 antibody | eBioscience, Biolegend* | 17-0041-81 ,10054* | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CD19 antibody | eBioscience | MA5-16536 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse PD-1 antibody | eBioscience | 61-9985-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse ICOS antibody | eBioscience | 12-9942-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse GL7 antibody | Biolegend | 144610 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CXCR5 antibody | Biolegend*, BD Bioscience | 145512*, 551960 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse BCL-6 antibody | Biolegend | 358512 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse Foxp3 antibody | eBioscience | 17-5773-82 | For detailed information see Table 1 |
| Streptavidin-BV421 | BD Bioscience | 563259 | For detailed information see Table 1 |
| FixableViability Dye | eBioscience | L34957 | For detailed information see Table 1 |
| 7AAD | Biolegend | 420404 | For detailed information see Table 1 |
| FcBlock (CD16/32) | BD Bioscience | 553141 | For detailed information see Table 1 |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 6-well,12-well & 96-well plates | Falcon/Corning | 353046,353043/3596 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 10 mL syringe-plunger | Exel INT | 26265 | |
| RPMI | Corning | 15-040-CV | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Orbital shaker | VWR | Model 200 | |
| Curved-end scissor | |||
| Fine Serrated Forceps | |||
| Small curved scissor |
References
- van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPα interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer’s patches: Organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).
- Heel, K. A., McCauley, R. D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. Review: Peyer’s patches. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 122-136 (1997).
- Fagarasan, S., Kinoshita, K., Muramatsu, M., Ikuta, K., Honjo, T. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413 (6856), 639-643 (2001).
- Hopkins, S. A., Niedergang, F., Corthesy-Theulaz, I. E., Kraehenbuhl, J. P. A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer’s patch dendritic cells. Cellular Microbiology. 2 (1), 59-68 (2000).
- Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches. Infection and Immunity. 71 (1), 504-509 (2003).
- Sato, A., Iwasaki, A. Peyer’s patch dendritic cells as regulators of mucosal adaptive immunity. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1333-1338 (2005).
- Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Y. Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways. Annals of the New York Academy of Sciences. 1247 (1), 97-116 (2012).
- Fagarasan, S., Kawamoto, S., Kanagawa, O., Suzuki, K. Adaptive Immune Regulation in the Gut: T Cell-Dependent and T Cell-Independent IgA Synthesis. Annual Review of Immunology. 28, 243-273 (2010).
- Hase, K., et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH + bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).
- Wu, H., et al. An Inhibitory Role for the Transcription Factor Stat3 in Controlling IL-4 and Bcl6 Expression in Follicular Helper T Cells. Journal of Immunology. 195 (5), 2080-2089 (2015).
- Vinuesa, C. G., Tangye, S. G., Moser, B., Mackay, C. R. Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity. Nature Reviews Immunology. 5 (11), 853-865 (2005).
- Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal Centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
- Vaeth, M., et al. Store-Operated Ca2+Entry in Follicular T Cells Controls Humoral Immune Responses and Autoimmunity. Immunity. 44 (6), 1350-1364 (2016).
- Meli, A. P., et al. The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance. Immunity. 45 (4), 831-846 (2016).
- Fu, W., et al. Deficiency in T follicular regulatory cells promotes autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 815-825 (2018).
- Espéli, M., Walker, J. M. T follicular helper cells - Methods and Protocols. , (2015).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visual Experiments. (111), e54114 (2016).
- De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer’s Patches. Journal of Visual Experiments. (73), e50167 (2013).
- Pastori, C., Lopalco, L. Isolation and in vitro Activation of Mouse Peyer’s Patch Cells from Small Intestine Tissue. Bio-protocol. 4 (21), e1282 (2014).
- Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. Journal of Visual Experiments. (58), 3225 (2011).
- Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).
- Bollig, N., et al. Transcription factor {IRF4} determines germinal center formation through follicular T-helper cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Science of U. S. A. 109 (22), 8664-8669 (2012).
- Pérez-Mazliah, D., et al. Follicular Helper T Cells are Essential for the Elimination of Plasmodium Infection. EBioMedicine. 24, 216-230 (2017).
- Sage, P. T., Sharpe, A. H. T follicular regulatory cells in the regulation of B cell responses. Trends Immunology. 36 (7), 410-418 (2015).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. Journal of Immunological Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
- Meenan, J., et al. Altered expression of alpha 4 beta 7, a gut homing integrin, by circulating and mucosal T cells in colonic mucosal inflammation. Gut. 40 (2), 241-246 (1997).
- Cao, A. T., et al. Interleukin (IL) -21 promotes intestinal IgA response to microbiota. Mucosal Immunology. 8 (5), 1072-1082 (2015).
- Wei, J., et al. Autophagy enforces functional integrity of regulatory T cells by coupling environmental cues and metabolic homeostasis. Nature Immunology. 17 (3), 277-285 (2016).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. 33 (S1), (2017).
- Bergqvist, P., Gardby, E., Stensson, A., Bemark, M., Lycke, N. Y. Gut IgA Class Switch Recombination in the Absence of CD40 Does Not Occur in the Lamina Propria and Is Independent of Germinal Centers. Journal of Immunology. 177 (11), 7772-7783 (2006).
- Keil, B., Gilles, A. M., Lecroisey, A., Hurion, N., Tong, N. T. Specificity of collagenase from Achromobacter iophagus. FEBS Letters. 56 (2), 292-296 (1975).
- Mora, J. R., et al. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer’s patch dendritic cells. Nature. 424 (6944), 88-93 (2003).
- Reboldi, A., et al. Mucosal immunology: IgA production requires B cell interaction with subepithelial dendritic cells in Peyer’s patches. Science. 352 (6287), (2016).
