Summary
In dieser Studie präsentieren wir eine neue und effektive Protokoll für die Isolierung von Lymphozyten aus Peyer Patches (PPs), die anschließend für in Vivo und in Vitro funktionelle Assays sowie Flow durchflusszytometrischen Studien des follikulären T verwendet werden können Helfer und germinal Center B-Zellen.
Abstract
In der Darm-Schleimhaut bilden Immunzellen eine einzigartige immunologische Einheit, die Immuntoleranz fördert, während die Übertragung gleichzeitig Immunabwehr gegen Krankheitserreger. Es ist allgemein bekannt, dass Peyer Patches (PPs) eine wesentliche Rolle in der Schleimhaut immun-Netzwerk haben, durch die Veranstaltung von mehreren Effektor T und B-Zell-Subsets. Ein bestimmten Anteil dieser Effektorzellen, follikuläre T Helfer (TFH) und germinal Center (GC) B-Zellen sind in der Verordnung der humoralen Immunität professionalisiert. Daher bieten die Charakterisierung dieser Zelle Teilmengen innerhalb von PPs in Bezug auf ihre Differenzierung-Programm und funktionellen Eigenschaften wichtige Informationen über die Schleimhaut Immunität. Zu diesem Zweck wäre eine leicht anwendbare, effiziente und reproduzierbare Methode der Lymphozyten isoliert von PPs wertvoll für Forscher. In dieser Studie hatten wir vor, eine wirksame Methode zur Isolierung von Lymphozyten aus Maus PPs mit hohe Zellausbeute zu generieren. Unser Ansatz offenbart, dass anfängliche Gewebe wie die Verwendung von Verdauungs Reagenzien und Gewebe Agitation, Verarbeitung sowie Zelle Färbung Bedingungen und Auswahl von Antikörper-Panels, haben großen Einfluss auf die Qualität und Identität der isolierten Lymphozyten und auf experimentelle Ergebnisse.
Hier beschreiben wir ein Protokoll, Forscher, um effizient Lymphozyten-Populationen von PPs ermöglicht reproduzierbare Flow Cytometry Beurteilung der T- und B-Zelle Teilmengen Schwerpunkt auf TFH und GC B Zelle Teilmengen zu isolieren.
Introduction
Der gesamte Magen-Darmtrakt von Anfang bis zum Ende ist mit einem umfangreichen lymphatischen Netz geschmückt, die Immunzellen mehr als jedes andere Organ in der Human- und Maus1enthält. Peyer ist Patches (PPs) bilden einen wesentlichen Bestandteil der intestinalen Zweig dieser zellulären immun-Organisation, so genannten Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe (GALT)2,3. In PPs, Tausende von Millionen von Antigenen abgeleitet aus diätetischen Materialien Kommensale Mikrobiota und Krankheitserreger sind ständig abgetastet wird und wenn notwendig entsprechende Immunantworten gegen sie sind montiert so Pflege Darm immun Homöostase. In diesem Sinne könnte PPs als "Mandeln des Dünndarms" benannt werden. KKS bestehen aus großen Sub Fächer: subepithelialen Kuppel (SED), große B-Zell-Follikel-Zonen; die darüber liegende Follikel-assoziierten Epithel (FAE) und interfollikulären Region (IFR), wo T-Zellen befindet sich4sind. Dieses einzigartige Abschottung der PPs ermöglicht verschiedenen Effektor Zelle Teilmengen zu kooperieren und verleiht somit Immunkompetenz im Darm.
PPs fehlt afferenten Lymphgefäße, und aus diesem Grund werden Antigene zu PPs aus Dünndarm transportiert nicht durch Lymphgefäße im Gegensatz zu die meisten von den anderen lymphatischen Organen durchgeführt. Stattdessen sind spezialisierte Epithelzellen befindet sich in FAE, so genannte M-Zellen, verantwortlich für die Übertragung der luminalen Antigene in der PPs-5. Anschließend werden die transportierten Antigene von dendritischen Zellen (DCs) abgeholt und Fresszellen, die im Großraum subepithelialen Kuppel (SED) unter die FAE6,7befinden. Dieses Antigen Sortierverfahren von DCs in der PP ist entscheidend für die adaptive Immunantwort8 und nachfolgende Generation von IgA insulinproduzierenden Zellen9zu initiieren.
Aufgrund der schweren Antigenen Belastung von Kommensalen Flora und diätetische Material aktiviert PPs Host endogen Effektor T und B Zelle Teilmengen in großen Häufigkeiten wie TFH und IgA+ GC B Zellen10, was darauf hindeutet, dass PPs eine Website des aktiven Immunsystems darstellen Antwort11. Erkennung von bis zu 20 – 25 % TFH Zellen im gesamten CD4+ T Handy-Fach und bis zu 10 – 15 % GC B innerhalb der gesamten B-Zellen Zellen ist möglich in KKS geimpfte junge C57BL/6 Mäusen12abgeholt. Im Gegensatz zu anderen T-Helfer-Zelltypen (i.e., Th1, Th2, Th17-Zellen), TFH Zellen zeigen einzigartige Tropismus in B-Zell-Follikel vor allem wegen CXCR5 Ausdruck, der TFH Zelle Homing entlang CXCL13 gradient13fördert. In den B-Zell-Follikel Zonen der PPs induzieren TFH Zellen IgA Class Switch Rekombination und somatische Hypermutation in aktivierten B-Zellen hohe Affinität IgA produzieren Zellen14 unterscheiden. Anschließend diese Antikörper-sezernierenden Plasmazellen migrieren in der Lamina Propria (LP) und immun Homöostase in den Darm10zu regulieren.
Identifizierung und Charakterisierung der TFH und GC B-Zell-Populationen in PPs könnten Forscher zu untersuchen, die Dynamik der humoralen Immunantwort unter Steady-State-Bedingungen ohne zeitraubende Immunisierung Modelle ermöglichen. traditionell verwendet im TFH-GC B Zelle Studien15,16,17,18. Analyse der TFH Zellen innerhalb von PPs ist nicht so einfach wie andere Zelle Teilmengen. Technische Herausforderungen sind ideale Vorbereitung Gewebeverhältnisse, Oberfläche Antikörper-Marker Kombination Identifizierung sowie die Auswahl geeigneter positiver und negativer Kontrollen. TFH und PP Forschungsfelder weisen große Variabilität in Bezug auf die experimentelle Verfahren und sind bei weitem nicht die Übertragung eines Konsens um standardisierte Protokolle aus mehreren Gründen zu etablieren. Erstens neigt jede Zelle Teilmenge innerhalb PPs differentiell Gewebeverhältnisse Vorbereitung erfordern weitere Änderungen in einer Zelle Teilmenge-spezifische Art und Weise betroffen zu sein. Zweitens gibt es eine deutliche Diskrepanz zwischen den gemeldeten Methoden über die Details der Zelle Vorbereitung von Dritten PPS, die Anzahl der Protokoll-basierte vergleichende Studien untersuchen ideale Gewebe Präparationstechniken und experimentellen Bedingungen für PP und TFH ist Forschung eher begrenzt.
Aktuelle Protokollbasierte Studien vorgeschlagen für PP Zelle Vorbereitung19,20,21,22 waren nicht TFH oder GC B-Zell-orientierte. Darüber hinaus einige Gewebe Herstellungsbedingungen für PPs19,20 wie Kollagenase-basierte Verdauung empfohlen wurden gefunden, um negativ auf das Ergebnis der TFH Identifikation durch Durchflusszytometrie18. Auf dieser Grundlage begründete wir, dass eine optimierte, standardisierte und reproduzierbare Protokoll, das zur TFH und GC B Zelldynamik in PPs Untersuchung wäre wertvoll für die Ermittler arbeiten zu diesem Thema. Diese Notwendigkeit gab uns den Anstoß, erzeugen eine verbesserte und aktuelle Protokoll für die Isolierung und Charakterisierung von PP-Lymphozyten, die fein für zelluläre Recovery, Rentabilität und Effizienz für Durchfluss durchflusszytometrischen Charakterisierung der mehrere T- und B optimiert ist Zelle Teilmengen. Wir wollten auch auszuschließende mehrere aufwändige Vorbereitungsschritte vorgeschlagen in früheren Protokollen, damit Verringerung der erforderlichen Manipulationen und Zeit für Gewebe- und Vorbereitung von PPs.
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Protocol
Alle Studien und Experimente, die in diesem Protokoll beschrieben wurden unter Leitlinien nach institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) des Beth Israel Deaconess Medical Center durchgeführt.
1. Gestaltung Versuchsaufbau und Maus-Gruppen
- (Optional) Co Haus die experimentellen Mäuse, horizontale Übertragung von Darm Microbiota zwischen experimentellen Mäuse zu erleichtern und um unspezifische Variabilität innerhalb der PP-Lymphozyten zu reduzieren. Darüber hinaus verwenden Sie stellt Steuerelemente des gleichen Geschlechts Variabilität zu minimieren.
2. chirurgische Exzision und Gewebe Vorbereitungsschritte:
- Chirurgische Entfernung des Dünndarms (SI)
- Einschläfern Sie Mäuse mit CO2 Erstickung oder eine gleichwertige Methode im institutionellen Tierethik Ausschuss angenommene.
- Übertragen Sie die Maus, um einen eigenen Bereich für die chirurgische Exzision. Rückseite nach unten legen und den Bauch mit 70 % Ethanol desinfiziert. Führen Sie eine Laparotomie durch Schneiden der Bauchhaut und Bauchfell entlang der Mittellinie vom Schambein, den Brustkorb damit zur Eröffnung der Bauchhöhle.
Hinweis: Führen Sie den ersten Schnitt auf einer relativ kleinen Fläche der Haut eindringen der Bauchhöhle und Darmgewebe zu beschädigen zu vermeiden. Die Exzision bis zum gewünschten anatomischen Grenze weiter. - Identifizieren Sie den Blinddarm, der eine ideale Landmarke für die Erkennung von terminal Ileum ist das distale Segment des Dünndarms darstellt.
Hinweis: Blinddarm befindet sich in der Regel auf der unteren linken Seite des Bauches Maus. - Punktgenaue Ileocaecal Kreuzung und machen Sie einen Schnitt auf dieser Ebene als distal wie möglich, den Dünndarm von den Blinddarm zu trennen. Vermeiden Sie in den nächsten Schritten übermäßige körperliche Kontakt mit der Darmwand weil zerbrechlich PPs leicht auf Touch zusammenbrechen.
- Entfernen Sie vorsichtig den gesamten Dünndarm bis zu den Pylorussphinkter durch das Mesenterium mit einer Schere schneiden. Erkennen der Kreuzung Pylorus und Duodenum und schnipp den Zwölffingerdarm auf dieser Ebene führt zur Ablösung der Dünndarm aus der Bauchhöhle zu vervollständigen.
Hinweis: (i) vermeiden Sie Hyperextension da dies den Bruch der Darmwandführen könnte. (Ii) LP-Lymphozyten isoliert neben PP Lymphozyten gewünscht, vollständige Entfernung der mesenterialen Fett ist notwendig. Jedoch zur PP Isolierung nur könnte verbleibenden mesenterialen Fett einige Vorteile während der weiteren Schritte der Isolierung bieten; Daher sollten sie beibehalten werden. - Freistehende Dünndarm in eine 6-Well-Platte mit kalten RPMI + 10 % fetalen bovine Serum (FBS) gefüllt und schütteln Sie sanft die Geweben manuell bis Darm segmentübergreifend in den kalten Medien getaucht sind. Pflegen Sie das Gewebe auf dem Eis in den nächsten Schritten.
- Nach dem Zerlegen der gewünschten Anzahl von Maus-Dünndarm, fahren Sie mit PP Exzision von gesammelten Dünndarm.
- Die chirurgische Exzision der PPs und Vorbereitung der einzelnen Zellsuspension:
- Sanft den Dünndarm auf ein Papiertuch von der mesenterialen Fett mit Pinzette greifen und mesenterialen zugewandte Papiertuch. Befeuchten Sie das gesamte Darm-Segment mit kalten RPMI + 10 % FBS Gewebe Dehydrierung und Klebrigkeit zu vermeiden.
Hinweis: Verbleibende mesenterialen Fett kann in dieser Phase hilfreich sein, weil Fettgewebe Segmente auf mesenterialen Ortsbild des SI das Papiertuch halten die Anti-mesenterialen Seite nach oben festhalten werden. - Identifizieren Sie die PPs, die als weiße Multi-lappenden Aggregate in eine "Blumenkohl" Form auf der Anti-mesenterialen Seite der Darmwand erscheinen.
Hinweis: Flushing, der luminalen Inhalt wird nicht empfohlen, bis alle PPs herausgeschnitten werden. Entleerung des luminalen Inhalts könnte dazu führen, dass den Zusammenbruch der PPs und verhindert, dass der Farbkontrast zwischen PPs und die Darmwand, die was sehr hilfreich zur visuellen Identifikation von PPs ist. - Nach der Identifizierung PPs auf der Anti-mesenterialen Seite, legen Sie die chirurgische Schere gebogene Ende auf PPs (Kurve sollte aufgedeckt) Ruhigstellung der PP von der proximalen und distalen Grenze.
Optional: Drücken Sie die PP sanft gegen die Klingen der Schere mit einer Fingerspitze. Dieses Manöver wird besser unter Ausschluss des umgebenden Gewebes nicht PP führen. Verbrauchsteuern die PPs sanft, mit Ausnahme der umliegenden Darmgewebe.
Hinweis: (i) dieser Schritt ist entscheidend, um maximale PP Zellausbeute bei gleichzeitiger Minimierung der Zelle Verunreinigungen aus dem benachbarten Darm Fächer wie LP und Darmepithel, sind auch reich an T-Zellen zu erhalten. (Ii) können ein SI von C57BL/6 Maus herausgeschnitten 5-10 PPs (Durchschnittsgröße, Multi-gelappt) abgeholt werden. Mit dem Ziel, noch kleinere PPs (Multi-gelappt), Sammlung von bis zu 12-13 PPs per Mausklick (C57BL/6) kann mithilfe dieses Protokolls. - Übertragung der ausgeschnittenen PPs auf ein 12-Well-Zellkultur-Platte gefüllt mit eiskalten RPMI + 10 % FBS und gepflegt auf Eis mit Zange oder gebogene Chirurgische Scheren.
Hinweis: (i) unmittelbar nach Exzision von PPs können Schleim und Darminhalt auf der PP-Oberfläche gereinigt werden durch Reiben das Gewebe sanft auf einem Papiertuch. Dieser Schritt hilft, die Lebensfähigkeit des PP-Lymphozyten zu verbessern. (Ii) anstelle der PPs auf einer Platte zu übertragen, kann die Röhren getrennt übertragen auch abhängig von Anzahl der Gesamtstichprobe betrachtet werden. - Optional: Wenn PP Exzision und anschließende Platzierung in der well-Platte abgeschlossen sind, können die Anzahl und Größe der PPs aus verschiedenen experimentellen/Maus Gruppen gesammelt dokumentiert werden durch eine Aufnahme der Gewebekultur Platte mit PPs.
- Bereiten Sie einen Satz von 50 mL konische Röhrchen gefüllt mit 25 mL RPMI + 10 % FBS (bei 37 ° C vorgewärmt). Mit einer Schere, schneiden Sie den Rand von einem 1.000 µL-Tipp aus der Distanz, die das Streben der PPs mit 1 mL Pipette ermöglichen. Die PPs mit 1 mL Pipette abzusaugen und auf die vorbereiteten 50 mL konische Röhrchen aus der Gewebekultur 12-Well-Platte übertragen.
Hinweis: Verwenden Sie einen neuen Tipp für jede Maus-Probe, um Cross-Kontamination zwischen den Proben zu vermeiden. - Sichern Sie den Deckel und stellen Sie die Rohre senkrecht in einem Orbitalschüttler bei 37 ° C, mit kontinuierlichen Agitation bei 125-150 u/min für 10 min. Unterdessen bereiten Sie einen neuen Satz von 50 mL-Tuben und platzieren Sie ein 40 µm Zelle Sieb auf der Oberseite jedes Röhrchen, durch die einzelne Zellsuspension vorbereitet werden.
Hinweis: (i) der Erregung Schritt wird der verbleibende Darm Inhalt, Schleim und Zelle Schutt entfernen, die die Zellviabilität und Wiederherstellung der PP-Lymphozyten zu verringern, wenn nicht entfernt. (Ii) gelten Sie jeglicher Art von Verdauungs-Enzymen nicht, auf PP-Gewebe, weil die Verdauung führt zu einen dramatischen Verlust der CXCR5 Ausdruck von der Zelloberfläche. - Nach der Aufregung Übertragung der PPs auf 40 µm Zelle Sieb auf die neu vorzubereitenden konisch 50 mL Röhrchen gelegt. Mit der abgerundeten Seite eine 10 mL Spritzenkolben, sanft stören die PPs durch die Zelle Sieb, einzelne Zellsuspension zu generieren. Spülen Sie das Sieb mit 15 – 20 mL kalte RPMI + 10 % FBS.
Hinweis: (i) vor dem Filtern, schütteln Sie die Röhrchen mit dem PPs horizontal. Dieser kurze Shake erleichtert die Übertragung von PPs in Zelle Siebe. (Ii) mit einem 70 µm-Zelle-Sieb für die Isolierung von nicht-lymphatischen Immunzellen (zB., Monozyten, Makrophagen, DCs) wird empfohlen. - Zentrifugieren Sie die einzelnen Zellsuspensionen 350 – 400 X g für 10 min bei 4 ° C.
- Sorgfältig den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zellen in einer Konzentration von 10 x 106 Zellen/mL. Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer.
Hinweis: (i) vor dem Zellzählung, die Ergebniszelle Zahl für jede Maus PP-Gruppe ungefähr abgeschätzt werden anhand der folgenden Formel: "0,5-1 x 106 Zellen x (Anzahl der PPs) = total Zellzahl". Weitere Verdünnungen mit Trypan blau für Zellzählung können erforderlich sein. (Ii) als Alternative zum manuellen zählen können automatisierte Zelle Zähler verwendet werden. - 2-2,5 x 106 Zellen im entsprechenden Volumen zu übertragen (z. B.., 200 µL) in eine 96-Well Rundboden-Platte.
Hinweis: Für einfarbige und negative Kontrollproben, vielleicht 0,5-1 x 106 Zellen ausreichend sein. - Zentrifugieren Sie die Platte 350 X g für 5 min bei 4 ° C. Streichen Sie die Platte.
- Waschen Sie die Zellen in 200 µL Puffer Färbung.
- Sanft den Dünndarm auf ein Papiertuch von der mesenterialen Fett mit Pinzette greifen und mesenterialen zugewandte Papiertuch. Befeuchten Sie das gesamte Darm-Segment mit kalten RPMI + 10 % FBS Gewebe Dehydrierung und Klebrigkeit zu vermeiden.
3. Oberfläche Antikörper Färbung
- Lebensfähigkeit Färbung:
- Nach der letzten Wäsche Aufschwemmen der Zellen in 100 μl fixierbar Lebensfähigkeit Farbstoff verdünnt mit PBS-Puffer (1:1 000). 30 min auf Eis oder bei 4 ° C im Dunkeln inkubieren.
Hinweis: (i) intrazelluläre Färbung für den Nachweis der wichtigsten Transkription Faktoren wie Foxp3 oder Bcl-6 erfordert Fixierung der Zellen. In diesem Fall nicht fixierbar Lebensfähigkeit Farbstoffe (zB., 7-AAD, DAPI) kann nicht verwendet werden. (Ii) um fixierbar Lebensfähigkeit Farbstoff zu verdünnen, verwenden Sie keine befleckenden Puffer, Protein enthält. In diesem Schritt verwendeten Medien müssen Protein-frei sein. (Iii) der Ausschluss von abgestorbenen Zellen mithilfe von Lebensfähigkeit Färbung ist entscheidend, denn abgestorbene Zellen erhebliche technische Schwierigkeiten in Flow-Zytometrie-Analyse durch das aussenden Autofluoreszenz und nonspecifically, Oberfläche Antikörper binden verursachen können, die auf False führen könnte positive Ergebnisse. - Waschen Sie die Zellen zweimal mit Puffer beflecken. Zentrifuge bei 350 X g für 5 min bei 4 ° C. Streichen Sie die Platte.
- Nach der letzten Wäsche Aufschwemmen der Zellen in 100 μl fixierbar Lebensfähigkeit Farbstoff verdünnt mit PBS-Puffer (1:1 000). 30 min auf Eis oder bei 4 ° C im Dunkeln inkubieren.
- FC-Block und Oberfläche - Schicht I:
- Bereiten Sie die Fc-Block-Lösung durch Verdünnung von Anti-CD16/32 Antikörper (1: 200) in der Färbung Puffer.
- Aufschwemmen der Zellen in 20 μL bereit Fc-Block-Lösung. Inkubieren Sie für 15 min auf Eis.
- Ohne waschen, fügen Sie 80 μL der Oberfläche Antikörper cocktail (siehe Tabelle 1 für den Antikörper Zusammenfassung) bei entsprechenden Verdünnungen vorbereitet hinzu. Inkubieren Sie für mindestens 30 min auf Eis.
- Waschen Sie zweimal durch Zugabe von übermäßigen Färbung Puffer. Zentrifuge bei 350 X g für 5 min bei 4 ° C. Streichen Sie die Platte.
- Oberfläche - Schicht II:
- Bereiten Sie Streptavidin Färbelösung durch Verdünnung Fluorochrom konjugiert Streptavidin in Färbung Puffer vor.
- Aufschwemmen Sie nach der letzten Wäsche Färbelösung Zellen mit 100 μL vorverdünnt Streptavidin (1: 100). Mindestens 15 min auf Eis im Dunkeln inkubieren.
- Zweimal mit Färbung Puffer waschen. Zentrifuge bei 350 X g für 5 min bei 4° C. Streichen Sie die Platte.
Optional: Wenn intrazelluläre Färbung für follikulären regulatorische T-Zell-Erkennung nicht, nach der letzten Wäsche gewünscht ist Aufschwemmen der Zellen in 200 μL der Färbung, Puffer und Transfer in die entsprechenden Rohre, Daten im Durchflusszytometer zu erwerben. Wenn die Proben nicht fixiert sind, sollte die Erfassung von Daten durch Durchflusszytometrie innerhalb von 3 – 4 h, um genaue Ergebnisse zu erhalten durchgeführt werden.
(4) Zelle Fixierung
- Bereiten Sie Fixierung/Permeabilisierung (Fix/Perm) funktionierende Lösung mit Reagenzien aus Foxp3/Transkription Faktor Färbung Puffer Set vor. Mischen Sie einteilige Fixierung/Permeabilisierung Konzentrat mit drei Teile der Befestigung/Permeabilisierung Verdünnungsmittel, das gewünschte Endvolumen.
- Nach der letzten Wäsche Aufschwemmen der Zellen in 200 μl Arbeitslösung Fix/Perm.
- Inkubieren Sie die Platte auf dem Eis oder bei 4 ° C für 20 min. Überschreiten Sie 20 min für diesen Schritt nicht. Längere Inkubationszeit kann die Zelle Erholung stark verringern.
- Zentrifuge bei 350 X g für 5 min bei 4 ° C. Streichen Sie die Platte. (Optional) Nach diesem Schritt können feste Zellen gespeichert werden, für mehrere Tage bei 4 ° C im Puffer mit Rinderserumalbumin (BSA) Färbung oder FBS bis nachfolgende intrazelluläre Färbung oder Flow Cytometry Erwerb.
- Aufzuwirbeln Sie die Zellen in 200 μl Puffer (x1) frisch vorab gereinigte deionisiertes Wasser verdünnt Permeabilisierung.
- Zentrifugieren Sie bei 350 X g für 5 min bei Raumtemperatur (RT).
- Einmal waschen Sie mit 200 μL Permeabilisierung Puffer und Zentrifuge bei 350 X g für 5 min bei RT
(5) intrazelluläre Färbung
- Bereiten Sie die Fc-Block-Lösung durch Verdünnung von Anti-CD16/32 Antikörper (1: 200) in Permeabilisierung Puffer.
Hinweis: Nach der Fixierung Schritt, die Zellen im Permeabilisierung Puffer bis zum Ende des intrazellulären Färbung Prozesses einzuhalten. - Nach der letzten Wäsche Aufschwemmen der Zellen in 20 μL der Fc-Block-Lösung. 10-15 min bei RT im Dunkeln inkubieren.
- Ohne waschen, fügen Sie 80 μL der intrazellulären Antikörper cocktail (100 μL Endvolumen) vorab in Permeabilisierung Puffer verdünnt hinzu. 30 min bei RT inkubieren
- Hinzufügen von 100 μL des Perm Puffer und Zentrifuge bei 350 X g für 5 min bei RT
- Einmal waschen mit 200 μL der Permeabilisierung Puffer, Zentrifugieren bei 350 X g für 5 min bei RT
- Nach dem letzten Waschen Aufschwemmen der Zellen in 200 μL der Färbung Puffer und die Zellen in entsprechende Röhrchen (Endvolumen von 400 μl in Färbung Puffer) zu übertragen und Daten durch Durchflusszytometrie erwerben. Beispiele gebeizt in 96-Well-Platte können auch ausgeführt werden, ohne Sie in Tuben zu übertragen, wenn ein Durchflusszytometer mit Platte Reader-Option zur Verfügung steht. Dieser Schritt minimiert Zellverlust während Zelle übertragen.
- Erwerben ein Minimum von 5 x 105 total Zellen im Durchflusszytometer, reproduzierbare Analyse der TFH, TFR durchführen zu können sowie GC B Zellen.
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Representative Results
Im Gegensatz zu einer vorherigen Protokoll20, haben wir beobachtet, dass PPs nicht gleichmäßig die SI verteilt sind aber mehr dicht zu den proximalen und distalen Enden des SI lokalisiert sind, wie in Abbildung 1A. Durchflusszytometrischen Analyse zeigte, dass, wenn korrekt befolgt, unser Protokoll ein PP-Lymphozytenpopulation gibt, die ähnlich wie Splenocyten (Abbildung 2AE, und 2D, H) mit vorwärts-Side Scatter Verteilung zeigt > 95 % Zelle Tragfähigkeit (Abb. 2 b und 2F). Im Gegensatz zu anderen sekundären lymphatischen Organen (SLOs) bei C57BL/6 Mäusen etwa 70 – 80 % der gesamten PP Lymphozyten bestehen aus B-Zellen, während CD4+ T Zellen bilden nur 10 – 15 % der gesamten PP Lymphozyten (Abbildung 2 und 2 G).
Bitte beachten Sie, dass CD4+ CD19+ doppelt positiv (DP) Zellen bilden ≈ 1 % des gesamten PP Lymphozyten. Mit einigen Vorsichtsmaßnahmen während Zelle Vorbereitung wie Durchführung von Fc-Block gegen Fc-Rezeptoren der B-Zellen und ohne Dubletten, CD4+ CD19+ DP Zellpopulation könnte minimiert (Abb. 3A und B). Jedoch ein Bruchteil der DPs, die nicht forward Scatter (FSC) Eigenschaften von Dubletten zeigen ist unumgänglich und sollte heraus von den einzigen positiven T und B Zellen Toren gated werden (Abb. 3 b). Unsere Ergebnisse zeigten, dass B-Zellen in den DP-Zellen sehr ausdrückliche CXCR5 auf ihrer Oberfläche (Abbildung 3), die zu falsch positiven Ergebnissen in der TFH Tor führen könnten, die abgestimmt ist auf CXCR5 Ausdruck in CD4+ T Zellen. Auf der anderen Seite fanden wir, dass GL7, eine Markierung der aktivierten B-Zellen, auch in CD4 ausdrückt+ CD19+ DP Zellen (Abbildung 3D), die könnte dazu führen, dass Störungen mit GC B Zelle gating.
Beispiele für TFH und GC B Zelle Anspritzung Algorithmen sind in Abbildung 4. dargestellt. Für die GC B Zelle Anspritzung, wir verwenden GL7 Kennzeichnung versus CD38, die GC-B-Zellen als GL7 identifiziert+ CD38– -B-Zellen (Abbildung 4A-B). PNA Kennzeichnung könnte anstelle GL723 verwendet werden, während CD38 durch einen der folgenden Marker ersetzt werden kann: IgD, Bcl-6 und CD95. Alternative gating Strategien für GC B-Zellen in gezeigt Abbildung S1. GC B Zelle Verhältnis in KKS zeigt große Variabilität bei C57BL/6 Mäusen. Jedoch haben im Vergleich zu anderen SLOs, PPs deutlich höheres GC B Zelle Verhältnis mit einer Reichweite von 2-10 % der gesamten B-Zellen unter Steady-State-Bedingungen. Anspritzung Strategie für PP TFH Zellen bezeichnet man als CD19– CD4+ PD-1Hallo CXCR5+ T-Zellen (Abbildung 4A, C). "Zebra plot" wurde gefunden, um eine optimale Demonstration Methode für die TFH Anspritzung wie es PD-1Hallo Bevölkerung mehr diskret im Vergleich zu anderen Plot (Abbildung 4) zeigt. TFR, eine Teilmenge der TFH Zellen mit dem Ausdruck Foxp3, werden als CD19 angespritzt– CD4+ PD-1Hallo CXCR5+ Foxp3+ T-Zellen (Abbildung 4). Wie GC B Zellen, der TFH Zelle Anteil variiert auch in geimpfte Maus Individuen mit einer Reichweite von 10 – 20 % der gesamten CD19– CD4+ PP Lymphozyten. Details zu alternativen gating Algorithmen für TFH-Zellen sind in Abbildung 4E, F und Abbildung S1C, D. beschrieben.
Zur Vermeidung von falschen Positivität aufgrund Hintergrundfärbung und Autofluoreszenz Isotype Steuerelemente oder alternative gleichwertigen Steuerungen wie Fluoreszenz Minus One (FMO) im Bedienfeld "Färbung" als Negativkontrolle für TFH und GC B Zelle Marker ( aufzunehmen Abbildung 4-J).
Um die Bedingungen für PP-Gewebe-Vorbereitung zu optimieren, entwickelten wir eine neuartige intern kontrollierte experimentellen Strategie, in der PPs wurden von einem einzelnen Mausklick gesammelt und gebündelt separat je nach anatomischen Herkunft (zB., Zwölffingerdarm, Ileum). Für die Durchführung von Experimenten, gepoolte PPs einzelner Gruppen so, dass jeder experimentellen zugeordnet wurden und Kontrollgruppe enthalten die gleiche Anzahl von PPs aus jeder anatomischen Region (Abb. 5A). Durch diesen Ansatz, wir fanden, dass Kollagenase-basierte enzymatische Verdauung (getestet bei 37,5 mg Kollagenase II oder IV pro 25 mL Verdauung Mix = 1,5 mg/mL), die wird häufig verwendet für Lymphozyten isoliert von verschiedenen Schleimhaut-Gewebe, deutlich reduzierte CXCR5 Ausdruck in PP Lymphozyten (Abb. 5 b), insbesondere im TFH Zellen (Abbildung 5F-ich), zwar die Expression von anderen Oberflächenmoleküle (zB., CD19, CD4) blieb intakt (Abbildung 5 C-E). Reduzierung der CXCR5 Erkennung war prominent, so dass die Expression des CXCR5 auf Kollagenase-behandelten TFH Zellen fast nisht zu unterscheidend von Isotype Kontrolle war (Abbildung 5F-ich). Weitere Experimente zeigten, dass die Störpegel der enzymatischen Verdauung mit CXCR5 Ausdruck der CXCR5 Antikörper Klon verwendet (Abbildung 6A-F) abhängig war. Insbesondere war die Erkennung Kapazität der CXCR5 Antikörper Klon 2 8 Kollagenase II Behandlung erheblich beeinträchtigt, als die Kapazität der Erkennung der CXCR5 Antikörper Klon L138D7 (Abb. 6A-D).
Enzymatische Verdauung reduziert nicht nur den Ausdruck des CXCR5, sondern auch der Anteil der gesamten Lymphozyten in PP-Zellen durch die FSC-SSC-Eigenschaften, während ein erheblicher Bruch der Zellen, die abseits der verdauten PPs ausgestellt nach vorne und Seite Streuung der eine höhere Intensität als PP-Lymphozyten (Abbildung 7A-C). Die Auswirkungen der Kollagenase auf Zelle Erholung trat in einer Dosis-abhängigen Weise (Abbildung 7A, H-J). Enzymatische Verdauung erhöht die Zellviabilität (Abbildung 7, E). Jedoch diesen Vorteil war nicht Minutenumsatz Zusammenhang mit Kollagenase Verdauung weil die Zellen isoliert aus PPs, nachdem die Erregung ohne Kollagenase ebenso begünstigt wurden (Abbildung 7F). Die Erkennung des nuklearen Transkriptionsfaktors Foxp3, die von besonderem Interesse hier ist, weil es in der Regel während der TFH Isolierung TFR Zellen identifizieren bewertet wird, wurde durch die Agitation bei 37 ° C unabhängig von der Kollagenase-Verdauung (Abbildung 7 verbessert. ).
Abbildung 1: makroskopische Struktur und anatomische Verteilung der murinen Peyer Patches. (A). ein Bild von Zwölffingerdarm-Ende des Dünndarms mit dem Magen zu erhalten. Zwei eng liegt PPs in den Zwölffingerdarm sind mit schwarzen Pfeilen gekennzeichnet. (B). PPs gesammelt von elf C57BL/6 Mäusen wurden einzeln in einem 12-Well-Platte gespeichert. (C). Bild von frisch ausgeschnittenen Maus PPs auf einem 40 µm-Sieb Zelle angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Flow durchflusszytometrischen Charakterisierung und gating Grundalgorithmus für PP Lymphozyten. (A). Punkt plottet zeigen die Verteilung der frisch isolierte unfixierten PP Lymphozyten Achsen FSC und SSC die große Ähnlichkeit mit Splenocyten dargestellt (D) aufweisen. (B). Ausschluss von abgestorbenen Zellen mittels 7AAD Ausdruck. 7AAD– Zellen lebenden Zellen darstellen. (C). CD19 und CD4-basierte Immunphänotypisierung der T- und B-Zellen unter Pre-gated lebenden PP-Zellen. (E-G). Repräsentative Analyse von festen PP Lymphozyten. (H). repräsentative Fließfähigkeit des festen Splenocyten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: CD4+ CD19+ doppelt positiv (DP) Zellen Ursache falsche Positivität im TFH und GC B Zelle gating. (A). CD4+CD19+ DP Lymphozyten in lebenden PP-Zellen nachgewiesen. (B). Trennung von DP Zellen basierend auf FSC Eigenschaften als Dubletten und Unterhemden. (C,D). CXCR5 und GL7 Ausdruck der DP-Zellen sind im Histogramm Grundstücke dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Vertreter TFH und GC B-Zell-gating Strategie. KKS wurden von einer 3 - Monate alte Maus und Lymphozyten wurden isoliert, wie im Abschnitt Protokoll beschrieben. (A) CD19 und CD4 Kennzeichnung von live PP Lymphozyten dargestellt sind. (B) CD38lo GL7HalloCD19+ B Zellen wurden als GC B-Zellen eingezäunt. (C) TFH-Zellen wurden als CXCR5 gated+PD-1Hallo CD4+ Zellen. (D) TFR-Zellen sind ein Bruchteil der TFH Zellen mit dem Ausdruck ihrer regulatorischen zellspezifische Transkriptionsfaktor Foxp3 zusammen mit TFH Marker und sind als CXCR5 gated+ PD-1Hallo Foxp3+ CD4+ T Zellen. (E-F) Anspritzung Strategie für TFH Oberflächenmarker bestätigt in Splenocyten von NP-OVA-immunisierten Maus mittels BCL-6 Ausdruck isoliert. (G-J) Fluoreszenz Minus One (FMO) Regler für Schlüssel TFH-TFR und GC Zellenmarkierungen werden dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Kollagenase-basierte enzymatische Verdauung führt zu einer massiven Reduktion der CXCR5 Erkennung. (A) PPs von 2 Monate alte Maus befindet sich in den Zwölffingerdarm (≈ 1/3 proximalen), Jejunum (≈ 1/3 mittleren) und Ileum (≈ 1/3 distal) wurden gesammelt und getrennt gebündelt. Gepoolte PPs wurden gleichmäßig auf den experimentellen Gruppen verteilt. Enzymatische Verdauung mit Kollagenase II oder IV bei 1,5 mg/mL Konzentration wurde mit Agitation für 10 min bei 37 ° c durchgeführt. (B-E) Histogramm Grundstücke Darstellung des Ausdrucks der Oberflächenmoleküle (CXCR5, CD19, PD-1, CD4) Zellen isoliert aus PPs, die Kollagenase-basierte Verdauung unterzogen wurden. (F-Ich) TFH Anspritzung innerhalb der Kollagenase-verabreicht und Kontrollgruppen ist in Zebra Parzellen unter Beweis gestellt. Daten repräsentieren drei unabhängige Experimenten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: die Wirkung von Kollagenase auf CXCR5 Ausdruck zeigte große Unterschied abhängig von der Anti-CXCR5 Antikörper Klon. PP-Lymphozyten gesammelt von einer 6-Monate-alten Maus, gebündelt und getrennt in verschiedenen Gruppen über Antikörper Klon verwendet und enzymatische Verdauung Anwendung. (A-F) Der Anteil der TFH Zellen ist dargestellt in Zebra Parzellen in Pre-gated live, CD19– CD4+ T Zellen. (A, C und E) PP-Zellen waren voller Flecken mit dem Biotin-konjugierten Anti-Maus CXCR5 Antikörper (2 8 Klonen), und mit BV421 Fluorochrom konjugierten Streptavidin. (B, D und F) PP-Zellen wurden mit einer konjugierten Anti-Maus CXCR5 Primärantikörper (L138D7 Klon) gefärbt. (A-B) TFH Anspritzung Grundstücke aus unverdauten PP Lymphozyten. (C-D) PPs mit Kollagenase II (20 mg/25 mL Verdauung Mix) verdaut und aufgeregt für 10 min bei 37 ° C. Daten repräsentieren zwei unabhängige Experimenten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: Kollagenase-basierte Verdauung und Agitation bei 37 ° C beeinflussen Zellviabilität, Erholung und intrazelluläre Färbung Effizienz. Ein 3 Monate Alter C57BL/6-Maus wurde geopfert; KKS wurden gesammelt und gebündelt, wie in Abbildung 5Abeschrieben. (A) nach der Sammlung von PPs, das Gewebe wurden in Anwesenheit von Kollagenase II (37,5 mg/25 mL Verdauung Mix) für 10 min gerührt, FSC und SSC Eigenschaften der festen PP-Zellen in (A) dargestellt sind und Lebensfähigkeit Färbung Plot dargestellt) ( D). (B, E) nach der Sammlung von PPs, hielten das Gewebe auf dem Eis ohne Agitation oder enzymatische Verdauung; FSC und SSC Eigenschaften der festen PPs-Zellen sind in (B) dargestellt und Lebensfähigkeit Färbung wird in (E) dargestellt. (C, F) Nach der Sammlung von PPs wurden Gewebe bei 125-150 u/min für 10 min bei 37 ° C in Abwesenheit von Kollagenase aufgeregt; FSC und SSC Merkmale und Lebensfähigkeit Färbung des festen PP-Zellen sind dargestellt (C, F), beziehungsweise. (G) Vergleich der Foxp3 Ausdruck in regulatorischen T-Zellen isoliert von aufgeregt und unaufgeregt PPs ohne Kollagenase-Verwaltung ist in der Histogramm-Plot dargestellt. (H-J) PPs von einer 6 - Monate alten C57BL/6-Maus gesammelt und behandelt wurden mit verschiedenen Konzentrationen von Kollagenase II: 25 mg pro 25 mL Verdauung Mix, 15 mg pro 25 mL Verdauung Mix oder keine Kollagenase. FSC und SSC-Plots die offenbaren die Beeinflussung der enzymatischen Verdauung PP Zelle Erholung und Ertrag werden dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8: das molekulare Modell und die komplette Aminosäuresequenz des CXCR5. (A) sieben-Pass transmembranen Protein-Struktur des CXCR5 modelliert. (B) die komplette Aminosäuresequenz des CXCR5 gezeigt. Die Reihenfolge der extrazellulären Regionen wird in rot angezeigt und extrazelluläre Aminosäuren mit vermutlich Kollagenase empfindliche chemische Bindungen sind in gelb demonstriert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Antigen | Klon | Fluourochrome | Verdünnung |
| CD4 | GK1.5, RM4-5 | APC, PECy7, PerCpCy5.5, FITC | 1: 100 |
| CD19 | 6 5 | FITC, APC/Cy7 | 1: 100 |
| PD-1 | J43 | PE Ef 610 (Texas Red) | 1: 100 |
| ICOS | 15 F9, 7E.17G9 | PE | 1: 100 |
| GL7 | GL7 | PerCp/Cy5.5 | 1: 75 |
| CXCR5 | 2-8,L138D7 * | Biotin | 01:50 |
| BCL-6 | 7 1 | PE/Cy7 | 01:50 |
| FOXP3 | FJK-16 | APC, PE | 1: 100 |
| Streptavidin | - | BV421, PE | 1: 100 |
| FixableViability Farbstoff | - | BV 510(AQUA) | 1:1,000 |
| 7AAD | - | PerCp/Cy5.5 | 1: 500 |
| FcBlock (CD16/32) | 2.4G2 | - | 1: 200 |
Tabelle 1: Zusammenfassung der Antikörper. Die Verdünnungen, Klone und Fluorochrom Konjugationen für die entsprechenden Antikörper und Lebensfähigkeit Farbstoffe sind angegeben. Die optimale Verdünnung variieren je nach experimentellen Bedingungen und viel Qualität des Produktes. Primäre BV421 konjugiert L138D7 Klon bei 01:20 Verdünnung zeigten vergleichbare CXCR5 Erkennung Kapazität mit dem Biotin-konjugiert 2 8 Klon bei 01:50 Verdünnung. Daher primär konjugiert L138D7 eignet sich als alternative zu Biotin konjugiert 2 8 Klon.
Abbildung ergänzende 1 (S1): Alternative Strategien für die TFH und GC B-Zellen gating. (A) Live PP Lymphozyten aus einer 3 Monate alten Maus auf dem C57BL/6 Hintergrund dargestellt. (B-C) GC-B-Zellen werden als CD38 angespritzt– GL7+ (B) und BCL-6+ GL7+ B-Zellen (C). (D-E) TFH Zellen sind dargestellt als PD-1Hallo CXCR5+ (D) und als ICOS+CXCR5+ CD4 + T Zellen (E). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
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Discussion
Hier beschreiben wir ein Protokoll für Durchfluss durchflusszytometrischen Charakterisierung von TFH und GC B Zellen optimiert. Einer der großen Vorteile unseres Protokolls ist, dass es die Isolation von bis zu 107 (durchschnittlich 4 – 5 x 106 Zellen) total PP Zellen aus einem einzigen Mausklick (C57BL/6-Stamm) ohne jede Verdauung ermöglicht. Wir beobachteten, dass die Ergebniszelle Ausbeute positiv mit der Anzahl der PPs korreliert war und aus die folgende einfache Gleichung, die hilfreich für die Planung von experimentellen geschätzt werden konnte: "total PP Zelle Anzahl pro Maus = 0,5 – 1 x (Anzahl der ausgeschnittenen PP pro Maus) X 106". Diese hohe Zellausbeute mit verstärkten Zellviabilität ergänzt wurde (> 95 %). Verbesserte Zelle Erholung und Lebensfähigkeit erlaubt durchflusszytometrischen Analyse der verschiedenen Lymphozyten-Teilmengen in PPs mit vielfältigen Antikörper Färbung Platten parallel durchführen.
Im Vergleich zu den letzten PP Isolierung Protokoll von De Jesus Et al.veröffentlicht. 20 und frühere Berichte19,21, gab unser Protokoll insgesamt deutlich höhere Zellausbeute und Lebensfähigkeit, trotz der Abwesenheit der Verdauung mit Kollagenase. Obwohl die Identifikation von PPs "tricky" für die erstmalige Ermittler möglicherweise, die Lernkurve für dieses Protokoll ist ziemlich steil, und wenn gemeistert, unsere Technik ermöglicht die Identifikation und die chirurgische Exzision der PPs aus dem Dünndarm in kurzer Zeit. Wenn die gewünschte PP-Nummer nach dem ersten Versuch nicht erreicht ist, empfiehlt es sich, wiederholt den PP-Identifikation-Schritt mit Schwerpunkt auf den proximalen und distalen Ende des SI. In unserer Praxis, fast in jeder Maus waren zwei nahe gelegenen PPs in der duodenalen Ende (Abbildung 1A) und mindestens 2 – 3 PPs innerhalb der letzten 5 cm des Ileum nachweisbar.
TFH Färbung kann anspruchsvoller als andere Zelle Teilmengen innerhalb der PPs, erfordern somit zusätzliche Aufmerksamkeit18. Wenn bestimmte Schritte bei der Verarbeitung von Gewebe und Zellen isoliert verpasst werden, könnte Ergebnisse irreführend sein. Daher empfehlen wir Forscher achten Sie auf die folgenden experimentellen "Tipps". Seit wichtige TFH und GC B Zelle Marker wie CXCR5 und GL7 in B- und T-Zellen, ausgedrückt werden können, ist es wichtig, einen B-Zell-Marker in Antikörper-Panels zu falsch positiven Ergebnissen aufgrund der kontaminierenden CD19 gehören+CD4-Zellen+ DP24 ( Abbildung 2). Bitte beachten Sie, dass gating Strategien auf T-Zell-Marker basiert nur25 ausreichend Ausschluss DP Zellen nicht liefern wird, da diese Zellen auch in hohem Grade T-Zell-Marker einschließlich CD3 express (Daten nicht gezeigt) und CD4. Neben den Ausschluss von DP Zellen, Flow Cytometry Ergebnisse sollten überprüft und bestätigt durch den Einsatz geeigneter Negativkontrollen (zB., Isotype Kontrollen, RGV). Nicht nur falsche positive Emotionen, sondern auch fehl am Platze TFH Tor kann zu falschen Ergebnissen und Schlussfolgerungen führen. Anpassung der TFH Tor könnte manchmal schwierig sein, besonders wenn TFH-Zell-Population nicht reichlich vorhanden, ist dabei nicht als diskrete Population in Durchflusszytometrie erscheinen. Diese Einschränkung, die Zugabe von mehreren TFH Markern zu umgehen (zB., BCL-6, PD-1, ICOS) in Antikörper Panel bieten alternative gating Möglichkeiten und Genauigkeit26zu erhöhen könnte. Aus praktischen Gründen wurde BCL-6 gefunden werden, ein ideale Co Färbung Marker für alternative TFH gating wie es verwendet werden kann, für die Anspritzung GC B gleichzeitig16 (Abbildung S1C) Zellen.
Darüber hinaus könnte eine Positivkontrolle Musters, enthält einen hohen Anteil der TFH haben Forscher gute Navigation für die Platzierung der TFH Tor ordnungsgemäß bereitstellen. In unseren Experimenten verwendeten wir PP Proben von gealterten Mäusen (älter als 6 Monate) als Positivkontrolle da wir festgestellt haben, dass Altern die Verstärkung der TFH Zellen in PPs bis zu 40 % der gesamten CD4 verursacht Zellen+ T im Steady-State (Daten nicht gezeigt). Wir empfehlen auch die Forscher, die weiter Interesse an technischen Details der TFH Färbung um die Methoden im Buch veröffentlichten Protokoll für TFH Zelle18Färbung zu betrachten.
Testen experimentelle Hypothesen in PP können relativ anspruchsvoll und erfordern eine sehr hohe Anzahl von Mäusen pro Gruppe, statistische Signifikanz21zu erreichen. Unter Ausnutzung der hohe Zellausbeute unseres Protokolls umgangen wir dieses Hindernis mit den folgenden experimentellen Strategien. Erstens wir herausgeschnitten, PPs und sortiert sie separat je nach anatomischen Herkunft (zB., Zwölffingerdarm, Jejunal und Ileum). Dann haben wir gleichmäßig verteilt diese gepoolte PPs in verschiedenen experimentellen und Kontrollgruppen. Diese intern kontrollierten experimentellen Strategie konnten wir die interindividuelle Differenz bei Mäusen zu minimieren, während alle Zellen aus einem einzigen Mausklick gewonnen wurden.
Darüber hinaus Variabilität zwischen verschiedenen Darm Kompartimenten (zB., Zwölffingerdarm Vs. Ileum)-zuvor berichtet, dass erhebliche2 – wurde als experimentelle verhindert und Kontrollgruppen bestand aus einer gleichen Anzahl von KKS pro anatomische Region (Abb. 5A). Durch Wiederholungen des unabhängigen Experimenten mit dem gleichen Ansatz durchführen, haben wir die Zuverlässigkeit und die Bedeutung der Ergebnisse verbessert. Neben unspezifische Variationen zu eliminieren, hilft diese Methode auch Ersatzteile Mäuse, Reagenzien und Zeit.
Während der Entwicklung und Optimierung unserer Protokoll zufolge waren unsere Ergebnisse Kollagenase II und IV-basierten Verdauung reduziert auffallend CXCR5 Ausdruck (Abb. 5 b) während andere Oberflächenmoleküle zur Erkennung TFH und GC B-Zellen blieb intakt) Abbildung 5 -E) . In einem kürzlich berichtet JoVE Protokoll19Kollagenase II zeigte sich sehr wirkungsvoll für Lymphozyten isoliert von PPs und LPs. Jedoch wurde Kollagenase II zuvor gemeldet, eine hohe Aktivität folgen, haben die Spaltung von mehreren Oberflächenmoleküle führt. Angesichts seiner Oberfläche-Molekül freundliche Art27 aufgrund der geringeren tryptic Aktivität und häufiger Nutzung in der Literatur28,29,30, Kollagenase IV war neben Kollagenase II in Unsere Studie und in den Konzentrationen verwendet, wie in den vorherigen Berichten empfohlen. Die Verwendung von Kollagenase und entsprechende Enzyme wurde eine widersprüchliche Frage in der Schleimhaut Immunologie aufgrund der unerwünschten Wirkungen der Verdauung auf Immunzellen wie veränderte Oberfläche Molekül Ausdruck31,27.
Es wurde bereits berichtet, dass die Verwendung von verschiedenen Arten von Kollagenase Fluss durchflusszytometrischen CXCR5 Erkennung im menschlichen Darm32 und Tonsillen Proben18stören könnten. Dagegen zeigten andere Studien die Isolation der TFH und GC B-Zellen aus PPs ohne den Einsatz von Collagenases24,33. Allerdings jetzt keine vergleichender Ansatz unternommen hatte, zu beurteilen, ob die Einbeziehung oder den Ausschluss von Kollagenase Verdauung von murinen PPS Maus CXCR5 die optimale Voraussetzung für die Isolierung der TFH CXCR5 exprimierenden Zellen darstellen würde ist bis 374 Aminosäure lange sieben-Pass Membranprotein mit relativ kurzen extrazelluläre Regionen im Vergleich zu anderen transmembranen Proteine wie CD4, CD19, die reichlich in lymphoiden Zellen in KKS (Daten aus UniProt) ausgedrückt werden. In Abbildung 8A-B, ein Molekülmodell und total Aminosäure-Sequenz der Maus CXCR5 dargestellt mit der vermuteten Zielsequenzen von Kollagenase-basierte Verdauung, neigt die chemischen Bindungen zwischen Glycin (Gly) und Neutral amino distanzieren Säuren-34. Die sieben-Pass transmembranen molekulare Struktur resultierende kurze extrazellulären Domänen möglicherweise dafür verantwortlich, dass CXCR5 Molekül anfällig für enzymatische Verdauung (Abb. 8A). Interessanterweise, fanden wir die Erkennung des CXCR5 Ausdrucks nach Kollagenase Behandlung ist abhängig von der Antikörper Klon verwendet. Obwohl 2 8 und L138D7 Klone ähnlichen Leistung in der unverdaute PP-Gruppe, bestimmt durch den Nachweis des vergleichbaren TFH Brüche in der verdauten PP-Gruppe zeigte L138D7 Klon ergab ca. 3 x (≈ 9 %) höheren Anteil der TFH Zellen innerhalb von CD4+ T-Zellen als die 2 8 Klon (≈ 3 %) (Abbildung 6). Dieser Befund legt nahe, dass reduzierte CXCR5 Färbung möglicherweise sekundär zu modifizierten dreidimensionalen Epitop Konfiguration durch die enzymatische Aktivität der Kollagenbildung. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Kollagenase-basierte Verdauung während der PP Vorbereitung vermieden werden muss.
Die Einmischung der Kollagenase Dissoziation mit CXCR5 Molekül Erkennung wurde durch den Ausschluss des Verdauung Schritt umgangen. Allerdings ist darauf hinzuweisen, dass für einige Gewebe wie LP, mechanische Störung reicht nicht aus, um die Zellen zu isolieren und für solche Gewebe enzymatische Verdauung benötigt19 wäre. In Zukunft werden wesentliche alternative Verdauung sowie Verdauung-kompatiblen Antikörper Klone zu umgehen, diese technische Einschränkung für Gewebe erfordert enzymatische Verdauungsprozesse zu testen. Bis dahin bleiben bildgebende Verfahren wie z. B. immun-Fluoreszenz-Mikroskopie als die Methode der Wahl für die Erkennung der TFH in diesen Geweben. Neben LP Zellen zu isolieren, die Isolierung von einigen blutbildenden Zelle Teilmengen wie DCs und Plasmazellen aus PPs benötigen enzymatische Verdauung35. Wenn unser Protokoll zu beschäftigen, sollten Forscher, die diese Zelle Teilmengen aus PPs isolieren wollen die entsprechenden enzymatischen Verdauung Schritt20einbeziehen. Mögliche Störungen der enzymatischen Verdauung mit dem Ausdruck der DC Marker sollte in Betracht gezogen werden und Verdauung Bedingungen sollten optimiert werden, je nach Bedarf. Wenn Isolierung der TFH und GC B-Zellen zusätzlich eine Zelle Teilmenge gewünscht ist, die Kollagenase Verdauung36, PPs, gesammelt von jeder Maus erfordert konnten in zwei Gruppen für die Verarbeitung mit und ohne Kollagenase-Behandlung in parallelen Platten getrennt werden.
Die Auswirkungen der Kollagenase auf PP Lymphozyten waren nicht auf Oberflächen Molekül Ausdruck beschränkt. Unsere Ergebnisse zeigten, dass enzymatische Verdauung einen relativen Rückgang der Lymphozyten-Anteil in den PP-Zellen in einer Dosis-abhängigen Weise (Abbildung 7 verursacht). Der Rückgang der Lymphozyten-Anteil möglicherweise eine Folge der Kollagenase-vermittelte Freisetzung von anderen Arten von blutbildenden Zelle Teilmengen wie Fresszellen und DCs aus PPs, die größer und genauer als lymphoide Zellen sind. Es ist auch möglich, dass Kollagenase Verdauung Zelle Freisetzung vermittelte aus dem benachbarten LP und intraepitheliale Fächer dazu, die Änderung der FSC-SSC Profil beitragen könnte. Diese Zelle Kontamination aus anderen Fächern Darm könnte auch Störungen in der Flow-Analyse von PP-Lymphozyten verursachen. Auf dieser Grundlage vermeiden zur Maximierung der Zelle Reinheit, wir auch die Zugabe von Reagenzien wie EDTA oder DVB-t, die weit verbreitet sind, Epithelzellen und Schleim20, extrahieren Gewebeverhältnisse Vorbereitung als physiologische und unmanipuliertes wie möglich zu halten. Trotz dieser negativen Effekte der enzymatischen Verdauung wurden auch positive Auswirkungen auf die PP-Lymphozyten wie Verbesserung der intrazelluläre Färbung und Zellviabilität (Abbildung 7-F, G) entdeckt. Allerdings ergab weitere Analysen, dass diese Effekte auf den Schüttelvorgang bei 37 ° C unabhängig von enzymatischen Verdauung zurückgeführt wurden, weil Zellviabilität und intrazellulären Foxp3 Färbung in vergleichbarem Umfang begünstigt wurden, wenn Zellen in aufgeregt waren das Fehlen der Kollagenbildung. Mechanistisch, möglicherweise die wohltuende Wirkung der Erregung durch die verbesserte Entfernung des Darminhalts und Schleim aus PPs.
Zusammenfassend lässt sich sagen haben wir eine optimierte Protokoll für die Isolierung von Lymphozyten aus PPS isoliert beschrieben, Zellen können auch für Strömung durchflusszytometrischen Charakterisierung der mehrere Zelle Teilmengen gebeizt oder können Zellsortierung ausgesetzt und anschließend eingesetzt werden in verschiedenen in-vitro- und in-Vivo funktionelle Assays.
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Disclosures
Keine Interessenkonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir möchten danken Laura Strauss und Peter Salbei für hilfreiche Diskussionen und mit Flow Cytometry Analysen zu unterstützen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD4 antibody | eBioscience, Biolegend* | 17-0041-81 ,10054* | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CD19 antibody | eBioscience | MA5-16536 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse PD-1 antibody | eBioscience | 61-9985-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse ICOS antibody | eBioscience | 12-9942-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse GL7 antibody | Biolegend | 144610 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CXCR5 antibody | Biolegend*, BD Bioscience | 145512*, 551960 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse BCL-6 antibody | Biolegend | 358512 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse Foxp3 antibody | eBioscience | 17-5773-82 | For detailed information see Table 1 |
| Streptavidin-BV421 | BD Bioscience | 563259 | For detailed information see Table 1 |
| FixableViability Dye | eBioscience | L34957 | For detailed information see Table 1 |
| 7AAD | Biolegend | 420404 | For detailed information see Table 1 |
| FcBlock (CD16/32) | BD Bioscience | 553141 | For detailed information see Table 1 |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 6-well,12-well & 96-well plates | Falcon/Corning | 353046,353043/3596 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 10 mL syringe-plunger | Exel INT | 26265 | |
| RPMI | Corning | 15-040-CV | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Orbital shaker | VWR | Model 200 | |
| Curved-end scissor | |||
| Fine Serrated Forceps | |||
| Small curved scissor |
References
- van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPα interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer’s patches: Organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).
- Heel, K. A., McCauley, R. D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. Review: Peyer’s patches. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 122-136 (1997).
- Fagarasan, S., Kinoshita, K., Muramatsu, M., Ikuta, K., Honjo, T. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413 (6856), 639-643 (2001).
- Hopkins, S. A., Niedergang, F., Corthesy-Theulaz, I. E., Kraehenbuhl, J. P. A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer’s patch dendritic cells. Cellular Microbiology. 2 (1), 59-68 (2000).
- Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches. Infection and Immunity. 71 (1), 504-509 (2003).
- Sato, A., Iwasaki, A. Peyer’s patch dendritic cells as regulators of mucosal adaptive immunity. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1333-1338 (2005).
- Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Y. Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways. Annals of the New York Academy of Sciences. 1247 (1), 97-116 (2012).
- Fagarasan, S., Kawamoto, S., Kanagawa, O., Suzuki, K. Adaptive Immune Regulation in the Gut: T Cell-Dependent and T Cell-Independent IgA Synthesis. Annual Review of Immunology. 28, 243-273 (2010).
- Hase, K., et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH + bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).
- Wu, H., et al. An Inhibitory Role for the Transcription Factor Stat3 in Controlling IL-4 and Bcl6 Expression in Follicular Helper T Cells. Journal of Immunology. 195 (5), 2080-2089 (2015).
- Vinuesa, C. G., Tangye, S. G., Moser, B., Mackay, C. R. Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity. Nature Reviews Immunology. 5 (11), 853-865 (2005).
- Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal Centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
- Vaeth, M., et al. Store-Operated Ca2+Entry in Follicular T Cells Controls Humoral Immune Responses and Autoimmunity. Immunity. 44 (6), 1350-1364 (2016).
- Meli, A. P., et al. The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance. Immunity. 45 (4), 831-846 (2016).
- Fu, W., et al. Deficiency in T follicular regulatory cells promotes autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 815-825 (2018).
- Espéli, M., Walker, J. M. T follicular helper cells - Methods and Protocols. , (2015).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visual Experiments. (111), e54114 (2016).
- De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer’s Patches. Journal of Visual Experiments. (73), e50167 (2013).
- Pastori, C., Lopalco, L. Isolation and in vitro Activation of Mouse Peyer’s Patch Cells from Small Intestine Tissue. Bio-protocol. 4 (21), e1282 (2014).
- Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. Journal of Visual Experiments. (58), 3225 (2011).
- Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).
- Bollig, N., et al. Transcription factor {IRF4} determines germinal center formation through follicular T-helper cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Science of U. S. A. 109 (22), 8664-8669 (2012).
- Pérez-Mazliah, D., et al. Follicular Helper T Cells are Essential for the Elimination of Plasmodium Infection. EBioMedicine. 24, 216-230 (2017).
- Sage, P. T., Sharpe, A. H. T follicular regulatory cells in the regulation of B cell responses. Trends Immunology. 36 (7), 410-418 (2015).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. Journal of Immunological Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
- Meenan, J., et al. Altered expression of alpha 4 beta 7, a gut homing integrin, by circulating and mucosal T cells in colonic mucosal inflammation. Gut. 40 (2), 241-246 (1997).
- Cao, A. T., et al. Interleukin (IL) -21 promotes intestinal IgA response to microbiota. Mucosal Immunology. 8 (5), 1072-1082 (2015).
- Wei, J., et al. Autophagy enforces functional integrity of regulatory T cells by coupling environmental cues and metabolic homeostasis. Nature Immunology. 17 (3), 277-285 (2016).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. 33 (S1), (2017).
- Bergqvist, P., Gardby, E., Stensson, A., Bemark, M., Lycke, N. Y. Gut IgA Class Switch Recombination in the Absence of CD40 Does Not Occur in the Lamina Propria and Is Independent of Germinal Centers. Journal of Immunology. 177 (11), 7772-7783 (2006).
- Keil, B., Gilles, A. M., Lecroisey, A., Hurion, N., Tong, N. T. Specificity of collagenase from Achromobacter iophagus. FEBS Letters. 56 (2), 292-296 (1975).
- Mora, J. R., et al. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer’s patch dendritic cells. Nature. 424 (6944), 88-93 (2003).
- Reboldi, A., et al. Mucosal immunology: IgA production requires B cell interaction with subepithelial dendritic cells in Peyer’s patches. Science. 352 (6287), (2016).
