Summary
In deze studie presenteren we een roman en effectieve protocol voor de isolatie van lymfocyten van Peyer van Patches (PPs), die vervolgens kunnen worden gebruikt voor in vivo en in vitro Functionele assays evenals stroom cytometrische studies van folliculaire T helper en germinal center B cellen.
Abstract
In de mucosa van de darm vormen immune cellen een unieke immunologische entiteit, die, immuun tolerantie stimuleert terwijl gelijktijdig overdracht van het immuunsysteem verdediging tegen ziekteverwekkers. Het is reeds lang gevestigd dat Peyer van patches (KKS) een essentiële rol in de mucosal immune netwerk hebben door het hosten van verschillende effector T en B-cel subsets. Een bepaalde fractie van deze effector cellen, folliculaire T-helper (TFH) en germinal center (GC) B-cellen worden geprofessionaliseerd in de regulering van de Humorale immuniteit. Vandaar, omvat de karakterisering van deze deelverzamelingen van de cel binnen PPs in termen van hun differentiatie programma en functionele eigenschappen kan leveren belangrijke informatie over mucosale immuniteit. Daartoe zou een eenvoudig toepassing, efficiënte en reproduceerbare methode van lymfocyt isolatie van PPs waardevol voor onderzoekers. In deze studie, we gericht op het genereren van een effectieve methode om te isoleren van lymfocyten van muis PPs met hoge cel opbrengst. Onze aanpak bleek dat eerste weefsel verwerking zoals het gebruik van spijsvertering reagentia en weefsel agitatie, evenals cel kleuring voorwaarden en selectie van antilichaam panelen, grote invloed hebben op de kwaliteit en de identiteit van de geïsoleerde lymfocyten en op experimentele resultaten.
Hier beschrijven we een protocol waarmee onderzoekers efficiënt isoleren lymfocyt populaties van PPs waardoor reproduceerbare stroom cytometry gebaseerde beoordeling van T en B-cel subsets voornamelijk gericht op TFH en GC B cel subsets.
Introduction
Het hele maagdarmkanaal vanaf het begin tot het einde is versierd met een uitgebreid lymfoïde netwerk dat immune cellen meer dan enig andere orgel in mens en muis1 bevat. Peyer de patches (KKS) vormen een belangrijk onderdeel van de intestinale tak van deze cellulaire immuun organisatie, zogenaamde gut-geassocieerde lymfoïde weefsel (GALT)2,3. Binnen PPs, duizenden miljoenen antigenen afgeleid van dieet materialen, commensale microbiota en pathogenen worden continu bemonsterd en wanneer nodig passende immuunrespons naar hen zijn gemonteerd dus handhaving intestinale immuun homeostase. In die zin kunnen de KKS worden genoemd als "amandelen van de dunne darm". KKS bestaan uit grote sub compartimenten: subepithelial koepel (SED), grote B-cel follikel zones; de bovenliggende follikel-geassocieerde epitheel (FAE) en de interfollicular regio (IFR) waar T-cellen gelegen4 zijn. Deze unieke compartimentering van PPs maakt het mogelijk verschillende effector cel deelverzamelingen om samen te werken, verleent dus immunocompetence in de darm.
KKS ontbreken afferent lymfatische, en vanwege deze reden niet antigenen vervoerd naar PPs van de dunne darm worden uitgevoerd via de lymfevaten in tegenstelling tot de meeste van de andere lymfoïde organen. In plaats daarvan, gespecialiseerde epitheliale cellen gelegen in FAE, zogenaamde M-cellen, zijn verantwoordelijk voor de overdracht van luminal antigenen in de KKS-5. Vervolgens, de vervoerde hoeveelheden antigenen worden opgepikt door de dendritische cellen (DC's) en fagocyten die zich in de regio subepithelial koepel (SED) onder de FAE6,7 bevinden. Dit proces antigeen sorteren door DCs in de PP is cruciaal voor het initiëren van de aanpassings immune reactie8 en latere generaties van IgA dat cellen9.
Als gevolg van de zware last die antigene commensale flora en dieet materiaal, KKS host endogeen geactiveerd effector T en B-cel deelverzamelingen in grote abundanties zoals TFH en IgA+ GC B cellen10, suggereren dat PPs een site van actieve immune vertegenwoordigen antwoord11. Detectie van tot 20-25% TFH cellen binnen de totale CD4+ T cel compartiment en tot 10-15% GC B binnen totaal aantal B-cellen cellen is mogelijk in KKS verzameld van unimmunized jonge C57BL/6 muizen12. In tegenstelling tot de soorten van andere T-helper cellen (dwz., Th1, Th2, Th17 cellen), TFH cellen Toon unieke tropisme in B-cel follikels voornamelijk ten gevolge van CXCR5 expressie, die TFH cel homing langs CXCL13 kleurovergang13 bevordert. In de B-cel follikel zones van PPs induceren TFH cellen IgA klasse schakelaar recombinatie en somatische hypermutation in geactiveerde B-cellen waaruit hoge-affiniteit IgA producerende cellen14 onderscheiden. Vervolgens deze plasmacellen antilichaam-afscheidende migreren naar de lamina propria (LP) en immuun homeostase in de darm10regelen.
Identificatie en karakterisering van TFH en GC B-cel populaties binnen PPs onderzoekers te onderzoeken van de dynamiek van de humorale immuunreacties onder steady-state omstandigheden zonder de behoefte aan tijdrovende immunisatie modellen in staat kunnen stellen traditioneel gebruikt in TFH-GC B cel studies15,16,17,18. Analyseren van TFH cellen binnen PPs is niet zo eenvoudig als andere cel subsets. Technische uitdagingen omvatten ideale weefsel voorbereiding voorwaarden, oppervlakte antilichaam-marker combinatie, identificeren, alsmede passende positieve en negatieve controles selecteren. Zowel TFH en PP onderzoeksgebieden vertonen grote variabiliteit in termen van de experimentele procedures en zijn verre van overdracht van een consensus om gestandaardiseerde protocollen als gevolg van verschillende redenen. Ten eerste neiging elke deelverzameling van de cel binnen PPs om differentieel door weefsel voorbereiding factoren vereisen verdere wijzigingen in een cel deelverzameling-specifieke manier worden beïnvloed. Ten tweede, is er een significante discrepantie tussen de gerapporteerde methoden met betrekking tot de details voor cel bereiding op basis van PPs. derde, het aantal protocol gebaseerde vergelijkende studies onderzoeken ideaal weefsel voorbereiding technieken en proefomstandigheden voor PP en TFH is onderzoek vrij beperkt.
Huidige protocol gebaseerde studies voorgesteld voor PP cel voorbereiding19,20,21,22 waren niet TFH- of GC B-cel-georiënteerd. Bovendien, sommige weefsel voorbereiding voorwaarden aanbevolen voor PPs19,20 zoals collagenase gebaseerde spijsvertering bleken de uitkomst van TFH identificatie negatief beïnvloeden door stroom cytometry18. Op deze basis redeneerde wij dat een geoptimaliseerde, gestandaardiseerde en reproduceerbare protocol dat kan worden gebruikt voor het bestuderen van TFH en GC B cel dynamiek binnen PPs zou waardevol zijn onderzoekers bezig met dit onderwerp. Deze behoefte gaf ons de impuls voor het genereren van een verbeterde en bijgewerkte protocol voor de isolatie en de karakterisering van PP lymfocyten die fijn is geoptimaliseerd voor cellulaire herstel, levensvatbaarheid en efficiëntie voor de karakterisering van het cytometrische van de stroom van verschillende T en B deelverzamelingen van de cel. We wilde ook uitsluiten van de verschillende stappen van de moeizame voorbereiding voorgesteld in eerdere protocollen, daardoor, vermindering van de vereiste manipulaties en tijd voor de voorbereiding van de weefsels en cellen van PPs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle studies en experimenten beschreven in dit protocol werden uitgevoerd onder richtlijnen volgens institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van Beth Israël diaken Medical Center.
1. de ontwerpen van experimentele opstelling en muis groepen
- (Optioneel) Samen het huis van de experimentele muizen om horizontale overdracht van darmflora tussen experimentele muizen en om niet-specifieke variabiliteit binnen PP lymfocyten. Daarnaast gebruiken littermate besturingselementen van hetzelfde geslacht te minimaliseren variabiliteit.
2. chirurgische excisie en weefsel voorbereiding stappen:
- Chirurgische verwijdering van de dunne darm (SI)
- Muizen met behulp van CO2 verstikking of een equivalente methode goedgekeurd door de Commissie institutionele dierenethiek euthanaseren.
- De muis overbrengen in een speciaal gebied voor chirurgische excisie. Plaats van de achterkant naar beneden en zuiveren van de buik met 70% ethanol. Een laparotomie uitvoeren door het snijden van de buikhuid en buikvlies langs de middellijn van het schaambeen aan de ribbenkast, waardoor de peritoneale holte.
Opmerking: Voer de eerste incisie op een relatief klein gebied van de huid penetreren de peritoneale Holte en beschadigen intestinale weefsel te voorkomen. Blijven de besnijdenis tot gewenste anatomische grens. - Identificeer het caecum, die is een ideale mijlpaal voor de detectie van de terminal ileum, hetgeen het distale deel van de dunne darm.
Opmerking: Caecum bevindt zich meestal op de lagere linkerkant van de buik van de muis. - Ileocaecale junction lokaliseren en maken een cut op dit niveau als distale mogelijk te scheiden van de dunne darm van het caecum. Gedurende de volgende stappen, Vermijd buitensporige fysiek contact met de darmwand omdat kwetsbare PPs gemakkelijk op aanraking samenvouwen.
- Verwijder voorzichtig de hele dunne darm tot de pyloric sphincter door het snijden van het mesenterium met behulp van schaar. Identificeren van de kruising tussen de Maagportier en twaalfvingerige darm en de twaalfvingerige darm op dit niveau, die leiden zal tot volledige detachement van dunne darm vanuit de buikholte snip.
Opmerking: (i) vermijden Hyperextensie aangezien dit de breuk van de darmwandzou kunnen veroorzaken. (ii) als LP lymfocyt isolatie is gewenst naast PP lymfocyten, volledige verwijdering van de mesenterische vet is nodig. Voor PP alleen op isolatie, kan resterende mesenterische vet evenwel enkele voordelen tijdens de verdere stappen van de isolatie; dus moet het worden gehandhaafd. - Vrijstaand dunne darmen plaats in een 6-well bord gevuld met koude RPMI + 10% foetale runderserum (FBS) en zachtjes de weefsels handmatig doorroeren totdat alle intestinale segmenten zijn ondergedompeld in de koude media. Het handhaven van de weefsels op ijs in de volgende stappen.
- Na de ontrafeling van het gewenste aantal muis dunne darmen, overgaan tot PP excisie van verzamelde dunne darmen.
- Chirurgische excisie van PPs en voorbereiding van eencellige schorsing:
- Zachtjes overdragen van de dunne darm op een papieren handdoek door de mesenterische vet met behulp van de verlostang aangrijpend en plaats de mesenterische zijde naar de papieren handdoek. Bevochtig het hele intestinale segment met koude RPMI + 10% FBS weefsel uitdroging en kleverigheid te voorkomen.
Opmerking: Resterende mesenterische vet kunnen nuttig zijn in dit stadium omdat vetweefsel segmenten op de mesenterische site van SI aan de papieren handdoek houden van de anti-mesenterische site naar vasthouden zal boven. - Het identificeren van de Pod, die worden weergegeven als wit multi lobulated aggregaten in de vorm van een "bloemkool-achtige" op de anti-mesenterische kant van de darmwand.
Opmerking: Flushing uit de luminal inhoud is niet aanbevolen totdat alle PPs worden weggesneden. Legen van de luminal inhoud kan leiden tot de ineenstorting van de PPs en het kleurcontrast tussen PPs en de darmwand, die zeer nuttig is voor de visuele identificatie van PPs zal voorkomen. - Na het identificeren van PPs aan de anti-mesenterische kant, plaats de chirurgische gebogen-einde scissor op PPs (kromme moet trotseren) beteugeling van de PP van de distale en proximale rand.
Optioneel: Duw de PP zachtjes richting de messen van schaar met een vingertop. Deze manoeuvre zal leiden tot betere uitsluiting van het omgevende weefsel van de niet-PP. Accijnzen de PPs zachtjes, met uitzondering van het omringende weefsel van de darm.
Opmerking: (i) deze stap is cruciaal voor het verkrijgen van maximale opbrengst van de cel van de PP terwijl het minimaliseren van de cel besmetting van naburige intestinale compartimenten zoals LP en intestinale epitheel, die ook rijk aan T-cellen zijn. (ii) vanaf één SI weggesneden uit C57BL/6 muis, kunnen 5-10 PPs (gemiddelde grootte, multi lobulated) worden verzameld. Door te streven naar nog kleinere PPs (niet multi lobulated), verzameling van maximaal 12-13 KKS per muis (C57BL/6) is mogelijk met behulp van dit protocol. - Overdracht de verwijderde PPs op een 12-well weefselkweek bord gevuld met ijskoude RPMI + 10% FBS en behouden op ijs met pincet of gebogen chirurgische scharen.
Opmerking: (i) onmiddellijk na excisie van PPs, slijm en intestinale inhoud op het oppervlak van PP kunnen worden gereinigd door het weefsel voorzichtig wrijven op een papieren handdoek. Deze stap zal helpen verbeteren van de levensvatbaarheid van PP lymfocyten. (ii) in plaats van het overbrengen van de PPs naar een plaat, kan overzetten naar gescheiden buizen ook worden beschouwd afhankelijk van aantal van de totale steekproef. - Optioneel: Wanneer PP excisie en latere plaatsing in de plaat goed zijn voltooid, het aantal en de grootte van PPs verzameld uit verschillende experimentele/muis groepen kunnen worden gedocumenteerd door het nemen van een foto van de plaat van de weefselkweek met PPs.
- Bereid een reeks van 50 mL conische buizen gevuld met 25 mL van RPMI + 10% FBS (vooraf opgewarmd bij 37 ° C). Met behulp van een paar van schaar, knip de rand van een 1.000 µL-tip van de afstand waarmee het streven van de KKS met 1 mL pipet. De KKS met 1 mL pipet gecombineerd en overbrengen van de 12-well weefselkweek plaat naar de conische buisjes bereid 50 mL.
Opmerking: Gebruik een nieuwe tip voor elk monster muis te voorkomen van kruisbesmetting tussen de monsters. - Beveilig het deksel en verticaal plaatsen van de buizen in een roteerschudapparaat bij 37 ° C, met continue agitatie bij 125 – 150 omwentelingen per minuut gedurende 10 minuten. Ondertussen bereiden een nieuwe set van 50 mL tubes en plaats een 40 µm cel zeef op de bovenkant van elke buis, waardoor één celsuspensie zal worden opgesteld.
Opmerking: (i) de agitatie stap verwijdert het resterende intestinale inhoud, slijm en cel puin, die de levensvatbaarheid van de cellen en het herstel van PP lymfocyten te verminderen als niet verwijderd. (ii) niet van toepassing elk soort spijsverteringsenzymen op PP weefsel omdat het spijsverteringsproces een dramatisch verlies van CXCR5-expressie aan vanaf het celoppervlak veroorzaakt. - Na de agitatie, door de KKS te overbrengen in de 40 µm cel zeef geplaatst op de top van de onlangs bereid conische 50 mL tubes. Met behulp van de afgeronde kant van de zuiger van een 10 mL spuit, zachtjes verstoren de PPs door de zeef van de cel voor het genereren van één celsuspensie. Spoel de zeef met 15-20 mL koude RPMI + 10% FBS.
Opmerking: (i) vóór filtering, schud de buizen met de PPs horizontaal. Deze korte shake vergemakkelijkt de overdracht van PPs in cel vulinrichtingen. (ii) het gebruikmaken van een 70 µm cel zeef voor de isolatie van niet-lymfoïde immuuncellen (bv., monocyten, macrofagen, DCs) wordt aanbevolen. - Centrifugeer de eencellige schorsingen bij 350 – 400 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
- Zorgvuldig Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen bij een concentratie van 10 x 106 cellen/mL. Met behulp van een hemocytometer cellen tellen.
Opmerking: (i) voorafgaand aan het tellen van de cel, het nummer van de cel Totaal voor elke muis PP-groep kan worden ongeveer geschat met behulp van de volgende formule: "0,5-1 x 106 cellen x (aantal PPs) = cel totaal tellen". Verdere verdunningen met trypan blauw voor het tellen van de cel kunnen het nodig zijn. (ii) als alternatief voor het handmatig tellen, kunnen geautomatiseerde cel items worden gebruikt. - Overdracht van 2-2,5 x 106 cellen in passende omvang (bv., 200 µL) in een 96-Wells ronde-bodemplaat.
Opmerking: Voor één kleur en negatieve controlemonsters, 0,5-1 x 106 cellen mogelijk voldoende. - Centrifugeer de plaat bij 350 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Flick van de plaat.
- Wassen van de cellen in 200 µL van kleuring Buffer.
- Zachtjes overdragen van de dunne darm op een papieren handdoek door de mesenterische vet met behulp van de verlostang aangrijpend en plaats de mesenterische zijde naar de papieren handdoek. Bevochtig het hele intestinale segment met koude RPMI + 10% FBS weefsel uitdroging en kleverigheid te voorkomen.
3. oppervlakte antilichaam kleuring
- Levensvatbaarheid kleuring:
- Na de definitieve wash, resuspendeer de cellen in 100 μl van corrigeerbare levensvatbaarheid kleurstof verdund in PBS (1:1, 000). Incubeer gedurende 30 min op ijs of bij 4 ° C in het donker.
Opmerking: (i) de intracellulaire kleuring voor het opsporen van belangrijke transcriptie factoren zoals Foxp3 of Bcl-6 vereist fixatie van de cellen. In dat geval niet-corrigeerbare levensvatbaarheid kleurstoffen (bv., 7-AAD, DAPI) kan niet worden gebruikt. (ii) om te verdunnen corrigeerbare levensvatbaarheid kleurstof, gebruik niet elke kleuring buffer die eiwitten bevatten. De media die worden gebruikt in deze stap moet worden proteïne-vrij. (iii) de uitsluiting van dode cellen met behulp van levensvatbaarheid kleuring is cruciaal omdat dode cellen ernstige technische moeilijkheden bij het stroom cytometry analyse veroorzaken kunnen door de uitstoot van autofluorescence en door nonspecifically, oppervlakte antilichamen te binden die tot valse leiden kunnen positieve resultaten. - Wassen van de cellen tweemaal met de kleuring van de buffer. Centrifugeer bij 350 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Flick van de plaat.
- Na de definitieve wash, resuspendeer de cellen in 100 μl van corrigeerbare levensvatbaarheid kleurstof verdund in PBS (1:1, 000). Incubeer gedurende 30 min op ijs of bij 4 ° C in het donker.
- FC blok en oppervlakte - laag I:
- Bereid de oplossing van de Fc-blok door verder verdunnen van anti-CD16/32 antilichaam (1:200) in de kleuring van de buffer.
- Resuspendeer de cellen in 20 μL van bereide oplossing van de Fc-blok. Incubeer gedurende 15 minuten op het ijs.
- Zonder wassen, toevoegen 80 μL van oppervlakte antilichaam cocktail (Zie tabel 1 voor het antilichaam samenvatting) in passende verdunningen bereid. Incubeer op ijs voor minstens 30 min.
- Wassen tweemaal door het toevoegen van buitensporige kleuring buffer. Centrifugeer bij 350 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Flick van de plaat.
- Oppervlakte - laag II:
- Daar kleurstofoplossing bereid door verdunning van fluorescerende-geconjugeerde daar in kleuring buffer.
- Na de definitieve wash, resuspendeer de cellen met 100 μl van vooraf verdunde streptavidine (1:100) kleurstofoplossing. Incubeer gedurende minstens 15 min op ijs in het donker.
- Wassen tweemaal met de kleuring van de buffer. Centrifugeer bij 350 x g gedurende 5 min bij 4° C. Flick van de plaat.
Optioneel: Als intracellulaire kleuring voor folliculaire regelgevende T cel detectie niet, na de laatste wash gewenst is, resuspendeer de cellen in 200 μL van kleuring buffer en overdracht in passende buizen om gegevens in de stroom cytometer te vergaren. Wanneer de monsters niet vast zijn, moet overname van gegevens door stroom cytometry plaatsvinden binnen 3-4 uur om nauwkeurige resultaten te verkrijgen.
4. cel fixatie
- Bereiden fixatie/permeabilization (Fix/Perm) werkende oplossing met behulp van de reagentia van het Foxp3/transcriptie Factor kleuring Buffer ingesteld. Meng één-deel van fixatie/permeabilization concentraat met drie delen van fixatie/permeabilization naar de gewenste eindvolume verdunningsmiddel.
- Na de definitieve wash, resuspendeer de cellen in 200 μL van de werkoplossing voor Fix/permanent.
- Incubeer de plaat op ijs of bij 4 ° C gedurende 20 minuten. 20 min voor deze stap niet overschrijden. Langere incubatietijd kan ernstig verminderen het herstel van de cel.
- Centrifugeer bij 350 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Flick van de plaat. (Optioneel) Na deze stap, vaste cellen kunnen worden opgeslagen voor meerdere dagen bij 4 ° C in de buffer met bovien serumalbumine (BSA) kleuring of FBS tot latere intracellulaire kleuring of stroom cytometry acquisitie.
- Resuspendeer de cellen in 200 μL van permeabilization Buffer (x1) vers vooraf verdund in gezuiverde gedeïoniseerd water.
- Centrifugeer bij 350 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Een keer wassen met 200 μL van permeabilization buffer en centrifugeer bij 350 x g gedurende 5 min op RT.
5. de intracellulaire kleuring
- Bereid de oplossing van de Fc-blok door verder verdunnen van anti-CD16/32 antilichaam (1:200) in permeabilization buffer.
Opmerking: Na de fixatie stap, de cellen moeten worden gehandhaafd in de buffer van de permeabilization tot het einde van het intracellulaire kleuring proces. - Na de definitieve wash, resuspendeer de cellen in 20 μL van Fc-blok oplossing. Incubeer gedurende 10-15 min. op RT in het donker.
- Zonder wassen, Voeg 80 μL van intracellulaire antilichaam cocktail (100 μl eindvolume) vooraf verdund in permeabilization buffer. Incubeer gedurende 30 min op RT.
- Voeg 100 μl van Perm Buffer en centrifuge bij 350 x g gedurende 5 min op RT.
- Een keer wassen met 200 μL van permeabilization buffer, centrifugeer bij 350 x g gedurende 5 min op RT.
- Na de definitieve wash, resuspendeer de cellen in 200 μL van kleuring van buffer en overdracht van de cellen in passende buizen (eindvolume van 400 μL in kleuring buffer) en gegevens verwerven door stroom cytometry. Monsters gekleurd in 96-wells-plaat kunnen ook worden uitgevoerd zonder overgeplaatst naar buizen als een stroom cytometer met plaat lezer optie beschikbaar is. Deze stap minimaliseert cel verlies tijdens het overbrengen van de cel.
- Een minimum van 5 x 105 totaal aantal cellen op de stroom cytometer om reproduceerbare analyse van TFH, TFR te kunnen verwerven alsmede GC B cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In tegenstelling tot een vorige protocol20, wij hebben geconstateerd dat PPs niet gelijkelijk zijn verdeeld in de SI maar meer dichtbevolkte zijn gelokaliseerd aan de uiteinden van het distale en proximale van de SI zoals in figuur 1A. Stroom cytometrische analyse toonde aan dat, indien correct gevolgd, ons protocol geeft een PP lymfocyten bevolking waaruit naar voren-naast scatter distributie vergelijkbaar met splenocytes (figuur 2AE, en 2D, H) met > 95% cel levensvatbaarheid (figuur 2B en 2F). In tegenstelling tot andere secundaire lymfoïde organen (SLOs), in C57BL/6 muizen ongeveer 70-80% van de totale PP lymfocyten bestaan van B-cellen, overwegende dat CD4+ T cellen vormen slechts 10 – 15% van de totale PP lymfocyten (figuur 2C en 2 G).
Houd er rekening mee dat CD4+ CD19+ dubbele positief (DP) cellen vormen ≈ 1% van de totale PP lymfocyten. Met bepaalde voorzorgsmaatregelen tijdens bereiding, cel zoals Fc-Block uitvoeren tegen Fc receptoren van B-cellen en exclusief paren, CD4+ CD19+ DP-celpopulatie kon worden geminimaliseerd (figuur 3A en B). Een fractie van DPs die niet vooruit scatter (FSC) kenmerken van paren aantoont is echter onvermijdelijk en moet worden gated uit van de enkele positieve T en B-cel gates (figuur 3B). Onze resultaten bleek dat B cellen binnen DP cellen zeer uitdrukkelijke CXCR5 op hun oppervlak (Figuur 3 c) dat kan leiden tot valse positieve resultaten in de TFH poort die is aangepast op basis van CXCR5 expressie in CD4+ T cellen. Aan de andere kant, we vonden dat GL7, een marker van geactiveerde B-cellen, komt ook tot uiting in CD4+ CD19+ DP cellen (figuur 3D), die zou veroorzaken interferentie met GC B cel gating.
Voorbeelden van TFH en GC B cel gating algoritmen zijn afgebeeld in Figuur 4. Voor GC B cel gating, gebruiken we GL7 labeling versus CD38, waarmee GC B cellen als GL7+ CD38- B cellen (figuur 4A-B). PNA labeling kan worden gebruikt in plaats van GL723 overwegende dat CD38 kan worden vervangen door een van de volgende markeringen: IgD, Bcl-6 en CD95. Alternatief gating strategieën voor GC B cellen worden gedemonstreerd figuur S1. GC B cel verhouding in KKS toont grote variabiliteit in C57BL/6 muizen. Vergeleken met andere SLOs, echter KKS aanzienlijk hoger GC B cel verhouding met een bereik van 2-10% van het totaal aantal B-cellen steady-state omstandigheden. Gating strategie voor PP TFH cellen wordt beschreven als CD19- CD4+ PD-1hi CXCR5+ T cellen (figuur 4A, C). "Zebra plot" bleek te zijn van een optimale demonstratie methode voor TFH gating zoals het schildert PD-1hi bevolking meer discreet ten opzichte van andersoortige perceel (figuur 4C). TFR, een subset van TFH cellen uiten Foxp3, zijn gated als CD19- CD4+ PD-1hi CXCR5+ Foxp3+ T cellen (Figuur 4 d). Als GC B cellen, de Fractie van de cel TFH varieert ook in unimmunized muis individuen met een bereik van 10 tot 20% van de totale CD19- CD4+ PP lymfocyten. Details voor alternatieve gating algoritmen voor TFH cellen worden beschreven in figuur 4E, F en Figuur S1C, D.
Om te voorkomen dat valse positiviteit vanwege achtergrondkleuring en autofluorescence, moeten isotype besturingselementen of alternatieve gelijkwaardige zoals fluorescentie Minus één (FMO) worden opgenomen in de kleuring deelvenster als een negatieve controle voor TFH en GC B cel markeringen ( Figuur 4 g-J).
Voor het optimaliseren van de voorwaarden voor PP weefsel voorbereiding, ontwikkelden we een nieuwe intern gecontroleerde experimentele strategie, waarin PPs werden verzameld uit één individuele muis en gebundeld afzonderlijk afhankelijk van hun anatomische oorsprong (bijv., duodenale, ileale). Voor het uitvoeren van experimenten, gepoolde PPs werden toegewezen aan afzonderlijke groepen zo dat elke experimentele en controlegroep opgenomen een gelijk aantal KKS van elke anatomische regio (figuur 5A). Door deze aanpak, vonden we dat collagenase gebaseerde enzymatische spijsvertering (getest op 37,5 mg collagenase II of IV per 25 mL voor spijsvertering mix = 1,5 mg/mL), die wordt meestal gebruikt voor lymfocyt isolatie van verschillende mucosal weefsels, sterk gereduceerde CXCR5 expressie in PP lymfocyten (figuur 5B), met name in TFH cellen (figuur 5F-ik), terwijl de expressie van andere oppervlakte moleculen (bv., CD19, CD4) bleef intact (Figuur 5 C-E). Vermindering van CXCR5 detectie was prominente zodat de uitdrukking van de CXCR5 op collagenase behandeld TFH cellen bijna niet te onderscheiden van isotype controle was (figuur 5F-ik). Verdere experimenten bleek dat het niveau van de interferentie van de enzymatische spijsvertering met CXCR5 uitdrukking afhankelijk van de CXCR5 antilichaam kloon gebruikt (figuur 6A-F was). In het bijzonder bij collagenase II behandeling was de detectiecapaciteit van CXCR5 antilichaam kloon 2 g 8 aanzienlijk meer bijzondere waardevermindering heeft ondergaan, dan de detectiecapaciteit van de CXCR5 antilichaam kloon L138D7 (Figuur 6A-D).
Enzymatische spijsvertering verminderd niet alleen de uitdrukking van CXCR5, maar ook het aandeel van de totale lymfocyten binnen PP cellen zoals bepaald door de kenmerken van de FSC-WS, terwijl een aanzienlijk deel van cellen geïsoleerd uit verteerd PPs tentoongesteld vooruit en kant spreiding van een hogere intensiteit dan PP lymfocyten (figuur 7A-C). De effecten van collagenase op cel herstel vond plaats in een dosis-afhankelijke manier (figuur 7A, H-J). Enzymatische spijsvertering verhoogd de levensvatbaarheid van de cellen (figuur 7D, E). Echter, dit voordeel was niet causatively gekoppeld aan collagenase spijsvertering omdat de cellen van PPs werd na de agitatie zonder collagenase geïsoleerd waren ook favoriet (figuur 7F). De detectie van de nucleaire transcriptiefactor Foxp3, die van bijzonder belang hier omdat het wordt meestal beoordeeld tijdens TFH isolatie TFR cellen opsporen, werd verbeterd door de agitatie bij 37 ° C ongeacht de collagenase spijsvertering (figuur 7G ).
Figuur 1: macroscopische structuur en anatomische distributie van lymfkliertest Peyer van Patches. (A). een afbeelding verkregen van duodenale-einde van de dunne darm met de maag. Twee nauw gelegen PPs in de twaalfvingerige darm worden aangegeven met zwarte pijlen. (B). PPs verzameld van elf C57BL/6 muizen werden afzonderlijk opgeslagen in een 12 goed-plaat. (C). afbeelding van vers verwijderde muis PPs op een zeef 40 µm cel weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Flow cytometrische karakterisering en fundamentele gating algoritme voor PP lymfocyten. (A). Dot plots tonen de distributie van vers geïsoleerde nietgefixeerde PP lymfocyten langs FSC en SSC assen die grote gelijkenis met splenocytes afgebeeld in (D vertonen). (B). uitsluiting van dode cellen door middel van 7AAD expressie. 7AAD- cellen vertegenwoordigen levende cellen. (C). CD19 en CD4-gebaseerde immunophenotyping van T en B cellen onder vooraf gated levende PP cellen. (E-G). Representatieve flow analyse van vaste PP lymfocyten. (H). representatieve flow eigenschappen van vaste splenocytes. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: CD4+ CD19+ dubbele positieve (DP) cellen oorzaak valse positiviteit in TFH en GC B cel gating. (A). CD4+CD19+ DP lymfocyten binnen levende PP cellen worden gedemonstreerd. (B). scheiding van DP cellen op basis van FSC kenmerken als paren en onderhemden. (C,D). CXCR5 en GL7 expressie van DP cellen worden afgebeeld op de percelen van het histogram. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: vertegenwoordiger TFH en GC B cel gating strategie. KKS werden verzameld uit een 3 - maanden oude muis en lymfocyten werden geïsoleerd zoals beschreven in de sectie Protocol. (A) CD19 en CD4 labeling van levende PP lymfocyten worden afgebeeld. (B) CD38lo GL7hiCD19+ B cellen werden gated als GC B cellen. (C) TFH cellen werden gated als CXCR5+PD-1hi CD4+ cellen. (D) TFR cellen zijn een fractie van TFH cellen uiten van regelgevende cel-specifieke transcriptiefactor Foxp3 samen met TFH markeringen en zijn gated als CXCR5+ PD-1hi Foxp3+ CD4+ T cellen. (E-F) Strategie voor TFH gating oppervlakte markeringen bevestigd in splenocytes geïsoleerd van NP-eicellen-geïmmuniseerd muis door middel van BCL-6 expressie. (G-J) Fluorescentie Minus één (FMO) controles voor sleutel TFH-TFR en GC cel markers zijn afgebeeld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Collagenase gebaseerde enzymatische spijsvertering leidt tot een enorme vermindering van CXCR5 detectie. (A) PPs van een 2 maand-oude muis, gelegen in de twaalfvingerige darm (≈ proximale 1/3), jejunum (≈ 1/3 middelste) en ileum (≈ 1/3 distale) werden verzameld en gebundeld afzonderlijk. Gebundelde PPs werden gelijkmatig verdeeld aan de experimentele groepen. Enzymatische spijsvertering met collagenase II of IV bij 1,5 mg/mL concentratie werd uitgevoerd met agitatie gedurende 10 minuten bij 37 ° C. (B-E) Histogram percelen beeltenis van de expressie van oppervlakte molecules (CXCR5, CD19, PD-1, CD4) van de cellen van PPs die werden onderworpen aan collagenase gebaseerde spijsvertering geïsoleerd. (F-ik) TFH gating binnen de collagenase bestuurde en controlegroepen wordt gedemonstreerd op de percelen van de zebra. Gegevens vertegenwoordigen drie onafhankelijke experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: het effect van collagenase op CXCR5 meningsuiting toonde grote verschil afhankelijk van de anti-CXCR5 antistof kloon. PP lymfocyten verzameld is uit een 6-maand-oude muis, gebundelde en gescheiden in verschillende groepen met betrekking tot antilichaam kloon gebruikte en enzymatische spijsvertering toepassing. (A-F) Het aandeel van TFH cellen wordt afgebeeld op de zebra percelen binnen omheinde vooraf live, CD19- CD4+ T cellen. (A, C en E) PP cellen werden gekleurd met het antilichaam anti-muis-CXCR5 Biotine-geconjugeerde (2 g 8 kloon), en daar geconjugeerd met BV421 fluorescerende. (B, D en F) PP cellen werden gekleurd met een primair geconjugeerd anti-muis CXCR5 antilichaam (L138D7 kloon). (A-B) TFH gating percelen van onverteerd PP lymfocyten. (C-D) PPs verteerd met collagenase II (20 mg/25 mL spijsvertering mix) en geschud gedurende 10 minuten bij 37 ° C. Gegevens vertegenwoordigen twee onafhankelijke experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: Collagenase gebaseerde spijsvertering en agitatie bij 37 ° C beïnvloeden de levensvatbaarheid van de cellen, herstel en intracellulaire kleuring efficiëntie. Een 3 maanden oude C57BL/6 muis werd geofferd; KKS werden verzameld en samengevoegd zoals beschreven in figuur 5A. (A) na het verzamelen van PPs, de weefsels werden geschud in aanwezigheid van collagenase II (37,5 mg/25 mL spijsvertering mix) gedurende 10 minuten, FSC en SSC kenmerken van vaste PP cellen worden afgebeeld in (A) en levensvatbaarheid kleuring perceel wordt afgebeeld in) D). (B, E) na de inzameling van PPs, hielden de weefsels op ijs zonder agitatie of enzymatische spijsvertering; FSC en SSC kenmerken van vaste PPs cellen worden afgebeeld in (B) en levensvatbaarheid kleuring wordt afgebeeld in (E). (C, F) Na de inzameling van PPs, waren weefsels opgewonden van 125-150 toeren per minuut gedurende 10 minuten bij 37° C in de afwezigheid van collagenase; FSC en SSC kenmerken en levensvatbaarheid kleuring van vaste PP cellen zijn afgebeeld (C, F), respectievelijk. (G) vergelijking van Foxp3 meningsuiting in regulatoire T-cellen geïsoleerd van geageerd en unagitated PPs zonder collagenase administratie wordt afgebeeld in de plot van het histogram. (H-J) KKS verzameld uit een 6 - maanden oude C57BL/6-muis en werden behandeld met verschillende concentraties van collagenase II: 25 mg per 25 mL spijsvertering mix, 15 mg per 25 mL spijsvertering mix of geen collagenase. FSC en SSC percelen die de effecten van de enzymatische spijsvertering op PP cel herstel en rendement onthullen zijn afgebeeld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8: het moleculaire model en de volledige aminozuur opeenvolging van CXCR5. (A) zeven-pass transmembraan eiwitstructuur van CXCR5 is gemodelleerd. (B) de volgorde van de complete aminozuur van de CXCR5 wordt aangetoond. De volgorde van de extracellulaire regio's wordt aangegeven in het rood en extracellulaire aminozuren met vermoedelijk collagenase gevoelige chemische bindingen worden gedemonstreerd in geel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Antigeen | Kloon | Fluourochrome | Verdunning |
| CD4 | GK1.5, RM4-5 | APC, PECy7, PerCpCy5.5, FITC | 1:100 |
| CD19 | 6D 5 | FITC, APC/Cy7 | 1:100 |
| PD-1 | J43 | PE ef 610 (Texas rood) | 1:100 |
| ICOS | 15 F9, 7E.17G9 | PE | 1:100 |
| GL7 | GL7 | PerCp/Cy5.5 | 1:75 |
| CXCR5 | 2 g-8,L138D7 * | Biotine | 1:50 |
| BCL-6 | 7D 1 | PE/Cy7 | 1:50 |
| FOXP3 | FJK-16 | APC, PE | 1:100 |
| Streptavidine | - | BV421, PE | 1:100 |
| FixableViability kleurstof | - | BV 510(AQUA) | 1:1,000 |
| 7AAD | - | PerCp/Cy5.5 | 1:500 |
| FcBlock (CD16/32) | 2.4G2 | - | 1:200 |
Tabel 1: samenvatting van de antilichaam. De verdunningen, klonen en fluorescerende vervoegingen voor de relevante antilichamen en levensvatbaarheid kleurstoffen worden vermeld. De optimale verdunning kan variëren afhankelijk van de experimentele omstandigheden en veel kwaliteit van het product. Primaire BV421-geconjugeerde L138D7 kloon op 1:20 verdunning toonde vergelijkbare capaciteit van de detectie van de CXCR5 met de 2 g Biotine-geconjugeerde 8 kloon op 1:50 verdunning. Daarom, primaire-geconjugeerde L138D7 kan worden gebruikt als alternatief voor Biotine-geconjugeerde 2 g 8 kloon.
Figuur aanvullende 1 (S1): alternatieve strategieën voor TFH en GC B cellen gating. (A) Live PP lymfocyten van een 3 maanden oude muis op de achtergrond C57BL/6 worden afgebeeld. (B-C) GC B cellen zijn gated als CD38- GL7+ (B) en BCL-6+ GL7+ B cellen (C). (D-E) TFH cellen worden afgeschilderd als PD-1hi CXCR5+ (D) en als ICOS+CXCR5+ CD4 + T cellen (E). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een protocol dat is geoptimaliseerd voor de karakterisering van het cytometrische van de stroom van TFH en GC B cellen. Een van de grote voordelen van onze protocol is dat hierdoor het isolement van maximaal 107 (gemiddeld 4-5 x 106 cellen) totale PP cellen uit een enkele muis (C57BL/6-stam) zonder enige spijsvertering proces. We hebben vastgesteld dat de cel Totaal opbrengst was positief gecorreleerd met het aantal PPs en van de volgende eenvoudige vergelijking die nuttig is voor de planning van de experimentele kon worden geschat: "totale PP cel tellen per muis = 0,5 – 1 x (aantal verwijderde PP per muis) x 106". De opbrengst van deze hoge cel werd aangevuld met verbeterde levensvatbaarheid (> 95%). Verbeterde cel herstel en levensvatbaarheid toegestaan flow cytometrische analyse van verschillende lymfocyt deelverzamelingen in KKS met behulp van diverse antilichaam kleuring panelen parallel uitvoeren.
Vergeleken met een recente PP isolatie protocol gepubliceerd door De Jesus et al. 20 en vorige verslagen19,21, gaf ons protocol aanzienlijk hoger rendement van de cel Totaal en levensvatbaarheid, ondanks het ontbreken van de spijsvertering met collagenase. Hoewel de identificatie van PPs "lastig" voor het eerst de onderzoekers, de leercurve voor dit protocol is vrij steil, en als de knie, onze techniek maakt het mogelijk de identificatie en chirurgische excisie van PPs uit de dunne darm in een korte tijd. Als het gewenste PP-nummer niet nadat de eerste poging bereikt is, raden we herhalen de PP identificatie stap gericht op het einde van het distale en proximale van de SI. In onze praktijk, bijna in elke muis, waren twee nauw gelegen PPs in de duodenale einde (figuur 1A) en ten minste 2-3 PPs binnen de laatste 5 cm van het ileum aantoonbaar.
TFH kleuring kan worden veeleisender dan andere deelverzamelingen van de cel binnen de KKS, waarvoor derhalve extra aandacht18. Als bepaalde stappen worden gemist tijdens de verwerking van het weefsel en cel isolatie, is er mogelijk resultaten heel misleidend. Wij stellen daarom voor onderzoekers om aandacht te besteden aan de volgende experimentele "tips". Sinds de belangrijkste TFH en GC B cel markeringen zoals CXCR5 en GL7 kan worden uitgedrukt in zowel B- en T-cellen, is het essentieel om een B-cel-marker onder antilichaam panelen te vermijden van vals-positieve resultaten als gevolg van de besmettende CD19+CD4+ DP cellen24 ( Figuur 2). Houd er rekening mee dat gating strategieën gebaseerd op T cel markeertekens alleen25 krijgt niet voldoende uitsluiting van DP cellen, aangezien deze cellen ook zeer express T cel markeringen met inbegrip van CD3 (gegevens niet worden weergegeven) en CD4. Naast de uitsluiting van DP cellen, stroom cytometry resultaten moeten worden gevalideerd en bevestigd door gebruik te maken van passende negatieve controles (bijv., isotype besturingselementen, FMO). Niet alleen valse positiviteit, maar ook misplaatst TFH poort kan leiden tot onjuiste resultaten en conclusies. Aanpassing van TFH poort kan soms lastig zijn vooral als TFH celpopulatie niet overvloedig, waardoor het niet verschijnen als een aparte populatie in stroom cytometry. Het omzeilen van deze beperking, de toevoeging van meerdere TFH markers (bijv., BCL-6, PD-1, ICOS) in antilichaam paneel kan alternatieve gating mogelijkheden bieden en verhogen nauwkeurigheid26. Om praktische redenen, BCL-6 bleek te zijn dat een ideale mede kleuring marker voor alternatieve TFH gating, als het kan worden gebruikt voor het gating GC B cellen gelijktijdig16 (Figuur S1C).
Bovendien, hebben een positieve controlemonster met een hoog percentage van TFH kon Navigaties moeten onderzoekers goed voor het plaatsen van TFH poort correct. In onze experimenten, gebruikten we PP monsters van leeftijd muizen (ouder dan 6 maanden) als positieve controle aangezien wij hebben gevonden dat veroudering de verhoging van de TFH cellen binnen PPs tot 40% van de totale CD4 veroorzaakt+ T cellen in stationaire toestand (gegevens niet worden weergegeven). Wij raden ook de onderzoekers die hebben verder belang bij technische details van TFH vlekken om te kijken naar de methoden in het protocol van het gepubliceerde boek voor TFH cel kleuring van18.
Testen experimentele hypothesen in PP kunnen vrij uitdagend en wellicht een zeer groot aantal muizen per groep tot statistische significantie21. Door te profiteren van de opbrengst van de hoge cel van ons protocol, omzeild we deze hindernis met de volgende experimentele strategieën. Ten eerste, we weggesneden PPs en gesorteerd hen afzonderlijk afhankelijk van hun anatomische oorsprong (bijv., duodenale, jejunal en ileale). Dan, we gelijkmatig verdeeld deze gebundelde PPs in verschillende experimentele en controlegroepen. Deze intern gecontroleerde experimentele strategie ons in staat gesteld om te minimaliseren van het Inter-individuele verschil in muizen, terwijl alle cellen werden verkregen uit een enkele muis.
Bovendien, variabiliteit tussen verschillende intestinale compartimenten (bv., twaalfvingerige darm vs. ileum)-eerder gemeld dat significante2 — werd verhinderd als experimentele en controlegroepen bestond uit een gelijk aantal KKS per anatomische regio (figuur 5A). Door het uitvoeren van replicatieonderzoeken voor onafhankelijke experimenten met behulp van dezelfde aanpak, verbeterd we de betrouwbaarheid en de betekenis van onze resultaten. Naast het elimineren van niet-specifieke variaties, helpt deze methodologie ook vrije muizen, reagentia en tijd.
Tijdens de ontwikkeling en de optimalisatie van onze protocol bleek onze resultaten dat collagenase II - en IV-gebaseerde spijsvertering minder opvallend CXCR5 expressie (figuur 5B) terwijl andere oppervlakte moleculen voor detectie TFH en GC B cellen bleef intact) Figuur 5C -E) . In een onlangs gerapporteerde JoVE protocol19, collagenase II werd aangetoond dat het zeer effectief zijn voor lymfocyt isolatie van PPs en LP's. Collagenase II is echter eerder gemeld om een hoge al activiteit, wat in de splitsing van verschillende oppervlakte moleculen resulteert. Gezien zijn vriendelijke karakter van de oppervlak-molecuul27 als gevolg van de lagere al activiteit en meer gemeenschappelijk gebruik in de literatuur28,29,30, Collagenase IV had ook overgenomen naast collagenase II in onze studie en gebruikt in de concentraties zoals aanbevolen in deze vorige verslagen. Het gebruik van collagenase en gelijkwaardige enzymen is een tegenstrijdige kwestie geweest in Mucosale immunologie als gevolg van de ongewenste effecten van de spijsvertering op immune cellen zoals gewijzigd oppervlakte molecuul expressie31,27.
Eerder werd gemeld dat het gebruik van verschillende soorten collagenase stroom cytometrische CXCR5 detectie in de menselijke darm32 en tonsillen monsters18kon verstoren. Omgekeerd, andere studies aangetoond dat het isolement van TFH en GC B cellen van PPs zonder het gebruik van collagenases24,33. Tot nu geen vergelijkende aanpak had ondernomen om te beoordelen of de opname of uitsluiting van collagenase spijsvertering de optimale voorwaarde voor isolatie van CXCR5-uiten TFH cellen uit lymfkliertest PPs. muis CXCR5 vertegenwoordigen zou is echter een 374 aminozuur lange zeven-pass membraan eiwit met relatief korte extracellulaire regio's ten opzichte van andere transmembraan eiwitten zoals CD4, CD19 die overvloedig worden uitgedrukt in de lymfoïde cellen in KKS (gegevens die zijn verkregen uit UniProt). In figuur 8A-B, een moleculair model en totale aminozuur opeenvolging van muis CXCR5 worden afgebeeld met de vermoedelijke doel sequenties van collagenase gebaseerde spijsvertering, die de neiging te distantiëren van chemische bindingen tussen glycine (Glycine) en neutrale amino zuren34. De zeven-pass transmembraan moleculaire structuur resulterende korte extracellulaire domeinen mogelijk verantwoordelijk voor het maken van CXCR5 molecuul kwetsbaar voor enzymatische spijsvertering (figuur 8A). Intrigerend, vonden we dat detectie van CXCR5 expressie na collagenase behandeling afhankelijk van de kloon van de antilichaam gebruikt is. Hoewel 2 g 8 en L138D7 klonen bleek soortgelijke prestaties in de onverteerd PP-groep, zoals bepaald door de detectie van vergelijkbare TFH fracties, in de groep verteerd PP L138D7 kloon bleek ongeveer 3 x (≈ 9%) hoger Fractie van TFH cellen binnen CD4+ T-cellen dan de 2 g-8 kloon (≈ 3%) (Figuur 6). Deze bevinding suggereert dat verminderde CXCR5 kleuring ondergeschikt aan gewijzigde driedimensionale epitoop configuratie door de enzymatische activiteit van collagenase wellicht. Onze resultaten wijzen erop dat collagenase gebaseerde spijsvertering tijdens PP voorbereiding moet worden vermeden.
De inmenging van collagenase dissociatie met CXCR5 molecuul detectie werd omzeild door met uitzondering van de stap van de spijsvertering. Echter moet worden opgemerkt dat voor sommige weefsels zoals LP, mechanische verstoring is niet voldoende om te isoleren van de cellen en voor dergelijke weefsels, enzymatische spijsvertering vereist19zou worden. In de toekomst, is het essentieel voor het testen van alternatieve spijsvertering voorwaarden evenals spijsvertering-compatibele antilichaam klonen te omzeilen deze technische beperking voor weefsels die enzymatische processen van de spijsvertering. Tot dan, zal beeldvormingstechnieken zoals immuun fluorescentie microscopie blijven als de methode van keuze voor TFH detectie in deze weefsels. Behalve LP cellen isoleren, vereist het isolement van sommige deelverzamelingen hematopoietische cellen zoals DCs en plasmacellen van PPs enzymatische spijsvertering35. Als dienst van ons protocol, moeten onderzoekers die willen isoleren van deze cel subsets van PPs gebruiken de juiste enzymatische spijsvertering stap20. Mogelijke storingen van de enzymatische spijsvertering met de expressie van DC markers in overweging moet worden genomen en spijsvertering voorwaarden zo nodig moeten worden geoptimaliseerd. Wanneer isolatie van TFH en GC B cellen gewenst is naast een subset van de cel waarvoor collagenase spijsvertering36, KKS van elke muis verzameld kon worden gescheiden in twee groepen voor verwerking met en zonder collagenase behandeling in parallelle panelen.
De effecten van collagenase op PP lymfocyten waren niet beperkt tot de oppervlakte molecuul expressie. Onze resultaten bleek dat de enzymatische spijsvertering een relatieve daling in de verhouding van de lymfocyt binnen PP cellen op een dosis-afhankelijke manier (Figuur 7 veroorzaakt). De daling van de lymfocyt breuk mogelijk een gevolg van collagenase-gemedieerde release van andere soorten hematopoietische cellen zoals fagocyten en DCs subsets van PPs die groter en meer granulair dan lymfoïde cellen zijn. Het is ook mogelijk dat collagenase spijsvertering cel vrijlating gemedieerde uit naburige LP en geest compartimenten tot de verandering van FSC-WS profiel bijdragen kunnen. Deze cel besmetting van andere compartimenten van de darm kan ook interferentie veroorzaken in de flow analyse van PP lymfocyten. Op die basis om te maximaliseren cel zuiverheid, we ook voorkomen dat de toevoeging van reagentia zoals EDTA of DTT die algemeen worden gebruikt voor uittreksel epitheliale cellen en slijm20, weefsel voorbereiding voorwaarden houden als fysiologische en unmanipulated mogelijk. Ondanks deze negatieve effecten van de enzymatische spijsvertering, werden ook gunstige effecten op de PP lymfocyten ontdekt zoals verbetering van de intracellulaire kleuring en levensvatbaarheid van de cellen (figuur 7D-F, G). Echter, verdere analyses bleek dat deze effecten werden toegeschreven aan het proces van agitatie bij 37 ° C, onafhankelijk van de enzymatische spijsvertering omdat de levensvatbaarheid van de cellen en intracellulaire Foxp3 kleuring in vergelijkbare mate favoriet waren wanneer cellen werden geschud in het ontbreken van collagenase. Mechanistically, misschien het positieve effect van agitatie wel als gevolg van de verbeterde verwijdering van intestinale inhoud en slijm uit de KKS.
Kortom, hebben wij beschreven een gestroomlijnde protocol voor de isolatie van lymfocyten van PPs. geïsoleerd cellen kunnen worden gekleurd voor stroom cytometrische karakterisering van verschillende cel deelverzamelingen of kunnen worden onderworpen aan de cel Sorteren en vervolgens werkzaam in verschillende in vitro en in vivo functionele testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij wil Laura Strauss en Peter Sage dank voor nuttige discussies en steunen met stroom cytometry analyses.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD4 antibody | eBioscience, Biolegend* | 17-0041-81 ,10054* | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CD19 antibody | eBioscience | MA5-16536 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse PD-1 antibody | eBioscience | 61-9985-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse ICOS antibody | eBioscience | 12-9942-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse GL7 antibody | Biolegend | 144610 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CXCR5 antibody | Biolegend*, BD Bioscience | 145512*, 551960 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse BCL-6 antibody | Biolegend | 358512 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse Foxp3 antibody | eBioscience | 17-5773-82 | For detailed information see Table 1 |
| Streptavidin-BV421 | BD Bioscience | 563259 | For detailed information see Table 1 |
| FixableViability Dye | eBioscience | L34957 | For detailed information see Table 1 |
| 7AAD | Biolegend | 420404 | For detailed information see Table 1 |
| FcBlock (CD16/32) | BD Bioscience | 553141 | For detailed information see Table 1 |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 6-well,12-well & 96-well plates | Falcon/Corning | 353046,353043/3596 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 10 mL syringe-plunger | Exel INT | 26265 | |
| RPMI | Corning | 15-040-CV | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Orbital shaker | VWR | Model 200 | |
| Curved-end scissor | |||
| Fine Serrated Forceps | |||
| Small curved scissor |
References
- van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPα interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer’s patches: Organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).
- Heel, K. A., McCauley, R. D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. Review: Peyer’s patches. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 122-136 (1997).
- Fagarasan, S., Kinoshita, K., Muramatsu, M., Ikuta, K., Honjo, T. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413 (6856), 639-643 (2001).
- Hopkins, S. A., Niedergang, F., Corthesy-Theulaz, I. E., Kraehenbuhl, J. P. A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer’s patch dendritic cells. Cellular Microbiology. 2 (1), 59-68 (2000).
- Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches. Infection and Immunity. 71 (1), 504-509 (2003).
- Sato, A., Iwasaki, A. Peyer’s patch dendritic cells as regulators of mucosal adaptive immunity. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1333-1338 (2005).
- Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Y. Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways. Annals of the New York Academy of Sciences. 1247 (1), 97-116 (2012).
- Fagarasan, S., Kawamoto, S., Kanagawa, O., Suzuki, K. Adaptive Immune Regulation in the Gut: T Cell-Dependent and T Cell-Independent IgA Synthesis. Annual Review of Immunology. 28, 243-273 (2010).
- Hase, K., et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH + bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).
- Wu, H., et al. An Inhibitory Role for the Transcription Factor Stat3 in Controlling IL-4 and Bcl6 Expression in Follicular Helper T Cells. Journal of Immunology. 195 (5), 2080-2089 (2015).
- Vinuesa, C. G., Tangye, S. G., Moser, B., Mackay, C. R. Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity. Nature Reviews Immunology. 5 (11), 853-865 (2005).
- Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal Centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
- Vaeth, M., et al. Store-Operated Ca2+Entry in Follicular T Cells Controls Humoral Immune Responses and Autoimmunity. Immunity. 44 (6), 1350-1364 (2016).
- Meli, A. P., et al. The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance. Immunity. 45 (4), 831-846 (2016).
- Fu, W., et al. Deficiency in T follicular regulatory cells promotes autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 815-825 (2018).
- Espéli, M., Walker, J. M. T follicular helper cells - Methods and Protocols. , (2015).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visual Experiments. (111), e54114 (2016).
- De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer’s Patches. Journal of Visual Experiments. (73), e50167 (2013).
- Pastori, C., Lopalco, L. Isolation and in vitro Activation of Mouse Peyer’s Patch Cells from Small Intestine Tissue. Bio-protocol. 4 (21), e1282 (2014).
- Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. Journal of Visual Experiments. (58), 3225 (2011).
- Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).
- Bollig, N., et al. Transcription factor {IRF4} determines germinal center formation through follicular T-helper cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Science of U. S. A. 109 (22), 8664-8669 (2012).
- Pérez-Mazliah, D., et al. Follicular Helper T Cells are Essential for the Elimination of Plasmodium Infection. EBioMedicine. 24, 216-230 (2017).
- Sage, P. T., Sharpe, A. H. T follicular regulatory cells in the regulation of B cell responses. Trends Immunology. 36 (7), 410-418 (2015).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. Journal of Immunological Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
- Meenan, J., et al. Altered expression of alpha 4 beta 7, a gut homing integrin, by circulating and mucosal T cells in colonic mucosal inflammation. Gut. 40 (2), 241-246 (1997).
- Cao, A. T., et al. Interleukin (IL) -21 promotes intestinal IgA response to microbiota. Mucosal Immunology. 8 (5), 1072-1082 (2015).
- Wei, J., et al. Autophagy enforces functional integrity of regulatory T cells by coupling environmental cues and metabolic homeostasis. Nature Immunology. 17 (3), 277-285 (2016).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. 33 (S1), (2017).
- Bergqvist, P., Gardby, E., Stensson, A., Bemark, M., Lycke, N. Y. Gut IgA Class Switch Recombination in the Absence of CD40 Does Not Occur in the Lamina Propria and Is Independent of Germinal Centers. Journal of Immunology. 177 (11), 7772-7783 (2006).
- Keil, B., Gilles, A. M., Lecroisey, A., Hurion, N., Tong, N. T. Specificity of collagenase from Achromobacter iophagus. FEBS Letters. 56 (2), 292-296 (1975).
- Mora, J. R., et al. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer’s patch dendritic cells. Nature. 424 (6944), 88-93 (2003).
- Reboldi, A., et al. Mucosal immunology: IgA production requires B cell interaction with subepithelial dendritic cells in Peyer’s patches. Science. 352 (6287), (2016).
