Summary
En este estudio, presentamos un novedoso y eficaz protocolo para el aislamiento de los linfocitos de las placas de Peyer (PP), que pueden utilizarse posteriormente para ensayos funcionales en vivo y en vitro como en estudios de citometría de flujo folicular t helper y células del centro germinal B.
Abstract
En la mucosa intestinal, células inmunes constituyen una entidad única de la inmunológica, que promueve la tolerancia inmunológica mientras que al mismo tiempo que confiere defensa inmune contra patógenos. Está bien establecido que placas de Peyer (PPs) tienen un papel esencial en la red inmune mucosa alojando varios efectoras T y células B subconjuntos. Una cierta fracción de estas células efectoras, ayudante T folicular (TFH) y las células de B de centro germinal (CG) se profesionalizó en la regulación de la inmunidad humoral. Por lo tanto, la caracterización de estos subconjuntos de la célula dentro de PPs en términos de su programa de diferenciación y propiedades funcionales puede proporcionar información importante sobre inmunidad mucosa. Para ello, un método fácilmente aplicable, eficiente y reproducible de aislamiento de linfocitos de PPs sería valioso para los investigadores. En este estudio, el objetivo fue generar un método efectivo para aislar los linfocitos de ratón PPs con rendimiento alto de la célula. Nuestro enfoque reveló ese tejido inicial procesamiento tales como el uso de reactivos digestivos y agitación de tejido, así como coloración condiciones y selección de los paneles de anticuerpos de la célula, tienen gran influencia en la calidad y la identidad de los linfocitos aislados y en resultados experimentales.
Aquí, describimos un protocolo permitiendo a los investigadores aislar eficientemente las poblaciones de linfocitos de PPs permitiendo reproducible flujo cytometry-evaluación de subconjuntos de T y células B centrándose principalmente en TFH y GC B subconjuntos de la célula.
Introduction
Todo el tracto gastrointestinal desde el principio hasta el final se viste de gala con una extensa red linfoide que contiene las células inmunes más que cualquier otro órgano humano y ratón1. Peyer de parches (PPs) constituyen un componente importante de la sección intestinal de esta organización celular inmune, llamado tejido linfoide asociado a intestino (GALT)2,3. En PPs, miles de millones de antígenos derivados de materiales alimenticios, patógenos y microbiota comensal que se muestrean continuamente, y cuando es necesarias respuestas inmunes adecuadas hacia ellos están montado así mantener inmune intestinal homeostasis. En ese sentido, PPs podría ser nombrado como "amígdalas del intestino". PPs consisten en compartimientos secundarios principales: cúpula subepitelial (SED), grandes zonas de folículos de células B; el epitelio suprayacente asociado folículo (FAE) y región interfollicular (IFR) donde las células T están ubicados4. Esta compartimentalización único de PPs permite subconjuntos de células efectoras diferentes a cooperar, por lo tanto, confiere inmunocompetencia en el intestino.
PPs carecen de vasos linfáticos aferentes, y por esta razón, antígenos transportados a PPs de intestino delgado no se están realizando a través de vasos linfáticos en contraste con la mayoría de los otros órganos linfoides. En cambio, las células epiteliales especializadas en FAE, llamadas células M, son responsables de la transferencia de antígenos luminales en el PPs5. Posteriormente, se recogen los antígenos transportados por las células dendríticas (DCs) y los fagocitos que se encuentran en la región de cúpula subepitelial (SED) debajo de la FAE6,7. Este proceso de clasificación de antígeno por DCs en el PP es crucial para iniciar la respuesta inmune adaptativa8 y posterior generación de IgA secretoras células9.
Debido a la pesada carga antigénica de flora comensal y del material alimenticio, PPs host endógeno activado efectoras T y células B subconjuntos en gran abundancia como células TFH y IgA+ GC B10, sugiriendo que el PPs representar un sitio de inmune activa respuesta11. Detección de hasta 20 – 25% células TFH en total CD4+ T compartimiento de la célula y hasta 10 – 15% GC B células dentro de células B totales es posible en PPs obtenidos de ratones C57BL/6 jóvenes inmunizados12. En contraste con otros tipos de células del ayudante de T (es decir., Th1, Th2, Th17 células), TFH células muestran tropismo singular en los folículos de células B principalmente debido a CXCR5 expresión, que promueve la TFH celular autoguiado hacia el blanco a lo largo de la gradiente de CXCL1313. En las zonas de folículos de células B de PPs, las células de la TFH inducir IgA clase interruptor de recombinación y la hipermutación somática en células B activadas que las células productoras de IgA de alta afinidad diferencian14. Posteriormente, estas células plasmáticas secretoras de anticuerpos migran a la lámina propia (LP) y regular la homeostasis inmune en la tripa10.
Identificación y caracterización de poblaciones celulares TFH y B GC dentro de PPs podrían permiten a los investigadores a investigar la dinámica de la respuesta inmune humoral bajo condiciones de estado estacionario sin la necesidad de modelos de inmunización desperdiciador de tiempo utilizado tradicionalmente en TFH-GC B celular estudios15,16,17,18. Analizando las células de la TFH en PPs no es tan fácil como otros subconjuntos de la célula. Desafíos técnicos incluyen la identificación de condiciones de preparación de tejido ideal, combinación de anticuerpo-marcador superficial, así como seleccionar los controles positivos y negativos adecuados. Campos de investigación TFH y PP muestran gran variabilidad en términos de procedimientos experimentales y están lejos de conferir un consenso para establecer protocolos estandarizados debido a varias razones. En primer lugar, cada subconjunto celular en PPs tiende a ser afectados diferencialmente por las condiciones de preparación de tejido que requieren más modificaciones de manera de subconjunto específico de célula. En segundo lugar, existe una discrepancia significativa entre los métodos reportados con respecto a los detalles de preparación de la célula de PPS. tercero, el número de estudios comparativos basados en el protocolo de investigación de técnicas de preparación de tejido ideal y condiciones experimentales para el PP y TFH investigación es bastante limitada.
Los estudios actuales basados en el protocolo sugeridos por PP celular preparación19,20,21,22 no eran TFH o GC orientado a la célula de B. Por otra parte, se encontraron algunas condiciones de preparación de tejido recomendados PPs19,20 como base de colagenasa digestión afectar negativamente el resultado de la identificación de TFH por citometría de flujo18. Sobre esta base, razonamos que un protocolo optimizado, estandarizado y reproducible que puede utilizarse para estudiar la dinámica celular TFH y B GC en PPs sería valioso para los investigadores trabajando sobre este tema. Esta necesidad nos dio el impulso para generar un protocolo mejorado y actualizado para el aislamiento y la caracterización de los linfocitos PP que finalmente está optimizado para la recuperación celular, viabilidad y eficiencia para la caracterización de citometría de flujo de varios T y B subconjuntos de la célula. También decidimos excluir varios pasos de preparación laboriosa sugeridos en anteriores protocolos, por lo tanto, reducir las manipulaciones necesarias y tiempo para la preparación de tejidos y células de PPs.
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Protocol
Todos los estudios y experimentos descritos en este protocolo se llevaron a cabo bajo los lineamientos de acuerdo institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC), de Beth Israel Deaconess Medical Center.
1. diseño de montaje Experimental y grupos de ratón
- (Opcional) Co casa de los ratones experimentales para facilitar la transmisión horizontal de la microbiota intestinal entre ratones experimentales y para reducir la variabilidad no específicos dentro de los linfocitos PP. Además, utilizar controles littermate del mismo género para reducir al mínimo variabilidad.
2. extirpación y pasos de preparación de tejidos:
- Extirpación quirúrgica del intestino delgado (SI)
- Eutanasia a ratones con CO2 asfixia o cualquier método equivalente aprobado por el Comité institucional de ética animal.
- Transferir el ratón a un área específica para la supresión quirúrgica. Coloque la parte trasera hacia abajo y desinfecte el abdomen con etanol al 70%. Realizar una laparotomía cortando la piel abdominal y el peritoneo a lo largo de la línea media del pubis a las costillas, abriendo la cavidad peritoneal.
Nota: Realizar la primera incisión en un área relativamente pequeña de la piel para evitar penetrar en la cavidad peritoneal y dañar el tejido intestinal. Continuar la supresión hasta frontera anatómica deseada. - Identificar el intestino ciego, que es un punto de referencia ideal para la detección del íleon terminal, que constituye el segmento distal del intestino delgado.
Nota: El ciego se encuentra generalmente en la parte inferior izquierda del abdomen de ratón. - Determine la ensambladura ileocaecal y hacer un corte a este nivel tan distal como sea posible separar el intestino delgado del intestino ciego. A lo largo de los próximos pasos, evitar excesivo contacto físico con la pared intestinal porque PPs frágil colapsan fácilmente al tacto.
- Retire con cuidado el intestino entero hasta el esfínter pilórico cortando el mesenterio con unas tijeras. Identificar a la unión entre el píloro y el duodeno, y cortar el duodeno en este nivel, que dará lugar a la completa separación del intestino de la cavidad abdominal.
Nota: (i) evitar la hiperextensión ya que podría causar la ruptura de la pared intestinal. (ii) si se desea el aislamiento de linfocitos LP además linfocitos PP, extirpación completa de la grasa mesentérica es necesario. Sin embargo, para el aislamiento del PP sólo, quedando la grasa mesentérica podría proporcionar algunos beneficios durante los pasos posteriores de aislamiento; por lo tanto, debe ser preservado. - Lugar separado intestino en una placa de 6 pozos llenos de RPMI frío + 10% suero bovino fetal (FBS) y frote suavemente los tejidos manualmente hasta que todos los segmentos intestinales se introducen en los medios de comunicación fríos. Mantener los tejidos en el hielo a lo largo de los próximos pasos.
- Después de disecar el número deseado de intestino de ratón, proceda a la supresión de PP de recogidas intestino.
- Supresión quirúrgica de PPs y la preparación de la suspensión celular solo:
- Transferir el intestino pequeño en una toalla de papel por la grasa mesentérica con unas pinzas de agarre y colocar la cara mesentérica de la toalla de papel. Humedezca el segmento intestinal todo con fría RPMI + 10% FBS para evitar la deshidratación del tejido y la viscosidad.
Nota: Queda la grasa mesentérica puede ser útil en esta etapa porque segmentos de tejido adiposo en el sitio mesentérico de SI se adhieren a la toalla de papel manteniendo el sitio anti-mesentérico hacia arriba. - Identificar el PPs, que aparecen como blancos agregados múltiples lobulados en forma de "coliflor-como" en el lado anti-mesentérica de la pared intestinal.
Nota: Flushing el contenido luminal no se recomienda hasta que todos los PPs son suprimidos. Vaciar el contenido luminal podría causar el colapso de las PPs y evitará que el contraste de color entre el PPs y la pared intestinal, que es muy útil para la identificación visual de PPs. - Tras la identificación de PPs en el lado anti-mesentérico, colocar la tijera quirúrgica del extremo curvado en PPs (curva debe mirar para arriba) que el PP su borde distal y proximal.
Opcional: Pulse el PP suavemente hacia las cuchillas de la tijera con la yema del dedo. Esta maniobra conducirá a la exclusión mejor de PP no tejido circundante. Suprimir el PPs suavemente, excluyendo el tejido intestinal circundante.
Nota: (i) este paso es crucial para obtener máximo rendimiento de células PP reduciendo al mínimo la contaminación de la célula vecina intestinales compartimientos como LP y el epitelio intestinal, que también son ricos en células T. (ii) de uno SI de ratón C57BL/6, 5-10 PPs (tamaño medio, múltiples lobulada) pueden recogerse. Apuntando más pequeños PPs (no multi-lobulados), colección de hasta 12-13 PPs por ratón (C57BL/6) es posible usando este protocolo. - Transferencia el PPs suprimidas a una placa de cultivo de tejidos 12-bien lleno de helado RPMI + 10% FBS y mantenidas en hielo con pinzas o tijeras quirúrgicas curvas.
Nota: (i) inmediatamente después de la supresión de PPs, moco y contenido intestinal en la superficie PP pueden limpiarse frotando suavemente el tejido sobre una toalla de papel. Este paso ayudará a mejorar la viabilidad de los linfocitos PP. (ii) en vez de transferir el PPs a una placa, separado tubos de transferencia también se puede considerar dependiendo del número de la muestra total. - Opcional: Al PP la supresión y posterior colocación en la placa de la pozo se ha completado, el número y tamaño de PPs de grupos experimentales/ratón diferente se pueden documentar tomando una foto de la placa de cultivo de tejidos que contienen PPs.
- Preparar un conjunto de tubos cónicos de 50 mL con 25 mL de RPMI + 10% FBS (previamente calentado a 37 ° C). Con un par de tijeras, corte el borde de una 1.000 μl Punta de la distancia que permite la aspiración de las PPs con pipeta de 1 mL. Aspire el PPs con pipeta de 1 mL y transferirlas desde la placa de cultivo de tejidos 12-bien a los tubos cónicos de 50 mL preparado.
Nota: Utilice una nueva punta para cada muestra de ratón para evitar la contaminación cruzada entre las muestras. - La tapa y coloque los tubos en posición vertical en un agitador orbital a 37 ° C, con agitación continua a 125 – 150 rpm durante 10 minutos. Mientras tanto, preparar un nuevo conjunto de tubos de 50 mL y colocar un filtro de célula 40 μm en la parte superior de cada tubo, a través del cual se preparará la suspensión unicelular.
Nota: (i) el paso de agitación eliminará los restantes desechos contenidos, moco y células intestinales, que disminuyen la viabilidad celular y la recuperación de los linfocitos PP si no se. (ii) no se aplican ningún tipo de enzimas digestivas en tejido PP debido a que el proceso de digestión provoca una pérdida dramática de CXCR5 expresión de la superficie de la célula. - Después de la agitación, transferencia el PPs a la coladera de la célula de 40 μm colocada en la parte superior de los tubos recién preparado cónico 50 mL. Usando el lado redondeado de un émbolo de la jeringa de 10 mL, suavemente interrumpir el PPs a través de la coladera de célula para generar suspensión unicelular. Enjuague el filtro con 15 – 20 mL de RPMI frío + el 10% FBS.
Nota: (i) antes de la filtración, agite los tubos que contienen el PPs horizontalmente. Esta sacudida corta facilitará a la transferencia de PPs en los filtros de la célula. (ii) utilizando un colador de celular de 70 μm para el aislamiento de las células inmunitarias no-linfoide (por ej., monocitos, macrófagos, DCs) se recomienda. - Centrifugar la suspensión unicelular a 350-400 x g durante 10 min a 4 ° C.
- Desechar el sobrenadante y resuspender las células a una concentración de 10 x 106 células/mL. Contar las células usando un hemocitómetro.
Nota: (i) antes al conteo de células, el número total de células para cada grupo de ratón PP puede ser aproximadamente estimado utilizando la siguiente fórmula: "0.5-1 x 106 células x (número de PPs) = recuento total". Más diluciones con trypan azul para el recuento celular pueden ser necesarias. (ii) como una alternativa al conteo manual, pueden utilizarse contadores celulares automatizados. - Transferencia de 2-2.5 x 106 células en volumen apropiado (por ej., 200 μL) en una placa de 96 pocillos de fondo redondo.
Nota: Para el solo color y las muestras control negativo, 0.5-1 x 106 células podrían ser suficientes. - Centrifugar la placa a 350 x g durante 5 min a 4 ° C. Película de la placa.
- Lavar las células en 200 μL de tampón de tinción.
- Transferir el intestino pequeño en una toalla de papel por la grasa mesentérica con unas pinzas de agarre y colocar la cara mesentérica de la toalla de papel. Humedezca el segmento intestinal todo con fría RPMI + 10% FBS para evitar la deshidratación del tejido y la viscosidad.
3. tinción de anticuerpo superficial
- Tinción de viabilidad:
- Después del último lavado, resuspender las células en 100 μL de viabilidad pueden corregir tinte diluido en PBS (1:1, 000). Incubar durante 30 min en hielo o a 4 ° C en la oscuridad.
Nota: (i) intracelular de tinción para la detección de la transcripción clave factores como Foxp3 o Bcl-6 requiere la fijación de las células. En ese caso, la viabilidad no fijable colorantes (ej., 7-AAD, DAPI) no puede utilizarse. (ii) para diluir el tinte viabilidad fijable, no use cualquier tampón de tinción que contiene proteína. Los medios utilizados en este paso deben ser libre de proteína. (iii) exclusión de células muertas usando tinción de viabilidad es crucial porque las células muertas pueden causar serias dificultades técnicas en flujo cytometry análisis emitiendo Autofluorescencia y atando un, anticuerpos de superficie que podría conducir a falsas resultados positivos. - Lavan las células dos veces con tampón de tinción. Centrifugar a 350 x g durante 5 min a 4 ° C. Película de la placa.
- Después del último lavado, resuspender las células en 100 μL de viabilidad pueden corregir tinte diluido en PBS (1:1, 000). Incubar durante 30 min en hielo o a 4 ° C en la oscuridad.
- Bloque de FC y superficie - capa I:
- Preparar la solución de Fc-bloque mediante la dilución del anticuerpo anti-CD16/32 (1: 200) en tampón de tinción.
- Resuspender las células en 20 μL de la solución preparada de Fc-bloque. Incubar por 15 min en hielo.
- Sin lavar, agregar 80 μL de anticuerpo superficial de cóctel (ver tabla 1 para el anticuerpo Resumen) preparados en diluciones adecuadas. Incubar en hielo durante al menos 30 minutos.
- Lavar dos veces mediante la adición de tampón de tinción excesiva. Centrifugar a 350 x g durante 5 min a 4 ° C. Película de la placa.
- Superficie - capa II:
- Preparar la solución de tinción de estreptavidina diluyendo fluorocromo conjugado estreptavidina en tampón de tinción.
- Después del último lavado, resuspender las células con 100 μL de estreptavidina previamente diluido (1: 100) solución de tinción. Incubar durante al menos 15 minutos en hielo en la oscuridad.
- Lavar dos veces con tampón de tinción. Centrifugar a 350 x g durante 5 min a 4° C. Película de la placa.
Opcional: Si tinción intracelular para la detección de la célula T reguladora folicular no se desea, después del último lavado, resuspender las células en 200 μL de tinción de buffer y transferencia en tubos apropiados para adquirir datos en citómetro de flujo. Cuando las muestras no son fijos, adquisición de datos mediante citometría de flujo se debe realizar dentro de 3 – 4 h para obtener resultados precisos.
4. fijación de la célula
- Preparar solución de trabajo de fijación/permeabilización (Fix/Perm) reactivos de Foxp3/transcripción Factor tinción búfer establecido. Mezclar una parte de la fijación/permeabilización concentrado con tres partes de fijación/permeabilización diluyente en el volumen final deseado.
- Después del último lavado, resuspender las células en 200 μL de solución de trabajo de Fix/Perm.
- Incube la placa en hielo o a 4 ° C por 20 min. Exceder los 20 minutos para este paso. Tiempo de incubación podría disminuir seriamente la recuperación de la célula.
- Centrifugar a 350 x g durante 5 min a 4 ° C. Película de la placa. (Opcional) Después de este paso, fija las células pueden almacenarse durante varios días a 4 º C en tampón que contiene albúmina de suero bovino (BSA) de tinción o FBS hasta posterior intracelular manchas o flujo cytometry adquisición.
- Resuspender las células en 200 μL de permeabilización Buffer (x1) recién diluido previamente en agua purificada desionizada.
- Centrifugue a 350 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT).
- Una vez lavado con 200 μL de buffer de permeabilización y centrifugue a 350 x g durante 5 min a TA.
5. intracelular de tinción
- Preparar la solución de Fc-bloque mediante la dilución del anticuerpo anti-CD16/32 (1: 200) en buffer de permeabilización.
Nota: Después del paso de la fijación, las células deben mantenerse en buffer de permeabilización hasta el final del proceso de tinción intracelular. - Después del último lavado, resuspender las células en 20 μL de solución de Fc-bloque. Incubar durante 10-15 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Sin lavar, agregar 80 μL de intracelular anticuerpo cóctel (volumen final de 100 μL) previamente diluido en buffer de permeabilización. Incubar durante 30 min a TA.
- Añada 100 μL de Buffer de Perm y centrifugue a 350 x g durante 5 min a TA.
- Una vez lavado con 200 μL de buffer de permeabilización, centrifugar a 350 x g durante 5 min a TA.
- Después del último lavado, resuspender las células en 200 μL de tampón de tinción y las células de transferencia en tubos adecuados (volumen final de 400 μL de tampón de tinción) y adquirir datos por citometría de flujo. Muestras teñidas en placa de 96 pocillos se pueden funcionar también sin transferir a tubos si se dispone de un citómetro de flujo con la opción de lector de la placa. Este paso minimiza la pérdida de la célula durante la transferencia de la célula.
- Adquirir un mínimo de 5 x 105 células totales en el citómetro de flujo para poder realizar análisis reproducibles de ESF, TFR, así como células B GC.
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Representative Results
En contraste con un anterior protocolo20, hemos observado que PPs no se distribuyen uniformemente a lo largo de la is, pero se localizan más densamente hacia el extremos distal y proximal de la is como se muestra en figura 1A. Análisis cytometric del flujo demostró que, si siguen correctamente nuestro protocolo da una población de linfocitos PP que demuestra la distribución de dispersión hacia delante-lateral similar a esplenocitos (figura 2AE y 2D, H) con > 95% celular viabilidad (figura 2B y 2F). A diferencia de otros órganos linfoides secundarios (SLOs), en ratones C57BL/6 70 – 80% de los linfocitos totales del PP consisten en las células de B, mientras que CD4+ T las células constituyen sólo 10-15% de total linfocitos PP (figura 2 y 2 G).
Tenga en cuenta que CD4+ CD19+ las células dobles positivas (DP) constituyen ≈ 1% de total linfocitos PP. Con ciertas precauciones durante la preparación de la célula como realizar bloque Fc contra receptores de Fc de las células B y excluyendo dobletes, CD4+ CD19+ DP población celular podría ser minimizado (Figura 3A y B). Sin embargo, una fracción de DPs que no muestran características de forward scatter (FSC) de Dobletes es inevitable y debería cerrada hacia fuera de las puertas de T y células B positivas solo (figura 3B). Nuestros resultados revelaron que las células de B dentro de las células DP CXCR5 altamente expresa en su superficie (figura 3) que podría conducir a resultados falsos positivos en la puerta TFH que se ajusta basado en expresión de CXCR5 en CD4+ T las células. Por otro lado, encontramos que GL7, un marcador de células B activadas, también se expresa en CD4+ CD19+ DP las células (figura 3D), que pueden causar interferencia con GC B célula gating.
Ejemplos de célula TFH y GC B bloquean algoritmos se representan en la figura 4. B GC sincronización celular, utilizamos GL7 etiquetado versus CD38, que identifica las células de B de GC como GL7+ CD38– las células de B (Figura 4A-B). Etiquetado ANP podría utilizarse en lugar de GL723 que CD38 puede sustituirse por uno de los siguientes marcadores: IgD, Bcl-6 y CD95. Alternativa estrategias que bloquean las células de B de GC son demostrado en figura S1. Relación de la célula B GC en PPs muestra gran variabilidad en los ratones C57BL/6. Sin embargo, en comparación con otros SLOs, PPs tienen significativamente mayor proporción de células B GC con un rango de 2-10% de células B totales bajo condiciones de estado estacionario. Estrategia para las células PP TFH que bloquean es descrito como CD19– CD4+ PD-1Hola CXCR5+ T las células (Figura 4A, C). "Trama de cebra" fue encontrado para ser un método de demostración óptima para ESF que bloquean como muestra PD-1Hola población más discreta en comparación con otros tipos de trama (figura 4). TFR, un subconjunto de las células de la ESF que expresan Foxp3, son bloqueados como CD19– CD4+ PD-1Hola CXCR5+ Foxp3+ T las células (figura 4). Como las células B GC, la fracción celular de ESF también varía en individuos inmunizados ratón con un rango de 10 – 20% del total CD19– CD4+ PP los linfocitos. Detalles de algoritmos alternativos bloquea células TFH se describen en la figura 4E, F y Figura S1C, D.
Para evitar la falsa positividad debido a la tinción de fondo y autofluorescencia, controles de isotipo o controles equivalentes alternativos como fluorescencia menos uno (FMO) deben incluirse en el panel de tinción como control negativo para marcadores de células TFH y GC B ( Figura 4-J).
Para optimizar las condiciones de preparación de tejido PP, desarrollamos una nueva estrategia experimental internamente controlada, en el que PPs se recolectaron de un ratón individual y agrupados por separado dependiendo de su origen anatómico (e.g., duodenal, ileal). Para la realización de experimentos, PPs combinados fueron asignados a los grupos individuales para que cada experimentales y grupo control incluyó un número igual de PPs de cada región anatómica (figura 5A). Por ello, encontramos que la digestión enzimática basado en la colagenasa (probado en 37,5 mg de colagenasa II o IV por cada 25 mL de la mezcla de digestión = 1,5 mg/mL), que comúnmente se utiliza para aislamiento de linfocitos de varios tejidos mucosa, CXCR5 redujo significativamente expresión en linfocitos PP (figura 5B), particularmente en las células de la TFH (figura 5F-me), mientras que la expresión de otras moléculas de superficie (por ej., CD19, CD4) seguía siendo intacto (Figura 5 C-E). Reducción de CXCR5 detección fue destacada para que la expresión de CXCR5 en células tratadas con colagenasa de la ESF era casi indistinguible de control de isotipo (figura 5F-I). Otros experimentos demostraron que el nivel de interferencia de la digestión enzimática con expresión CXCR5 era dependiente en el clon CXCR5 de anticuerpo utilizado (figura 6A-F). En concreto, sobre el tratamiento de II de colagenasa, la capacidad de detección de anticuerpo, CXCR5 clon 2 8 fue significativamente más deteriorada, que la capacidad de detección del clon de anticuerpo CXCR5 L138D7 (Figura 6A-D).
Digestión enzimática reduce no sólo la expresión de CXCR5 sino también la proporción de linfocitos totales dentro de las células PP según lo determinado por las características de FSC-SSC, mientras que una fracción considerable de células aisladas del PPs digeridos exhibidos hacia adelante y del lado dispersión de una intensidad mayor que los linfocitos PP (Figura 7A-C). Los efectos de la colagenasa en la recuperación de la célula ocurrieron de una manera dependiente de la dosis (Figura 7A, H-J). Digestión enzimática aumenta la viabilidad de las células (Figura 7, E). Sin embargo, este beneficio no fue causativo vinculado a la digestión de colagenasa porque las células aisladas de PPs después de la agitación sin colagenasa fueron favorecidas de manera similar (figura 7F). La detección del factor de transcripción nuclear Foxp3, que es de particular interés aquí porque generalmente se evalúa durante el aislamiento de ESF para identificar células TFR, fue mejorada por la agitación a 37 ° C independientemente de la digestión de la colagenasa (figura 7 ).
Figura 1: estructura macroscópica y distribución anatómica de murino placas de Peyer. (A). una imagen obtenida de extremo duodenal del intestino delgado con el estómago. Dos PPs situado cerca en el duodeno se indican con flechas negras. (B). PPs de once ratones C57BL/6 fueron almacenadas individualmente en una placa de 12 pozos. (C). imagen de ratón recién suprimido PPs muestra en un tamiz de 40 μm células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: flujo cytometric caracterización y algoritmo básico bloquea para linfocitos PP. (A). diagramas de punto demuestran la distribución de linfocitos PP no fijadas recientemente aisladas a lo largo de ejes FSC y SSC, que exhiben gran similitud de esplenocitos en (D). (B). exclusión de células muertas por medio de la expresión 7AAD. 7AAD– las células representan células vivas. (C). CD19 y immunophenotyping basada en CD4 de células T y B entre la cerrada células vivas del PP. (C-e-G). Análisis de flujo representativo de linfocitos PP fijados. (H). las características de flujo representativo de esplenocitos fijo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: CD4+ CD19+ doble positivo (DP) las células causa falsa positividad en TFH y GC B célula gating. (A). CD4+CD19+ DP los linfocitos dentro de células vivas del PP se han demostrado. (B). las células de la separación de DP basan en características FSC como dobletes y camisetas. (C,D). CXCR5 y GL7 expresión de células de DP son representados en parcelas histograma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Representante TFH y GC B estrategia bloquea celular. PPs se recolectaron de un ratón 3 - meses de edad y linfocitos fueron aislados como se describe en la sección de protocolo. CD19 (A) y CD4 etiquetado de linfocitos PP vivo son representados. (B) CD38lo GL7HolaCD19+ B células fueron cerradas como las células de B de GC. (C) TFH células fueron bloqueadas como CXCR5+PD-1Hola CD4+ las células. (D) TFR células son una fracción de TFH células expresando el factor de transcripción células específicas reguladoras Foxp3 junto con marcadores TFH y son bloqueadas como CXCR5+ PD-1Hola Foxp3+ CD4+ T las células. (E-F) Gating estrategia para ESF marcadores de superficie en esplenocitos aislaron de ratón NP-OVA-inmunizados mediante la expresión de BCL-6. (G-J) Controles de fluorescencia menos uno (FMO) clave TFH-TFR y marcadores de la célula de GC son representados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: digestión enzimática colagenasa-basado conduce a una reducción masiva de detección CXCR5. PPs (A) de 2 meses ratón situado en el duodeno (≈ 1/3 proximal), yeyuno (≈ 1/3 medio) y el íleon (≈ 1/3 distal) fueron recogidos y agrupados por separado. Los PPs se distribuyeron igualmente a los grupos experimentales. Se realizó la digestión enzimática con colagenasa II o IV en concentración de 1.5 mg/mL con agitación por 10 min a 37 ° C. (B-E) Histograma de parcelas que representan la expresión de moléculas de superficie (CXCR5, CD19, PD-1, CD4) de las células aisladas de PPs que se sometieron a digestión con colagenasa-basado. (F-I) TFH que bloquean en el administrados de colagenasa y grupos de control se demuestra en las parcelas de la cebra. Los datos representan tres experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: efecto de colagenasa en expresión de CXCR5 mostró gran diferencia dependiendo del clon de anticuerpo anti-CXCR5. PP de un ratón de 6 meses de edad, agrupados y separados en grupos diferentes con respecto a anticuerpos los linfocitos clon aplicación de digestión enzimática y usado. (A-F) La proporción de células TFH es representada en las parcelas de la cebra en la cerrada vivo, CD19– CD4+ T las células. (A, C y E) las células PP fueron manchadas con el anticuerpo de CXCR5 anti-ratón conjugado con biotina (2 8 clon), y estreptavidina conjugada con el fluorocromo BV421. (B, D y F) de las células PP fueron manchadas con un conjugado anti-ratón CXCR5 de anticuerpo primario (L138D7 clone). ESF (A-B) compuerta parcelas de linfocitos PP sin digerir. (C-D) PPs digeridos con colagenasa II (20 mg/25 mL de la mezcla de digestión) y agitado durante 10 min a 37 ° C. Los datos representan dos experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: digestión con colagenasa-basado y agitación a 37 ° C influyen en la viabilidad celular, recuperación y eficiencia tinción intracelular. 3 ratón C57BL/6 meses de edad fue sacrificado; PPs fueron recogido y agrupado como se indica en la figura 5A. (A) después de la colección de PPs, los tejidos se agita en presencia de colagenasa II (37,5 mg/25 mL de la mezcla de digestión) por 10 min, las características FSC y SSC de células PP fijadas están representadas en (A) y viabilidad tinción trama se representa en) D). (B, E) después de la colección de PPs, los tejidos se mantuvieron en hielo sin agitación o digestión enzimática; Las características FSC y SSC de células PPs fijas están representadas en (B) y tinción de viabilidad se muestra en (E). (C, F) Después de la colección de PPs, los tejidos fueron agitados a 125-150 rpm por 10 min a 37° C en ausencia de colagenasa; Las características FSC y SSC y tinción de viabilidad de células PP fijadas son representados (C, F), respectivamente. (G) comparación de la expresión de Foxp3 en células de T reguladoras de agitado y unagitated PPs sin administración de colagenasa se representa en la trama de histograma. (H-J) PPs recogidas de un ratón C57BL/6 6 - meses de edad y fueron tratado con diferentes concentraciones de colagenasa II: 25 mg por la mezcla de digestión de 25 mL, 15 mg por la mezcla de digestión de 25 mL o no colagenasa. Parcelas FSC y SSC, que revelan los efectos de la digestión enzimática en la recuperación de la célula PP y rendimiento están representados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: modelo molecular y la secuencia completa del aminoácido de CXCR5. Paso 7 (A) estructura de las proteínas transmembrana de CXCR5 es modelada. (B) la secuencia completa del aminoácido de CXCR5 está demostrado. La secuencia de regiones extracelulares está indicada en rojo y extracelulares amino ácidos con enlaces químicos sensibles de presumible colagenasa se demuestra en amarillo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Antígeno de | Clon | Fluourochrome | Dilución |
| CD4 | GK1.5, RM4-5 | APC, PECy7, PerCpCy5.5, FITC | 1: 100 |
| CD19 | 5 DE 6 | FITC, APC/Cy7 | 1: 100 |
| PD-1 | J43 | Ef de PE 610 (Texas Red) | 1: 100 |
| ICOS | F9 15, 7E.17G9 | PE | 1: 100 |
| GL7 | GL7 | PerCp/Cy5.5 | 1: 75 |
| CXCR5 | 2 8,L138D7 * | Biotina | 1:50 |
| BCL-6 | 1 DE 7 | PE/Cy7 | 1:50 |
| FOXP3 | FJK-16 | APC, PE | 1: 100 |
| Estreptavidina | - | BV421, PE | 1: 100 |
| Tinte de FixableViability | - | 510(AQUA) BV | 1:1,000 |
| 7AAD | - | PerCp/Cy5.5 | 1: 500 |
| FcBlock (CD16/32) | 2.4G2 | - | 1: 200 |
Tabla 1: Resumen del anticuerpo. Las diluciones, clones y conjugaciones del fluorocromo de anticuerpos relevantes y tintes de viabilidad se indican. La dilución óptima puede variar dependiendo de las condiciones experimentales y mucha calidad del producto. Clon de conjugado BV421 L138D7 primaria en el 1:20 dilución mostró capacidad de detección de CXCR5 comparable con el conjugado con biotina 2 8 clon en 1:50 dilución. Por lo tanto, L138D7 primaria conjugado puede ser utilizado como alternativa a conjugado con biotina 2 8 clon.
Figura 1 complementaria (S1): alternativa gating estrategias para células TFH y GC B. (A) se representan linfocitos PP Live de 3 meses ratón en el fondo de C57BL/6. (B-C) Las células de B de GC son bloqueadas como CD38– GL7+ (B) y BCL-6+ GL7+ B células (C). (D-E) Las células de la ESF se describen como PD-1Hola CXCR5+ (D) y como ICOS+CXCR5+ CD4 + T células (E). Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Aquí, describimos un protocolo optimizado para caracterización de citometría de flujo de células TFH y B GC. Una de las principales ventajas de nuestro protocolo es que permite el aislamiento de hasta 107 (promedio 4 a 5 x 106 células) total PP las células de un ratón (cepa C57BL/6) sin ningún proceso digestivo. Observamos que el rendimiento total de la célula se correlacionó positivamente con el número de PPs y que podría estimarse de la siguiente ecuación simple que es útil para la planificación experimental: "total PP celular cuenta por ratón = 0,5 – 1 x (número de PP suprimido por ratón) x 106". Esta producción de célula alta se complementó con viabilidad celular mejorada (> 95%). Viabilidad y recuperación celular mejorada permitieron realizar el análisis cytometric del flujo de diversos subconjuntos del linfocito en PPs usando anticuerpos diversos paneles en paralelo la coloración.
En comparación con un reciente protocolo de aislamiento PP publicado por De Jesús et al. 20 y anteriores informes19,21, nuestro protocolo dio considerablemente mayor rendimiento total de la célula y viabilidad, a pesar de la ausencia de la digestión con colagenasa. Aunque la identificación de PPs podría ser "difícil" para los investigadores de la primera vez, la curva de aprendizaje de este protocolo es bastante inclinada, y si domina, nuestra técnica permite la identificación y extirpación del PPs del intestino en un corto hora. Si no se alcanza el número deseado de la PP después de la primera tentativa, sugerimos repetir el paso de la identificación de PP centrándose en el extremo distal y proximal de la SI. En nuestra práctica, casi en cada ratón, dos PPs encuentra en el extremo duodenal (figura 1A) y al menos 2 – 3 PPs dentro de los últimos 5 cm del íleon eran perceptibles.
TFH tinción puede ser más exigente que otros subconjuntos de células dentro de los PPs, así que requieren atención adicional18. Si le falten ciertos pasos durante el proceso de tejido y aislamiento de células, los resultados podrían ser muy engañosas. Por lo tanto, sugerimos a los investigadores para prestar atención a los siguientes "consejos" experimentales. Desde clave TFH y GC B marcadores de la célula tales como CXCR5 y GL7 pueden expresarse en las células B y T, es fundamental incluir un marcador de células B en los paneles de anticuerpos para evitar resultados falsos positivos debido a los contaminantes CD19+CD4+ DP las células24 ( Figura 2). Tenga en cuenta que estrategias de sincronización basado en marcadores de células T sólo25 no proporcionará suficiente exclusión de células de DP ya que estas células también expresan marcadores de células T como CD3 (datos no mostrados) y CD4. Además de la exclusión de las células de la DP, resultados de citometría de flujo deben ser validados y confirmados mediante el empleo de adecuados controles negativos (por ej., controles de isotipo, consistente). No sólo falsa positividad sino también fuera de lugar la puerta ESF puede conducir a falsos resultados y conclusiones. Ajuste de puerta TFH a veces puede ser difícil especialmente si TFH celular población no es abundante, que aparece así no como una población discreta en citometría de flujo. Para burlar esta limitación, la adición de múltiples marcadores TFH (e.g., BCL-6, PD-1, ICOS) anticuerpos panel podría proporcionar oportunidades bloquea alternativas y aumentar precisión26. Por razones prácticas, BCL-6 fue encontrada para ser un marcador Co manchas ideal para gating de TFH alternativos como puede ser usado para bloquear GC B células simultáneamente16 (Figura S1C).
Además, tener una muestra de control positivo que contiene una alta proporción TFH podría proporcionar investigadores buena navegación para colocar puerta TFH correctamente. En nuestros experimentos, se utilizaron muestras de los PP de ratones edad (mayores de 6 meses) como control positivo ya que hemos encontrado que envejecimiento provoca la mejora de las células de la TFH en PPs hasta un 40% del total CD4+ T células en estado estacionario (datos no mostrados). También animamos a los investigadores que tienen más interés en las características técnicas de tinción para observar los métodos en el libro de protocolo publicado para celular TFH tinción18ESF.
Prueba hipótesis experimentales en el PP pueden ser relativamente difíciles y podrían requerir un gran número de ratones por grupo para alcanzar significación estadística21. Aprovechando el rendimiento de la celda alta de nuestro protocolo, hemos eludido este obstáculo con las siguientes estrategias experimentales. Primero, suprimido PPs y los clasifican por separado dependiendo de su origen anatómico (e.g., duodenal, yeyuno e íleon). Luego, igualmente distribuimos estos PPs agrupados en diferentes experimentales y grupos control. Esta estrategia experimental internamente controlada nos permitió minimizar la diferencia interindividual en los ratones, mientras que todas las células se obtuvieron de un ratón.
Además, variabilidad entre diferentes compartimientos intestinales (e.g., duodeno vs. íleon)-divulgado previamente para ser significativa2 — fue prevenido como experimental y grupos de control consistieron de un número igual de PPs por región anatómica (figura 5A). Mediante la realización de réplicas de experimentos independientes con el mismo enfoque, hemos mejorado la fiabilidad y la significación de nuestros resultados. Además de eliminar las variaciones inespecíficas, esta metodología también ayuda a tiempo, reactivos y ratones repuestos.
Durante el desarrollo y optimización de nuestro protocolo, nuestros resultados revelaron que colagenasa basada en II y IV digestión notablemente redujo la expresión de CXCR5 (figura 5B) mientras que otras moléculas de superficie para la detección de TFH y células B GC seguía siendo intacto ( Figura 5 -E) . En un reciente JoVE protocolo19, colagenasa II fue demostrado para ser muy eficaz para el aislamiento de linfocitos de PPs y LPs. Sin embargo, colagenasa II se ha divulgado previamente para tener una alta actividad tríptica, que resulta en la ruptura de varias moléculas de superficie. Dada su naturaleza amigable molécula de superficie27 debido a la menor actividad tríptica y uso más común en la literatura28,29,30, colagenasa IV también ha incluido además de colagenasa II en nuestro estudio y en las concentraciones recomendadas en los informes anteriores. El uso de colagenasa y enzimas equivalente ha sido un tema contradictorio en Inmunología mucosa debido a los efectos no deseados de la digestión en las células inmunes alteradas como molécula superficial expresión31,27.
Previamente se informó que el uso de diferentes tipos de colagenasa podría interferir con la detección de CXCR5 en intestino humano32 y amígdala muestras18de citometría de flujo. Por el contrario, otros estudios demostraron el aislamiento de células TFH y GC B de PPs sin el uso de colagenasas24,33. Sin embargo, hasta ahora no había realizado ningún planteamiento comparativo para determinar si la inclusión o exclusión de la digestión de colagenasa representaría la condición óptima para el aislamiento de células expresando CXCR5 TFH de murino PPS. ratón CXCR5 es un aminoácido 374 proteína de membrana larga paso de siete regiones extracelular relativamente corto en comparación con otras proteínas transmembranales como CD4, CD19 que se expresan abundantemente en las células linfoides en PPs (datos obtenidos de UniProt). En la figura 8A-B, un modelo molecular y secuencia de aminoácidos totales de ratón CXCR5 son representados con las secuencias de presunto objetivo de digestión con colagenasa-basado, que tiende a disociar enlaces químicos entre la glicina (Gly) y neutral amino ácidos34. Los dominios extracelulares corto resultante de siete pasos transmembrana estructura molecular podrían ser responsables de CXCR5 molécula vulnerable a digestión enzimática (figura 8A). Curiosamente, encontramos la detección de expresión de CXCR5 después del tratamiento de la colagenasa es dependiente en el clon de anticuerpo utilizado. Aunque 2 8 y L138D7 clones mostraron un rendimiento similar en el grupo PP no digerido, según lo determinado por la detección de fracciones TFH comparables, en el grupo PP digerido, L138D7 clon reveló aproximadamente 3 x fracción mayor (≈ 9%) de las células de la TFH en CD4+ Las células T de los 8 2 clon (≈ 3%) (Figura 6). Este hallazgo sugiere que la reducida CXCR5 tinción pudiera ser secundario a la configuración modificada del epítopo tridimensional por la actividad enzimática de la colagenasa. Nuestros resultados indican que la digestión de la colagenasa debe evitarse durante la preparación del PP.
La interferencia de la disociación de la colagenasa con la detección de la molécula de CXCR5 fue eluda por excluir el paso de la digestión. Sin embargo, cabe señalar que para algunos tejidos como el LP, la interrupción mecánica no es suficiente para aislar las células y para estos tejidos, la digestión enzimática sería necesario19. En el futuro, será esencial para probar condiciones digestión alternativo así como anticuerpos compatibles con digestión clones para saltarse esta limitación técnica para los tejidos que requieren procesos enzimáticos digestivos. Hasta entonces, las técnicas de imagen tales como microscopía de fluorescencia inmune permanece como el método de elección para la detección de TFH en estos tejidos. Además de aislar las células del LP, el aislamiento de algunos subconjuntos de células hematopoyéticas como DCs y las células plasmáticas de PPs requieren de digestión enzimática35. Al utilizar nuestro protocolo, los investigadores que desean aislar a estos subconjuntos de la célula de PPs deben incluir la apropiada digestión enzimática paso20. Posible interferencia de la digestión enzimática con la expresión de marcadores de DC debe tenerse en cuenta y las condiciones de digestión deben optimizarse según sea necesario. Cuando se desea aislamiento de células TFH y GC B además de un subconjunto de células que requiere colagenasa digestión36, PPs de cada ratón se podría separar en dos grupos de tratamiento con y sin tratamiento de colagenasa en paneles paralelos.
Los efectos de la colagenasa en linfocitos de PP no fueron restringidos a la expresión superficial de la molécula. Nuestros resultados revelaron que la digestión enzimática causado una disminución relativa en la proporción de linfocitos dentro de las células de los PP en forma dosis dependiente (figura 7). La disminución de la fracción de linfocitos puede ser una consecuencia de la liberación de colagenasa-mediada de otros tipos de subconjuntos de células hematopoyéticas como fagocitos y DCs de PPs que son más grandes y más granular de células linfoides. También es posible que la digestión colagenasa mediada por liberación celular de vecinos LP y compartimientos intraepiteliales podrían contribuir al cambio de Perfil de FSC-SSC. Esta contaminación de la célula de otros compartimentos del intestino también puede causar interferencias en el análisis de flujo de los linfocitos PP. Sobre esa base, para maximizar la pureza de la célula, también evitamos la adición de reactivos, tales como EDTA o TDT que son ampliamente utilizados para extraer las células epiteliales y moco20, manteniendo las condiciones de preparación de tejido como fisiológicos y unmanipulated como sea posible. A pesar de estos efectos adversos de la digestión enzimática, efectos beneficiosos en los linfocitos PP también fueron descubiertas como mejora de tinción intracelular y viabilidad de las células (figura 7-F, G). Sin embargo, otros análisis revelaron que estos efectos fueron atribuidos al proceso de agitación a 37 ° C independientemente de la digestión enzimática, porque la viabilidad celular y tinción intracelular de Foxp3 fueron favorecidos en medida comparable cuando las células fueron agitadas en la ausencia de colagenasa. Mecánico, el efecto beneficioso de la agitación puede ser debido a la mejor eliminación del contenido intestinal y el moco de PPs.
En Resumen, hemos descrito un protocolo optimizado para el aislamiento de linfocitos de aislados de sus células pueden teñidas para caracterización de citometría de flujo de varios subconjuntos de la célula o puede sometidas a clasificación celular y posteriormente empleadas en varios in vitro y ensayos funcionales de en vivo .
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Disclosures
No hay conflicto de interés declarado.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a Laura Strauss y Peter Sage para discusiones útiles y ayuda con los análisis de citometría de flujo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD4 antibody | eBioscience, Biolegend* | 17-0041-81 ,10054* | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CD19 antibody | eBioscience | MA5-16536 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse PD-1 antibody | eBioscience | 61-9985-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse ICOS antibody | eBioscience | 12-9942-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse GL7 antibody | Biolegend | 144610 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CXCR5 antibody | Biolegend*, BD Bioscience | 145512*, 551960 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse BCL-6 antibody | Biolegend | 358512 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse Foxp3 antibody | eBioscience | 17-5773-82 | For detailed information see Table 1 |
| Streptavidin-BV421 | BD Bioscience | 563259 | For detailed information see Table 1 |
| FixableViability Dye | eBioscience | L34957 | For detailed information see Table 1 |
| 7AAD | Biolegend | 420404 | For detailed information see Table 1 |
| FcBlock (CD16/32) | BD Bioscience | 553141 | For detailed information see Table 1 |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 6-well,12-well & 96-well plates | Falcon/Corning | 353046,353043/3596 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 10 mL syringe-plunger | Exel INT | 26265 | |
| RPMI | Corning | 15-040-CV | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Orbital shaker | VWR | Model 200 | |
| Curved-end scissor | |||
| Fine Serrated Forceps | |||
| Small curved scissor |
References
- van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPα interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer’s patches: Organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).
- Heel, K. A., McCauley, R. D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. Review: Peyer’s patches. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 122-136 (1997).
- Fagarasan, S., Kinoshita, K., Muramatsu, M., Ikuta, K., Honjo, T. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413 (6856), 639-643 (2001).
- Hopkins, S. A., Niedergang, F., Corthesy-Theulaz, I. E., Kraehenbuhl, J. P. A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer’s patch dendritic cells. Cellular Microbiology. 2 (1), 59-68 (2000).
- Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches. Infection and Immunity. 71 (1), 504-509 (2003).
- Sato, A., Iwasaki, A. Peyer’s patch dendritic cells as regulators of mucosal adaptive immunity. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1333-1338 (2005).
- Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Y. Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways. Annals of the New York Academy of Sciences. 1247 (1), 97-116 (2012).
- Fagarasan, S., Kawamoto, S., Kanagawa, O., Suzuki, K. Adaptive Immune Regulation in the Gut: T Cell-Dependent and T Cell-Independent IgA Synthesis. Annual Review of Immunology. 28, 243-273 (2010).
- Hase, K., et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH + bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).
- Wu, H., et al. An Inhibitory Role for the Transcription Factor Stat3 in Controlling IL-4 and Bcl6 Expression in Follicular Helper T Cells. Journal of Immunology. 195 (5), 2080-2089 (2015).
- Vinuesa, C. G., Tangye, S. G., Moser, B., Mackay, C. R. Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity. Nature Reviews Immunology. 5 (11), 853-865 (2005).
- Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal Centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
- Vaeth, M., et al. Store-Operated Ca2+Entry in Follicular T Cells Controls Humoral Immune Responses and Autoimmunity. Immunity. 44 (6), 1350-1364 (2016).
- Meli, A. P., et al. The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance. Immunity. 45 (4), 831-846 (2016).
- Fu, W., et al. Deficiency in T follicular regulatory cells promotes autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 815-825 (2018).
- Espéli, M., Walker, J. M. T follicular helper cells - Methods and Protocols. , (2015).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visual Experiments. (111), e54114 (2016).
- De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer’s Patches. Journal of Visual Experiments. (73), e50167 (2013).
- Pastori, C., Lopalco, L. Isolation and in vitro Activation of Mouse Peyer’s Patch Cells from Small Intestine Tissue. Bio-protocol. 4 (21), e1282 (2014).
- Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. Journal of Visual Experiments. (58), 3225 (2011).
- Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).
- Bollig, N., et al. Transcription factor {IRF4} determines germinal center formation through follicular T-helper cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Science of U. S. A. 109 (22), 8664-8669 (2012).
- Pérez-Mazliah, D., et al. Follicular Helper T Cells are Essential for the Elimination of Plasmodium Infection. EBioMedicine. 24, 216-230 (2017).
- Sage, P. T., Sharpe, A. H. T follicular regulatory cells in the regulation of B cell responses. Trends Immunology. 36 (7), 410-418 (2015).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. Journal of Immunological Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
- Meenan, J., et al. Altered expression of alpha 4 beta 7, a gut homing integrin, by circulating and mucosal T cells in colonic mucosal inflammation. Gut. 40 (2), 241-246 (1997).
- Cao, A. T., et al. Interleukin (IL) -21 promotes intestinal IgA response to microbiota. Mucosal Immunology. 8 (5), 1072-1082 (2015).
- Wei, J., et al. Autophagy enforces functional integrity of regulatory T cells by coupling environmental cues and metabolic homeostasis. Nature Immunology. 17 (3), 277-285 (2016).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. 33 (S1), (2017).
- Bergqvist, P., Gardby, E., Stensson, A., Bemark, M., Lycke, N. Y. Gut IgA Class Switch Recombination in the Absence of CD40 Does Not Occur in the Lamina Propria and Is Independent of Germinal Centers. Journal of Immunology. 177 (11), 7772-7783 (2006).
- Keil, B., Gilles, A. M., Lecroisey, A., Hurion, N., Tong, N. T. Specificity of collagenase from Achromobacter iophagus. FEBS Letters. 56 (2), 292-296 (1975).
- Mora, J. R., et al. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer’s patch dendritic cells. Nature. 424 (6944), 88-93 (2003).
- Reboldi, A., et al. Mucosal immunology: IgA production requires B cell interaction with subepithelial dendritic cells in Peyer’s patches. Science. 352 (6287), (2016).
