Summary
I denna studie presenterar vi en ny och effektiv protokoll för isolering av lymfocyter från Peyers plack (PPs), som därefter kan användas för in-vivo och in vitro- funktionella analyser samt flöde flödescytometrisk studier av follikulära T hjälpare och germinal center B celler.
Abstract
I tarmslemhinnan i utgör immunceller en unik immunologiska enhet, som främjar immuntolerans samtidigt som samtidigt ger immunförsvaret mot patogener. Det är väletablerat att Peyers plack (PPs) har en viktig roll i slemhinne immunsystemet nätverket av hosting flera effektor T och B-cell delmängder. En viss bråkdel av dessa effektor celler, follikulära T helper (TFH) och germinal center (GC) B-celler är professionaliserad i regleringen av humorala immuniteten. Karakterisering av dessa cell undergrupper inom PPs när det gäller deras differentiering program och funktionella egenskaper kan därför ge viktig information om slemhinnor immunitet. I detta syfte skulle ett enkelt tillämpliga, effektiv och reproducerbar metod av lymfocyter isolering från PPs vara värdefullt att forskare. I denna studie syftar vi till att generera en effektiv metod för att isolera lymfocyter från mus PPs med hög cell avkastning. Vår metod visade det första vävnad behandling såsom användning av mag reagenser och vävnad agitation, samt cell färgning villkor och urval av antikropp paneler, har stort inflytande på den kvalitet och identitet av isolerade lymfocyter och på experimentella resultat.
Här beskriver vi ett protokoll som gör det möjligt för forskare att effektivt isolera lymfocyter befolkningen från PPs möjliggör reproducerbara flöde flödescytometri-baserad bedömning av T- och B-cell underuppsättningar fokus på TFH och GC B cell delmängder.
Introduction
Hela magtarmkanalen från början till slut är prydd med ett omfattande lymfoida nätverk som innehåller immunceller mer än någon annan orgel i mänskliga och mus1. Peyer's patchar (PPs) utgör en huvudkomponent i den intestinala grenen av denna cellulära immunförsvaret organisation, så kallade gut-associerade lymfoida vävnad (GALT)2,3. Inom PPs, tusentals miljoner antigener som härrör från kosten material, kommensaler bakterieflora och patogener som provtas kontinuerligt, och när behövs lämplig immunsvar mot dem är monterade således upprätthålla tarmens immunförsvar homeostas. I det avseendet kunde PPs namnges som ”tonsillerna av tunntarmen”. PPs består av stora sub fack: subepitelial dome (SED), stora B-cell follikeln zoner; den överliggande follikeln-associerade epitel (FAE) och interfollicular region (IFR) där T-celler är beläget4. Denna unika uppdelning i PPs möjliggör olika effektor cell grupper att samarbeta, ger således, immunkompetens i tarmen.
PPs saknar afferenta lymfkärlen, och på grund av denna anledning antigener transporteras till PPs från tunntarmen genomförs inte genom lymfkärl i motsats till de flesta av de andra lymfoida organ. Istället är specialiserade epitelceller i FAE, så kallade M celler, ansvarig för överföring av luminala antigener i PPs5. Därefter transporteras antigenerna fångas upp av de dendritiska cellerna (DCs) och fagocyter som finns i regionen subepitelial dome (SED) under FAE6,7. Denna antigen sortering process av DCs i PP är avgörande för att initiera adaptiva immunsvaret8 och efterföljande generation av IgA utsöndrar celler9.
På grund av den tunga antigena bördan från kommensaler flora och kosten material, PPs värd endogenously aktiverats effektor T och B-cell delmängder i stor sammansättning såsom TFH och IgA+ GC B celler10, tyder på att PPs representerar en plats av aktiv immun svar11. Påvisande av upp till 20 – 25% TFH celler inom totala CD4+ T cell fack och upp till 10 – 15% GC B celler inom totala B-celler är möjligt i PPs som samlats in från unimmunized unga C57BL/6 möss12. I motsats till andra typer av T-hjälpare celler (dvs., Th1, Th2, Th17-celler), TFH celler Visa unika tropism till B-cell folliklar främst på grund av CXCR5 uttryck, som främjar TFH cell homing längs CXCL13 gradient13. I B-cell follikeln zonplanerar av PPs inducerar TFH celler IgA klass switch rekombination och somatisk hypermutation i aktiverade B-celler som hög affinitet IgA producerar celler skilja14. Därefter dessa antikroppar-utsöndrar plasma celler migrerar till lamina propria (LP) och reglera immunförsvaret homeostas i gut10.
Identifiering och karakterisering av TFH och GC B cellpopulationer inom PPs kan göra det möjligt för forskare att undersöka dynamiken i humorala immunsvar under steady-state-förhållanden utan behov av tidskrävande immunisering modeller traditionellt används i TFH-GC B cell studier15,16,17,18. Analysera TFH celler inom PPs är inte så enkelt som andra cell delmängder. Tekniska utmaningar inkluderar att identifiera idealisk vävnad förberedelse villkor, surface antikropp-markör kombination, samt välja lämpliga positiva och negativa kontroller. Både TFH och PP forskningsfält uppvisar stor variation i form av experimentella rutiner och är långt ifrån ger ett samförstånd för att upprätta standardiserade protokoll på grund av flera skäl. Först, varje cell delmängd inom PPs tenderar att påverkas differentially av vävnad förberedelse villkor som kräver ytterligare ändringar i en cell delmängd-specifika sätt. Andra finns det en betydande skillnad bland de rapportera metoderna när det gäller detaljerna i cell förberedelse från tredje PPs., antalet protokoll-baserade jämförande studier som undersöker idealisk vävnad tekniker beredning och experimentella förhållanden för PP och TFH är forskning ganska begränsade.
Aktuella protokoll-baserade studier som föreslås för PP cell förberedelse19,20,21,22 var inte TFH- eller GC B cell-orienterade. Dessutom vissa vävnad förberedelse förhållanden rekommenderas för PPs19,20 såsom kollagenas-baserade matsmältningen befanns påverka resultatet av TFH identifiering av flödescytometri negativt18. På denna grundval resonerade vi att en optimerad, standardiserade och reproducerbara protokoll som kan användas för att studera TFH och GC B cell dynamiken i PPs skulle vara värdefullt att utredare som arbetar på detta ämne. Detta behov gav oss kraft att generera en förbättrad och uppdaterad protokollet för isolering och karakterisering av PP lymfocyter som är fint optimerat för cellulär återhämtning, lönsamhet och effektivitet för flöde flödescytometrisk karaktärisering av flera T- och B cell delmängder. Vi syftar också till att utesluta flera mödosamma förberedelser som föreslås i föregående protokoll, därmed minska krävs manipulationer och tid för vävnads- och förberedelser från PPs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla studier och experiment som beskrivs i detta protokoll genomfördes under riktlinjer enligt institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av Beth Israel Deaconess Medical Center.
1. utforma Experimental Set-up och mus grupper
- (Valfritt) Co hus experimentella mössen att underlätta horisontell överföring av tarmfloran mellan experimentell möss och minska icke-specifik variabilitet inom PP lymfocyter. Dessutom använda littermate kontroller av samma kön för att minimera variabiliteten.
2. kirurgisk Excision och vävnad förberedelser:
- Kirurgiskt avlägsnande av tunntarmen (SI)
- Euthanize möss med CO2 kvävning eller någon motsvarande metod som godkänts av utskottet för institutionella djuretik.
- Flytta musen till en dedikerad plats för kirurgisk excision. Placera baksidan nedåt och sanera buken med 70% etanol. Utföra en laparotomi genom att skära av bukhuden och bukhinnan längs mittlinjen från pubis till bröstkorgen vilket öppnar i bukhålan.
Obs: Utför första snittet på ett relativt litet område av huden för att undvika att tränga in i bukhålan och skada Tarmvävnaden. Fortsätta excision tills önskad anatomiska gränsen. - Identifiera den blindtarmen, som är ett perfekt besöksmål för detektion av terminala ileum, som utgör den distala delen av tunntarmen.
Obs: Blindtarmen ligger vanligtvis på nedre vänstra sidan av musen buken. - Lokalisera ileocekala junction och göra ett snitt på denna nivå som distala som möjligt att separera tunntarmen från blindtarmen. Under hela nästa steg, undvika överdriven fysisk kontakt med tarmväggen eftersom ömtåliga PPs kollapsa enkelt vid beröring.
- Ta försiktigt bort hela tunntarmen tills pyloric sphincter genom att skära krös med sax. Identifiera korsningen mellan pylorus och tolvfingertarmen och snip tolvfingertarmen på denna nivå, vilket kommer att leda till fullständig avskildhet av tunntarmen från bukhålan.
Obs: (i) undvika översträckning som detta kan orsaka bristning av tarmväggen. (ii) om LP lymfocyter isolering önskas förutom PP lymfocyter, fullständigt avlägsnande av det mesenteriska fettet är nödvändigt. Dock för PP isolering endast, kan återstående mesenterica fett ge vissa fördelar under stegen för ytterligare isolering; Därför, det bör bevaras. - Placera fristående tunntarmen i en 6-väl tallrik fylld med kall RPMI + 10% fetalt bovint serum (FBS) och skaka försiktigt vävnader manuellt tills alla intestinal segment är nedsänkt i kallt media. Underhålla vävnader på is i hela nästa steg.
- Efter dissekera önskat antal mus små tarmarna, gå vidare till PP excision från insamlade tunntarmen.
- Kirurgisk Excision av PPs och förberedelse av enda cellsuspension:
- Försiktigt överföra tunntarmen på en pappershandduk av gripande mesenterica fettet med hjälp av pincetten och placera den mesenteriska vänd pappershandduk. Fukta hela tarmens segmentet med kall RPMI + 10% FBS att undvika vävnad uttorkning och klibbighet.
Obs: Återstående mesenterica fett kan vara till hjälp i detta skede eftersom fettvävnad segment på webbplatsen mesenterica si kommer att hålla fast hushållspapper att hålla webbplatsen anti mesenterica uppåt. - Identifiera PPs, som visas som vita multi lobulated aggregat i en ”blomkål-liknande” form på anti mesenterica sida av tarmväggen.
Obs: Flushing luminala innehållet rekommenderas inte förrän alla PPs är censurerade. Tömning luminala innehållet kan orsaka kollapsen av PPs och förhindrar att kontrasten mellan PPs och tarmväggen, vilket är mycket användbart för visuell identifiering av PPs. - Efter att identifiera PPs på anti mesenterica sida, placera den kirurgiska böjda-end sax på PPs (kurvan bör möta) fasthållande PP från dess distala och proximala gränsen.
Valfritt: Tryck PP försiktigt mot bladen av sax med en fingertopp. Denna manöver leder till bättre uteslutandet av omgivande icke-PP vävnad. Punktskatt PPs försiktigt, exklusive den omgivande Tarmvävnaden.
Obs: (i) detta steg är avgörande för att få maximal PP cell avkastning samtidigt minimera cell kontaminering från närliggande intestinal fack som LP och intestinal epitel, som också är rik på T-celler. (ii) från en SI censurerade från C57BL/6 mus, kan 5-10 PPs (genomsnittliga storlek, multi lobulated) samlas. Genom att sikta ännu mindre PPs (inte flera lobulated), samling av upp till 12-13 PPs per mus (C57BL/6) är möjligt använder detta protokoll. - Överföring exciderad PPs till en 12-väl vävnadsodling tallrik fylld med iskall RPMI + 10% FBS och underhållna på is med pincett eller böjda kirurgisk sax.
Obs: (i) omedelbart efter excision av PPs, slem och tarmens innehåll på PP ytan kan rengöras genom att gnugga vävnaden försiktigt på en pappershandduk. Detta steg kommer att förbättra lönsamheten för PP lymfocyter. (ii) i stället för att överföra PPs till en platta, kan överföra till separerade rör också övervägas beroende på antalet totala stickprov. - Valfritt: När PP excision och efterföljande placering i väl plattan genomförs, antal och storlek av PPs som samlats in från olika experimentella/mus grupper kan dokumenteras genom att ta en bild av vävnadsodling plattan som innehåller PPs.
- Förbereda en uppsättning 50 mL koniska rör fyllda med 25 mL RPMI + 10% FBS (pre värmas vid 37 ° C). Med hjälp av ett par sax, klipp kanten av ett 1000 µL tips från avståndet som gör att aspiration av PPs med 1 mL pipett. Aspirera PPs med 1 mL pipett och överföra dem från 12-väl vävnadsodling plattan till de förberedda 50 mL koniska rör.
Obs: Använd ett nytt tips för varje mus prov för att undvika korskontaminering mellan proverna. - Secure locket och placera rören vertikalt i orbitalskak vid 37 ° C, med kontinuerlig omrörning vid 125 – 150 rpm i 10 min. Samtidigt förbereda en ny uppsättning 50 mL rör och placera en 40 µm cell SIL på toppen av varje tub, genom vilken enda cellsuspension tillreds.
Obs: A agitation steg kommer att ta bort återstående tarmens innehåll, slem och cell skräp, som minska cellernas viabilitet och återhämtning av PP lymfocyter om inte bort. (ii) gäller inte någon form av matsmältningsenzymer på PP vävnad eftersom rötningsprocessen orsakar en dramatisk förlust av CXCR5 uttryck från cellytan. - Efter agitationen, överföra PPs till 40 µm cell silen placeras på toppen av de nyligen beredda koniska 50 mL rör. Använda den runda sidan av en 10 mL kolv, försiktigt att störa PPs genom cell silen att generera enda cellsuspension. Skölj silen med 15 – 20 mL kall RPMI + 10% FBS.
Obs: (i) före filtrering, skaka rören som innehåller PPs horisontellt. Detta kort skaka kommer att underlätta överföringen av PPs till cell silar. (ii) använder en 70 µm cell sil för isolering av icke-lymfoida immunceller (t.ex., monocyter, makrofager, DCs) rekommenderas. - Centrifugera de enda cellsuspensioner på 350 – 400 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
- Noggrant avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna vid en koncentration på 10 x 106 celler/mL. Räkna de celler som använder en hemocytometer.
Obs: (i) före cellen räkna, summacell numret för varje mus PP kan cirka uppskattas med hjälp av följande formel ”: 0,5-1 x 106 celler x (antal PPs) = totala celltal”. Ytterligare utspädningar med trypan blå för cell inventering kan vara nödvändigt. (ii) som ett alternativ till manuell räknar, kan automatiserade cell räknare användas. - Överföra 2-2,5 x 106 celler i lämplig volym (t.ex., 200 µL) in en runda-bottenplatta med 96 brunnar.
Obs: För en enda färg och negativa kontrollprover, 0,5-1 x 106 celler vara tillräckligt. - Centrifugera plattan på 350 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Snärta plattan.
- Tvätta cellerna i 200 µL färgning buffert.
- Försiktigt överföra tunntarmen på en pappershandduk av gripande mesenterica fettet med hjälp av pincetten och placera den mesenteriska vänd pappershandduk. Fukta hela tarmens segmentet med kall RPMI + 10% FBS att undvika vävnad uttorkning och klibbighet.
3. ytan antikropp färgning
- Livskraft färgning:
- Efter den sista tvättningen, resuspendera cellerna i 100 μL av fastställbara livskraft dye utspätt i PBS (1:1, 000). Inkubera i 30 min på is eller vid 4 ° C i mörker.
Obs: a intracellulära färgning för detektion av viktiga transkription faktorer såsom Foxp3 eller Bcl-6 kräver fixering av cellerna. I så fall icke-fastställbara livskraft färgämnen (t.ex., 7-AAD, DAPI) kan inte användas. (ii) för att späda ut fastställbara livskraft färgämne, Använd inte någon färgning buffert som innehåller protein. Media som används i detta steg måste vara protein-fria. (iii) uteslutning av döda celler med hjälp av livskraft färgning är avgörande eftersom döda celler kan orsaka allvarliga tekniska svårigheter för flödescytometri Flödesanalys av avger autofluorescens och bindande ytan antikroppar nonspecifically, vilket kan leda till falskt positiva resultat. - Tvätta cellerna två gånger med färgning buffert. Centrifugera vid 350 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Snärta plattan.
- Efter den sista tvättningen, resuspendera cellerna i 100 μL av fastställbara livskraft dye utspätt i PBS (1:1, 000). Inkubera i 30 min på is eller vid 4 ° C i mörker.
- FC Block och Surface - lager I:
- Bered den Fc-block genom att späda ut anti-CD16/32 antikropp (1: 200) i färgning buffert.
- Att resuspendera cellerna i 20 μL av beredd Fc-block. Inkubera i 15 min på is.
- Lägga till 80 μl av surface antikroppar cocktail (se tabell 1 för antikroppen Sammanfattning) beredd på lämpliga utspädningar utan tvätt. Inkubera i isen i minst 30 min.
- Tvätta två gånger genom att lägga till överdriven färgning buffert. Centrifugera vid 350 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Snärta plattan.
- Surface - lager II:
- Förbered streptividin färglösningen genom spädning fluorokrom-konjugerad streptividin i färgning buffert.
- Efter den sista tvättningen, resuspendera cellerna med 100 μL av pre utspädda streptividin (1: 100) färgning lösning. Inkubera i minst 15 min på is i mörkret.
- Tvätta två gånger med färgning buffert. Centrifugera vid 350 x g under 5 minuter vid 4° C. Snärta plattan.
Valfritt: Om intracellulära färgning för follikulär regulatoriska T-cellen upptäckt inte önskas, efter den sista tvättningen, resuspendera cellerna i 200 μL av färgning buffert och överföring till lämpliga rör uppkopplingstyp i flödescytometer. När proverna inte är fast, bör förvärv av data av flödescytometri utföras inom 3 – 4 timmar att få korrekta resultat.
4. cell fixering
- Förbereda fixering/permeabilisering (Fix/Perm) fungerande lösning med reagens Foxp3/transkription faktorn färgning buffert set. Blanda en del av fixering/permeabilisering koncentrat med tre delar av fixering/permeabilisering spädningsvätska till önskad slutlig volym.
- Efter den sista tvättningen, resuspendera cellerna i 200 μL av Fix/Perm fungerande lösning.
- Inkubera plattan på is eller vid 4 ° C i 20 min. Inte överstiger 20 min för detta steg. Längre inkubationstid kan kraftigt minska cell återhämtningen.
- Centrifugera vid 350 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Snärta plattan. (Tillval) Efter detta steg, fast celler kan förvaras i flera dagar vid 4 ° C i färgning buffert innehållande bovint serumalbumin (BSA) eller FBS tills efterföljande intracellulära färgning eller flöde flödescytometri förvärv.
- Att resuspendera cellerna i 200 μL permeabilisering buffert (x1) färska pre utspädd renad avjoniserat vatten.
- Centrifugera vid 350 x g under 5 minuter i rumstemperatur (RT).
- Tvätta en gång med 200 μL permeabilisering buffert och centrifugera vid 350 x g under 5 minuter på RT.
5. intracellulära färgning
- Bered den Fc-block genom att späda ut anti-CD16/32 antikropp (1: 200) i permeabilisering buffert.
Obs: Efter fixering steget, cellerna måste upprätthållas i permeabilisering buffert till slutet av den intracellulära färgning processen. - Efter den sista tvättningen, resuspendera cellerna i 20 μL av Fc-block lösning. Inkubera i 10 – 15 min på RT i mörkret.
- Utan tvätt, tillsätt 80 μl av intracellulära antikroppar cocktail (100 μL slutliga volym) före utspätt i permeabilisering buffert. Inkubera i 30 min på RT.
- Tillsätt 100 μL av Perm buffert och centrifugera vid 350 x g i 5 min på RT.
- Tvätta en gång med 200 μL permeabilisering buffert, Centrifugera 350 x g för 5 min på RT.
- Efter den sista tvättningen, resuspendera cellerna i 200 μL av färgning buffert och överföra cellerna in lämpliga rören (slutlig volym på 400 μL i färgning buffert) och uppkopplingstyp av flödescytometri. Prover som färgas i plattan med 96 brunnar kan också köras utan att överföra in rören om en flödescytometer med plattan läsaren alternativet är tillgängligt. Detta steg minimerar cellförlust under cell överföring.
- Förvärva ett minimum av 5 x 105 totalt celler på en flödescytometer för att kunna utföra reproducerbara analys av TFH, TFR samt GC B celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I motsats till en föregående protokoll20, vi har observerat att PPs inte jämnt fördelade över SI men är lokaliserade mer tätt mot distala och proximala ändarna av SI som visas i figur 1A. Flöde flödescytometrisk analys visade att om följt korrekt våra protokoll ger en PP lymfocyter befolkningen som visar framåt-side scatter distribution liknar splenocytes (figur 2AE, och 2D, H) med > 95% cell lönsamhet (figur 2B och 2F). I motsats till andra sekundära lymfoida organ (SLOs), i C57BL/6 möss cirka 70 – 80% av totala PP lymfocyter består av B-celler, medan CD4+ T celler utgör endast 10 – 15% av totala PP lymfocyter (figur 2 c och 2 G).
Observera att CD4+ CD19+ dubbel positiv (DP) celler utgör ≈ 1% av totala PP lymfocyter. Med vissa försiktighetsåtgärder under cell beredning som utför Fc-Block mot Fc receptorer av B-celler och exklusive midjekort jacka, CD4+ CD19+ DP cell befolkningen kunde vara minimerad (figur 3A och B). Dock en bråkdel av DPs som inte visar framåt scatter (FSC) kännetecken av dubletter är oundviklig och bör vara gated ut från de enda positiva T och B-cell gates (figur 3B). Våra resultat visade att B-celler inom DP celler mycket uttryckliga CXCR5 på ytan (figur 3 c) som kan leda till falskt positiva resultat i utfärda utegångsförbud för TFH som justeras baserat på CXCR5 uttrycket i CD4+ T celler. Däremot, Vi hittade att GL7, en markör för aktiverade B-celler, uttrycks också i CD4+ CD19+ DP celler (figur 3D), som kan orsaka störningar med GC B cell gating.
Exempel på TFH och GC B cell gating algoritmer avbildas i figur 4. För GC B cell gating, använder vi GL7 märkning kontra CD38, som identifierar GC B-celler som GL7+ CD38– B-celler (figur 4A-B). PNA märkning kan användas i stället för GL723 CD38 kan ersättas av en av följande markörer: IgD, Bcl-6 och CD95. Alternativ gating strategier för GC B-celler är visat i figur S1. GC B cell förhållandet i PPs uppvisar stor variation i C57BL/6 möss. Men har jämfört med andra SLOs, PPs betydligt högre GC B cell baserat med en rad 2-10% av totalt B-celler Understeady-State. Gating strategi för PP TFH celler beskrivs som CD19– CD4+ PD-1Hej CXCR5+ T cells (figur 4A, C). ”Zebra plot” befanns vara en optimal demonstration metod för TFH gating som den skildrar PD-1Hej befolkningen mer diskret jämfört med andra tomt typer (figur 4 c). TFR, en delmängd av TFH-celler som uttrycker Foxp3, är gated som CD19– CD4+ PD-1Hej CXCR5+ Foxp3+ T cells (figur 4 d). Som GC B cells, TFH cell fraktionen varierar också i unimmunized mus individer med ett utbud av 10 – 20% av totala CD19– CD4+ PP lymfocyter. Detaljer för alternativa Usenets algoritmer för TFH celler beskrivs i figur 4E, F och Figur S1C, D.
För att undvika falsk positivitet på grund av bakgrundsfärgning och autofluorescens, bör isotyp kontroller eller alternativa likvärdiga kontroller såsom fluorescens Minus en (FMO) ingå i panelen färgning som negativ kontroll för TFH och GC B cell markörer ( Figur 4 g-J).
För att optimera förutsättningarna för PP vävnad förberedelse, vi utvecklat en roman internt kontrollerade experimentella strategi, där PPs har samlats in från en individuell mus och poolade separat beroende på deras anatomiska ursprung (t.ex., duodenalsår, ileal). För att utföra experiment, poolade PPs tilldelades till enskilda grupper så att varje experimentella och kontrollgruppen ingår ett lika stort antal PPs från varje anatomisk region (figur 5A). Genom detta tillvägagångssätt, fann vi att kollagenas-baserade enzymatisk nedbrytning (testat på 37,5 mg kollagenas II eller IV per 25 mL av matsmältningen mix = 1,5 mg/mL), som vanligen används för lymfocyter isolering från olika slemhinnor vävnader, betydligt reducerad CXCR5 uttryck i PP lymfocyter (figur 5B), särskilt i TFH celler (figur 5F-jag), medan uttrycket av andra ytan molekyler (t.ex., CD19, CD4) förblev intakt (Figur 5 C-E). Minskning av CXCR5 upptäckt var framträdande så att uttrycket av CXCR5 på kollagenas-behandlade TFH celler var nästan omöjlig att skilja från isotypen kontroll (figur 5F-jag). Ytterligare experiment visade att störningar av enzymatisk nedbrytning med CXCR5 uttryck var beroende av CXCR5 antikropp klonen används (figur 6A-F). Bestämt vid kollagenas II behandling var upptäckt kapacitet CXCR5 antikropp klon 2 g 8 mer påtagligt nedsatt, än upptäckt kapacitet CXCR5 antikropp klonen L138D7 (Figur 6A-D).
Enzymatisk nedbrytning reduceras inte bara uttryck för CXCR5 men också andelen totala lymfocyter inom PP celler som bestäms av de FSC-SSC-egenskaperna, medan en betydande del av celler isolerade från smält PPs uppvisade fram och sida scatteren av en högre intensitet än PP lymfocyter (figur 7A-C). Kollagenas effekter på cellen återhämtning inträffade på ett dosberoende sätt (figur 7A, H-J). Enzymatisk nedbrytning ökade cellernas viabilitet (figur 7 d, E). Dock denna förmån causatively länkades inte till kollagenas matsmältningen eftersom de celler som isolerats från PPs efter agitationen utan kollagenas var gynnade likaså (figur 7F). Upptäckt av den nukleära transkriptionsfaktor Foxp3, vilket är av särskilt intresse här eftersom det bedöms vanligtvis under TFH isolering att identifiera TFR celler, förbättrades av agitationen vid 37 ° C oavsett kollagenas matsmältningen (figur 7 g ).
Figur 1: makroskopisk struktur och anatomiska distribution av murina Peyers. (A). en bild som erhållits från duodenal-slutet av tunntarmen med magen. Två nära belägna PPs i tolvfingertarmen indikeras med svarta pilar. (B). PPs samlas in från elva C57BL/6 möss förvarades individuellt i en 12 brunn-platta. (C). bilden av nymalen exciderad mus PPs visas på en 40 µm cell SIL. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Flow flödescytometrisk karakterisering och grundläggande Usenets algoritm för PP lymfocyter. (A). Dot tomter visar fördelningen av nymalen isolerade ofixerade PP lymfocyter längs FSC och SSC axlar som uppvisar stora likheter med splenocytes skildras i (D). (B). uteslutning av döda celler med hjälp av 7AAD uttryck. 7AAD– celler representerar levande celler. (C). CD19 och CD4-baserade immunophenotyping T och B celler bland pre gated levande PP celler. (E-G). Representativa Flödesanalys av fasta PP lymfocyter. (H). representativa flödesegenskaper av fasta splenocytes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: CD4+ CD19+ dubbel positiv (DP) celler orsakar falsk positivitet i TFH och GC B cell gating. (A). CD4+CD19+ DP lymfocyter inom levande PP celler demonstreras. (B). Separation av DP celler baserat på FSC egenskaper som dubletter och undertröjor. (C,D). CXCR5 och GL7 uttryck för DP celler avbildas i histogrammet tomter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representant TFH och GC B cell Usenets strategi. PPs har samlats in från en 3 - månad-gammal mus och lymfocyter isolerades som beskrivs i avsnittet protokoll. (A) CD19 och CD4 märkning av levande PP lymfocyter skildras. (B) CD38lo GL7HejCD19+ B celler var gated som GC B celler. (C), TFH celler var gated som CXCR5+PD-1Hej CD4+ celler. (D), TFR celler är en bråkdel av TFH-celler som uttrycker regelverk-specifika transkriptionsfaktor Foxp3 tillsammans med TFH markörer och är gated som CXCR5+ PD-1Hej Foxp3+ CD4+ T celler. (E-F) Gating strategi för TFH yta markörer bekräftas i splenocytes isolerade från NP-OVA-immuniserade musen med hjälp av BCL-6 uttryck. (G-J) Fluorescens Minus en (FMO) kontroller för nyckel TFH-TFR och GC cell markörer är avbildade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: kollagenas-baserade enzymatisk nedbrytning leder till en massiv minskning av CXCR5 upptäckt. (A) PPs från en 2 månader gammal mus ligger i tolvfingertarmen (≈ 1/3 proximala), jejunum (≈ 1/3 mellersta) och ileum (≈ 1/3 distala) samlades in och poolade separat. Poolade PPs var fördelas lika mellan de experimentella grupperna. Enzymatisk nedbrytning med kollagenas II eller IV på 1,5 mg/mL koncentration utfördes med agitation under 10 minuter vid 37 ° C. (B-E) Histogrammet tomter som skildrar uttrycket av ytan molekyler (CXCR5, CD19, PD-1, CD4) av de celler som isolerats från PPs som utsattes för kollagenas-baserade matsmältningen. (F-jag) TFH gating inom den kollagenas administreras och kontrollgrupper demonstreras i zebra tomter. Uppgifterna representerar tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: effekten av kollagenas på CXCR5 uttryck visade stor skillnad beroende på anti-CXCR5 antikropp klonen. PP-lymfocyter som samlats in från en 6-månad-gammal mus, poolade och separerade i olika grupper när det gäller antikropp klona används och enzymatisk nedbrytning ansökan. (A-F) Andelen TFH celler är avbildad i zebra tomter inom pre gated live, CD19– CD4+ T celler. (A, C och E) PP celler var fläckade av Biotin-konjugerad antimus CXCR5 antikroppen (2 g 8 klon), och streptividin konjugerade med BV421 fluorokrom. (B, D och F) PP celler var målat med en primär konjugerad antikropp mot mus CXCR5 (L138D7 klon). (A-B) TFH gating tomter från osmält PP lymfocyter. (C-D) PPs rötas med kollagenas II (20 mg/25 mL av matsmältningen mix) och agiterade för 10 min vid 37 ° C. Uppgifterna utgör två oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: kollagenas-baserade matsmältningen och agitation vid 37 ° C påverka cellernas viabilitet, återhämtning och intracellulära färgning effektivitet. En 3 månader gammal C57BL/6 mus offrades; PPs samlades och poolade som beskrivs i figur 5A. (A) efter insamling av PPs, vävnader var upprörd i närvaro av kollagenas II (37,5 mg/25 mL av matsmältningen mix) i 10 min, FSC och SSC egenskaper hos fasta PP celler skildras i (A) och livskraft färgning tomt avbildas i) D). (B, E) efter insamling av PPs, vävnader förvarades på is utan agitation eller enzymatisk nedbrytning; FSC och SSC egenskaper hos fasta PPs celler skildras i (B) och livskraft färgning är avbildad i (E). (C, F) Efter insamlingen av PPs, var vävnader upprörd på 125-150 rpm i 10 min vid 37° C i avsaknad av kollagenas; FSC och SSC egenskaper och livskraft färgning av fasta PP celler är avbildad (C, F), respektive. (G) jämförelse av Foxp3 uttryck i regulatoriska T-celler som isolerats från upprörd och unagitated PPs utan kollagenas administrering är avbildad i histogrammet tomten. (H-J) PPs samlas in från en 6 - månader gammal C57BL/6 mus och behandlades med olika koncentrationer av kollagenas II: 25 mg per 25 mL matsmältningen mix, 15 mg per 25 mL matsmältningen mix eller ingen kollagenas. FSC och SSC tomter som avslöjar effekterna av enzymatisk nedbrytning på PP cell återhämtning och avkastning är avbildade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: molekylär modellen och komplett aminosyresekvensen av CXCR5. (A) sju-pass transmembrane proteinstruktur CXCR5 modelleras. (B), komplett aminosyresekvensen av CXCR5 demonstreras. Sekvensen av extracellulära regioner indikeras i rött och extracellulära aminosyror med förmodad kollagenas känsliga kemiska bindningar demonstreras i gult. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Antigen | Klon | Fluourochrome | Utspädning |
| CD4 | GK1.5, RM4-5 | APC, PECy7, PerCpCy5.5, FITC | 1: 100 |
| CD19 | 6 D 5 | FITC, APC/Cy7 | 1: 100 |
| PD-1 | J43 | PE ef 610 (Texas röd) | 1: 100 |
| ICOS | 15 F9, 7E.17G9 | PE | 1: 100 |
| GL7 | GL7 | PerCp/Cy5.5 | 1:75 |
| CXCR5 | 2 g 8,L138D7 * | Biotin | 1:50 |
| BCL-6 | 7 D 1 | PE/Cy7 | 1:50 |
| FOXP3 | FJK-16 | APC, PE | 1: 100 |
| Streptividin | - | BV421, PE | 1: 100 |
| FixableViability Dye | - | BV 510(AQUA) | 1:1,000 |
| 7AAD | - | PerCp/Cy5.5 | 1: 500 |
| FcBlock (CD16/32) | 2.4G2 | - | 1: 200 |
Tabell 1: antikropp Sammanfattning. De utspädningar, kloner och fluorokrom konjugationer för relevanta antikroppar och livskraft färgämnen indikeras. Den optimala utspädningen kan variera beroende på experimentella förhållanden och mycket kvaliteten på produkten. Primära BV421-konjugerad L138D7 klon på 1:20 utspädning visade jämförbar CXCR5 upptäckt kapacitet med biotin-konjugerad 2 g 8 klon på 1:50 utspädning. Därför primär-konjugerad L138D7 kan användas som alternativ till biotin-konjugerad 2 g 8 klon.
Figur kompletterande 1 (S1): alternativa gating strategier för TFH och GC B celler. (A) Live PP lymfocyter från en 3 månader gammal mus på C57BL/6 bakgrund skildras. (B-C) GC B-celler är gated som CD38– GL7+ (B) och BCL-6+ GL7+ B cells (C). (D-E) TFH celler skildras som PD-1Hej CXCR5+ (D) och som ICOS+CXCR5+ CD4 + T celler (E). Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi ett protokoll som optimerats för flöde flödescytometrisk karakterisering av TFH och GC B-cellerna. En av de stora fördelarna med våra protokoll är att det möjliggör isolering av upp till 107 (genomsnitt 4 – 5 x 106 celler) totala PP celler från en enda mus (C57BL/6 stam) utan någon matsmältningen. Vi observerade att summacell avkastningen var positivt korrelerade med antalet PPs och kunde beräknas från följande enkla ekvation som är till hjälp för experimentell planering ”: totala PP cell count per mus = 0,5 – 1 x (antal exciderad PP per mus) x 106”. Denna hög cell avkastning kompletterades med förbättrad cellernas viabilitet (> 95%). Förbättrad cell återhämtning och lönsamheten tillåts utföra flöde flödescytometrisk analys av olika lymfocyter delmängder i PPs med olika antikroppen färgning paneler parallellt.
Jämfört med en nyligen PP isolering protokoll publiceras av De Jesus et al. 20 och tidigare rapporter19,21, våra protokoll gav betydligt högre summacell avkastning och lönsamhet, trots avsaknad av matsmältningen med kollagenas. Även om identifiering av PPs kan vara ”svårt” för första gången utredarna, inlärningskurvan för detta protokoll är ganska brant, och om behärskar, vår teknik tillåter identifiering och kirurgisk excision av PPs från tunntarmen i en kort tid. Om önskat PP antal inte uppnås efter det första försöket, föreslår vi upprepa steget PP identifiering med fokus på den distala och proximala änden av SI. I vår praktik, nästan i varje mus, var två nära ligger PPs i duodenal slutet (figur 1A) och minst 2 – 3 PPs inom de senaste 5 cm från ileum detekterbar.
TFH färgning kan vara mer krävande än andra cell undergrupper inom PPs, vilket kräver extra uppmärksamhet18. Om vissa steg missas under vävnad behandling och cell isolering, kan resultaten vara ganska missvisande. Därför föreslår vi forskare att uppmärksamma följande experimentella ”tips”. Sedan nyckel TFH och GC B cell markörer såsom CXCR5 och GL7 kan uttryckas i både T och B celler, är det viktigt att inkludera en B-cell markör i antikropp paneler för att undvika falskt positiva resultat på grund av det kontaminerande CD19+CD4+ DP celler24 ( Figur 2). Observera att gating strategier baserat på T-cells markörer bara25 inte ger tillräcklig uteslutandet av DP celler eftersom dessa celler uttrycker också mycket T-cells markörer inklusive CD3 (inga data anges) och CD4. Förutom undantag av DP celler, flöde flödescytometri resultat bör valideras och bekräftat genom att anställa lämpliga negativa kontroller (t.ex., isotyp kontroller, ram av ömsesidiga åtaganden). Inte bara falsk positivitet men också felplacerade TFH gate kan leda till felaktiga resultat och slutsatser. Justering av TFH gate kunde ibland vara en utmaning speciellt om TFH cell befolkningen inte riklig, därmed inte visas som en diskret befolkning i flödescytometri. Att kringgå denna begränsning, tillägg av flera TFH markörer (t.ex., BCL-6, PD-1, ICOS) till antikropp panel kan ge alternativa Usenets möjligheter och öka noggrannheten26. Av praktiska skäl befanns BCL-6 vara en idealisk Co färgning markör för alternativa TFH gating eftersom den kan användas för gating GC B celler samtidigt16 (Figur S1C).
Dessutom kunde med ett positivt kontrollprov innehållande en hög andel TFH ge forskare bra navigering för att placera TFH gate korrekt. I våra försök har vi använt PP prover från åldern möss (äldre än 6 månader) som positiv kontroll eftersom vi har funnit att åldrande orsakar förbättring av TFH celler inom PPs upp till 40% av totala CD4 celler+ T i steady-state (inga data anges). Vi uppmuntrar också forskare som har ytterligare intresse för tekniska Detaljer för TFH färgning för att titta på metoderna i publicerade protokollet boken för TFH cell färgning18.
Testa experimentella hypoteser i PP kan vara relativt utmanande och kan kräva ett mycket stort antal möss per grupp att nå statistisk signifikans21. Genom att utnyttja den höga cell avkastningen av våra protokoll, kringgås vi detta hinder med följande experimentella strategier. Först vi censurerade PPs och sorterade dem separat beroende på deras anatomiska ursprung (t.ex., duodenalsår, jejunal och ileal). Sedan fördelat vi jämnt dessa poolade PPs i olika experimentella och kontrollgrupper. Denna internt kontrollerade experimentella strategi gjorde det möjligt att minimera den interindividuella skillnaden i möss medan alla celler erhölls från en enda mus.
Dessutom variabilitet mellan olika intestinala fack (t.ex., tolvfingertarmen vs. ileum)-tidigare rapporterats vara betydande2 — hindrades som experimentell och kontrollgrupper bestod från ett lika stort antal PPs per anatomiska regionen (figur 5A),. Genom att utföra replikat av oberoende experiment med samma strategi, förbättrat vi tillförlitligheten och betydelsen av våra resultat. Förutom att eliminera ospecifik variationer, hjälper denna metod också reservdelar möss, reagenser och tid.
Under utveckling och optimering av våra protokoll visade våra resultat att kollagenas II och IV-baserade matsmältningen minskade påfallande CXCR5 uttryck (figur 5B) medan andra ytan molekyler för att upptäcka TFH och GC B-cellerna förblev intakt) Figur 5 c -E) . I en nyligen rapporterad JoVE protokoll19, kollagenas II visade sig vara mycket effektiv för lymfocyter isolering från PPs och LPs. Dock har kollagenas II tidigare rapporterats ha en hög tryptic aktivitet, vilket resulterar i klyvning av flera ytan molekyler. Med tanke på dess yta-molekyl vänlig natur27 på grund av den lägre tryptic aktivitet och vanligare användning i litteratur28,29,30, kollagenas IV hade också varit ingår förutom kollagenas II i vår studie och används i koncentrationerna som rekommenderas i dessa tidigare rapporter. Användning av kollagenas och motsvarande enzymer har varit en motsägelsefull fråga i slemhinnor immunologi på grund av de oönskade effekterna av matsmältningen om immunceller som ändras ytan molekyl uttryck31,27.
Tidigare rapporterades det att användningen av olika typer av kollagenas kan störa flödet flödescytometrisk CXCR5 upptäckt inom mänskliga tarmen32 och tonsill prov18. Omvänt, andra studier visat isolering av TFH och GC B celler från PPs utan användning av kollagenaser24,33. Men fram till nu ingen jämförande förhållningssätt hade gjorts för att bedöma om inbegripandet eller uteslutandet av kollagenas matsmältningen skulle innebära den optimala villkoren för isolering av CXCR5-uttryckande TFH celler från murina PPs. mus CXCR5 är en 374 aminosyra långa sju-pass membranprotein med relativt kort extracellulära regioner jämfört med andra transmembrana proteiner såsom CD4, CD19 som tydligt uttrycks i lymfoida celler i PPs (uppgifter som erhållits från UniProt). I figur 8A-B, molekylär modell och totala aminosyrasekvens mus CXCR5 skildras med den förmodade mål sekvenser av kollagenas-baserade matsmältning, som tenderar att dissociera kemiska bindningar mellan glycin (Gly) och neutral aminosyror syror34. De sju-pass transmembrana molekylstruktur resulterande kort extracellulära domänerna kan ansvara för att göra CXCR5 molekyl sårbara för enzymatisk nedbrytning (figur 8A). Spännande, hittade vi att detektion av CXCR5 uttryck efter kollagenas behandling är beroende av antikropp klonen används. Även om 2 g 8 och L138D7 kloner visade liknande prestanda i gruppen osmält PP som bestäms av detektion av jämförbara TFH fraktioner, i gruppen smält PP L138D7 klon avslöjade cirka 3 x (≈ 9%) högre bråkdel av TFH celler inom CD4+ T-celler än de 2 g 8 klon (≈ 3%) (Figur 6). Detta fynd tyder på att minskad CXCR5 färgning kan vara sekundärt till modifierade tredimensionella epitop konfigurationen av den enzymatiska aktiviteten av kollagenas. Våra resultat tyder att kollagenas-baserade matsmältningen måste undvikas under PP beredning.
Inblandning av kollagenas dissociation med CXCR5 molekyl upptäckt kringgicks genom att utesluta steget matsmältningen. Det bör dock noteras att för vissa vävnader såsom LP, mekaniska störningar är inte tillräckligt att isolera cellerna och för sådana vävnader, enzymatisk nedbrytning vore krävs19. I framtiden kommer det vara nödvändigt att testa alternativa matsmältningen villkor samt matsmältningen-kompatibel antikropp kloner att kringgå denna tekniska begränsning för vävnader som kräver enzymatisk matsmältningsprocess. Tills dess förblir avbildningstekniker såsom immun fluorescensmikroskopi som metoden för val av TFH upptäckt i dessa vävnader. Förutom att isolera LP celler, kräver isolering av vissa hematopoetiska celler undergrupper såsom DCs och plasma celler från PPs enzymatisk nedbrytning35. När anställa våra protokoll, bör forskare som önskar att isolera dessa cell delmängder från PPs omfatta lämpliga enzymatisk nedbrytning steg20. Eventuell inblandning av enzymatisk nedbrytning med uttryck för DC markörer bör beaktas och matsmältningen villkor bör optimeras efter behov. När isolering av TFH och GC B celler önskas förutom en cell delmängd som kräver kollagenas matsmältningen36, PPs samlas in från varje mus kunde avskiljas i två grupper för bearbetning med och utan kollagenas behandling i parallella paneler.
Effekterna av kollagenas på PP lymfocyter var inte begränsade till ytan molekyl uttryck. Våra resultat visade att enzymatisk nedbrytning orsakas en relativ minskning av lymfocyter andel inom PP celler på ett dosberoende sätt (figur 7). Minskningen av andelen lymfocyter kan vara en följd av kollagenas-medierad frisättning av andra typer av hematopoetiska celler delmängder som fagocyter och DCs från PPs som är större och mer detaljerad än lymfoida celler. Det är också möjligt att kollagenas matsmältningen medierad cell release från närliggande LP och intraepitelial fack kan bidra till förändringen av FSC-SSC profil. Denna cell kontaminering från andra gut fack kan också orsaka störningar i flödet analysen av PP lymfocyter. Som utgångspunkt för att maximera cell renhet, undvika vi också tillägg av reagens såsom EDTA eller DTT som ofta används för att extrahera epitelceller och slem20, att hålla vävnad förberedelse villkor som fysiologiska och omanipulerat som möjligt. Trots dessa negativa effekter av enzymatisk nedbrytning upptäcktes också positiva effekter på PP lymfocyter såsom förbättring av intracellulära färgning och cellernas viabilitet (figur 7 d-F, G). Dock ytterligare visade analyser att dessa effekter tillskrevs agitation processen vid 37 ° C oberoende av enzymatisk nedbrytning eftersom cellernas viabilitet och intracellulära Foxp3 färgning gynnades i jämförbar utsträckning när celler var upprörd i avsaknad av kollagenas. Slentrianmässigt, kan den positiva effekten av agitation bero på förbättrad borttagning av tarmens innehåll och slem från PPs.
Sammanfattningsvis har vi beskrivit ett strömlinjeformat protokoll för isolering av lymfocyter från PPs. isolerade celler kan färgas för flöde flödescytometrisk karaktärisering av flera cell delmängder eller kan vara utsätts för cellen sortera och därefter anställd i olika in vitro- och i vivo funktionella analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter förklarade.
Acknowledgments
Vi skulle vilja tacka Laura Strauss och Peter salvia för bra diskussioner och stöd med flödescytometri flödesanalyser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD4 antibody | eBioscience, Biolegend* | 17-0041-81 ,10054* | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CD19 antibody | eBioscience | MA5-16536 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse PD-1 antibody | eBioscience | 61-9985-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse ICOS antibody | eBioscience | 12-9942-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse GL7 antibody | Biolegend | 144610 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CXCR5 antibody | Biolegend*, BD Bioscience | 145512*, 551960 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse BCL-6 antibody | Biolegend | 358512 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse Foxp3 antibody | eBioscience | 17-5773-82 | For detailed information see Table 1 |
| Streptavidin-BV421 | BD Bioscience | 563259 | For detailed information see Table 1 |
| FixableViability Dye | eBioscience | L34957 | For detailed information see Table 1 |
| 7AAD | Biolegend | 420404 | For detailed information see Table 1 |
| FcBlock (CD16/32) | BD Bioscience | 553141 | For detailed information see Table 1 |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 6-well,12-well & 96-well plates | Falcon/Corning | 353046,353043/3596 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 10 mL syringe-plunger | Exel INT | 26265 | |
| RPMI | Corning | 15-040-CV | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Orbital shaker | VWR | Model 200 | |
| Curved-end scissor | |||
| Fine Serrated Forceps | |||
| Small curved scissor |
References
- van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPα interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer’s patches: Organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).
- Heel, K. A., McCauley, R. D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. Review: Peyer’s patches. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 122-136 (1997).
- Fagarasan, S., Kinoshita, K., Muramatsu, M., Ikuta, K., Honjo, T. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413 (6856), 639-643 (2001).
- Hopkins, S. A., Niedergang, F., Corthesy-Theulaz, I. E., Kraehenbuhl, J. P. A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer’s patch dendritic cells. Cellular Microbiology. 2 (1), 59-68 (2000).
- Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches. Infection and Immunity. 71 (1), 504-509 (2003).
- Sato, A., Iwasaki, A. Peyer’s patch dendritic cells as regulators of mucosal adaptive immunity. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1333-1338 (2005).
- Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Y. Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways. Annals of the New York Academy of Sciences. 1247 (1), 97-116 (2012).
- Fagarasan, S., Kawamoto, S., Kanagawa, O., Suzuki, K. Adaptive Immune Regulation in the Gut: T Cell-Dependent and T Cell-Independent IgA Synthesis. Annual Review of Immunology. 28, 243-273 (2010).
- Hase, K., et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH + bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).
- Wu, H., et al. An Inhibitory Role for the Transcription Factor Stat3 in Controlling IL-4 and Bcl6 Expression in Follicular Helper T Cells. Journal of Immunology. 195 (5), 2080-2089 (2015).
- Vinuesa, C. G., Tangye, S. G., Moser, B., Mackay, C. R. Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity. Nature Reviews Immunology. 5 (11), 853-865 (2005).
- Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal Centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
- Vaeth, M., et al. Store-Operated Ca2+Entry in Follicular T Cells Controls Humoral Immune Responses and Autoimmunity. Immunity. 44 (6), 1350-1364 (2016).
- Meli, A. P., et al. The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance. Immunity. 45 (4), 831-846 (2016).
- Fu, W., et al. Deficiency in T follicular regulatory cells promotes autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 815-825 (2018).
- Espéli, M., Walker, J. M. T follicular helper cells - Methods and Protocols. , (2015).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visual Experiments. (111), e54114 (2016).
- De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer’s Patches. Journal of Visual Experiments. (73), e50167 (2013).
- Pastori, C., Lopalco, L. Isolation and in vitro Activation of Mouse Peyer’s Patch Cells from Small Intestine Tissue. Bio-protocol. 4 (21), e1282 (2014).
- Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. Journal of Visual Experiments. (58), 3225 (2011).
- Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).
- Bollig, N., et al. Transcription factor {IRF4} determines germinal center formation through follicular T-helper cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Science of U. S. A. 109 (22), 8664-8669 (2012).
- Pérez-Mazliah, D., et al. Follicular Helper T Cells are Essential for the Elimination of Plasmodium Infection. EBioMedicine. 24, 216-230 (2017).
- Sage, P. T., Sharpe, A. H. T follicular regulatory cells in the regulation of B cell responses. Trends Immunology. 36 (7), 410-418 (2015).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. Journal of Immunological Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
- Meenan, J., et al. Altered expression of alpha 4 beta 7, a gut homing integrin, by circulating and mucosal T cells in colonic mucosal inflammation. Gut. 40 (2), 241-246 (1997).
- Cao, A. T., et al. Interleukin (IL) -21 promotes intestinal IgA response to microbiota. Mucosal Immunology. 8 (5), 1072-1082 (2015).
- Wei, J., et al. Autophagy enforces functional integrity of regulatory T cells by coupling environmental cues and metabolic homeostasis. Nature Immunology. 17 (3), 277-285 (2016).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. 33 (S1), (2017).
- Bergqvist, P., Gardby, E., Stensson, A., Bemark, M., Lycke, N. Y. Gut IgA Class Switch Recombination in the Absence of CD40 Does Not Occur in the Lamina Propria and Is Independent of Germinal Centers. Journal of Immunology. 177 (11), 7772-7783 (2006).
- Keil, B., Gilles, A. M., Lecroisey, A., Hurion, N., Tong, N. T. Specificity of collagenase from Achromobacter iophagus. FEBS Letters. 56 (2), 292-296 (1975).
- Mora, J. R., et al. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer’s patch dendritic cells. Nature. 424 (6944), 88-93 (2003).
- Reboldi, A., et al. Mucosal immunology: IgA production requires B cell interaction with subepithelial dendritic cells in Peyer’s patches. Science. 352 (6287), (2016).
