Summary
Dans cette étude, nous présentons un roman et un protocole efficace pour isoler des lymphocytes de plaques de Peyer (PPs), qui peuvent être utilisés ultérieurement pour des essais fonctionnels in vivo et in vitro , mais aussi des études cytométrie en flux de T folliculaire d’assistance et des cellules germinales Centre B.
Abstract
Dans la muqueuse de l’intestin, cellules immunitaires constituent une entité unique immunologique, ce qui favorise la tolérance immunitaire tout en conférant simultanément des défenses immunitaires contre les agents pathogènes. Il est bien établi que de Peyer (PPs) ont un rôle essentiel dans le réseau de système immunitaire muqueux en accueillant plusieurs effecteur T et cellules B sous-ensembles. Une certaine fraction de ces cellules effectrices, les folliculaire T helper (TFH) et les cellules de B de centre germinatif (GC) sont professionnalisé dans la régulation de l’immunité humorale. Par conséquent, la caractérisation de ces sous-ensembles de cellules au sein du PPs quant à leur programme de différenciation et les propriétés fonctionnelles peut fournir des informations importantes concernant l’immunité des muqueuses. À cette fin, une méthode facilement applicable, efficace et reproductible d’isolement de lymphocyte de PPs serait utile aux chercheurs. Dans cette étude, nous avons cherché pour générer une méthode efficace pour isoler des lymphocytes de souris PPs avec rendement élevé cellulaire. Notre approche a révélé qu’évoluées telles que l’utilisation de réactifs digestifs et agitation de tissu, le tissu initial ainsi que cell coloration de conditions et de sélection des panneaux d’anticorps, ont une grande influence sur la qualité et l’identité des lymphocytes isolés et sur résultats expérimentaux.
Nous décrivons ici un protocole permettant aux chercheurs d’isoler efficacement les populations de lymphocytes de PPs permettant l’évaluation reproductible écoulement cytometry des sous-ensembles de T et les lymphocytes B se concentrant principalement sur des sous-ensembles de cellules TFH et GC B.
Introduction
Le tube digestif entier dès le début à la fin est paré avec un vaste réseau lymphoïde qui contient des cellules immunitaires plus que tout autre organe chez l’homme et la souris1. Peyer de patchs (PPs) constituent une composante majeure de la branche intestinale de cet organisme immunitaire cellulaire, ce qu’on appelle tissu lymphoïde associé au tube digestif (GALT)2,3. Au sein de PPs, des milliers de millions d’antigènes provenant des matières alimentaires, agents pathogènes et le microbiote commensal sont échantillonnés en permanence et quand nécessaire les réponses immunitaires appropriées à leur égard sont monté immunitaire intestinal donc maintenant homéostasie. En ce sens, PPs peuvent être nommés comme « les amygdales de l’intestin grêle ». PPs sont constitués de grands compartiments secondaires : dôme sous-épithéliaux (SED), grandes zones de follicule de B-cellule ; l’épithélium de follicule associée sus-jacente (EAF) et interfolliculaire région (aux instruments IFR) où les cellules T sont situé au4. Ce cloisonnement unique des sous-ensembles de cellules effectrices différents PPs permet de coopérer, confère ainsi, immunocompétence dans le tube digestif.
PPs manquent de vaisseaux lymphatiques afférents, et pour cette raison, antigènes transportés à PPs d’intestin grêle ne sont pas en cours par l’intermédiaire des vaisseaux lymphatiques contrairement à la plupart des autres organes lymphoïdes. Au lieu de cela, les cellules épithéliales spécialisées situés dans EAF, appelées cellules M, sont responsables pour le transfert des antigènes luminaux dans le PPs5. Par la suite, les antigènes transportés sont captés par les cellules dendritiques (CD) et les phagocytes qui sont trouvent dans la région de dôme sous-épithéliaux (SED) sous les EAF6,7. Ce processus de tri antigène par DCs dans le PP est crucial pour initier la réponse immunitaire adaptative8 et la génération ultérieure d’IgA sécréteur cellules9.
En raison du lourd fardeau antigénique de la flore commensale et matériel alimentaire, PPs hôte endogène activé effecteur T et cellules B sous-ensembles en grande abondance par exemple TFH et IgA+ GC B cellules10, suggérant que le PPs représentent un site d’immunitaire active réponse11. Détection jusqu'à 20-25 % cellules CD4 total FOH+ T cell compartiment et jusqu'à 10 à 15 % GC B cellules au sein des cellules B totales est possible en PPA prélevés non immunisés de souris C57BL/6 jeunes12. Contrairement à d’autres types de cellule auxiliaire T (i.e., Th1, Th2, cellules Th17), TFH cellules présentent tropisme unique follicule lymphocytes B, principalement en raison de l’expression CXCR5, qui promeut le homing cellule TFH le long du gradient CXCL1313. Dans les zones de follicule de lymphocytes B du PPs, cellules TFH induisent la recombinaison de commutateur de classe IgA et le hypermutation somatique dans les lymphocytes B activés d'où haute affinité IgA produisant des cellules différencient le14. Par la suite, ces plasmocytes sécrétant des anticorps migrent vers la lamina propria (LP) et réguler l’homéostasie immunitaire dans le tube digestif10.
Identification et caractérisation des populations de cellules TFH et GC B dans PPs pourraient permettre aux chercheurs étudier la dynamique de la réponse immunitaire humorale dans des conditions d’équilibre sans avoir besoin de modèles de vaccination chronophage utilisé traditionnellement en TFH-GC B cellule études15,16,17,18. Analysant les cellules TFH dans PPs n’est pas aussi simple que les autres sous-ensembles de cellules. Défis techniques comprennent l’identification des conditions de préparation de tissu idéal, combinaison anticorps-marqueur de surface, mais aussi de sélectionner des contrôles positifs et négatifs appropriés. Champs de recherche tant TFH et PP pièce grande variabilité en termes de procédures expérimentales et sont loin de conférer un consensus afin d’établir des protocoles standardisés pour différentes raisons. Tout d’abord, chaque sous-ensemble de cellules au sein du PPs tend à être affectées différemment par les conditions de préparation des tissus nécessitant des modifications supplémentaires dans une manière de sous-ensemble spécifique de cellule. Deuxièmement, il y a un écart important entre les méthodes signalées concernant les détails de la préparation de cellules de PPS. Troisièmement, le nombre d’études comparatives basées sur le protocole étudie les techniques de préparation des tissus idéal et conditions expérimentales pour PP et TFH recherche est plutôt limité.
Les études actuelles basées sur le protocole suggérés pour PP cellule préparation19,20,21,22 n’étaient pas TFH - ou GC axée sur les lymphocytes B. En outre, certaines conditions de préparation de tissus recommandées pour PPs19,20 comme la digestion de collagénase base trouvées d’affecter le résultat de l’identification de TFH par cytométrie18. Sur cette base, nous avons pensé qu’un protocole optimisé, standardisé et reproductible qui peut être utilisé pour étudier la dynamique de cellules TFH et GC B dans PPs pourrait se révéler utile aux enquêteurs travaillant sur le sujet. Ce besoin nous a donné l’élan nécessaire pour générer un protocole amélioré et à jour pour l’isolement et la caractérisation des lymphocytes PP finement optimisée pour la récupération de cellulaire, la viabilité et l’efficacité pour la caractérisation de cytométrie en flux de plusieurs T et B sous-ensembles de cellules. Nous visait également à exclure plusieurs étapes de préparation laborieuse suggérés dans les protocoles antérieurs, ainsi, réduire les manipulations nécessaires et le temps de préparation de tissus et de cellules de PPs.
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Protocol
Toutes les études et les expériences décrites dans le présent protocole ont été effectuées en vertu des lignes directrices selon Institutional Animal Care et utilisation Comité (IACUC) de Beth Israel Deaconess Medical Center.
1. conception de montage expérimental et des groupes de souris
- (Facultatif) La maison conjointement les souris expérimentales afin de faciliter la transmission horizontale du microbiote intestinal entre souris expérimentales et à réduire la variabilité non spécifiques au sein des lymphocytes PP. En outre, utiliser des contrôles de la même portée du même sexe afin de minimiser la variabilité.
2. chirurgicale Excision et étapes de préparation de tissus :
- Ablation chirurgicale de l’intestin grêle (is)
- Euthanasier la souris à l’aide de CO2 asphyxie ou toute autre méthode équivalente approuvée par le Comité institutionnel d’éthique animale.
- Transférer la souris dans un espace dédié pour excision chirurgicale. Placer le dos vers le bas et assainir l’abdomen avec l’éthanol à 70 %. Effectuer une laparotomie en coupant la peau abdominale et le péritoine le long de la ligne médiane du pubis à la cage thoracique, ouvrant ainsi la cavité péritonéale.
Remarque : Effectuez la première incision sur une zone relativement petite de la peau afin d’éviter de pénétrer dans la cavité péritonéale et endommager les tissus intestinaux. Continuer l’excision jusqu'à la frontière anatomique désirée. - Identifier le caecum, qui est un point de repère idéal pour la détection de l’iléon terminal, ce qui constitue le segment distal de l’intestin grêle.
NOTE : Caecum se trouve habituellement sur le côté inférieur gauche de l’abdomen de la souris. - Localiser la jonction iléo-caecale et faites une coupe à ce niveau aussi distale que possible de séparer l’intestin grêle du caecum. Dans l’ensemble les prochaines étapes, évitez un contact physique excessif avec la paroi intestinale car PPs fragiles s’effondrer facilement au toucher.
- Retirez délicatement l’intestin entier jusqu'à ce que le sphincter pylorique en coupant le mésentère à l’aide de ciseaux. Identifier la jonction entre le pylore et du duodénum, et découper le duodénum à ce niveau, ce qui conduira à compléter le détachement de l’intestin grêle de la cavité abdominale.
NOTE : (i) éviter hyperextension car cela pourrait provoquer la rupture de la paroi intestinale. (ii) si isolement lymphocytaire LP est souhaitée en plus de lymphocytes PP, le retrait complet de la graisse mésentérique est nécessaire. Toutefois, pour l’isolement de PP seulement, restant la graisse mésentérique pourrait fournir certains avantages pendant les nouvelles mesures d’isolement ; par conséquent, il devrait être préservé. - Intestin grêle place détaché dans une plaque 6 puits remplis de RPMI froid + 10 % sérum fœtal (SVF) et agiter délicatement les tissus manuellement jusqu'à ce que tous les segments intestinaux sont immergés dans les médias froids. Maintenir les tissus sur la glace tout au long des prochaines étapes.
- Après dissection le nombre désiré de souris petits intestins, procéder à l’excision de PP de collectées petit intestin.
- Excision chirurgicale des PPs et préparation de la Suspension cellulaire unique :
- Doucement, l’intestin grêle de transfert sur une serviette en papier, en la saisissant la graisse mésentérique avec une pincette et placer le côté mésentérique vers la serviette en papier. Humidifier l’ensemble du segment intestinal avec froid RPMI + 10 % FBS pour éviter la déshydratation des tissus et rigidité.
NOTE : Restant de graisse mésentérique peut être utile à ce stade parce que les segments de tissu graisseux sur le site mésentérique de SI seront en tiendra à la serviette de papier gardant le site anti-mésentérique vers le haut. - Identifier le PPs, qui apparaissent comme blancs agrégats sphériques multiples dans une forme « chou-fleur » sur le côté anti-mésentérique de la paroi intestinale.
Remarque : Débusquer le contenu luminal est déconseillé jusqu'à ce que tous les PPs sont excisés. Vider le contenu luminal pourrait entraîner l’effondrement du PPs et empêchera le contraste de couleur entre les PPs et la paroi intestinale, ce qui est très utile pour l’identification visuelle des PPs. - Après avoir identifié les PPs sur le côté anti-mésentérique, placez le ciseaux bout courbé chirurgicale sur PPs (courbe devrait faire face vers le haut) interdisant la PP de sa bordure distale et proximale.
Facultatif : Poussez le PP doucement vers les lames des ciseaux bout du doigt. Cette manœuvre entraînera l’exclusion mieux des non-PP tissus environnants. L’accise le PPs doucement, à l’exclusion de tissu intestinal environnant.
NOTE : (i) cette étape est fondamentale obtenir le rendement maximal des cellules PP tout en réduisant au minimum la contamination de la cellule des voisins compartiments intestinaux tels que LP et l’épithélium intestinal, qui sont aussi riches en lymphocytes T. (ii) d’un SI excisé de souris C57BL/6, 5-10 PPs (de taille moyenne, multiples sphériques) peuvent être collectées. En visant une encore plus petites PPs (pas multiples sphériques), collection de jusqu'à 12-13 PPs par souris (C57BL/6) est possible en utilisant ce protocole. - Transfert le PPs excisé à une plaque de culture de tissu de 12 puits remplis de glacee RPMI + 10 % FBS et entretenues sur glace à l’aide de forceps ou ciseaux chirurgicaux incurvé.
NOTE : (i) immédiatement après l’excision de PPs, mucus et contenu intestinal sur la surface PP peuvent être nettoyés en frottant le tissu délicatement sur du papier absorbant. Cette étape permettra d’améliorer la viabilité des lymphocytes PP. (ii) au lieu de transférer le PPs sur une plaque, transférant à séparés des tubes peut également considérer selon le nombre total de l’échantillon. - Facultatif : Lorsque l’excision PP et placement ultérieur dans le puits de la plaque sont terminées, le nombre et la taille des PPs prélevés dans des groupes différents expérimental/souris peuvent être documentées en prenant une photo de la plaque de culture tissulaire contenant du PPs.
- Préparer une série de tubes coniques de 50 mL contenant 25 mL de RPMI + 10 % SVF (préchauffé à 37 ° C). À l’aide d’une paire de ciseaux, couper le bord d’une pointe µL 1 000 de la distance qui permettra à l’aspiration du PPs avec pipette 1 mL. Aspirer le PPs avec pipette 1 mL et transférer de la plaque de culture de tissu de 12 puits sur les tubes coniques de prêt de 50 mL.
Remarque : Utiliser un nouvel embout pour chaque échantillon de souris pour éviter la contamination croisée entre les échantillons. - Fixer le couvercle et placer les tubes verticalement dans un agitateur orbital à 37 ° C, sous agitation continue à 125 à 150 tr/min pendant 10 min. Pendant ce temps, préparer une nouvelle série de tubes de 50 mL et placer une crépine de cellule de 40 µm sur le dessus de chaque tube, à travers lequel suspension monocellulaire sera préparée.
NOTE : (i) l’étape agitation supprimera les débris contenus, de mucus et de cellules intestinales restants, qui diminue la viabilité des cellules et la récupération des lymphocytes PP si il n’est pas supprimé. (ii) ne s’appliquent pas n’importe quel type d’enzymes digestives sur tissu PP parce que le processus de digestion entraîne une perte dramatique d’expression CXCR5 de la surface cellulaire. - Après l’agitation, transférer le PPs à la crépine de cellule de 40 µm sur le dessus les tubes nouvellement préparé conique de 50 mL. En utilisant le côté arrondi d’un piston de seringue de 10 mL, perturber doucement le PPs à travers le tamis cellulaire pour générer suspension monocellulaire. Rincer la crépine avec 15 à 20 mL de froid RPMI + 10 % FBS.
NOTE : (i) avant de filtrer, secouer les tubes contenant le PPs horizontalement. Cette secousse brève facilitera le transfert des PPs dans les crépines de cellule. (ii) en utilisant une passoire de cellule de 70 µm pour isoler des cellules immunitaires non lymphoïdes (e.g., monocytes, macrophages, DCs) est recommandé. - Centrifuger les suspensions unicellulaires à 350 – 400 g pendant 10 min à 4 ° C.
- Soigneusement, éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules à une concentration de 10 x 106 cellules/mL. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
NOTE : (i) avant de comptage de cellules, le nombre total de cellules pour chaque groupe de souris PP peut être environ estimée selon la formule suivante : « à 0,5 ou 1 x 106 cellules (nombre de PPs) x = nombre total de cellules ». Autres dilutions avec trypan blue pour le comptage des cellules peuvent être nécessaires. (ii) comme alternative au comptage manuel, compteurs de cellules automatisées peuvent être utilisés. - 2-2. 5 x 106 cellules en volume approprié de transférer (e.g., 200 µL) dans une plaque 96 puits fond rond.
Remarque : Pour les unicolores et des échantillons de contrôle négatif, 0,5 à 1 x 106 cellules pourraient suffire. - Centrifuger la plaque à 350 x g pendant 5 min à 4 ° C. Mettez la plaque.
- Laver les cellules dans 200 µL de tampon de coloration.
- Doucement, l’intestin grêle de transfert sur une serviette en papier, en la saisissant la graisse mésentérique avec une pincette et placer le côté mésentérique vers la serviette en papier. Humidifier l’ensemble du segment intestinal avec froid RPMI + 10 % FBS pour éviter la déshydratation des tissus et rigidité.
3. surface anticorps
- Viabilité de coloration :
- Après le lavage final, remettre en suspension les cellules de 100 μL de viabilité fixable colorant dilué dans du PBS (1:1, 000). Incuber pendant 30 minutes sur la glace ou à 4 ° C dans l’obscurité.
NOTE : (i) intracellulaire de coloration pour la détection des clés transcription facteurs comme Foxp3 ou Bcl-6 exige la fixation des cellules. Dans ce cas, non réparable viabilité colorants (par exemple., 7-AAD, DAPI) ne peut pas être utilisé. (ii) afin de diluer le colorant de viabilité réparable, n’utilisez pas n’importe quel tampon coloration qui contient des protéines. Les médias utilisés dans cette étape doivent être exempt de protéines. (iii) l’exclusion des cellules mortes à l’aide de coloration de la viabilité est cruciale car les cellules mortes peuvent causer de graves difficultés techniques d’analyse en cytométrie en flux en émettant l’autofluorescence et par des anticorps de surface de liaison non spécifique, qui pourrait conduire à fausses résultats positifs. - Laver les cellules deux fois avec le tampon de coloration. Centrifuger à 350 x g pendant 5 min à 4 ° C. Mettez la plaque.
- Après le lavage final, remettre en suspension les cellules de 100 μL de viabilité fixable colorant dilué dans du PBS (1:1, 000). Incuber pendant 30 minutes sur la glace ou à 4 ° C dans l’obscurité.
- Bloc de FC et Surface - couche I:
- Préparer la solution de Fc-bloc en diluant les anticorps anti-CD16/32 (1 : 200) dans la mémoire tampon de coloration.
- Remettre en suspension les cellules de 20 μL de solution préparée de Fc-bloc. Incuber pendant 15 minutes sur la glace.
- Sans laver, ajouter 80 μL de surface anticorps cocktail (voir le tableau 1 pour la synthèse d’anticorps) préparés à des dilutions appropriées. Incuber sur glace pendant au moins 30 min.
- Laver deux fois en ajoutant tampon coloration excessive. Centrifuger à 350 x g pendant 5 min à 4 ° C. Mettez la plaque.
- Surface - couche II :
- Préparer la solution colorante streptavidine en diluant fluorochrome conjugué streptavidine dans le tampon de coloration.
- Après le lavage final, remettre en suspension les cellules avec 100 μL de streptavidine préalablement diluée (1/100) solution de coloration. Incuber pendant au moins 15 minutes sur la glace dans l’obscurité.
- Laver deux fois avec le tampon de coloration. Centrifuger à 350 x g pendant 5 min à 4° C. Mettez la plaque.
Facultatif : Si coloration intracellulaire pour T réglementaires folliculaires détection n’est pas souhaitée, après le dernier lavage, remettre en suspension les cellules dans 200 μl de tampon et le transfert dans les tubes appropriés en vue d’acquérir des données dans le cytomètre en flux de coloration. Lorsque les échantillons ne sont pas fixes, acquisition de données par cytométrie en flux doit être effectuée dans les 3 à 4 h afin d’obtenir des résultats précis.
4. cellule Fixation
- Préparer la solution de travail de fixation/perméabilisation (Fix/Perm) en utilisant les réactifs de Foxp3/Transcription Factor coloration Set de tampon. Mélanger une partie de fixation/perméabilisation concentré avec trois pièces de fixation/perméabilisation diluant jusqu’au volume final souhaité.
- Après le lavage final, remettre en suspension les cellules dans 200 μl de solution de travail Fix/Perm.
- Incuber les plaques sur la glace ou à 4 ° C pendant 20 min. Ne dépassez pas 20 min pour cette étape. Temps d’incubation plus long pourraient diminuer fortement la récupération de la cellule.
- Centrifuger à 350 x g pendant 5 min à 4 ° C. Mettez la plaque. (Facultatif) Après cette étape, les cellules fixes peuvent être stockés pendant plusieurs jours à 4 ° C dans un tampon contenant de l’albumine sérique bovine (BSA) la coloration ou FBS jusqu'à intracellulaire coloration ou écoulement cytometry acquisition ultérieure.
- Remettre en suspension les cellules dans 200 μl de perméabilisation tampon (x1) fraîchement préalablement dilué dans l’eau désionisée purifiée.
- Centrifuger à 350 x g pendant 5 min à température ambiante (RT).
- Laver une fois avec 200 μl de tampon de perméabilisation et centrifuger à 350 x g pendant 5 min à température ambiante.
5. intracellulaire de coloration
- Préparer la solution de Fc-bloc en diluant les anticorps anti-CD16/32 (1 : 200) dans un tampon perméabilisation.
Remarque : Après l’étape de fixation, les cellules doivent être maintenues dans un tampon perméabilisation jusqu'à la fin du processus de coloration intracellulaire. - Après le lavage final, remettre en suspension les cellules de 20 μL de solution Fc-bloc. Incuber pendant 10 à 15 min à ta dans l’obscurité.
- Sans laver, ajouter 80 μL de cocktail intracellulaire anticorps (volume final de 100 μL) préalablement dilué dans un tampon perméabilisation. Incuber 30 min à température ambiante.
- Ajouter 100 μL de tampon de Perm et centrifuger à 350 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Laver une fois avec 200 μL de tampon de perméabilisation, centrifuger à 350 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Après le lavage final, remettre en suspension les cellules dans 200 μl de tampon de coloration et transférer les cellules dans les tubes appropriés (volume final de 400 ml dans le tampon de marquage) et acquisition de données par cytométrie en flux. Les échantillons colorés en plaque 96 puits peuvent également être exécutés sans transférer dans des tubes si un cytomètre en flux avec option de lecteur de plaque est disponible. Cette étape minimise la perte de cellules pendant le transfert de cellule.
- Acquérir un minimum de 5 x 105 cellules total sur le cytomètre en flux pour pouvoir effectuer une analyse reproductible de TFH, ISF ainsi que GC B des cellules.
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Representative Results
Contrairement à un précédent protocole20, nous avons observé que le PPs ne sont pas répartis uniformément sur le SI mais sont localisées plus dense vers les extrémités proximales et distales de l’is, comme le montre Figure 1 a. Analyse en cytométrie en flux a montré que, si suivies correctement, notre protocole donne une population de lymphocytes PP illustrant la distribution de diffusion vers l’avant-latérale semblable à splénocytes (Figure 2 aE et 2D, H) avec > 95 % de cellules viabilité (Figure 2 b et 2F). Contrairement aux autres organes lymphoïdes secondaires (SLO), chez les souris C57BL/6 environ 70 à 80 % des lymphocytes totaux de PP constitués de cellules de B, alors que CD4+ T les cellules constituent seulement 10 à 15 % des lymphocytes totaux de PP (Figure 2 et 2 G).
Veuillez noter que CD4+ CD19+ cellules doubles positives (DP) constituent ≈ 1 % des lymphocytes totaux de PP. Avec certaines précautions lors de la préparation de cellules comme exécutant Fc-bloc contre les récepteurs Fc des cellules B et à l’exclusion des doublets, CD4+ CD19+ DP population cellulaire pourrait être minimisé (Figure 3 a et B). Toutefois, une fraction du DPs qui ne démontre pas de caractéristiques de dispersion vers l’avant (FSC) des doublets est inévitable et doivent être dépendants sur des portes T et les lymphocytes B positifs unique (Figure 3 b). Nos résultats ont révélé que des cellules B dans les cellules DP CXCR5 très explicite sur leur surface (Figure 3) qui peut-être conduire à des résultats faussement positifs dans la porte de TFH qui est ajustée basée sur expression CXCR5 CD4+ T des cellules. En revanche, nous avons constaté que GL7, un marqueur des lymphocytes B activés, s’exprime également dans CD4+ CD19+ DP cellules (Figure 3D), qui peut provoquer des interférences dont le GC B cell.
Exemples de cellule TFH et GC B bloquant les algorithmes sont illustrés dans la Figure 4. Nous utilisons pour GC B cellule Gate, GL7 étiquetage contre CD38, qui identifie les cellules GC B comme GL7+ CD38 cellules de B– (Figure 4 a-B). PNA étiquetage pourrait être utilisé à la place GL723 que CD38 peut être remplacée par un des marqueurs suivants : IgD, Bcl-6 et CD95. Alternative gating stratégies pour cellules GC B sont illustrés dans le Figure S1. Rapport cellule GC B en PPA montre la grande variabilité chez les souris C57BL/6. Toutefois, par rapport aux autres ALS, PPs ont rapport de cellule GC B significativement plus élevée avec une gamme de 2 à 10 % des cellules de B totales en vertu de l’état d’équilibre. Blocage de stratégie pour les cellules PP TFH est décrit comme CD19– CD4+ PD-1Salut CXCR5+ T cells (Figure 4 a, C). « Zebra tracer » s’est avéré pour être une méthode de démonstration optimale pour TFH blocage car il dépeint PD-1Salut population plus discrètement par rapport à d’autres types de terrain (Figure 4). TFR, un sous-ensemble de cellules TFH exprimant Foxp3, sont bloquées comme CD19– CD4+ PD-1Salut CXCR5+ Foxp3+ T cells (Figure 4). Comme les cellules GC B, la fraction cellulaire TFH varie également chez les individus de souris non immunisées avec une gamme de 10 à 20 % du total CD19– CD4+ PP lymphocytes. Détails des algorithmes de gating alternatifs pour les cellules TFH sont décrites dans Figure 4E, F et Figure S1C, D.
Pour éviter les fausse positivité en raison de la coloration de fond et d’autofluorescence, isotype contrôles ou des contrôles équivalents alternatives comme la Fluorescence Minus One (FMO) devraient être inclus dans le panneau de coloration comme témoin négatif pour les marqueurs de cellule TFH et GC B ( Figure 4-J).
Pour optimiser les conditions de préparation du tissu PP, nous avons développé une nouvelle stratégie expérimentale contrôlée en interne, dans lequel PPs ont été prélevés sur une souris individuelle et groupés séparément selon leurs origines anatomiques (p. ex.., duodénal, iléal). Pour réaliser des expériences, PPs mis en commun ont été assignés à différents groupes de sorte que chaque expérimentales et le groupe de contrôle comprenait un nombre égal de PPs de chaque région anatomique (Figure 5 a). Par cette approche, nous avons trouvé cette digestion enzymatique axée sur la collagénase (testé à 37,5 mg de collagénase II ou IV / 25 mL du mélange digestion = 1,5 mg/mL), qui est couramment utilisé pour l’isolement de lymphocyte de divers tissus muqueux, CXCR5 considérablement réduit expression dans les lymphocytes PP (Figure 5 b), en particulier dans les cellules TFH (Figure 5F-j’ai), tandis que l’expression d’autres molécules de surface (p. ex.., CD19, CD4) est resté intact (Figure 5 C-E). Réduction de détection CXCR5 dominait afin que l’expression de CXCR5 sur les cellules TFH collagénase traitées était presque impossible à distinguer de l’isotype contrôle (Figure 5F-j’ai). D’autres expériences ont montré que le niveau de brouillage de la digestion enzymatique avec CXCR5 expression dépendait le clone d’anticorps CXCR5 utilisé (Figure 6 a-F). Plus précisément, par traitement de collagénase II, la capacité de détection du clone d’anticorps CXCR5 2 8 était plus considérablement affaiblie, que la capacité de détection du clone CXCR5 anticorps L138D7 (Figure 6 a-D).
Digestion enzymatique réduit non seulement l’expression de CXCR5, mais aussi la proportion de lymphocytes totaux dans les cellules PP tel que déterminé par les caractéristiques de FSC-SSC, tout en une fraction considérable des cellules isolées de digéré PPs exposés vers l’avant et de côté dispersion d’une intensité plus élevée que les lymphocytes PP (Figure 7 a-C). Les effets de la collagénase sur le rétablissement de la cellule s’est produite de manière dose-dépendante (Figure 7 a, H-J). Digestion enzymatique augmente la viabilité cellulaire (Figure 7, E). Cependant, cet avantage n’était pas causatively lié à la digestion de collagénase parce que les cellules isolées de PPs après l’agitation sans collagénase ont favorisé de même (Figure 7F). La détection du facteur de transcription nucléaire Foxp3, qui est ici un intérêt particulier car il est habituellement évaluée lors de l’isolation de TFH pour identifier les cellules de l’ISF, a été améliorée par l’agitation à 37 ° C, quelle que soit la digestion de collagénase (Figure 7 ).
Figure 1 : structure macroscopique et la répartition anatomique du murin de Peyer. (A). une image obtenue de duodénal-partie de l’intestin grêle à l’estomac. Deux PPs-situé près du duodénum sont indiquées par des flèches noires. (B). PPs prélevés dans onze souris C57BL/6 ont été stockées individuellement dans une plaque de 12 puits. (C). Image de souris fraîchement excisées PPs affichée sur un tamis de cellule de 40 µm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : débit caractérisation par cytométrie en flux et algorithme de base gating pour lymphocytes PP. (A). les parcelles Dot démontrent la distribution des lymphocytes PP interprétations fraîchement isolées le long des axes FSC et SSC qui montrent la grande similitude de splénocytes représentés en (D). (B). Exclusion des cellules mortes au moyen de l’expression de 7AAD. 7AAD– cellules représentent des cellules vivantes. (C). CD19 et axée sur les CD4 immunophénotypage des cellules T et B parmi des dépendant des cellules vivantes de PP. (E.-g.). Analyse des flux représentatif des lymphocytes PP fixes. (H). caractéristiques d’écoulement représentatif des splénocytes fixes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : CD4+ CD19+ Double positif (DP) cellules cause fausse positivité à TFH et GC B cellule blocage. (A). CD4+CD19+ DP lymphocytes dans des cellules vivantes de PP sont démontrés. (B). cellules de séparation de DP selon FSC caractéristiques comme les doublets et maillots de corps. (C,D). CXCR5 et GL7 expression des cellules DP sont représentés dans les parcelles de l’histogramme. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : stratégie de blocage de cellules représentant TFH et GC B. PPs ont été prélevés dans une souris 3 - mois, et les lymphocytes ont été isolés comme décrit dans la section protocole. Étiquetage CD19 (A) et de CD4 des lymphocytes direct de PP sont représentés. (B) CD38lo GL7SalutCD19+ B cellules étaient bloquées comme cellules GC B. (C), TFH cellules étaient bloquées comme CXCR5+PD-1Salut CD4+ cellules. (D) TFR cellules sont une fraction des cellules TFH exprimant le facteur de régulation spécifique des cellules transcription Foxp3 ainsi que des marqueurs TFH et sont bloquées comme CXCR5+ PD-1Salut Foxp3+ CD4+ T des cellules. (E-F) Gating stratégie pour TFH marqueurs de surface a confirmé en splénocytes isolement de souris NP-OVA-vaccinés au moyen de l’expression de BCL-6. (G-J) Contrôles de fluorescence Minus One (FMO) clé TFH-TFR et marqueurs de cellules GC sont représentés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : digestion enzymatique axée sur la collagénase conduit à une réduction massive de détection CXCR5. PPs (A) d’une souris à 2 mois situé dans le duodénum (≈ 1/3 proximal), le jéjunum (≈ 1/3 moyen) et l’iléon (≈ 1/3 distal) ont été recueillies et regroupées séparément. PPs mis en commun ont été également distribués aux groupes expérimentaux. Digestion enzymatique avec la collagénase II ou IV à concentration de 1,5 mg/mL a été réalisée en agitant pendant 10 min à 37 ° C. (B-E) Histogramme des parcelles représentant l’expression de molécules de surface (CXCR5, CD19, PD-1, CD4) des cellules isolées de PPs qui ont été soumis à la digestion de collagénase-basé. (F-I) TFH blocage au sein de la collagénase administrés et groupes témoins est démontrée dans les parcelles de zèbre. Les données représentent trois expériences indépendantes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : l’effet de collagénase sur l’expression CXCR5 a montré la grande différence selon le clone d’anticorps anti-CXCR5. PP lymphocytes prélevés sur une souris de 6 mois, mise en commun et séparés en différents groupes au sujet de l’anticorps clone demande digestion enzymatiques et utilisés. (A-F) La proportion de cellules TFH est représentée dans les parcelles de zèbre dans les limites des gated direct, CD19– CD4+ T des cellules. (A, C et E) PP cellules ont été colorées avec l’anticorps conjugué Biotine de CXCR5 d’anti-souris (2 8 clone), streptavidine conjugué fluorochrome BV421. (B, D et F) PP cellules ont été colorées avec un anticorps primaire de CXCR5 du anti-souris conjugué (clone L138D7). (A-B) TFH gating parcelles de lymphocytes PP non digérés. (C-D) PPs digérés par la collagénase II (20 mg/25 mL du mélange de la digestion) et agités pendant 10 min à 37 ° C. Les données représentent deux expériences indépendantes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : digestion axée sur la collagénase et l’agitation à 37 ° C influent sur la viabilité des cellules, de récupération et d’efficacité coloration intracellulaire. 3 souris C57BL/6 mois a été sacrifié ; PPs ont été recueillis et mis en commun tel que décrit dans la Figure 5 a. (A) après la collection de PPs, les tissus ont été agité en présence de collagénase II (37.5 mg/25 mL de mélange digestion) pendant 10 min, FSC et SSC caractéristiques des cellules PP fixes sont représentés en (A) et viabilité coloration intrigue est représentée en) D). (B, E) après le prélèvement du PPs, les tissus se trouvaient sur la glace sans agitation ou digestion enzymatique ; FSC et SSC caractéristiques des cellules fixes de PPs sont représentés en (B) et coloration de viabilité est représentée dans (E). (C, F) Après le prélèvement du PPs, les tissus ont été agitées à 125-150 tr/min pendant 10 min à 37° C en l’absence de collagénase ; Caractéristiques FSC et SSC et viabilité la coloration des cellules PP fixes sont représentés (C, F), respectivement. (G) Comparaison d’expression Foxp3 dans les lymphocytes T régulateurs isolées de PPs agités et unagitated sans administration de collagénase est représentée dans le graphique de l’histogramme. (H.-j.) PPs prélevés dans une souris C57BL/6 6 - mois et ont été traités avec différentes concentrations de collagénase II : 25 mg / mélange de 25 mL digestion, 15 mg / 25 mL digestion mix ou aucun collagénase. Parcelles FSC et SSC qui révèlent les effets de la digestion enzymatique sur la récupération de cellules PP et le rendement sont représentés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : le modèle moléculaire et la séquence complète des acides aminés de CXCR5. (A) sept passages est inspirée de la structure des protéines transmembranaires de CXCR5. (B), la séquence complète des acides aminés de CXCR5 est démontrée. La séquence des régions extracellulaires est indiquée en rouge et les acides aminés extracellulaires avec collagénase présumable des liaisons chimiques sensibles sont démontrés en jaune. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Antigène | Clone | Fluourochrome | Dilution |
| CD4 | GK1.5, RM4-5 | APC, PECy7, PerCpCy5.5, FITC | 1/100 |
| CD19 | 6 5 | FITC, APC/Cy7 | 1/100 |
| PD-1 | J43 | Ef PE 610 (Texas Red) | 1/100 |
| ICOS | 15 F9, 7E.17G9 | PE | 1/100 |
| GL7 | GL7 | PerCp/Cy5.5 | 1:75 |
| CXCR5 | 2 8,L138D7 * | Biotine | 01:50 |
| BCL-6 | 1 DE 7 | PE/Cy7 | 01:50 |
| FOXP3 | EMILIENE-16 | APC, PE | 1/100 |
| Streptavidine | - | BV421, PE | 1/100 |
| FixableViability colorant | - | 510(AQUA) BV | 1 : 1 000 |
| 7AAD | - | PerCp/Cy5.5 | 1/500 |
| FcBlock (CD16/32) | 2.4G2 | - | 1 : 200 |
Tableau 1 : Résumé des anticorps. Les dilutions, les clones et les conjugaisons fluorochrome pour les anticorps pertinentes et les teintures de viabilité sont indiqués. La dilution optimale peut varier selon les conditions expérimentales et de la qualité de lot du produit. Clone de conjugués BV421 L138D7 primaire à 01:20 dilution a montré la capacité de détection CXCR5 comparable avec les 8 2 conjugué Biotine clone à 01:50 dilution. Par conséquent, L138D7 primaire conjugué peut être utilisé comme alternative au conjugué Biotine 2 8 clone.
Figure supplémentaire 1 (S1) : Alternative de déclenchement des stratégies pour les cellules TFH et GC B. (A) lymphocytes PP Live d’une souris de 3 mois sur le fond de C57BL/6 sont représentés. (B-C) Cellules B GC sont bloquées comme CD38– GL7+ (B) et BCL-6+ GL7+ B cellules (C). (D-E) Cellules TFH sont dépeints comme des PD-1Salut CXCR5+ (D) et comme OIC+CXCR5+ T CD4 + cellules (E). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Nous décrivons ici un protocole optimisé pour la caractérisation de cytométrie en flux des cellules TFH et GC B. Un des principaux avantages de notre protocole est qu’il permet l’isolement de jusqu'à 10 cellules PP totales7 (en moyenne 4 à 5 x 106 cellules) d’une seule souris (souche C57BL/6) sans n’importe quel processus de digestion. Nous avons observé que le rendement total de cellules est positivement corrélé avec le nombre de PPs et pouvait être estimé à partir de l’équation simple suivante ce qui est utile pour la planification expérimentale : « total PP cell count par souris = 0,5 – 1 x (nombre de PP excisé par souris) x 106«. Ce rendement cellulaire élevée a été complété avec la viabilité cellulaire améliorée (> 95 %). Récupération améliorée de cell et viabilité permettent effectuant cytométrie de divers sous-ensembles de lymphocytes en Spa à l’aide de divers anticorps coloration des panneaux en parallèle.
Par rapport à un récent protocole d’isolement PP publié par Delaye et al. 20 et les précédents rapports19,21, notre protocole a considérablement plus élevé rendement total de cellules et la viabilité, malgré l’absence de la digestion avec la collagénase. Bien que l’identification des PPs pourrait être « difficile » pour les enquêteurs de la première fois, la courbe d’apprentissage pour que ce protocole est assez raide, et si maîtrisé, notre technique permet l’identification et l’excision chirurgicale de PPs dans l’intestin grêle dans une courte temps. Si le nombre PP désiré n’est pas atteint après la première tentative, nous vous suggérons de répéter l’étape d’identification PP en se concentrant sur l’extrémité distale et proximale de l’is. Dans notre pratique, presque dans chaque souris, deux PPs étroitement situés en fin de compte duodénal (Figure 1 a) et au moins 2-3 PPs dans les 5 derniers centimètres de l’iléon sont décelables.
TFH coloration peut être plus ambitieux que les autres sous-ensembles de cellules dans le PPs, ce qui nécessite une attention supplémentaire18. Si certaines mesures sont manquées pendant le traitement de tissus et isolement des cellules, des résultats peuvent être assez trompeuses. Par conséquent, nous vous suggérons de chercheurs de prêter attention à l’expérimentales suivants « conseils ». Depuis les principaux marqueurs de cellules TFH et GC B telles que CXCR5 et GL7 peut être exprimée dans les cellules des B et T, il est important d’inclure un marqueur des lymphocytes B en panneaux d’anticorps pour éviter les faux positifs en raison de la contamination CD19+CD4+ DP cellules24 ( Figure 2). Veuillez noter que stratégies de blocage basé sur des marqueurs de cellules T seulement25 ne fournira pas d’exclusion suffisamment de cellules DP puisque ces cellules expriment également fortement des marqueurs de cellules T y compris CD3 (données non présentées) et CD4. En plus de l’exclusion des cellules DP, résultats de cytométrie de flux devraient être validés et confirmés en utilisant des contrôles négatifs appropriés (par ex.., isotype contrôles, OGP). Non seulement fausse positivité mais aussi déplacée porte TFH peut conduire à des résultats erronés et conclusions. Ajustement de porte TFH peut parfois être difficile surtout si la population de cellules TFH n’est pas abondante, ainsi ne pas apparaissant comme une population discrète en cytométrie. Pour contourner cette limitation, l’ajout de plusieurs marqueurs TFH (e.g., BCL-6, PD-1, ICOS) en anticorps panneau pourrait offrir des possibilités de blocage alternatifs et augmenter la précision de26. Pour des raisons pratiques, BCL-6 s’est avéré pour être qu'un marqueur de co marquage idéal pour alternative TFH gating car il peut être utilisé pour blocage GC B cellules simultanément16 (Figure S1C).
Par ailleurs, ayant un échantillon de contrôle positif contenant une forte proportion TFH pourrait fournir aux chercheurs bonne navigation pour placer correctement les porte TFH. Dans nos expériences, nous avons utilisé des échantillons PP de souris âgées (plus de 6 mois) comme témoin positif puisque nous avons trouvé que le vieillissement provoque le renforcement des cellules TFH dans PPs jusqu'à 40 % du total CD4+ T des cellules en état d’équilibre (données non présentées). Nous encourageons également les chercheurs qui ont davantage intérêt à des détails techniques du TFH coloration afin d’étudier les méthodes dans le livre de protocole publié pour cellule TFH coloration18.
Essais expérimentaux hypotheses en PP peuvent être relativement difficiles et peuvent nécessiter un nombre très élevé de souris par groupe pour atteindre la signification statistique21. En tirant parti du rendement cellulaire élevée de notre protocole, nous avons contourné cet obstacle avec les stratégies expérimentales suivantes. Tout d’abord, nous avons excisé PPs et triées séparément selon leur origine anatomique (par exemple. duodénales, jéjunum et iléon). Ensuite, nous avons répartis ces PPs regroupées dans différents expérimentales et les groupes témoins. Cette stratégie expérimentale contrôlée en interne nous a permis de minimiser la différence inter-individuelle chez la souris, tandis que toutes les cellules proviennent d’une seule souris.
En outre, la variabilité entre les différents compartiments de l’intestinales (par exemple., duodénum vs. iléon)-signalé auparavant être importante2 — n’a pas pu comme expérimental et groupes témoins se composait d’un nombre égal de Spa par région anatomique (Figure 5 a). En effectuant des répétitions d’expériences indépendantes en utilisant la même approche, nous avons amélioré la fiabilité et l’importance de nos résultats. Outre l’élimination des variations non spécifiques, cette méthodologie permet également temps, des réactifs et des souris de rechange.
Pendant le développement et l’optimisation de notre protocole, nos résultats ont révélé que base II et IV de digestion de collagénase réduit remarquablement CXCR5 expression (Figure 5 b) tandis que d’autres molécules de surface pour la détection TFH et GC B cellules demeurent intacts) Figure 5 -E) . Dans un récemment déclarés JoVE protocole19, collagénase II s’est avéré être très efficace pour l’isolation de lymphocyte de PPs et LPs. Cependant, collagénase II avait déjà été signalé d’avoir une forte activité tryptique, qui se traduit par un clivage de plusieurs molécules de surface. Compte tenu de sa nature amicale de surface-molécule27 en raison de la faible activité tryptique et l’utilisation la plus courante dans la littérature28,29,30, collagénase IV avait également été inclus en plus de la collagénase II en notre étude et utilisé dans les concentrations tel que recommandé dans ces précédents rapports. L’utilisation de la collagénase et enzymes équivalents a été une question contradictoire en immunologie des muqueuses dues aux effets indésirables de la digestion sur des cellules immunitaires altérées comme molécule de surface expression31,27.
Auparavant, il a été signalé que l’utilisation de différents types de collagénase pouvant gêner l’écoulement par cytométrie en flux CXCR5 détection au sein de l’intestin humain amygdale et32 échantillons18. À l’inverse, autres études ont montré l’isolement des cellules TFH et GC B de PPs sans l’utilisation de collagénases24,,33. Toutefois, jusqu'à maintenant aucune approche comparative n’avait été entreprise pour déterminer si l’inclusion ou l’exclusion de la digestion de collagénase ne constituerait la condition optimale pour l’isolement de cellules exprimant CXCR5 FOH murine PPS. souris CXCR5 est un acide aminé 374 protéine de la membrane de long sept passages avec des régions extracellulaires relativement courtes par rapport aux autres protéines transmembranaires telles que CD4, CD19 qui sont abondamment exprimés dans les cellules lymphoïdes dans PPs (données obtenues de UniProt). Dans la Figure 8 a-B, un modèle moléculaire et la séquence d’acides aminés totaux de souris CXCR5 sont représentés avec les séquences cible présumée de la digestion de collagénase-basée, qui tend à se dissocier des liaisons chimiques entre la glycine (Gly) et neutral amino acides,34. Les domaines extracellulaires court qui en résulte de sept passages transmembranaires structure moléculaire pourraient être responsables de ce qui rend CXCR5 molécule vulnérables à la digestion enzymatique (Figure 8 a). Curieusement, nous avons trouvé cette détection d’expression CXCR5 après que traitement de collagénase repose sur le clone d’anticorps utilisé. Bien que 2 8 et L138D7 clones ont montré des performances similaires dans le groupe PP non digéré, tel que déterminé par la détection des fractions TFH comparables, dans le groupe PP digérée, L138D7 clone a révélé environ 3 x la fraction plus élevée (≈ 9 %) des cellules CD4 FOH+ Lymphocytes T que les 8 2 clone (≈ 3 %) (Figure 6). Cette constatation suggère que réduite CXCR5 coloration peut être secondaire à une configuration modifiée épitope en trois dimensions de l’activité enzymatique de collagénase. Nos résultats indiquent que digestion de collagénase-base doit être évitée lors de la préparation de PP.
L’interférence de la dissociation de la collagénase avec détection de molécules de CXCR5 a été contournée par l’exclusion de l’étape de digestion. Toutefois, il est à noter que pour certains tissus comme le LP, rupture mécanique ne suffit pas d’isoler les cellules et pour ces tissus, digestion enzymatique serait requis19. À l’avenir, il sera essentiel de tester les conditions alternatives digestion ainsi que digestion compatible anticorps clones pour contourner cette limitation technique pour tissus nécessitant une digestion enzymatique. Jusque-là, les techniques d’imagerie telles que la microscopie de fluorescence immunitaire restera comme la méthode de choix pour la détection de TFH dans ces tissus. En plus d’isoler les cellules LP, l’isolement de certains sous-ensembles de cellules hématopoïétiques tels que DCs et plasmocytes de PPs exigent la digestion enzymatique35. Lorsque vous utilisez notre protocole, chercheurs désireux d’isoler ces sous-ensembles de cellules de PPs doivent inclure l’étape de digestion enzymatique approprié20. Les interférences possibles de la digestion enzymatique avec l’expression de marqueurs DC devraient être pris en considération et des conditions de digestion doivent être optimisées selon les besoins. Lorsque l’isolement de cellules TFH et GC B est souhaitée en plus un sous-ensemble de cellules nécessitant une collagénase digestion36, PPs prélevés dans chaque souris pouvait être séparée en deux groupes pour le traitement avec et sans traitement de collagénase dans panneaux parallèles.
Les effets de la collagénase sur lymphocytes PP n’étaient pas limitées à l’expression de la molécule de surface. Nos résultats ont révélé que la digestion enzymatique a causé une baisse relative de la proportion de lymphocytes dans les cellules PP de manière dose-dépendante (Figure 7). La diminution de la fraction des lymphocytes peut être une conséquence de la libération induite par la collagénase d’autres types de sous-ensembles de cellules hématopoïétiques comme les phagocytes et DCs de PPs qui sont plus grandes et plus précis que les cellules lymphoïdes. Il est également possible que la digestion de collagénase médiée par la cellule libération des voisins LP et compartiments intra-épithéliale pourraient contribuer au changement de profil de FSC-SSC. Cette contamination cellulaire des autres compartiments de l’intestin peut également provoquer des interférences dans l’analyse des flux des lymphocytes PP. Sur cette base, afin de maximiser la pureté de la cellule, nous aussi éviter l’addition des réactifs comme l’EDTA ou TNT qui sont largement utilisés pour extraire des cellules épithéliales et mucus20, maintien des conditions de préparation de tissus comme physiologique et non manipulés que possible. Malgré ces effets indésirables de la digestion enzymatique, des effets bénéfiques sur les lymphocytes PP ont aussi été découverts tels que l’amélioration de la coloration intracellulaire et la viabilité cellulaire (Figure 7-F, G). Toutefois, outre les analyses ont révélé que ces effets ont été attribués au processus d’agitation à 37 ° C, indépendamment de la digestion enzymatique, car la viabilité cellulaire et intracellulaire Foxp3 coloration étaient favorisés dans une mesure comparable lorsque les cellules étaient agités dans l’absence de collagénase. Mécaniquement, l’effet bénéfique de l’agitation peut être due à la meilleure élimination du contenu intestinal et le mucus du PPs.
En résumé, nous avons décrit un protocole simplifié pour l’isolement des lymphocytes de Isolated PPS. cellules peuvent être colorés pour la caractérisation de cytométrie en flux de plusieurs sous-ensembles de cellules ou peut être soumis au tri cellulaire et par la suite employées dans divers in vitro et in vivo des essais fonctionnels.
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Disclosures
Aucun conflit d’intérêts ne déclarés.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Laura Strauss et Peter Sage pour discussions utiles et appuyer avec les analyses de cytométrie de flux.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD4 antibody | eBioscience, Biolegend* | 17-0041-81 ,10054* | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CD19 antibody | eBioscience | MA5-16536 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse PD-1 antibody | eBioscience | 61-9985-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse ICOS antibody | eBioscience | 12-9942-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse GL7 antibody | Biolegend | 144610 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CXCR5 antibody | Biolegend*, BD Bioscience | 145512*, 551960 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse BCL-6 antibody | Biolegend | 358512 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse Foxp3 antibody | eBioscience | 17-5773-82 | For detailed information see Table 1 |
| Streptavidin-BV421 | BD Bioscience | 563259 | For detailed information see Table 1 |
| FixableViability Dye | eBioscience | L34957 | For detailed information see Table 1 |
| 7AAD | Biolegend | 420404 | For detailed information see Table 1 |
| FcBlock (CD16/32) | BD Bioscience | 553141 | For detailed information see Table 1 |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 6-well,12-well & 96-well plates | Falcon/Corning | 353046,353043/3596 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 10 mL syringe-plunger | Exel INT | 26265 | |
| RPMI | Corning | 15-040-CV | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Orbital shaker | VWR | Model 200 | |
| Curved-end scissor | |||
| Fine Serrated Forceps | |||
| Small curved scissor |
References
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