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Cancer Research

Unraveling jogadores-chave da imunidade Humoral: avançado e otimizado protocolo de isolamento de linfócitos de Murine do Peyer Patches

Published: November 21, 2018 doi: 10.3791/58490

Summary

Neste estudo, apresentamos uma nova e eficaz protocolo para a isolação de linfócitos de remendos de Peyer (PPs), que podem ser usados posteriormente para ensaios funcionais in vivo e in vitro , bem como estudos de fluxo cytometric t folicular auxiliar e células B de centro germinativo.

Abstract

Na mucosa do intestino, células do sistema imunológico constituem uma entidade imunológica exclusiva, que promove a tolerância imunológica ao mesmo tempo conferindo simultaneamente a defesa imunológica contra agentes patogénicos. Está bem estabelecido que de Peyer (PPs) têm um papel essencial na rede imune mucosal hospedando vários efetores T e células B subconjuntos. Uma certa fração dessas células efetoras, folicular T helper (TFH) e as células B do centro germinativo (GC) estão profissionalizando na regulação da imunidade humoral. Daí, a caracterização destes subconjuntos de célula dentro de PPs em termos de programa de diferenciação e propriedades funcionais pode fornecer informações importantes sobre a imunidade da mucosa. Para este fim, um método facilmente aplicável, eficiente e reprodutível de isolamento de linfócitos de PPs seria valioso para os pesquisadores. Neste estudo, tivemos como objetivo gerar um método eficaz para isolar linfócitos de rato PPs com rendimento elevado célula. Nossa abordagem revelou que o tecido inicial de processamento tais como o uso de reagentes digestivos e agitação de tecido, bem como coloração condições e seleção dos painéis de anticorpo celular, têm grande influência sobre a qualidade e a identidade dos linfócitos isolados e em resultados experimentais.

Aqui, descrevemos um protocolo que permite aos investigadores eficientemente isolar populações de linfócitos de PPs permitindo avaliação baseada em citometria de fluxo pode ser reproduzido de subconjuntos T e células B, principalmente focando TFH e GC B subconjuntos de célula.

Introduction

O trato gastrointestinal inteiro desde o início até o fim é adornado com uma extensa rede linfoide que contém células do sistema imunológico, mais do que qualquer outro órgão em humanos e rato1. Peyer do patches (PPs), constituem um componente importante do ramo intestinal desta organização imune celular, tecido linfoide associado intestino so-called (GALT)2,3. Dentro de PPs, milhares de milhões de antígenos derivados de matérias alimentares, microbiota comensal e patógenos estão sendo amostrados continuamente, e quando necessárias respostas adequadas do imunológico em direção a eles são montado assim manter imune intestinal homeostase. Nesse sentido, o PPs poderiam ser nomeados como "as amígdalas do intestino". PPC consiste em grandes compartimentos sub: cúpula subepithelial (SED), grandes zonas de folículo de células B; o epitélio sobrejacente do folículo-associado (FAE) e região interfollicular (IFR) onde as células T estão localizados4. Este exclusiva compartimentalização de PPs permite subconjuntos de células efetoras diferentes para cooperar, assim, confere a imunocompetência no intestino.

PPs não têm vasos linfáticos aferentes, e devido a este motivo, antígenos transportados para PPs do intestino não estão sendo conduzidos através de vasos linfáticos, em contraste com a maioria dos outros órgãos linfoides. Em vez disso, as células epiteliais especializadas localizadas na FAE, chamadas células M, são responsáveis para a transferência dos antígenos luminal para o PPs5. Posteriormente, os antígenos transportados são captados pelas células dendríticas (DCs) e os fagócitos que estão localizados na região abaixo da FAE6,7subepithelial cúpula (SED). Este processo de classificação de antígeno por DCs em PP é crucial para iniciar a resposta imune adaptativa8 e posterior geração de IgA secretando células9.

Devido o pesado fardo antigênico da flora comensal e material dietético, anfitrião do PPs endogenamente ativado effector T e células B subconjuntos em grande abundância como TFH e IgA+ GC B células10, sugerindo que o PPs representam um site de imune ativo resposta11. Detecção de até 20 – 25% células TFH dentro CD4 total+ T do compartimento de pilha e até 10-15% GC B células dentro das células B totais é possível em PPs colhidos C57BL/6 ratos jovens vivem12. Em contraste com outros tipos de células do ajudante de T (i. e., Th1, Th2, células Th17), células TFH mostram tropismo único em células B folículos principalmente devido à expressão de CXCR5, que promove a orientação de TFH célula ao longo de gradientes CXCL1313. Nas zonas de folículo de células B de PPs, células TFH induzem recombinação de interruptor de classe IgA e somática em células B ativadas, do qual as células produtoras de IgA de alta afinidade diferenciam14. Posteriormente, essas células plasmáticas desegregação migrar para a lâmina própria (LP) e regulam a homeostase imune do intestino,10.

Identificação e caracterização de populações de células TFH e GC B dentro PPs podem permitir aos investigadores investigar a dinâmica da humorais respostas imunes sob condições de estado estacionário, sem a necessidade de modelos de imunização demorada tradicionalmente usado em TFH-GC B célula estudos15,16,17,18. Analisar as células TFH dentro PPs não é tão simples como outros subconjuntos de célula. Desafios técnicos incluem identificar as condições de preparação do tecido ideal, combinação do anticorpo de superfície-marcador, bem como selecionando apropriados controles positivos e negativos. Campos de pesquisa tanto TFH e PP apresentam grande variabilidade em termos de procedimentos experimentais e estão longe de conferir um consenso para estabelecer protocolos padronizados devido a várias razões. Em primeiro lugar, cada subconjunto de célula dentro PPs tende a ser diferencialmente afetaram as condições de preparação de tecido que requer ainda mais modificações na forma de subconjunto específico de célula. Em segundo lugar, há uma discrepância significativa entre os métodos relatados sobre os detalhes da preparação da pilha de PPS. terceiro, o número de estudos comparativos com base em protocolo investigar técnicas de preparação do tecido ideal e condições experimentais para PP e TFH investigação é bastante limitada.

Estudos atuais baseados em protocolo sugeridos para PP célula preparação19,20,21,22 não eram TFH - ou GC orientada em células B. Além disso, algumas condições de preparação do tecido recomendadas para PPs19,20 , tais como digestão baseada em colagenase foram encontradas para afetar negativamente o resultado da identificação de TFH por citometria de fluxo18. Nesta base, nós raciocinou que um protocolo otimizado, padronizado e reproduzível que pode ser usado para estudar a dinâmica de células TFH e GC B no PPs seria valioso para os investigadores a trabalhar sobre este tema. Esta necessidade nos deu o impulso para gerar um protocolo melhorado e actualizado para o isolamento e caracterização de linfócitos PP finamente otimizado para recuperação celular, viabilidade e eficiência para a caracterização de fluxo cytometric de vários T e B subconjuntos de célula. Objetivamos também excluir várias etapas de preparação laboriosa sugeridas em protocolos anteriores, desse modo, reduzindo a manipulações necessárias e o tempo para a preparação de tecidos e células do PPs.

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Protocol

Todos os estudos e experimentos descritos neste protocolo foram conduzidos sob orientações de acordo com cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) do Beth Israel Deaconess Medical Center.

1. concepção de montagem Experimental e grupos de Mouse

  1. (Opcional) Co da casa os ratos experimentais para facilitar a transmissão horizontal da microbiota do intestino entre ratos experimentais e reduzir variabilidade específico dentro de linfócitos PP. Além disso, use controles littermate do mesmo sexo para minimizar a variabilidade.

2. cirúrgica excisão e etapas de preparação do tecido:

  1. Remoção cirúrgica do intestino delgado (SI)
    1. Eutanásia em ratos usando CO2 asfixia ou qualquer método equivalente aprovado pelo Comitê de ética animal institucional.
    2. Transferi o mouse para uma área dedicada para excisão cirúrgica. Coloque a parte traseira para baixo e higienizar o abdômen com etanol a 70%. Realizar uma laparotomia pelo corte da pele abdominal e peritônio, ao longo da linha mediana do púbis para a caixa torácica abrindo a cavidade peritoneal.
      Nota: Execute a primeira incisão em uma área relativamente pequena da pele para evitar a penetração da cavidade peritoneal e danificar o tecido intestinal. Continue a excisão até fronteira anatômica desejada.
    3. Identifica o ceco, que é um marco ideal para a detecção de íleo terminal, que constitui o segmento distal do intestino delgado.
      Nota: Ceco geralmente está localizado no lado inferior esquerdo do abdômen do mouse.
    4. Identificar a junção ileocecal e fazer um corte nesse nível mais distal possível separar o ceco do intestino delgado. Durante os próximos passos, evite contato físico excessivo com a parede intestinal porque frágil PPs colapso facilmente ao toque.
    5. Remova cuidadosamente o intestino inteiro até o esfíncter pilórica cortando o mesentério com uma tesoura. Identificar a junção entre o piloro e o duodeno, e cortar o duodeno a este nível, o que levará para concluir o desprendimento do intestino delgado da cavidade abdominal.
      Nota: (i) Evite hiperextensão como isso pode causar a ruptura da parede intestinal. (ii) se isolamento de linfócitos de LP é desejado além de linfócitos PP, a remoção completa da gordura mesentérica é necessária. No entanto, para o isolamento de PP só, permanecendo gordura mesentérica poderia fornecer alguns benefícios durante as etapas de isolamento adicionais; Portanto, que deveria ser preservado.
    6. Intestino delgado lugar destacado em uma placa de 6 cheia de frio RPMI + 10% de soro fetal bovino (FBS) e agitar suavemente os tecidos manualmente até que todos os segmentos intestinais estão submersos na mídia fria. Manter os tecidos no gelo durante os próximos passos.
    7. Depois de dissecar o número desejado de intestino de rato, proceda à excisão de PP de intestino delgado coletado.
  2. Excisão cirúrgica de PPs e preparação da suspensão de célula única:
    1. Delicadamente transferir o intestino em uma papel toalha agarrando-se a gordura mesentérica usando fórceps e coloca a mesentérica virados para a toalha de papel. Umedeça o segmento intestinal inteiro com frio RPMI + 10% FBS para evitar a desidratação do tecido e viscosidade.
      Nota: Restante gordura mesentérica pode ser útil nesta fase porque segmentos de tecido adiposo no site mesentérico de SI vão ficar com a toalha de papel, mantendo o site antimesentérico virada para cima.
    2. Identifica o PPs, que aparecem como agregados multi lobulados brancos em forma de "couve-flor, como" antimesentérica do lado da parede intestinal.
      Nota: Flushing o conteúdo luminal não é recomendado até que todos os PPs são extirpados. Esvaziar o conteúdo luminal pode causar o colapso do PPs e impedirá o contraste de cores entre o PPs e a parede intestinal, que é muito útil para a identificação visual do PPs.
    3. Depois de identificar o PPs do lado antimesentérica, coloque a tesoura de ponta curva cirúrgica no PPs (curva deve enfrentar) o PP de restrição de sua borda distal e proximal.
      Opcional: Empurre o PP suavemente em direção as lâminas da tesoura, usando a ponta do dedo. Esta manobra vai levar a melhor exclusão dos não-PP tecido circundante. Excisar o PPs suavemente, excluindo o tecido intestinal.
      Nota: (i) este passo é fundamental para obter o máximo rendimento de célula PP, minimizando a contaminação de célula de vizinhas compartimentos intestinais tais como LP e epitélio intestinal, que também são ricos em células T. (ii) a partir de um SI extirpado do mouse C57BL/6, 5-10 PPs (tamanho médio, multi lobulado) podem ser coletados. Apontando ainda menores PPs (multi lobuladas), coleção de até 12-13 PPs por rato (C57BL/6) é possível usando este protocolo.
    4. O PPs extirpado de transferência para uma placa de cultura de tecido 12-bem preenchidos com gelada RPMI + 10% FBS e conservado em gelo, usando a pinça ou tesoura cirúrgica curva.
      Nota: (i) imediatamente após a excisão do PPs, muco e conteúdo intestinal na superfície dos PP podem ser limpos esfregando suavemente o tecido sobre uma toalha de papel. Esta etapa irá ajudar a melhorar a viabilidade de linfócitos PP. (ii) em vez de transferir o PPs para um prato, transferindo para separar os tubos também pode ser considerado dependendo do número total da amostra.
    5. Opcional: Quando a excisão de PP e posterior colocação na placa bem são concluídas, o número e o tamanho do PPs coletados de grupos experimentais/mouse diferente podem ser documentados por tirar uma foto da placa de cultura de tecidos que contenham PPs.
    6. Preparar um conjunto de tubos de 50ml cónico preenchido com 25 mL de RPMI + 10% FBS (pré aquecido a 37 ° C). Usando um par de tesouras, corte a borda de uma dica de 1.000 µ l da distância que permite a aspiração do PPs de pipeta de 1 mL. Aspirar o PPs de pipeta de 1 mL e transferi-los da placa de cultura de tecidos de 12 poços para os tubos cónicos preparado 50 mL.
      Nota: Utilize uma ponta nova para cada amostra de rato para evitar contaminação cruzada entre as amostras.
    7. Fixe a tampa e coloque os tubos na vertical em um agitador orbital a 37 ° C, com agitação contínua a 125-150 rpm durante 10 min. Enquanto isso, preparar um novo conjunto de tubos de 50 mL e coloque um coador de célula de 40 µm no topo de cada tubo, através do qual será preparada suspensão de célula única.
      Nota: (i) a etapa de agitação irá remover os restantes detritos conteúdo, muco e células intestinais, que diminuem a viabilidade celular e recuperação de linfócitos PP se não forem removidos. (ii) não se aplica qualquer tipo de enzimas digestivas no tecido PP porque o processo de digestão provoca uma perda dramática de CXCR5 expressão da superfície celular.
    8. Após a agitação, transferi o PPs para o filtro de célula de 40 µm colocado na parte superior dos tubos de 50ml cónico recém preparada. Usando o lado arredondado de um êmbolo de seringa de 10 mL, delicadamente perturbar o PPs através do filtro de célula para gerar suspensão única célula. Lave o filtro com 15-20 mL de frio RPMI + 10% FBS.
      Nota: (i) antes da filtragem, agite os tubos contendo o PPs horizontalmente. Este batido curto irá facilitar a transferência de PPs em filtros de célula. (ii) usando um coador de célula de 70 µm para o isolamento de células do sistema imunológico não-linfoides (EG., monócitos, macrófagos, DCs) é recomendado.
    9. Centrifugar as suspensões de célula única a 350 – 400 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
    10. Cuidadosamente, desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em uma concentração de 10 x 106 células/mL. Conte as células usando um hemocytometer.
      Nota: (i) antes de a contagem de células, o número de células totais para cada grupo de rato PP pode ser aproximadamente calculado usando a seguinte fórmula: "0.5-1 x 106 células x (número de PPs) = contagem total de células". Mais diluições com trypan azul para a contagem de células podem ser necessárias. (ii) como uma alternativa para contagem manual, contadores de células automatizadas podem ser usados.
    11. Transferência de 2 a 2,5 x 106 células em volume adequado (ex., 200 µ l) em uma placa de 96 poços fundo redondo.
      Nota: Para uma única cor e as amostras de controlo negativo, 0,5-1 x 106 células podem ser suficientes.
    12. Centrifugue a placa a 350 x g por 5 min a 4 ° C. Agite a placa.
    13. Lave as células em 200 µ l de tampão de coloração.

3. superfície anticorpos

  1. Viabilidade de coloração:
    1. Após a lavagem final, Ressuspender as células em 100 μL de viabilidade fixável corante diluído em PBS (1:1, 000). Incube durante 30 min no gelo ou a 4 ° C, no escuro.
      Nota: (i) intracelular de coloração para a detecção de transcrição chave fatores tais como Foxp3 ou Bcl-6 requer a fixação das células. Nesse caso, não-corrigível viabilidade corantes (ex., 7-AAD, DAPI) não pode ser usado. (ii) para diluir o corante de viabilidade fixável, não use qualquer coloração buffer que contém proteína. A mídia utilizada nesta etapa deve ser livre de proteína. (iii) a exclusão das células mortas, usando coloração de viabilidade é crucial, porque as células mortas podem causar sérias dificuldades técnicas em fluxo cytometry análise através da emissão de autofluorescência e por anticorpos superfície de ligação nonspecifically, que pode levar a falso resultados positivos.
    2. Lave as células duas vezes com tampão de coloração. Centrifugar a 350 x g por 5 min a 4 ° C. Agite a placa.
  2. Bloco de FC e de superfície - camada i:
    1. Prepare a solução Fc-bloco diluindo o anticorpo anti-CD16/32 (1: 200) na coloração de reserva.
    2. Ressuspender as células em 20 μL de solução preparada de Fc-bloco. Incube por 15 min no gelo.
    3. Sem lavar, acrescentar 80 μL do anticorpo de superfície cocktail (ver tabela 1 para o anticorpo Resumo) preparado em diluições apropriadas. Incube no gelo pelo menos 30 min.
    4. Lave duas vezes pela adição de buffer de coloração excessiva. Centrifugar a 350 x g por 5 min a 4 ° C. Agite a placa.
  3. Superfície - camada II:
    1. Prepare a solução de coloração de estreptavidina diluindo estreptavidina conjugada com fluorocromo no buffer de coloração.
    2. Após a lavagem final, Ressuspender as células com 100 μL de estreptavidina pré-diluída (1: 100) solução de coloração. Incube durante pelo menos 15 min no gelo no escuro.
    3. Lave duas vezes com tampão de coloração. Centrifugar a 350 x g por 5 min a 4° C. Agite a placa.
      Opcional: Se a coloracao intracelular para a deteção de célula folicular de T reguladoras não é desejada, após a última lavagem, Ressuspender as células em 200 μL de manchar o buffer e transferência em tubos apropriados para adquirir dados em citômetro de fluxo. Quando as amostras não são fixas, aquisição de dados por citometria de fluxo deve ser realizada em 3 – 4 h para obter resultados precisos.

4. fixação da pilha

  1. Prepare a solução de trabalho de fixação/permeabilização (correção/Perm) usando os reagentes de Foxp3/transcrição fator coloração Buffer definido. Misture uma parte de fixação/permeabilização concentrado com três partes de fixação/permeabilização diluente para o volume final desejado.
  2. Após a lavagem final, Ressuspender as células em 200 μL de solução de trabalho de correção/Perm.
  3. Incube a placa no gelo ou a 4 ° C por 20 min. Não exceda 20 min para esta etapa. Tempo de incubação severamente pode diminuir a recuperação celular.
  4. Centrifugar a 350 x g por 5 min a 4 ° C. Agite a placa. (Opcional) Após esta etapa, células fixas podem ser armazenadas por vários dias a 4 ° C, de coloração, o buffer que contém albumina de soro bovino (BSA) ou FBS até aquisição de citometria intracelular subsequente da coloração ou fluxo.
  5. Ressuspender as células em 200 μL de permeabilização Buffer (x1) recém previamente diluído em água deionizada purificada.
  6. Centrifugar a 350 x g durante 5 min à temperatura ambiente (RT).
  7. Lave uma vez com 200 μL de tampão de permeabilização e centrifugar 350 x g por 5 min à RT

5. intracelular de coloração

  1. Prepare a solução de Fc-bloco diluindo o anticorpo anti-CD16/32 (1: 200) em tampão de permeabilização.
    Nota: Após a etapa de fixação, as células devem ser mantidas em buffer de permeabilização até ao final do processo de coloração intracelular.
  2. Após a lavagem final, Ressuspender as células em 20 μL de solução de Fc-bloco. Incube durante 10 a 15 min a RT no escuro.
  3. Sem lavar, acrescentar 80 μL de intracelular anticorpo cocktail (volume final de 100 μL) previamente diluído em tampão de permeabilização. Incubar durante 30 min à RT.
  4. Adicionar 100 μL de Buffer de Perm e centrifugar a 350 x g durante 5 min à RT
  5. Lave uma vez com 200 μL de tampão de permeabilização, centrifugar a 350 x g durante 5 min à RT
  6. Após a lavagem final, Ressuspender as células em 200 μL de tampão de coloração e transferir as células em tubos apropriados (volume final de 400 μL em buffer de coloração) e aquisição de dados por citometria de fluxo. Amostras coradas em placa de 96 poços também podem ser executadas sem transferir para tubos se um citômetro de fluxo com opção de leitor de placa está disponível. Esta etapa minimiza a perda de células durante a transferência de célula.
  7. Adquirir um mínimo de 5 x 105 células total sobre o citômetro de fluxo para ser capaz de realizar análises reprodutíveis de TFH, TFR, bem como as células B GC.

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Representative Results

Em contraste com um protocolo anterior20, temos observado que o PPs não estão distribuídas uniformemente por todo o SI mas são localizadas mais densamente em direção as extremidades distais e proximais de SI, como mostrado na figura 1A. Fluxo cytometric análise mostrou que, se seguidos corretamente, nosso protocolo dá uma população de linfócitos PP que demonstra a distribuição de dispersão para a frente-lado semelhante ao splenocytes (Figura 2AE e 2D, H) com > 95% célula viabilidade (Figura 2B e 2F). Em contraste com outros órgãos linfoides secundários (SLOs), em camundongos C57BL/6 aproximadamente 70 a 80% dos linfócitos totais de PP consistem de células B, Considerando que o CD4+ T células constituem apenas 10 a 15% dos linfócitos totais do PP (Figura 2 e 2 G).

Por favor, note que CD4+ CD19+ positivo duplo (DP) células constituem ≈ 1% de linfócitos totais do PP. Com certas precauções durante a preparação da célula como realizando Fc-bloco contra Fc receptores de células B e excluindo os gibões, CD4+ CD19+ DP população celular poderia ser minimizado (Figura 3A e B). No entanto, uma fração do DPs que não demonstram características de dispersão para a frente (FSC) de parelhas é inevitável e deve ser fechada fora dos portões único de T e células B positivos (Figura 3B). Nossos resultados revelaram que células B dentro das células DP CXCR5 altamente expressa na sua superfície (Figura 3) que pode levar a resultados falso-positivos no portão TFH que é ajustado com base na expressão de CXCR5 em CD4+ T células. Por outro lado, nós encontramos que GL7, um marcador de células B ativadas, também é expresso em CD4+ CD19+ DP células (Figura 3D), que pode causar interferência com GC B retenção de célula.

Exemplos de células TFH e GC B retenção de algoritmos são descritos na Figura 4. Para retenção de pilha GC B, usamos GL7 rotulagem contra CD38, que identifica as células GC B como GL7+ CD38 pilhas de B (Figura 4A-B). Rotulagem de PNA pode ser usado em vez de GL723 considerando CD38 pode ser substituído por um dos seguintes marcadores: IgD, Bcl-6 e CD95. Alternativa gating estratégias para células de GC B são demonstradas em Figura S1. Relação de pilha GC B em PPs mostra grande variabilidade em camundongos C57BL/6. No entanto, em comparação com outros SLOs, PPs têm significativamente mais elevada taxa de célula GC B com um intervalo de 2-10% do totais células B sob condições de estado estacionário. Retenção de estratégia para as células PP TFH é descrito como CD19 CD4+ PD-1Oi CXCR5+ T células (Figura 4A, C). "Zebra plot" verificou-se ser um método de demonstração ideal para TFH gating como retrata PD-1Oi população mais discretamente em comparação com outros tipos de trama (Figura 4). TFR, um subconjunto de células TFH expressam Foxp3, são bloqueadas como CD19 CD4+ PD-1Oi CXCR5+ Foxp3+ T células (Figura 4). Como GC B células, a fração de células TFH também varia em indivíduos vivem do mouse com um intervalo de 10 – 20% do total CD19 CD4+ PP linfócitos. Detalhes dos algoritmos associados alternativos para as células TFH são descritos na Figura 4E, F e Figura S1C, D.

Para evitar falsa positividade devido a coloração de fundo e autofluorescência, isotipo controles ou controles equivalentes alternativos tais como fluorescência menos um (FMO) devem ser incluídos no painel coloração como um controle negativo para marcadores de células TFH e GC B ( Figura 4-J).

Para otimizar as condições de preparação de tecidos PP, desenvolvemos uma romance estratégia experimental controlada internamente, no qual PPs foram coletados de um rato individual em agrupados separadamente, dependendo de sua origem anatômica (ex., duodenal, ileal). Para a realização de experimentos, PPs em pool foram atribuídos a grupos individuais de modo que cada experimentais e grupo controle incluído um número igual de PPs de cada região anatômica (Figura 5A). Por esta abordagem, encontramos essa digestão enzimática com base de colagenase (testado em 37,5 mg de colagenase II ou IV por 25 mL de mistura de digestão = 1,5 mg/mL), que é comumente usado para isolamento de linfócitos de vários tecidos da mucosa, significativamente reduzida CXCR5 expressão em linfócitos PP (Figura 5B), particularmente em células TFH (Figura 5F-eu), enquanto a expressão de outras moléculas de superfície (ex., CD19, CD4) permaneceu intacto (Figura 5-C-E). Redução da deteção de CXCR5 foi importante para que a expressão de CXCR5 em células TFH colagenase-tratados foi quase indistinguível do isotipo controle (Figura 5F-eu). Mais experimentos mostraram que o nível de interferência de digestão enzimática com expressão de CXCR5 foi dependente o clone anticorpo CXCR5 usado (figura 6A-F). Especificamente, tratamento de colagenase II, a capacidade de detecção do anticorpo de CXCR5 clone 2 8 foi mais significativamente prejudicada, do que a capacidade de detecção do clone CXCR5 anticorpo L138D7 (Figura 6A-D).

Digestão enzimática reduzida não só a expressão de CXCR5, mas também a proporção de linfócitos totais dentro de células PP, conforme determinado pelas características FSC-SSC, enquanto uma fração considerável de células isoladas de PPs digeridos exibidas para a frente e lateral dispersão de uma intensidade mais elevada do que os linfócitos PP (Figura 7A-C). Os efeitos da colagenase na recuperação celular ocorreram de forma dose-dependente (figura 7A, H-J). Digestão enzimática aumentou a viabilidade celular (Figura 7, E). No entanto, este benefício não estava causatively ligado à digestão de colagenase porque as células isoladas de PPs, após a agitação sem colagenase foram favorecidas similarmente (figura 7F). A detecção de fator de transcrição nuclear Foxp3, que é de especial interesse aqui porque considera-se geralmente durante o isolamento de TFH para identificar células TFR, foi melhorada pela agitação a 37 ° C, independentemente da digestão de colagenase (Figura 7 ).

Figure 1
Figura 1: estrutura macroscópica e distribuição anatômica de murino de Peyer. (A). uma imagem obtida duodenal-final do intestino delgado com o estômago. Dois próximos PPs no duodeno são indicadas com setas pretas. (B). PPs coletados de onze camundongos C57BL/6 foram armazenadas individualmente em uma placa-12. (C). imagem de rato recém extirpado PPs exibido em um coador de célula de 40 µm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: fluxo cytometric caracterização e algoritmo básico de associada para linfócitos PP. (A). lotes do ponto demonstram a distribuição dos linfócitos PP recém isoladas não fixadas ao longo de eixos FSC e SSC, que apresentam grande semelhança com splenocytes retratada em (D). (B). exclusão de células mortas através da expressão 7AAD. 7AAD células representam células vivas. (C). CD19 e CD4-baseado immunophenotyping de células T e B entre pre-condomínio fechado células vivas do PP. (E-G). Análise de fluxo representativo de linfócitos PP fixos. (H). características de fluxo representativo dos splenocytes fixo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: CD4+ CD19+ duplo positivo (DP) células causa falsa positividade em TFH e GC B retenção de célula. (A). CD4+CD19+ DP linfócitos dentro de células vivas de PP são demonstrados. (B). células de separação de DP baseiam em características do FSC como parelhas e camisolas. (C,D). CXCR5 e GL7 expressão de células DP são retratados em parcelas de histograma. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: representante TFH e GC B célula associada estratégia. PPC foram coletados de um mouse de 3 meses de idade e linfócitos foram isolados, conforme descrito na seção de protocolo. (A) CD19 e CD4 rotulagem de linfócitos PP ao vivo são retratados. (B) CD38Eis GL7OiCD19+ B células foram bloqueadas como células GC B. (C), TFH células foram bloqueadas como CXCR5+PD-1Oi CD4+ células. (D), TFR células são uma fração das células TFH expressando fator de transcrição de células específicas reguladoras Foxp3 juntamente com marcadores TFH e são bloqueadas como CXCR5+ PD-1Oi Foxp3+ CD4+ T células. (E-F) Gating estratégia para TFH marcadores de superfície confirmadas em splenocytes isolaram de rato NP-óvulos-imunizados por meio da expressão de BCL-6. (G-J) Controles de fluorescência menos um (FMO) para chave TFH-TFR e marcadores de célula de GC são retratados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: digestão enzimática com base de colagenase leva a uma redução maciça da deteção de CXCR5. (A) PPs de 2 meses mouse localizado no duodeno (≈ 1/3 proximal), jejuno (≈ 1/3 médio) e íleo (≈ 1/3 distal) foram coletadas e agrupadas separadamente. PPs em pool foram igualmente distribuídos para os grupos experimentais. Digestão enzimática com colagenase II ou IV na concentração de 1,5 mg/mL foi realizada com agitação por 10 min a 37 ° C. (B-E) Histograma parcelas representando a expressão de moléculas de superfície (CXCR5, CD19, PD-1, CD4) das células isoladas de PPs que foram submetidos a digestão de colagenase-baseado. (F-eu) TFH gating dentro administrada a colagenase e grupos de controle é demonstrada nas tramas de zebra. Dados representam três experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: O efeito de colagenase em expressão CXCR5 mostrou grande diferença dependendo o clone do anticorpo anti-CXCR5. PP linfócitos recolhidos de um mouse de 6 meses de idade, agrupados e separados em diferentes grupos sobre anticorpo clonagem aplicação de digestão enzimática e usado. (A-F) A proporção de células TFH é retratada nas tramas zebra dentro pre-condomínio fechado ao vivo, CD19 CD4+ T células. (A, C e E) células PP estavam manchadas com o anticorpo conjugado biotina de CXCR5 anti-rato (8 2 clone), e estreptavidina conjugado com fluorocromo BV421. (B, D e F) células PP estavam manchadas com um primário anti-rato CXCR5 anticorpo conjugado (clone de L138D7). (A-B) TFH gating parcelas de linfócitos PP não digeridos. (C-D) PPs digerido com colagenase II (20) mg/25 mL da mistura de digestão e agitados durante 10 minutos a 37 ° C. Dados representam dois experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: digestão baseada em colagenase e agitação a 37 ° C influenciaram a viabilidade celular, a recuperação e a eficiência de coloração intracelular. Um rato de C57BL/6 meses de idade 3 foi sacrificado; PPC foram coletadas e agrupadas conforme descrito na Figura 5A. (A) depois que a coleção de PPs, os tecidos foram agitados na presença de colagenase II (37,5 mg/25 mL de mistura de digestão) por 10 min, FSC e SSC características de células fixas de PP são representadas em (A) e viabilidade de coloração trama é retratada no ( D). (B, E) após a coleção de PPs, os tecidos foram mantidos no gelo sem agitação ou digestão enzimática; Características de células de PPs fixas FSC e SSC são representadas em (B) e viabilidade de coloração é retratado em (E). (C, F) Após a coleta do PPs, tecidos foram agitados a 125-150 rpm durante 10 minutos a 37° C, na ausência de colagenase; Características do FSC e SSC e viabilidade de coloração de células fixas de PP são retratados (C, F), respectivamente. (G) comparação de expressão de Foxp3 em pilhas de T reguladoras isolado do PPs agitados e unagitated sem administração de colagenase é retratada na trama do histograma. (H-J) PPs coletados de um rato de C57BL/6 a 6 meses de idade e foram tratados com diferentes concentrações de colagenase II: 25 mg por mistura de digestão de 25 mL, 15 mg / 25 mL digestão mix ou não colagenase. FSC e SSC tramas que revelam os efeitos da digestão enzimática na recuperação de células PP e rendimento são retratadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: O modelo molecular e a sequência completa de aminoácidos de CXCR5. Passa-sete (A) estrutura de proteínas transmembranares de CXCR5 é modelada. (B) a sequência completa de aminoácidos de CXCR5 é demonstrado. A sequência das regiões extracelulares é indicada em vermelho e extracelulares aminoácidos com ligações químicas sensíveis de colagenase presumível são demonstrados em amarelo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Antigénio Clone Fluourochrome Diluição
DDS GK1.5, RM4-5 APC, PECy7, PerCpCy5.5, FITC 1: 100
CD19 5 DE 6 FITC, APC/Cy7 1: 100
PD-1 J43 Ef PE 610 (Texas Red) 1: 100
ICOS 15 F9, 7E.17G9 PE 1: 100
GL7 GL7 PerCp/Cy5.5 1:75
CXCR5 2 8,L138D7 * Biotina 01:50
BCL-6 1 DE 7 PE/Cy7 01:50
FOXP3 RAFAELL-16 APC, PE 1: 100
Streptavidin - BV421, PE 1: 100
FixableViability corante - 510(AQUA) BV 1:1,000
7AAD - PerCp/Cy5.5 1: 500
FcBlock (CD16/32) 2.4G2 - 1: 200

Tabela 1: Resumo de anticorpo. As diluições, clones e conjugações de fluorocromo para os anticorpos pertinentes e viabilidade corantes são indicadas. A diluição ideal pode variar, dependendo de condições experimentais e a qualidade do lote do produto. Primário BV421-conjugados L138D7 clone em 01:20 diluição mostrou capacidade de detecção de CXCR5 comparável com o conjugado biotina 2 8 clone às 01:50 diluição. Portanto, L138D7 primária-conjugado pode ser usado como alternativa à biotina-conjugados 2 8 clone.

Figura complementar 1 (S1): alternativa de gating estratégias para células TFH e GC B. (A) linfócitos PP Live de 3 meses mouse no fundo C57BL/6 são retratados. (B-C) Células B GC são bloqueadas como CD38GL7+ (B) e BCL-6+ GL7+ B células (C). (D-E) Células TFH são retratadas como PD-1Oi CXCR5+ (D) e como ICOS+CXCR5+ T CD4 + células (E). Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para caracterização de fluxo cytometric das células TFH e GC B. Uma das principais vantagens do nosso protocolo é que ele permite que o isolamento de até 107 (média de 4 – 5 x 106 células) de células PP totais de um único rato (estirpe C57BL/6) sem qualquer processo digestivo. Observamos que o rendimento total da célula foi positivamente correlacionado com o número de PPs e pode ser estimado a partir da seguinte equação simples que é útil para o planejamento experimental: "total PP célula contagem por rato = 0,5 – 1 x (número de extirpado PP por rato) x 106". Este rendimento elevado célula foi complementado com viabilidade celular melhorada (> 95%). Recuperação melhorada de célula e viabilidade permitiram executar análise de fluxo cytometric de vários subconjuntos de linfócitos em PPs usando diverso anticorpo que mancha os painéis em paralelo.

Comparado a um protocolo de isolamento PP recente publicado De Jesus et al. 20 e anteriores relatórios19,21, nosso protocolo deu consideravelmente mais elevado rendimento total da célula e viabilidade, apesar da ausência da digestão com colagenase. Embora a identificação do PPs pode ser "complicada" para os investigadores pela primeira vez, a curva de aprendizado para este protocolo é muito íngreme, e se domina, nossa técnica permite a identificação e excisão cirúrgica do PPs do intestino em um curto está na hora. Se o número desejado de PP não é alcançado após a primeira tentativa, sugerimos repetir a etapa de identificação de PP com foco na extremidade distal e proximal de SI. Em nossa prática, em quase todos os ratos, dois PPs estreitamente localizados na extremidade duodenal (figura 1A) e pelo menos 2-3 PPs dentro o último de 5 cm do íleo foram detectáveis.

TFH mancha pode ser mais exigente do que outros subconjuntos de células dentro do PPs, exigindo atenção extra18. Se determinadas etapas são perdidas durante o processamento de tecidos e isolamento de célula, os resultados poderiam ser muito enganosos. Portanto, sugerimos os pesquisadores para a atenção para as seguintes dicas"experimentais". Desde marcadores de células TFH e GC B chaves tais como CXCR5 e GL7 podem ser expressa em células B e T tanto, é fundamental para incluir um marcador de células B em painéis de anticorpos para evitar resultados falso-positivos devido a contaminantes CD19+CD4+ DP células24 ( Figura 2). Por favor note que as estratégias de retenção baseada em marcadores de células T somente25 não irá fornecer suficiente exclusão de células DP desde que estas células também altamente expressam marcadores de células T, incluindo CD3 (dados não mostrados) e CD4. Além da exclusão de células DP, resultados de citometria de fluxo devem ser validados e confirmados por empregando controles negativos apropriados (por exemplo., controles de isotipo, FMO). Falsa positividade, não só mas também portão TFH equivocada pode levar a resultados falsos e conclusões. Ajuste de portão TFH às vezes poderia ser desafiador, especialmente se a população de TFH celular não é abundante, aparecendo, assim, não como uma população discreta em citometria de fluxo. Para contornar essa limitação, a adição de vários marcadores TFH (EG., BCL-6, PD-1, ICOS) em anticorpo painel pode fornecer possibilidades alternativas associadas e aumentar a precisão de26. Por razões práticas, BCL-6 foi encontrado para ser um marcador co coloração ideal para retenção de TFH alternativo que pode ser usada para retenção de GC B células simultaneamente16 (Figura S1C).

Além disso, ter uma amostra de controlo positivo contendo uma alta proporção TFH poderia fornecer pesquisadores boa navegação para colocação de portão TFH corretamente. Em nossos experimentos, usamos amostras dos PP de ratos envelhecidos (mais de 6 meses) como um controle positivo desde que nós encontramos que o envelhecimento causa o realce das células TFH dentro PPs até 40% de CD4 total+ T células em estado estacionário (dados não mostrados). Nós também encorajamos os pesquisadores que têm mais interesse em detalhes técnicos de TFH coloração para examinar os métodos no livro publicado protocolo para célula TFH coloração18.

Teste as hipóteses experimentais em PP podem ser relativamente desafiadoras e podem exigir um número muito elevado de ratos por grupo para alcançar significância estatística21. Tirando proveito do rendimento do nosso protocolo pilha elevada, nós contornado este obstáculo com as seguintes estratégias experimentais. Primeiro, extirpado PPs e classificados-los separadamente, dependendo de sua origem anatômica (ex., duodenal, jejunal e ileal). Em seguida, distribuímos igualmente esses PPs agrupados em diferentes experimentais e grupos de controle. Esta estratégia experimental controlada internamente nos permitiu minimizar a diferença entre individuais em camundongos, enquanto todas as células foram obtidas de um único rato.

Além disso, variabilidade entre diferentes compartimentos intestinais (EG., duodeno vs. íleo)-anteriormente relatados para ser significativo2 — foi impedida como experimental e grupos de controle consistiam de um número igual de PPs por região anatômica (Figura 5A). Através da realização de repetições de experimentos independentes usando a mesma abordagem, melhorámos a confiabilidade e o significado dos nossos resultados. Além de eliminar variações inespecíficas, esta metodologia também ajuda a tempo, reagentes e mouses sobressalentes.

Durante o desenvolvimento e otimização de nosso protocolo, nossos resultados revelaram que colagenase baseada em II e IV digestão impressionantemente reduzido CXCR5 expressão (Figura 5B), enquanto outras moléculas de superfície para a deteção TFH e células GC B permaneceram intacto ( Figura 5 -E) . Em um recentemente relatado JoVE protocolo19, colagenase II foi mostrado para ser muito eficaz para isolamento de linfócitos de PPs e LPs. No entanto, colagenase II anteriormente foi relatado para ter uma alta atividade tryptic, que resulta na clivagem de várias moléculas de superfície. Dada a sua natureza amigável de superfície-molécula27 devido à baixa atividade tryptic e o uso mais comum na literatura28,29,30, colagenase IV foram também incluído além de colagenase II em nosso estudo e usado nas concentrações, como recomendado nos relatórios anteriores. O uso de colagenase e enzimas equivalentes tem sido uma questão contraditória em Imunologia da mucosa devido aos efeitos indesejáveis da digestão na molécula de superfície de células do sistema imunológico tais como alteradas a expressão31,27.

Anteriormente foi relatado que o uso de diferentes tipos de colagenase poderia interferir com o fluxo cytometric CXCR5 deteção dentro do intestino humano32 e tonsila amostras18. Por outro lado, outros estudos demonstraram o isolamento das células TFH e GC B do PPs sem o uso de colagenases24,33. No entanto, até agora nenhuma abordagem comparativa tinha sido empreendida para avaliar se a inclusão ou exclusão de digestão de colagenase representaria a condição ideal para o isolamento de células TFH CXCR5-expressando de murino PPS. Mouse CXCR5 é um ácido aminado 374 proteína de membrana sete passa-tempo com regiões extracelulares relativamente curtas, em comparação com outras proteínas transmembranares como CD4, CD19 abundantemente expressas em células linfoides em PPs (dados obtidos de UniProt). Na Figura 8A-B, um modelo molecular e a sequência de aminoácidos total do mouse CXCR5 são retratados com as sequências de destino presumido de digestão com base de colagenase, que tende a dissociar as ligações químicas entre glicina (Gly) e neutral amino ácidos,34. Os domínios extracelular resultante curto de passa-sete transmembrana estrutura molecular podem ser responsáveis por fazer a molécula de CXCR5 vulnerável a digestão enzimática (Figura 8A). Curiosamente, encontramos a deteção de CXCR5 expressão após o tratamento de colagenase é dependente o clone de anticorpo usado. Embora 2 8 e L138D7 clones apresentaram desempenho semelhante no grupo PP não digerido, conforme determinado pela detecção de fracções TFH comparáveis, no grupo do PP digerido, L138D7 clone revelou cerca de 3x (≈ 9%) maior fração de células TFH dentro CD4+ As pilhas de T do que o 8 2 clone (≈ 3%) (Figura 6). Este achado sugere que a reduzida mancha de CXCR5 pode ser secundária à configuração do epítopo tridimensional modificados pela atividade enzimática da colagenase. Nossos resultados indicam que baseado em colagenase digestão deve ser evitado durante a preparação do PP.

A interferência da dissociação de colagenase com deteção de molécula CXCR5 foi contornada, excluindo a etapa de digestão. No entanto, deve notar-se que, em alguns tecidos, tais como LP, ruptura mecânica não é suficiente para isolar as células e para tais tecidos, digestão enzimática seria necessário19. No futuro, será essencial para testar condições de digestão alternativos, bem como clones de digestão-compatível com o anticorpo para contornar essa limitação técnica para tecidos que requerem processos digestivos enzimáticos. Até então, técnicas de imagem, tais como a microscopia de fluorescência imune vão ficar como o método de escolha para a deteção de TFH nestes tecidos. Além de isolar células de LP, o isolamento de alguns subconjuntos de células hematopoiéticas como DCs e células plasmáticas de PPs requerem digestão enzimática35. Quando empregando nosso protocolo, pesquisadores que desejam isolar estes subconjuntos de célula do PPs devem incluir a digestão enzimática adequada passo20. Possível interferência de digestão enzimática com a expressão de marcadores de DC deve ser tida em conta e condições de digestão devem ser otimizadas conforme necessário. Quando o isolamento das células TFH e GC B é desejado além de um subconjunto de célula que requer colagenase digestão36, PPs coletados de cada rato poderia ser separado em dois grupos para processamento com e sem tratamento de colagenase em painéis paralelos.

Os efeitos da colagenase em linfócitos PP não estavam restritos a expressão da molécula de superfície. Nossos resultados revelaram que o digestão enzimática causou uma diminuição relativa a proporção de linfócitos dentro das células PP de forma dose-dependente (Figura 7). A diminuição da fração de linfócitos pode ser uma consequência da liberação de colagenase-mediada de outros tipos de subconjuntos de células como os fagócitos e DCs de PPs que são maiores e mais granular do que células linfoides. Também é possível que a digestão de colagenase mediada por célula liberação das vizinhas LP e compartimentos intra-epitelial poderiam contribuir para a mudança do perfil do FSC-SSC. Esta contaminação de células de outros compartimentos do intestino pode também causar interferência na análise dos fluxos de linfócitos PP. Nessa base, para maximizar a pureza da célula, também evitamos a adição de reagentes tais como EDTA ou TDT que são amplamente utilizados para extrair as células epiteliais e muco20, mantendo as condições de preparação do tecido como fisiológica e unmanipulated quanto possível. Apesar destes efeitos adversos da digestão enzimática, efeitos benéficos em linfócitos PP também foram descobertos tais como a melhoria de coloracao intracelular e viabilidade celular (Figura 7-F, G). No entanto, novas análises revelaram que estes efeitos foram atribuídos ao processo de agitação a 37 ° C, independentemente de digestão enzimática porque viabilidade celular e coloracao intracelular de Foxp3 foram favorecidos em uma medida comparável quando as células foram agitadas em a ausência de colagenase. Mecanicamente, o efeito benéfico de agitação pode ser devido à remoção melhorada do conteúdo intestinal e muco do PPs.

Em resumo, descrevemos um protocolo simplificado para o isolamento de linfócitos de PPS. Isolated células podem ser manchadas para caracterização de fluxo cytometric de vários subconjuntos de célula ou podem ser submetidas a triagem de célula e posteriormente empregadas em diversos in vitro e na vivo ensaios funcionais.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer a Laura Strauss e Peter Sage para discussões úteis e apoio com análises de citometria de fluxo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-mouse CD4 antibody eBioscience, Biolegend* 17-0041-81 ,10054* For detailed information see Table 1
anti-mouse CD19 antibody eBioscience MA5-16536 For detailed information see Table 1
anti-mouse PD-1 antibody eBioscience 61-9985-82 For detailed information see Table 1
anti-mouse ICOS antibody eBioscience 12-9942-82 For detailed information see Table 1
anti-mouse GL7 antibody Biolegend 144610 For detailed information see Table 1
anti-mouse CXCR5 antibody Biolegend*, BD Bioscience 145512*, 551960 For detailed information see Table 1
anti-mouse BCL-6 antibody Biolegend 358512 For detailed information see Table 1
anti-mouse Foxp3 antibody eBioscience 17-5773-82 For detailed information see Table 1
Streptavidin-BV421 BD Bioscience 563259 For detailed information see Table 1
FixableViability Dye eBioscience L34957 For detailed information see Table 1
7AAD Biolegend 420404 For detailed information see Table 1
FcBlock (CD16/32) BD Bioscience 553141 For detailed information see Table 1
Collagenase II Worthington LS004176
Collagenase IV Worthington LS004188
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set eBioscience 00-5523-00
6-well,12-well & 96-well plates Falcon/Corning 353046,353043/3596
50 mL conical tubes Falcon 3520
40 µm cell strainer Falcon 352340
10 mL syringe-plunger Exel INT 26265
RPMI Corning 15-040-CV
PBS Corning 21-040-CM
FBS Atlanta Biologicals S11150
Orbital shaker VWR Model 200
Curved-end scissor
Fine Serrated Forceps
Small curved scissor

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References

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Cancer Research edição 141 de Peyer células foliculares de auxiliar T centro germinativo célula B isolamento de linfócitos preparação do tecido subconjuntos de linfócitos órgãos linfoides colagenase
Unraveling jogadores-chave da imunidade Humoral: avançado e otimizado protocolo de isolamento de linfócitos de Murine do Peyer Patches
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Yazicioglu, Y. F., Aksoylar, H. I., Pal, R., Patsoukis, N., Boussiotis, V. A. Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer's Patches. J. Vis. Exp. (141), e58490, doi:10.3791/58490 (2018).

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