Summary
I denne studien presenterer vi en ny og effektiv protokoll for isolering av lymfocytter fra Peyers patcher (PPs), som senere kan brukes i vivo og i vitro funksjonelle analyser samt flyt cytometric studier av follikulær T hjelper og germinal sentrum B celler.
Abstract
I tarmen mucosa utgjør immunceller en unik immunologiske enhet, som fremmer immun toleranse mens samtidig overdragelse immunologiske forsvar mot patogener. Det er godt etablert at Peyers oppdateringer (PPs) har en viktig rolle i slimhinnene immun nettverket av hosting flere effektor T- og B-celle undergrupper. En viss brøkdel av disse Effektor celler follikulær T helper (TFH) og germinal sentrum (GC) B-celler er professionalized i regulering av humoral immunitet. Derfor kan karakterisering av disse celle undergrupper innenfor PPs deres differensiering programmet og funksjonelle egenskaper gi viktig informasjon om mucosal immunitet. Dette ville en lett anvendelig, effektiv og reproduserbar metode lymfocytt isolasjon fra PPs være verdifullt å forskere. I denne studien har vi som mål å skape en effektiv metode for å isolere lymfocytter fra musen PPs med høyt utbytte. Vår tilnærming avslørt at første vev behandling som bruk av fordøyelseskanal reagenser og vev agitasjon, samt flekker forhold og utvalg av antistoff paneler, har stor innflytelse på kvaliteten og identiteten til isolerte lymfocytter og på eksperimentelle resultater.
Her beskriver vi en protokoll slik at forskere isolere effektivt lymfocytt befolkningen fra PPs tillater reproduserbar flyt cytometri-basert vurdering av T- og B-celle undergrupper primært fokusere på TFH og GC B celle undergrupper.
Introduction
Hele gastrointestinaltraktus fra begynnelsen til slutten er pyntet med et omfattende lymfoide nettverk som inneholder immunceller mer enn noen andre organ i menneskelige og mus1. Peyer's oppdateringer (PPs) utgjør en viktig del av intestinal grenen av denne mobilnettet immunforsvaret organisasjonen, såkalte gut-assosiert lymfoid vev (GALT)2,3. I PPs, tusenvis av millioner av antigener avledet fra kosttilskudd materialer, commensal bakterieflora og patogener å være samples kontinuerlig, og når nødvendig riktig immunreaksjoner mot dem er montert dermed opprettholde intestinal immun homeostase. I den forstand, kan PPs bli navngitt som "mandlene i tynntarmen". PPs består av store sub rom: subepithelial dome (SED), stor B-celle hårsekken soner; overliggende hårsekken-assosiert epitel (FAE) og interfollicular-regionen (IFR) der T-celler er ligger4. Dette unike compartmentalization av PPs gjør forskjellige effektor celle undergrupper å samarbeide, gir dermed immunkompetanse i tarmen.
PPs mangler afferente lymfekar, og på grunn av denne grunn antigener transportert til PPs fra tynntarm ikke blir utført gjennom lymfekar står i kontrast til de andre lymfoide organene. I stedet, spesialiserte epitelceller i FAE, såkalt M celler, er ansvarlig for overføring av luminal antigener i PPs5. Deretter transportert antigener blir plukket opp av de dendrittiske cellene (DCs) og phagocytes i regionen subepithelial dome (SED) under FAE6,7. Denne antigen sortering prosessen ved DCs i PP er avgjørende å starte adaptive immunrespons8 og etterfølgende generasjon av IgA sekresjon celler9.
På grunn av den tunge antigen byrden fra commensal flora og kosttilskudd materiale, PPs vert endogenously aktivert effektor T- og B-celle delsett i store antall som TFH og IgA+ GC B celler10, antyder at PPs representerer et område av aktive immun svar11. Påvisning av opptil 20 – 25% TFH celler i totale CD4+ T celle kupé og opp til 10-15% GC B celler i totale B-celler er mulig i PPs fra unimmunized unge C57BL/6 mus12. I motsetning til andre T hjelper celletyper (dvs., Th1, Th2, Th17 celler), TFH celler Vis unike tropism til B-cellen follikler hovedsakelig på grunn av CXCR5 uttrykk som fremmer TFH celle homing langs CXCL13 gradient13. I sonene B celle hårsekken av PPs indusere TFH celler IgA klassen bryter rekombinasjon og somatiske hypermutation i aktivert B celler som høy affinitet IgA produsere cellene skille14. Deretter disse antistoff-sekresjon plasma celler migrere til lamina propria (LP) og regulere immunsystemet homeostase i tarmen10.
Identifikasjon og karakterisering av TFH og GC B celle populasjoner i PPs kan gjøre forskere å undersøke dynamikken i humoral immunreaksjoner under stabil forhold uten tidkrevende immunisering modeller tradisjonelt brukt i TFH-GC B celle studier15,16,17,18. Analysere TFH celler i PPs er ikke så enkelt som andre celle undergrupper. Tekniske utfordringer inkluderer identifisere ideelle vev forberedelse forhold, overflate antistoff-markør kombinasjon, samt velge riktig positive og negative kontroller. Både TFH og PP forskningsfelt viser stor variasjon i eksperimentell prosedyrer og er langt fra overdragelse konsensus for å opprette standardiserte protokoller av flere grunner. Først hver celle delsett i PPs tendens til å bli påvirket ulikt av vev forberedelse tilstander som krever ytterligere endringer i en celle delsett-spesifikk måte. Andre, det er en betydelig avvik mellom de rapporterte metodene om detaljene for celle forberedelse fra PPs. tredje, antall portbasert komparative studier undersøker ideelle vev forberedelser teknikker og eksperimentelle forhold forskning er temmelig begrenset for PP og TFH.
Gjeldende portbasert studier foreslått for PP celle forberedelse19,20,21,22 var ikke TFH- eller GC B celle-orientert. Videre noen vev forberedelse forhold anbefales for PPs19,20 som collagenase-baserte fordøyelsen ble funnet for å påvirke utfallet av TFH identifikasjon av flowcytometri negativt18. På dette grunnlaget tenkte vi at en optimalisert, standardisert og reproduserbar protokoll som kan brukes til å studere TFH og GC B celle dynamikken i PPs ville være verdifullt å etterforskerne jobber på dette emnet. Dette behovet ga oss drivkraft til å generere en forbedret og oppdatert protokoll for isolering og karakterisering av PP lymfocytter som er fint optimalisert for mobilnettet utvinning, levedyktighet og effektivitet for flyt cytometric karakteristikk av flere T- og B celle undergrupper. Vi har også rettet å utelukke flere arbeidskrevende klargjøringstrinn som foreslått i tidligere protokoller, dermed redusere nødvendige manipulasjoner og tid for vev og celle forberedelse fra PPs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle studier og eksperimenter beskrevet i denne protokollen ble utført under retningslinjer institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Beth Israel Medical Center diakonale.
1. design eksperimentelle Set-up og mus grupper
- (Valgfritt) Co huset eksperimentelle mus å lette vannrett overføring av tarmen bakterieflora mellom eksperimentelle mus og redusere uspesifisert variasjon i PP lymfocytter. I tillegg bruk littermate kontroller av samme kjønn for å minimere variasjon.
2. inngrep forbrukeravgift og vev forberedende trinn:
- Kirurgisk fjerning av tynntarmen (SI)
- Euthanize mus CO2 kvelning eller en tilsvarende metode godkjent av institusjonelle dyreetikk.
- Overføre musen til et område for inngrep forbrukeravgift. Plasser baksiden ned og rense magen med 70% etanol. Utføre en laparotomy ved å kutte abdominal huden og peritoneum langs midtlinjen fra pubis til ribbe buret dermed åpne bukhulen.
Merk: Utfør den første snittet på et relativt lite område i huden å unngå gjennomtrengende bukhulen og skade tarmen tissue. Fortsette excision til ønsket anatomiske grensen. - Identifisere caecum, som er en ideell for påvisning av terminal ileum, som utgjør den distale del av tynntarmen.
Merk: Caecum er vanligvis plassert på nedre venstre side av musen magen. - Finne ileocaecal junction og gjøre et kutt på dette nivået som distale som mulig å skille tynntarmen fra caecum. Unngå overdreven fysisk kontakt med tarmveggen gjennom de neste trinnene, fordi skjøre PPs skjule enkelt ved berøring.
- Forsiktig fjerne hele tynntarmen før den inn sphincter ved å kutte mesentery med saks. Identifisere krysset mellom pylorus og duodenum og klipp tolvfingertarmen på dette nivået, som vil føre til fullføre avdeling av tynntarmen fra bukhulen.
Merk: (i) unngå hyperextension som dette kan føre til brudd på tarmveggen. (ii) hvis LP lymfocytt isolasjon ønskes i tillegg til PP lymfocytter, fullstendig fjerning av hvem fett er nødvendig. Men PP-isolering, kan gjenværende hvem fett gi noen fordeler under den videre skritt for isolasjon; Derfor bør det bevares. - Plasser frittliggende små tarmer i en 6-vel plate fylt med kaldt RPMI + 10% fosterets bovin serum (FBS) og forsiktig agitere vev manuelt før alle intestinal segmenter er neddykket i kalde media. Opprettholde vev på is gjennom de neste trinnene.
- Etter dissekere ønsket antall musen små tarmer, går du til PP excision fra samlet små tarmer.
- Inngrep forbrukeravgift PPs og forberedelser for en enkeltcelle suspensjon:
- Forsiktig overføre tynntarmen på et papirhåndkle ved hvem fettet ved hjelp av pinsett og sett hvem siden mot tørkepapir. Fukte hele intestinal segmentet med kaldt RPMI + 10% FBS å unngå vev dehydrering og klissete.
Merk: Gjenværende hvem fett kan være nyttig på dette stadiet fordi fettvev segmenter på SI hvem nettstedet vil holde seg til papirhåndkle holde anti-hvem området grossist. - Identifisere PPs, som vises som hvite multi lobulated mengdefunksjoner i "blomkål-lignende" figur på anti-hvem siden av tarmveggen.
Merk: Flushing ut luminal innholdet er ikke anbefalt til alle PPs er forbrukeravgift. Tømme luminal innholdet kan forårsake sammenbruddet av PPs og vil hindre fargekontrasten mellom PPs og intestinal veggen, som er svært nyttig for visuell identifikasjon av PPs. - Etter identifisere PPs på anti-hvem side, plasserer du den kirurgiske buet slutten scissor på PPs (kurve skal være vendt opp) begrensende PP fra den distale og proksimale grensen.
Valgfritt: Trykk PP forsiktig mot bladene på saks med en fingertupp. Denne manøveren vil føre til bedre utelukkelse av omkringliggende ikke sider vev. Avgiftsdirektoratet PPs forsiktig, unntatt de omkringliggende tarmen tissue.
Merk: (i) dette trinnet er avgjørende for å få maksimal PP celle avkastning samtidig minimere celle forurensning fra nabokommunene intestinal avdelinger som LP og intestinal epitel, som er også rik på T-celler. (ii) fra en SI forbrukeravgift fra C57BL/6 musen, kan 5-10 PPs (gjennomsnittlig størrelse, flere lobulated) samles. Gjennom enda mindre PPs (ikke flere lobulated), samling av opptil 12-13 PPs per mus (C57BL/6) er mulig å bruke denne protokollen. - Overføring forbrukeravgift PPs til en 12-vel vev kultur plate fylt med iskald RPMI + 10% FBS og vedlikeholdt på is tang eller buet kirurgisk saks.
Merk: (i) umiddelbart etter excision av PPs, mucus og intestinal innholdet på PP overflaten kan rengjøres ved å gni vevet forsiktig på et papirhåndkle. Dette trinnet vil forbedre levedyktigheten til PP lymfocytter. (ii) i stedet for overføring PPs til en plate, kan overføre til atskilt rør også bli vurdert avhengig av totale eksempel tall. - Valgfritt: Når PP excision og påfølgende plassering i godt platen er fullført, antallet og størrelsen på PPs fra annen eksperimentell/mus grupper kan dokumenteres ved å ta et bilde av vev kultur plate inneholder PPs.
- Forberede et sett av 50 mL konisk rør fylt med 25 mL av RPMI + 10% FBS (pre oppvarmet på 37 ° C). Bruke et par saks, kuttet kanten av et 1000 µL tips fra avstand at aspirasjon av PPs med 1 mL pipette. Sug opp PPs med 1 mL pipette og overføre dem fra 12-vel vev kultur plate til forberedt 50 mL konisk rør.
Merk: Bruk en ny spiss for hver musen prøve for å unngå kryss-smitte blant eksemplene. - Sikre lokket og sted rør vertikalt i en orbital shaker ved 37 ° C, med kontinuerlig agitasjon på 125-150 rpm for 10 min. I mellomtiden forbereder et nytt sett av 50 mL rør og plassere en 40 µm celle sil på hver tube, som enkelt celle suspensjon tilberedes.
Merk: (i) agitasjon foranstaltningen ville fjerne de gjenværende intestinal innhold, Slim og celle rusk, som reduserer celle levedyktighet og utvinning av PP lymfocytter dersom ikke fjernet. (ii) gjelde ikke alle slags fordøyelsesenzymer på PP vev fordi fordøyelsen prosessen forårsaker et dramatisk tap av CXCR5 uttrykk fra celleoverflaten. - Etter agitasjon, overføre PPs til 40 µm celle silen oversiden nylig forberedt konisk 50 mL rørene. Bruker den runde siden av en 10 mL sprøytestempelet, forsiktig forstyrre PPs gjennom cellen silen generere enkeltcelle suspensjon. Skyll silen med 15 – 20 mL kaldt RPMI + 10% FBS.
Merk: (i) før du filtrerer, riste rør som inneholder PPs vannrett. Denne korte riste vil lette overføringen av PPs i cellen siler. (ii) bruker en 70 µm celle sil for isolering av ikke-lymfoide immunceller (f.eks., monocytter, makrofager, DCs) anbefales. - Sentrifuge enkeltcelle suspensjoner 350-400 x g i 10 min på 4 ° C.
- Forsiktig kaste nedbryting og resuspend cellene i en konsentrasjon av 10 x 106 celler/mL. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer.
Merk: (i) før til celle telling, hvor totalt-cellen for hver musen PP ca bestemmes ved hjelp av følgende formel: "0,5-1 x 106 celler x (antall PPs) = total celletall". Ytterligere fortynninger med trypan blå for cellen opptelling kan være nødvendig. (ii) som et alternativ til manuell telling, kan automatiserte celle tellere brukes. - Overføre 2-2,5 x 106 celler i riktig volum (f.eks., 200 µL) inn i en 96-brønns runde-bunnplaten.
Merk: For én farge og negativ kontroll prøver, 0,5-1 x 106 celler kan være tilstrekkelig. - Sentrifuge platen 350 x g i 5 min på 4 ° C. Bla platen.
- Vask cellene i 200 µL flekker bufferen.
- Forsiktig overføre tynntarmen på et papirhåndkle ved hvem fettet ved hjelp av pinsett og sett hvem siden mot tørkepapir. Fukte hele intestinal segmentet med kaldt RPMI + 10% FBS å unngå vev dehydrering og klissete.
3. overflate antistoff flekker
- Levedyktighet flekker:
- Etter siste vask, resuspend cellene i 100 μL fixable levedyktighet fargestoff fortynnet i PBS (1:1, 000). Inkuber i 30 min på isen eller i 4 ° C i mørket.
Merk: (i) intracellulær flekker for påvisning av viktige transkripsjon faktorer som Foxp3 eller Bcl-6 krever fiksering av cellene. I så fall ikke-fixable levedyktighet fargestoffer (f.eks., 7-AAD, DAPI) kan ikke brukes. (ii) for å fortynne fixable levedyktighet fargestoff, bruk ikke noen flekker buffer som inneholder protein. Mediene som brukes i dette trinnet må protein-fri. (iii) utelukkelse av døde celler ved hjelp av levedyktighet flekker er avgjørende fordi døde celler kan forårsake alvorlige tekniske problemer i flyt cytometri analyse ved emitting autofluorescence og bindende overflaten antistoffer nonspecifically, som kan føre til falsk positive resultater. - Vask cellene to ganger med flekker buffer. Sentrifuger 350 x g i 5 min på 4 ° C. Bla platen.
- Etter siste vask, resuspend cellene i 100 μL fixable levedyktighet fargestoff fortynnet i PBS (1:1, 000). Inkuber i 30 min på isen eller i 4 ° C i mørket.
- FC Block og overflate - lag I:
- Klargjør Fc-blokk løsningen ved å fortynne anti-CD16/32 antistoff (1:200) i flekker buffer.
- Resuspend cellene i 20 μL Fc-blokk løsningen. Inkuber i 15 min på is.
- Uten å vaske, kan du legge 80 μL overflaten antistoff cocktail (se tabell 1 antistoffer Sammendrag) forberedt på riktig fortynninger. Ruge på is minst 30 min.
- Vask to ganger ved å legge til overdreven flekker buffer. Sentrifuger 350 x g i 5 min på 4 ° C. Bla platen.
- Overflate - lag II:
- Klargjør Streptavidin flekker løsning ved å fortynne fluorochrome-konjugerte Streptavidin flekker buffer.
- Etter siste vask, resuspend cellene med 100 μL pre utvannet Streptavidin (1: 100) flekker løsning. Inkuber i minst 15 min på isen i mørket.
- Vask to ganger med flekker buffer. Sentrifuger 350 x g i 5 min på 4° C. Bla platen.
Valgfritt: Hvis intracellulær flekker for follikulær regulatoriske T celle gjenkjenning ikke er ønskelig, etter siste vask, resuspend cellene i 200 μL av flekker buffer og overføring til riktig rør hente data i flyt cytometer. Oppkjøpet av data av flowcytometri skal utføres innen 3-4 timer å få nøyaktige resultater når prøvene ikke er faste.
4. celle fiksering
- Forberede fiksering/permeabilization (fastsette/Perm) arbeidsoppløsning ved hjelp av reagensene Foxp3/transkripsjon faktor flekker Buffer angi. Bland en av fiksering/permeabilization konsentrat med tre deler av fiksering/permeabilization fortynningsmiddel ønsket endelige volumet.
- Etter siste vask, resuspend cellene i 200 μL av fastsette/Perm fungerende løsning.
- Inkuber platen på isen eller i 4 ° C for 20 min. Ikke overstige 20 min for dette trinnet. Lengre inkubasjon tid kan bli sterkt redusert celle utvinning.
- Sentrifuger 350 x g i 5 min på 4 ° C. Bla platen. (Valgfritt) Etter dette trinnet fast celler kan lagres i flere dager på 4 ° C i flekker bufferen som inneholder bovin serum albumin (BSA) eller FBS til etterfølgende intracellulær flekker eller flow cytometri oppkjøpet.
- Resuspend cellene i 200 μL av permeabilization Buffer (x1) fersk pre fortynnet i renset deionisert vann.
- Sentrifuge 350 x g i 5 minutter ved romtemperatur (RT).
- Vask en gang med 200 μL av permeabilization buffer og sentrifuge 350 x g for 5 min på RT.
5. intracellulær flekker
- Klargjør Fc-blokk løsningen ved å fortynne anti-CD16/32 antistoff (1:200) i permeabilization buffer.
Merk: Etter fiksering trinn, cellene må opprettholdes i permeabilization buffer til slutten av intracellulær farging prosessen. - Etter siste vask, resuspend cellene i 20 μL Fc-blokk løsning. Inkuber i 10-15 minutter på RT i mørket.
- Uten å vaske, tilsett 80 μL intracellulær antistoff cocktail (100 μL siste volum) pre fortynnet i permeabilization buffer. Inkuber i 30 min på RT.
- Tilsett 100 μL Perm Buffer og sentrifuger 350 x g i 5 min på RT.
- Vask en gang med 200 μL av permeabilization buffer, sentrifuge 350 x g i 5 min på RT.
- Etter siste vask, resuspend cellene i 200 μL av flekker buffer og overføre cellene til riktig rør (siste volum av 400 μL flekker buffer) og hente data av flowcytometri. Prøver beiset i 96-brønnen plate kan også kjøres uten å overføre inn i rør hvis en flyt cytometer med plate leser alternativet tilgjengelig. Dette trinnet minimerer celle tap under overføring av cellen.
- Anskaffe minst 5 x 105 totalt celler i flyt cytometer kunne utføre reproduserbar analyse av TFH, SFT samt GC B celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I motsetning til en tidligere protokollen20, vi har observert at PPs ikke er jevnt fordelt i hele SI men er lokalisert mer tett mot distale og proksimale endene av SI som vist i figur 1A. Flyt cytometric analyse viste at hvis fulgt riktig, vår protokollen gir en PP lymfocytt befolkningen som viser frem side scatter distribusjon ligner på splenocytes (figur 2AE og 2D, H) med > 95% celle levedyktighet (figur 2B og 2F). I motsetning til andre sekundære lymfoide organer (SLOs), i C57BL/6 mus ca 70-80% av total PP lymfocytter består av B-celler, mens CD4+ T celler utgjør bare 10-15% av total PP lymfocytter (figur 2C og 2 G).
Merk at CD4+ CD19+ dobbel positive (DP) celler utgjør ≈ 1% av total PP lymfocytter. Med visse forholdsregler under cellen forberedelse som utfører Fc-blokk mot Fc reseptorer på B celler, unntatt doublets, CD4+ CD19+ DP celle befolkningen kan være minimert (figur 3A og B). Men en brøkdel av DPs som ikke viser frem xy (FSC) kjennetegner doublets er uunngåelig, og bør være gated ut fra eneste positive T- og B-celle portene (figur 3B). Resultatene viste at B-cellene i DP celler svært express CXCR5 på overflaten deres (Figur 3 c) som kan føre til falske positive resultater i TFH porten som justeres basert på CXCR5 uttrykk i CD4+ T celler. På den annen side, fant vi at GL7, en markør for aktiveres B celler, er også uttrykt i CD4+ CD19+ DP celler (figur 3D), forårsake interferens med GC B celle gating.
Eksempler på TFH og GC B celle gating algoritmer er avbildet i Figur 4. For GC B celle gating, bruker vi GL7 merking versus CD38, som identifiserer GC B celler som GL7+ CD38- B-celler (figur 4A-B). PNA merking kan brukes i stedet for GL723 mens CD38 kan erstattes av en av følgende markører: IgD Bcl-6 og CD95. Alternativ gating strategier for GC B-celler er vist i figur S1. GC B celle forholdet i PPs viser stor variasjon i C57BL/6 mus. Men har sammenlignet med andre SLOs, PPs betydelig høyere GC B celle forhold med en rekke 2-10% av totale B celler under steady-state-betingelser. Gating strategi for PP TFH celler er beskrevet som CD19- CD4+ PD-1Hei CXCR5+ T celler (figur 4A, C). "Zebra plott" ble funnet for å være en optimal demonstrasjon metode for TFH gating som den skildrer PD-1Hei befolkningen mer diskret sammenlignet med andre plott typer (figur 4C). SFT, et delsett av TFH celler uttrykke Foxp3, er gated som CD19- CD4+ PD-1Hei CXCR5+ Foxp3+ T celler (Figur 4 d). Som GC B celler, TFH celle brøken varierer også i unimmunized musen individer med en rekke 10-20% av totale CD19- CD4+ PP lymfocytter. Detaljer om alternative gating algoritmer for TFH celler er beskrevet i figur 4E, F og Figur S1C, D.
For å unngå falske positivitet bakgrunn flekker og autofluorescence, skal isotype kontroller eller alternativ tilsvarende kontroller som fluorescens Minus én (FMO) være inkludert i flekker panelet som en negativ kontroll for TFH og GC B celle markører ( Figur 4G-J).
For å optimalisere betingelsene for PP vev forberedelse, vi utviklet en ny internt kontrollert eksperimentelle strategi, der PPs ble samlet fra ett enkelt museklikk og samlet seg avhengig av deres anatomiske opprinnelse (f.eks., duodenalsår, chymet). For å utføre eksperimenter, gruppert PPs tildelt individuelle grupper slik at hver eksperimentelle og kontrollgruppe inkludert av PPs fra hver anatomiske region (figur 5A). Ved denne tilnærmingen, fant vi at collagenase-baserte enzymatisk fordøyelse (testet på 37,5 mg collagenase II eller IV per 25 mL av fordøyelsen = 1.5 mg/mL), som vanligvis brukes for lymfocytt isolasjon fra ulike mucosal vev, betydelig redusert CXCR5 uttrykk i PP lymfocytter (figur 5B), spesielt i TFH celler (figur 5F-jeg), mens uttrykk for andre overflaten molekyler (f.eks., CD19, CD4) forble intakt (Figur 5 C-E). Reduksjon av CXCR5 var fremtredende slik at uttrykk for CXCR5 på collagenase-behandlet TFH celler var nesten utvisket fra isotype kontroll (figur 5F-jeg). Videre viste at forstyrrelser nivået av enzymatisk fordøyelsen CXCR5 uttrykk var avhengig av den CXCR5 antistoff klone brukes (figur 6A-F). Spesielt etter collagenase II behandling var oppdagelsen kapasitet CXCR5 antistoff klone 2 g 8 mer betydelig svekket, enn oppdagelsen kapasiteten til CXCR5 antistoff klone L138D7 (Figur 6A-D).
Enzymatisk fordøyelsen redusert ikke bare uttrykk for CXCR5, men også andelen av total lymfocytter i PP celler som FSC-SSC egenskapene, mens en betydelig del av celler isolert fra fordøyd PPs utstilt frem og side punktdiagram med en høyere intensitet enn PP lymfocytter (finne 7A-C). Effekten av collagenase på celle utvinning oppstod i en doseavhengig måte (figur 7A, H-J). Enzymatisk fordøyelsen økt celle levedyktighet (figur 7 d, E). Men dette ble ikke causatively koblet til collagenase fordøyelsen fordi cellene isolert fra PPs etter agitasjon uten collagenase ble favorisert tilsvarende (figur 7F). Oppdagelsen av den kjernefysiske transkripsjon faktoren Foxp3, som er av spesiell interesse her fordi det er vanligvis vurdert under TFH isolasjon til å identifisere SFT celler, ble forbedret ved agitasjon på 37 ° C uansett collagenase fordøyelsen (figur 7G ).
Figur 1: makroskopisk struktur og anatomisk distribusjon murine Peyers lapper. (A). et bilde Hentet fra duodenalsår-enden av tynntarmen med magen. To tett plassert PPs i tolvfingertarmen angis med svarte piler. (B). PPs fra elleve C57BL/6 mus ble lagret enkeltvis i en 12 vel-plate. (C). bilde av fersk forbrukeravgift musen PPs vises på en 40 µm celle sil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: flyt cytometric karakterisering og enkel gating algoritme for PP lymfocytter. (A). Dot tomter viser fordelingen av fersk isolert unfixed PP lymfocytter langs FSC og SSC akser som viser stor likhet splenocytes avbildet i (D). (B). utelukkelse av døde celler ved hjelp av 7AAD uttrykk. 7AAD- -cellene representerer lever celler. (C). CD19 og CD4-baserte immunophenotyping av T- og B-cellene blant pre gated lever PP celler. (E-G). Representant flyt analyse av fast PP lymfocytter. (H). representant flyt av faste splenocytes. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: CD4+ CD19+ dobbel Positive (DP) celler årsaken falske positivitet i TFH og GC B celle gating. (A). CD4+CD19+ DP lymfocytter i live PP celler er vist. (B). separasjon av DP cellene basert på FSC egenskaper som doublets og singlets. (C,D). CXCR5 og GL7 uttrykk for DP celler er avbildet i histogrammet tomter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representant TFH og GC B celle gating strategi. PPs ble Hentet fra en 3 - måneder gammel mus og lymfocytter ble isolert som beskrevet i delen protokollen. (A) CD19 og CD4 merking av live PP lymfocytter er avbildet. (B) CD38lo GL7HeiCD19+ B celler var gated som GC B celler. (C) TFH celler var gated som CXCR5+PD-1Hei CD4+ celler. (D) SFT celler er en brøkdel av TFH celler uttrykke regulatoriske celle-spesifikke transkripsjon faktor Foxp3 sammen med TFH indikatorer og er gated som CXCR5+ PD-1Hei Foxp3+ CD4+ T celler. (E-F) Gating strategi for TFH overflate markører i splenocytes isolert fra NP-OVA-vaksineres mus ved hjelp av BCL-6 uttrykk. (G-J) Fluorescens Minus én (FMO) kontroller for nøkkel TFH-SFT og GC celle markører er avbildet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Collagenase-baserte enzymatisk fordøyelsen fører til en massiv reduksjon av CXCR5. (A) PPs fra 2 måneder gammel mus i tolvfingertarmen (≈ 1/3 proksimale), jejunum (≈ 1/3 midten) og ileum (≈ 1/3 distale) var samlet og samlet separat. Grupperte PPs ble like distribuert til eksperimentelle grupper. Enzymatisk fordøyelsen med collagenase II eller IV på 1.5 mg/mL konsentrasjonen ble utført med agitasjon for 10 min på 37 ° C. (B-E) Histogrammet tomter viser uttrykket av overflaten molekyler (CXCR5, CD19, PD-1, CD4) av celler isolert fra PPs som ble utsatt for collagenase-baserte fordøyelsen. (F-jeg) TFH gating innen collagenase-administrert og kontroll grupper demonstreres i zebra tomter. Dataene representerer tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: effekten av collagenase på CXCR5 uttrykk viste stor forskjell avhengig av anti-CXCR5 antistoff klone. PP lymfocytter inn fra 6-måneden-gamle musen, samles og atskilt i ulike grupper om antistoff klone brukes og enzymatiske fordøyelsen program. (A-F) Andelen av TFH celler er avbildet i zebra tomter innen gated pre live, CD19- CD4+ T celler. (A, C og E) PP celler var farget med Biotin-konjugerte anti-musen CXCR5 antistoffer (2 g 8 klone), og Streptavidin konjugert med BV421 fluorochrome. (B, D og F) PP celler var farget med en primær konjugert anti-musen CXCR5 antistoff (L138D7 klone). (A-B) TFH gating tomter fra ufordøyd PP lymfocytter. (C-D) PPs fordøyd med collagenase II (20 mg/25 mL fordøyelsen Mix) og opphisset i 10 min på 37 ° C. Dataene representerer to uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Collagenase-baserte fordøyelsen og agitasjon på 37 ° C påvirker celle levedyktighet, utvinning og intracellulær flekker effektivitet. 3 måneder gamle C57BL/6 mus ble ofret; PPs var samlet og samlet som beskrevet i figur 5A. (A) etter samlingen av PPs, vev var opphisset i nærvær av collagenase II (37,5 mg/25 mL fordøyelsen Mix) i 10 min, FSC og SSC kjennetegner fast PP celler vises i (A) og levedyktighet flekker tomten er avbildet i) D). (B, E) etter samlingen av PPs, vev ble holdt på is uten agitasjon eller enzymatisk fordøyelse; FSC og SSC kjennetegner fast PPs celler vises i (B) og levedyktighet flekker er avbildet i (E). (C, F) Etter samlingen av PPs, var vev opphisset 125-150 RPM for 10 min på 37° C i fravær av collagenase; FSC og SSC egenskaper og levedyktighet farging av fast PP celler er avbildet (C, F), henholdsvis. (G) sammenligning av Foxp3 uttrykk i regulatoriske T celler isolert fra opphisset og unagitated PPs uten collagenase administrasjon er avbildet i histogrammet plottet. (H-J) PPs samlet fra en 6 - måned gamle C57BL/6 mus og ble behandlet med ulike konsentrasjoner av collagenase II: 25 mg per 25 mL fordøyelsen mix, 15 mg per 25 mL fordøyelsen blanding eller ingen collagenase. FSC og SSC tomter som avslører effekten av enzymatisk fordøyelsen på PP celle utvinning og avkastning er avbildet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: molekylære modellen og komplett aminosyresekvens av CXCR5. (A) syv omganger transmembrane protein strukturen til CXCR5 er modellert. (B) komplett aminosyresekvens av CXCR5 er vist. Sekvensen av ekstracellulære regioner er merket med rødt og ekstracellulære aminosyrer med presumable collagenase følsom kjemisk obligasjoner er vist i gult. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Antigen | Klone | Fluourochrome | Fortynning |
| CD4 | GK1.5, RM4-5 | APC, PECy7, PerCpCy5.5, FITC | 1: 100 |
| CD19 | 6D 5 | FITC, APC/Cy7 | 1: 100 |
| PD-1 | J43 | PE ef 610 (Texas rød) | 1: 100 |
| ICOS | 15 F9, 7E.17G9 | PE | 1: 100 |
| GL7 | GL7 | PerCp/Cy5.5 | 1:75 |
| CXCR5 | 2 g-8,L138D7 * | Biotin | 1:50 |
| BCL-6 | 7 D 1 | PE/Cy7 | 1:50 |
| FOXP3 | FJK-16 | APC, PE | 1: 100 |
| Streptavidin | - | BV421, PE | 1: 100 |
| FixableViability farge | - | BV 510(AQUA) | 1:1,000 |
| 7AAD | - | PerCp/Cy5.5 | 1:500 |
| FcBlock (CD16/32) | 2.4G2 | - | 1:200 |
Tabell 1: antistoff Sammendrag. Fortynninger, Klon og fluorochrome conjugations for relevante antistoffer og levedyktighet fargestoffer er angitt. Den optimale fortynning kan variere avhengig av eksperimentelle forhold og mange kvaliteten på produktet. Primære BV421-konjugerte L138D7 klone på 1:20 fortynning viste sammenlignbar CXCR5 gjenkjenning kapasitet med biotin-konjugerte 2 g 8 klone på 1:50 fortynning. Derfor primær-konjugerte L138D7 kan brukes som alternativ til biotin-konjugerte 2 g-8 klone.
Figur supplerende 1 (S1): Alternative gating strategier for TFH og GC B-cellene. (A) Live PP lymfocytter fra 3 måneder gammel mus på C57BL/6 bakgrunnen er avbildet. (ABC) GC B-celler er gated som CD38- GL7+ (B) og BCL-6+ GL7+ B celler (C). (D-E) TFH celler vises som PD-1Hei CXCR5+ (D) og som ICOS+CXCR5+ CD4 + T celler (E). Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en protokollen optimert for flyt cytometric karakteristikk av TFH og GC B-cellene. En av de store fordelene med vår protokollen er at den lar isolering av opptil 107 (gjennomsnitt 4 – 5 x 106 celler) totalt PP celler fra et enkelt museklikk (C57BL/6 belastning) uten fordøyelsen prosess. Vi observerte at total-celle avkastningen var positivt korrelert med hvor mange PPs og kan estimeres fra det følgende enkle ligningen som er nyttig for planlegging av eksperimentelle: "totale PP celle teller per musen = 0,5-1 x (antall forbrukeravgift PP per mus) x 106". Dette høyt gir ble supplert med forbedret celle levedyktighet (> 95%). Forbedret celle utvinning og levedyktighet kan utføre flyt cytometric analyse av ulike lymfocytt delsett i PPs bruke ulike antistoff flekker paneler parallelt.
Sammenlignet med en siste PP isolasjon protokoll publisert av De Jesus et al. 20 og tidligere rapporter19,21, ga våre protokollen betraktelig høyere total-celle avkastning og livskraft, til tross for fravær av fordøyelsen med collagenase. Selv om identifikasjonen av PPs kan være "vanskelige" for første gang etterforskerne, læringskurven for denne protokollen er ganske bratt, og hvis mestret, våre teknikken kan identifikasjon og inngrep forbrukeravgift av PPs fra tynntarm i en kort tid. Hvis ønsket PP nummer ikke nås etter første forsøk, foreslår vi gjentar PP identifikasjon trinn fokuserer på den distale og proksimale enden av SI. I vår praksis, nesten i alle mus, var to tett plassert PPs duodenalsår slutt (figur 1A) og minst 2-3 PPs i de siste 5 cm i ileum synlig.
TFH flekker kan være mer krevende enn andre celle undergrupper innenfor PPs, og dermed krever ekstra oppmerksomhet18. Hvis enkelte trinn er savnet vev behandling og cellen aisolering, kan resultatene være ganske misvisende. Derfor foreslår vi forskere å være oppmerksom på følgende eksperimentelle "tips". Siden viktige TFH og GC B celle markører som CXCR5 og GL7 kan uttrykkes i både B og T celler, er det avgjørende med merketråd B celle i antistoff paneler å unngå falske positive resultater på grunn av forurensende CD19+CD4+ DP celler24 ( Figur 2). Merk at gating strategier basert på T celle markører bare25 ikke gir tilstrekkelig utelukkelse av DP celler siden disse cellene også svært express T celle indikatorer inkludert CD3 (data ikke vist) og CD4. I tillegg til utelukkelse av DP celler, flyt cytometri resultater skal være godkjent og bekreftet ved å bruke riktige negative kontroller (f.eks., isotype kontroller, FMOs). Ikke bare falske positivitet, men også feilplasserte TFH gate kan føre til falske resultater og konklusjoner. Justering av TFH gate kan noen ganger være utfordrende spesielt hvis TFH celle befolkningen ikke er rikelig, dermed ikke vises som et atskilt befolkningen i flowcytometri. Å omgå denne begrensningen, tillegg av flere TFH indikatorer (f.eks., BCL-6, PD-1, ICOS) i antistoff panel kan gi alternative gating muligheter og øke nøyaktigheten26. Av praktiske årsaker, ble BCL-6 funnet for å være en ideell co flekker markør for alternativ TFH gating som det kan brukes for gating GC B celler samtidig16 (Figur S1C).
Videre kunne har en positiv kontroll prøven som inneholder en høy andel TFH gi forskere god navigasjon for å plassere TFH gate riktig. I vårt forsøk, vi brukte PP prøver fra alderen mus (eldre enn 6 måneder) som en positiv siden vi har funnet at aldring årsaker styrking av TFH celler i PPs opp til 40% av totale CD4+ T celler i steady state (data ikke vist). Vi oppfordrer også forskerne som har mer interesse for tekniske detaljer av TFH flekker for å betrakte metodene i boken publiserte protokollen for TFH celle flekker18.
Testing eksperimentelle hypoteser i PP kan være relativt utfordrende og kreve et svært høyt antall mus per gruppe til statistisk betydning21. Ved å utnytte høyt avkastningen av våre protokollen, omgås vi denne hindringen med følgende eksperimentelle strategier. Først vi forbrukeravgift PPs og sortert dem separat avhengig av deres anatomiske opprinnelse (f.eks., duodenalsår, jejunal og chymet). Da distribuert vi like disse gruppert PPs i forskjellige eksperimentelle og kontroll grupper. Dette internt kontrollert eksperimentelle strategi mulig for oss å minimere Inter-individuelle forskjellen i mus mens alle celler Hentet fra et enkelt museklikk.
Videre variasjon mellom forskjellige intestinal rom (f.eks., tolvfingertarmen vs. ileum)-tidligere rapportert å være betydelig2 -ble forhindret som eksperimentelle og kontroll grupper besto fra av PPs per Anatomisk regionen (figur 5A). Ved å utføre av uavhengige forsøk bruke samme tilnærming, forbedret vi pålitelighet og betydningen av våre resultater. I tillegg til å eliminere uspesifikke variasjoner, hjelper denne metoden også ekstra mus, reagenser og tid.
Under utvikling og optimalisering av våre protokollen viste resultatene at collagenase II og IV-baserte fordøyelsen påfallende redusert CXCR5 uttrykk (figur 5B) mens andre overflaten molekyler for gjenkjenning TFH og GC B celler forble intakt ( Figur 5C -E) . I en nylig rapportert JoVE protokollen19, collagenase II viste seg å være svært effektiv lymfocytt isolering fra PPs og LPs. Imidlertid er collagenase II tidligere rapportert å ha en høy tryptic aktivitet, som resulterer i spalting av flere overflaten molekyler. Gitt sin overflaten-molekylet ufarlige27 lavere tryptic aktivitet og mer vanlig bruk i litteratur28,29,30, Collagenase IV hadde også blitt inkludert i tillegg collagenase II i vår studie og brukes i konsentrasjonene som anbefalt i disse tidligere rapporter. Bruk av collagenase og tilsvarende enzymer har vært en motstridende problemet i slimhinnene immunologi på grunn av uønskede effekter av fordøyelsen på immunceller som forandret overflate molekyl uttrykk31,27.
Tidligere ble det rapportert at bruk av ulike typer collagenase kan forstyrre flyten cytometric CXCR5 gjenkjenning i menneskelige tarmen32 og mandel prøver18. Derimot vist andre studier isolering av TFH og GC B celler fra PPs uten bruk av collagenases24,33. Men inntil nå ingen sammenlignende tilnærming ble foretatt å vurdere om inkluderingen eller utelatelsen collagenase fordøyelsen representere den optimale tilstanden for isolering av CXCR5-uttrykke TFH celler fra murine PPs. musen CXCR5 er en 374 aminosyre lang syv omganger membran proteiner med relativt kort ekstracellulære regioner sammenlignet med andre transmembrane proteiner som CD4, CD19 som er rikelig uttrykt i lymfoide celler i PPs (data fra UniProt). I figur 8A-B, molekylær modell og totale aminosyresekvens av musen CXCR5 er avbildet med antatte målet sekvensene collagenase-baserte fordøyelsen, som pleier å distansere kjemisk obligasjoner mellom glysin (Gly) og nøytral amino syrer34. Syv omganger transmembrane molekylstrukturen resulterende kort ekstracellulære domenene kan være ansvarlig for å gjøre CXCR5 molekyl sårbar for enzymatisk fordøyelse (figur 8A). Intriguingly, fant vi at oppdagelsen av CXCR5 uttrykk etter collagenase behandling er avhengig av antistoff klone brukes. Selv om 2 g-8 og L138D7 kloner viste samme ytelse i ufordøyd PP gruppen som bestemmes av gjenkjenning av sammenlignbare TFH fraksjoner, i gruppen fordøyd PP L138D7 klone avdekket ca 3 x (≈ 9%) høyere brøkdel av TFH celler i CD4+ T-celler enn 2 g-8 klone (≈ 3%) (Figur 6). Dette funnet antyder at redusert CXCR5 flekker kan være sekundært til endrede tredimensjonale epitope konfigurasjonen av den enzymatiske aktiviteten av collagenase. Våre resultater indikerer at collagenase-baserte fordøyelsen må unngås under PP forberedelse.
Forstyrrelser av collagenase dissosiasjon med CXCR5 molekyl deteksjon var circumvented ved unntatt fordøyelsen trinnet. Det bør imidlertid bemerkes at for noen vev som LP, mekanisk avbrudd er ikke tilstrekkelig å isolere cellene og for slike vev, enzymatisk fordøyelsen ville være nødvendig19. I fremtiden vil det være viktig å teste alternative fordøyelsen forhold samt fordøyelsen-kompatible antistoff kloner å omkjøringsvei denne tekniske begrensningen for vev krever enzymatisk fordøyelsen prosessene. Inntil da fortsetter Bildeteknikker som immun fluorescens mikroskopi som metoden for valg for TFH gjenkjenning i disse vev. I tillegg til isolere LP celler, isolering av noen blodkreft celle undergrupper som DCs og plasma celler fra PPs krever enzymatisk fordøyelsen35. Når ansette våre protokollen, bør forskere som ønsker å isolere disse celle undergrupper fra PPs inkludere de aktuelle enzymatiske fordøyelsen trinn20. Eventuell interferens enzymatisk fordøyelsen med uttrykk for DC markører bør tas i betraktning og fordøyelsen betingelsene skal være optimalisert etter behov. Når isolering av TFH og GC B-cellene er ønsket i tillegg til en celle delsett som krever collagenase fordøyelsen36, PPs fra hver musen kan deles i to grupper for behandling med og uten collagenase behandling i parallell paneler.
Effekten av collagenase på PP lymfocytter var ikke begrenset til overflaten molekyl uttrykk. Resultatene viste at enzymatisk fordøyelsen forårsaket en relativ reduksjon i lymfocytt andelen i PP celler i en doseavhengig måte (figur 7). Reduksjon av lymfocytt delen kan være en konsekvens av collagenase-mediert utgivelsen av andre typer blodkreft celle undergrupper som phagocytes og DCs fra PPs som er større og mer detaljert enn lymfoide celler. Det er også mulig at collagenase fordøyelsen mediert celle utgivelse fra nabolandet LP og intraepithelial avdelinger kan bidra til endring av FSC-SSC profil. Denne cellen forurensning fra andre gut avdelinger kan også forårsake forstyrrelser i flyten analyse av PP lymfocytter. På grunnlag for å maksimere celle renhet, unngå vi også tillegg av reagenser som EDTA eller DTT som brukes til å trekke ut epitelceller og Slim20, holde vev forberedelse forhold som fysiologiske og unmanipulated som mulig. Til tross for disse bivirkninger av enzymatisk fordøyelsen, ble gunstige effekter på PP lymfocytter også oppdaget som forbedring av intracellulær flekker og celle levedyktighet (figur 7 d-F, G). Men videre avslørte analyse at disse effektene ble tilskrevet agitasjon prosessen på 37 ° C uavhengig av enzymatisk fordøyelsen fordi cellen levedyktighet og intracellulær Foxp3 flekker ble favorisert i tilsvarende grad når cellene var opphisset i fravær av collagenase. Mechanistically, kan den gunstige effekten av agitasjon skyldes forbedret fjerning av intestinal innholdet og Slim fra PPs.
I sammendraget, har vi beskrevet en strømlinjeformet protokoll for isolering av lymfocytter fra PPs. bortgjemte celler kan være farget for flyt cytometric karakteristikk av flere celle delsett eller kan utsettes for cellen sortering og ansatt i ulike i vitro og i vivo funksjonelle analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke Laura Strauss og Peter Sage for nyttig diskusjoner og støtte med flyt cytometri analyser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD4 antibody | eBioscience, Biolegend* | 17-0041-81 ,10054* | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CD19 antibody | eBioscience | MA5-16536 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse PD-1 antibody | eBioscience | 61-9985-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse ICOS antibody | eBioscience | 12-9942-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse GL7 antibody | Biolegend | 144610 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CXCR5 antibody | Biolegend*, BD Bioscience | 145512*, 551960 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse BCL-6 antibody | Biolegend | 358512 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse Foxp3 antibody | eBioscience | 17-5773-82 | For detailed information see Table 1 |
| Streptavidin-BV421 | BD Bioscience | 563259 | For detailed information see Table 1 |
| FixableViability Dye | eBioscience | L34957 | For detailed information see Table 1 |
| 7AAD | Biolegend | 420404 | For detailed information see Table 1 |
| FcBlock (CD16/32) | BD Bioscience | 553141 | For detailed information see Table 1 |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 6-well,12-well & 96-well plates | Falcon/Corning | 353046,353043/3596 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 10 mL syringe-plunger | Exel INT | 26265 | |
| RPMI | Corning | 15-040-CV | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Orbital shaker | VWR | Model 200 | |
| Curved-end scissor | |||
| Fine Serrated Forceps | |||
| Small curved scissor |
References
- van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPα interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer’s patches: Organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).
- Heel, K. A., McCauley, R. D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. Review: Peyer’s patches. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 122-136 (1997).
- Fagarasan, S., Kinoshita, K., Muramatsu, M., Ikuta, K., Honjo, T. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413 (6856), 639-643 (2001).
- Hopkins, S. A., Niedergang, F., Corthesy-Theulaz, I. E., Kraehenbuhl, J. P. A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer’s patch dendritic cells. Cellular Microbiology. 2 (1), 59-68 (2000).
- Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches. Infection and Immunity. 71 (1), 504-509 (2003).
- Sato, A., Iwasaki, A. Peyer’s patch dendritic cells as regulators of mucosal adaptive immunity. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1333-1338 (2005).
- Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Y. Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways. Annals of the New York Academy of Sciences. 1247 (1), 97-116 (2012).
- Fagarasan, S., Kawamoto, S., Kanagawa, O., Suzuki, K. Adaptive Immune Regulation in the Gut: T Cell-Dependent and T Cell-Independent IgA Synthesis. Annual Review of Immunology. 28, 243-273 (2010).
- Hase, K., et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH + bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).
- Wu, H., et al. An Inhibitory Role for the Transcription Factor Stat3 in Controlling IL-4 and Bcl6 Expression in Follicular Helper T Cells. Journal of Immunology. 195 (5), 2080-2089 (2015).
- Vinuesa, C. G., Tangye, S. G., Moser, B., Mackay, C. R. Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity. Nature Reviews Immunology. 5 (11), 853-865 (2005).
- Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal Centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
- Vaeth, M., et al. Store-Operated Ca2+Entry in Follicular T Cells Controls Humoral Immune Responses and Autoimmunity. Immunity. 44 (6), 1350-1364 (2016).
- Meli, A. P., et al. The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance. Immunity. 45 (4), 831-846 (2016).
- Fu, W., et al. Deficiency in T follicular regulatory cells promotes autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 815-825 (2018).
- Espéli, M., Walker, J. M. T follicular helper cells - Methods and Protocols. , (2015).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visual Experiments. (111), e54114 (2016).
- De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer’s Patches. Journal of Visual Experiments. (73), e50167 (2013).
- Pastori, C., Lopalco, L. Isolation and in vitro Activation of Mouse Peyer’s Patch Cells from Small Intestine Tissue. Bio-protocol. 4 (21), e1282 (2014).
- Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. Journal of Visual Experiments. (58), 3225 (2011).
- Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).
- Bollig, N., et al. Transcription factor {IRF4} determines germinal center formation through follicular T-helper cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Science of U. S. A. 109 (22), 8664-8669 (2012).
- Pérez-Mazliah, D., et al. Follicular Helper T Cells are Essential for the Elimination of Plasmodium Infection. EBioMedicine. 24, 216-230 (2017).
- Sage, P. T., Sharpe, A. H. T follicular regulatory cells in the regulation of B cell responses. Trends Immunology. 36 (7), 410-418 (2015).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. Journal of Immunological Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
- Meenan, J., et al. Altered expression of alpha 4 beta 7, a gut homing integrin, by circulating and mucosal T cells in colonic mucosal inflammation. Gut. 40 (2), 241-246 (1997).
- Cao, A. T., et al. Interleukin (IL) -21 promotes intestinal IgA response to microbiota. Mucosal Immunology. 8 (5), 1072-1082 (2015).
- Wei, J., et al. Autophagy enforces functional integrity of regulatory T cells by coupling environmental cues and metabolic homeostasis. Nature Immunology. 17 (3), 277-285 (2016).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. 33 (S1), (2017).
- Bergqvist, P., Gardby, E., Stensson, A., Bemark, M., Lycke, N. Y. Gut IgA Class Switch Recombination in the Absence of CD40 Does Not Occur in the Lamina Propria and Is Independent of Germinal Centers. Journal of Immunology. 177 (11), 7772-7783 (2006).
- Keil, B., Gilles, A. M., Lecroisey, A., Hurion, N., Tong, N. T. Specificity of collagenase from Achromobacter iophagus. FEBS Letters. 56 (2), 292-296 (1975).
- Mora, J. R., et al. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer’s patch dendritic cells. Nature. 424 (6944), 88-93 (2003).
- Reboldi, A., et al. Mucosal immunology: IgA production requires B cell interaction with subepithelial dendritic cells in Peyer’s patches. Science. 352 (6287), (2016).
