Summary
Bu çalışmada, biz bir roman ve lenfositlerin izolasyonu için etkili iletişim kuralı Peyer's yamalar (PPs), daha sonra in vivo ve in vitro fonksiyonel deneyleri için hem de akış sitometrik çalışmalar foliküler t kullanılabilir sunmak yardımcı ve germinal Merkez B hücreleri.
Abstract
Bağırsak mukoza bağışıklık hücreleri bağışıklık toleransı aynı anda patojenlere karşı bağışıklık savunma veriyor ise teşvik benzersiz bir immünolojik varlık oluşturmaktadır. De Peyer's yamalar (PPs) önemli bir rol mukozal bağışıklık ağ çeşitli efektör T ve B hücre alt kümeleri barındırarak sahip kuruldu. Bu efektör hücreleri, foliküler T helper (TFH) ve germinal Merkez (GC) B hücreleri belirli bir kısmını humoral bağışıklık Yönetmelikte professionalized. Bu nedenle, farklılaşma programı ve fonksiyonel özellikleri açısından bu hücre alt kümeleri-PPs içinde karakterizasyonu mukozal bağışıklık hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. Bu amaçla, PPs lenfosit izolasyon kolayca uygulanabilir, verimli ve tekrarlanabilir bir yöntemin araştırmacılar için değerli olacaktır. Bu çalışmada, lenfositler yüksek hücre verim ile fare PPs dan izole etmek için etkili bir yöntem oluşturmak amaçlanmıştır. Bizim yaklaşım o ilk doku doku ajitasyon ve sindirim reaktifler kullanımı gibi işleme ortaya hem de hücre boyama koşulları ve antikor paneller yelpazesi, kalite ve kimlik izole lenfositler ve üzerinde büyük etkisi var deneysel sonuçlar.
Burada, verimli bir şekilde tekrarlanabilir akış sitometresi tabanlı değerlendirilmesi T ve B hücre alt kümeleri öncelikle TFH ve GC B hücre alt kümeleri üzerinde odaklanarak izin PPs lenfosit nüfus yalıtmak araştırmacılar sağlayan bir protokol açıklayın.
Introduction
Sonunda tüm gastrointestinal sistem başından itibaren daha fazla organ insan ve fare1bağışıklık hücreleri içeren geniş bir lenfoid ağ ile katlı olduğunu. Peyer's yamalar (PPs) teşkil bu hücresel bağışıklık organizasyon, sözde gut ilişkili lenfoid doku (GALT)2,3bağırsak dalı önemli bir bileşeni. PPs, diyet malzemelerden türetilmiş antijenleri milyonlarca binlerce içinde komensal microbiota ve patojenler sürekli örnek ve ne zaman gerekli uygun bağışıklık yanıtı onlara doğru takılı böylece bakımı bağırsak bağışıklık vardır homeostazı. Bu anlamda, PPs "ince bağırsak bademcikler" adlandırılabilir. PPs oluşan büyük alt bölmeler: subepithelial kubbe (SED), büyük B hücreli folikül bölgeleri; üstteki folikül ilişkili epitel (FAE) ve interfollicular bölgesi (IFR) nerede bulunduğu4T hücreleri vardır. İşbirliği için PPs sağlar farklı efektör hücre alt kümeleri benzersiz bu compartmentalization böylece, immunocompetence gut confers.
PPs afferent Lenfleribile eksikliği ve bu nedenle, PPs için ince bağırsak nakli antijenleri lenfoid diğer organları aksine lenf damarları aracılığıyla yürütülmektedir değil. Bunun yerine, FAE, sözde M hücreleri, bulunan özel epitel hücreler luminal antijenleri transfer PPs5içine sorumludur. Daha sonra taşınan antijenleri dendritik hücreler (DC) tarafından toplanır ve fagositler FAE6,7altında subepithelial kubbe (SED) bölgesinde yer alır. Bu antijen sıralama işlemi DCs PP tarafından edinilmiş bağışıklık yanıtı8 ve IgA salgılayan hücreler9sonraki nesil başlatmak çok önemlidir.
Komensal flora ve diyet malzeme ağır antijenik yükü nedeniyle, PPs ana bilgisayar endogenously efektör T ve B hücre alt kümeleri TFH ve IgA+ GC B hücreleri10gibi büyük zenginliği içinde PPs bir sitenin aktif bağışıklık temsil ettiğini düşündüren aktive Yanıt11. Algılama % 20-25'e kadar toplam CD4 TFH hücrelerde+ T hücre bölmesi ve yukarı GC B hücreleri içindeki toplam B hücreleri % 10-15 unimmunized genç C57BL/6 fareler12toplanan PPs mümkündür. Aksine diğer T yardımcı hücresi türleri (i.e., Th1, Th2, Th17 hücreleri), TFH hücreleri B hücre köklerinin öncelikle TFH hücre posta CXCL13 degrade13boyunca teşvik CXCR5 ifade sayesinde içine benzersiz tropism gösterir. PPs B hücre folikül bölgelerinde, IgA sınıf anahtar rekombinasyon ve içinden14yüksek afinite IgA üreten hücreleri ayırt aktif B hücrelere somatik Hipermutasyon TFH hücreleri neden. Daha sonra bu antikor salgılayan plazma hücreleri lamina propria (LP) göç ve gut10bağışıklık homeostazı düzenler.
TFH ve GC B hücre popülasyonlarının PPs içinde malzemelerin kimlik ve humoral bağışıklık yanıtı zaman alıcı bağışıklama modelleri gerek kalmadan kararlı durum koşullarda dinamikleri araştırmak araştırmacılar etkinleştirmek geleneksel olarak kullanılan TFH-GC B hücre çalışmaları15,da16,17,18. PPs hücrelerde TFH çözümlemeleri diğer hücre alt kümeleri olarak kadar basit değil. Teknik sorunlar ideal doku hazırlık koşulları, yüzey antikor-marker kombinasyonu, tanımlama yanı sıra uygun pozitif ve negatif denetimleri seçme içerir. TFH ve PP araştırma alanları deneysel prosedürler açısından büyük değişkenlik gösterir ve uzak veriyor çeşitli nedenlerden dolayı standart iletişim kuralları kurmak için bir fikir birliği vardır. İlk olarak, PPs içindeki her hücre alt doku hazırlık koşulları daha da bir hücre alt özgü şekilde değişiklik yapılmasını gerektiren differentially etkilenecek eğilimindedir. İkinci olarak, detayları hücre hazırlık üzerinden üçüncü PPS, karşılaştırmalı çalışmalar iletişim kuralı-based araştırma ideal doku hazırlama teknikleri ve deneysel koşullar sayısı hakkında bildirilen yöntemler arasında önemli bir tutarsızlık var s ve TFH için araştırma oldukça sınırlı kalıyor.
PP hücre hazırlık19,için20,21,22 önerdi mevcut iletişim kuralı-based çalışmalar TFH - ya da GC B hücre yönelik değildi. Ayrıca, PPs19,20 collagenase tabanlı sindirim gibi için önerilen bazı doku hazırlık koşullar TFH tespiti sonucu akış sitometresi tarafından olumsuz yönde etkileyecek bulunmuştur18. Bu temelde, TFH ve GC B hücre dinamiği içinde PPs çalışma için kullanılan bir en iyi duruma getirilmiş, standart ve tekrarlanabilir protokol bu konu üzerinde çalışan araştırmacılar için değerli olacağını gerekçeli. Bu ihtiyacı bize yalıtım ve ince hücresel kurtarma, canlılık ve verimlilik akış sitometrik karakterizasyonu birkaç T ve B için en iyi şekilde PP lenfositler karakterizasyonu için geliştirilmiş ve güncel bir protokol oluşturmak için bir ivme verdi hücre alt kümeleri. Biz de önceki Protokoller'de, böylece, önerilen birkaç zahmetli hazırlık adımları dışlamak için gerekli işlemler ve doku ve hücre hazırlık PPs dan için zamanı azaltmak amaçlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm çalışmalar ve deneyler bu protokol için açıklanan kurallarına göre kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Beth Israel Deaconess Tıp Merkezi altında yapılmıştır.
1. deneysel Set-up ve fare grupları tasarlama
- (İsteğe bağlı) Deneysel fareler gut microbiota deneysel fareler arasında yatay iletimini kolaylaştırmak ve PP lenfositler içinde non-spesifik değişkenliği azaltmak için ortak ev. Ayrıca, littermate denetimleri aynı cinsiyet farklılıklarına en aza indirmek için kullanın.
2. cerrahi eksizyon ve doku hazırlık adımları:
- Cerrahi kaldırma ince bağırsak (sı)
- CO2 boğulma veya kurumsal hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmış eşdeğer herhangi bir yöntemi kullanarak fare ötenazi.
- Fare cerrahi eksizyon için özel bir alan aktarın. Arka yerleştirin ve karın % 70 etanol ile sterilize. Laparatomi karın deri ve periton apış arasından orta hat için böylece peritoneal kavite açılış göğüs kafesi boyunca keserek gerçekleştirin.
Not: ilk kesi periton boşluğuna delici ve bağırsak doku zarar önlemek için cilt nispeten küçük bir alan üzerinde gerçekleştirin. Eksizyon istenen anatomik sınır kadar devam edin. - İnce bağırsak distal parçasını oluşturan terminal ileum tespiti için ideal bir dönüm noktası caecum tanımlayın.
Not: Caecum genellikle fare karın sol alt tarafında yer alır. - İleocaecal kavşak kesin olarak belirlemek ve bu düzeyde bir kesim olarak distal ince bağırsak caecum ayırmak mümkün olduğunca olun. Kırılgan PPs kolayca dokunmatik daraltmak için sonraki adımlar barsak duvarında aşırı fiziksel temastan kaçının.
- Yavaşça tüm ince bağırsak kadar pilor sfinkter makas kullanarak bıçaklanmasından keserek çıkarın. Mide ve duodenum arasında kavşak tanımlamak ve duodenum bağırsağın karın boşluğu üzerinden müfreze tamamlamak için yol açacak bu düzeyde makasla kesme.
Not: (i) hyperextension bubağırsak duvarının yırtılması neden önlemek. (II) LP lenfosit yalıtım PP lenfositler ek olarak isterseniz, mezenterik yağlı tümüyle kaldırılmasını gereklidir. Ancak, sadece PP yalıtımı için mezenterik yağlı kalan bazı faydaları daha fazla yalıtım adımları uyguladığınızda sağlayabilir; Bu nedenle, korunmalıdır. - Müstakil küçük bağırsak soğuk RPMI + % 10 fetal Sığır serum (FBS) ile dolu bir 6-şey tabak yerleştirin ve hafifçe dokular tüm bağırsak kesimleri soğuk ortamda batık kadar el ile tahrik. Sonraki adımları boyunca buzda doku korumak.
- Fare küçük bağırsak için istediğiniz sayıyı dissekan sonra PP eksizyon için toplanan küçük bağırsak devam edin.
- Cerrahi eksizyon PPs ve tek hücre süspansiyon hazırlanması:
- Yavaşça forseps kullanarak mezenterik yağlı sürükleyici bir kağıt havlu üzerinde ince bağırsak aktarmak ve mezenterik yüzü kağıt havlu bakacak şekilde yerleştirin. Bütün bağırsak segment soğuk RPMI + % 10 ile nemlendirin FBS doku dehidratasyon ve yapışkanlık önlemek için.
Not: yağ dokusu kesimleri sı mezenterik sitede yukarı dönük olacak şekilde Anti-mezenterik site tutmak kağıt havlu için sopa olacak çünkü mezenterik yağlı kalan bu aşamada yardımcı olabilir. - "Karnabahar benzeri" şekil barsak duvarında Anti-mezenterik tarafındaki beyaz çok loblu toplamları olarak görünür PPs tanımlayın.
Not: tüm PPs eksize kadar luminal içerik dışarı Flushing tavsiye edilmez. Luminal içeriğini boşaltma PPs çöküşü neden olabilir ve renk karşıtlığını PPs ve PPs görsel tanımlaması için çok yararlıdır barsak duvarında arasındaki engeller. - PPs Anti-mezenterik tarafında belirledikten sonra cerrahi kıvrık uçlu makas PPs üzerinde yerleştirin (eğri yüzleşmek) PP onun distal ve proksimal sınırdan yasaklama.
İsteğe bağlı: PP bir parmak ucu kullanarak makas bıçakları doğru yavaşça itin. Bu manevra s doku çevreleyen daha iyi dışlama için yol açacaktır. PPs yavaşça, çevreleyen bağırsak dokusu hariç tüketim.
Not: (i) bu adımı LP ve bağırsak epiteli, Ayrıca T hücrelerinde zengin gibi bağırsak bölmeleri komşu gelen hücre kirlenme en aza indirirken maksimal PP hücre verim elde etmek çok önemlidir. (II C57BL/6 fare eksize bir SI), 5-10 PPs (ortalama boyutu, çok loblu) toplanabilir. Daha da küçük PPs (değil çok loblu), toplama ilâ amaçlayan tarafından 12-13 PPs fare (C57BL/6) başına bu iletişim kuralını kullanan mümkün. - 12-iyi doku kültürü plaka eksize PPs aktarmak dolu buz gibi RPMI + %10 FBS ve bakımı üzerinde buz forseps veya eğri cerrahi makas kullanarak.
Not: (i) hemen sonra eksizyon, PPs, mukus ve bağırsak içeriği s yüzeyi doku yavaşça bir kağıt havlu üzerinde sürtünme tarafından temizlenebilir. Bu adımı PP lenfositler canlılığı geliştirmemize yardımcı olacaktır. (II) bir tabağa PPs aktarma yerine, ayrılmış tüpler aktarılması da toplam örnek sayısı bağlı olarak kabul edilebilir. - İsteğe bağlı: PP eksizyon ve iyi plaka içine sonraki yerleştirme tamamlandığında, farklı deneysel/fare gruplardan toplanan PPs boyutunu ve sayısını PPs içeren doku kültürü plaka resmini alarak hepsinin belgesi var.
- 50 mL konik tüpler RPMI + %10 25 mL ile dolu bir dizi hazırlamak FBS (37 ° C'de önceden ısındı). Makas kullanarak, 1.000 µL bahşiş kenarına PPs 1 mL pipet ile aspirasyon sağlayacak mesafeden kesti. PPs 1 mL pipet ile Aspire edin ve hazırlanan 50 mL konik tüpler için 12-iyi doku kültürü plaka aktarabilirsiniz.
Not: her fare örnek için yeni bir uç örnekler arasında çapraz bulaşma önlemek için kullanın. - Kapağı güvenli ve tüpler bir orbital çalkalayıcı-37 ° C'de 10 dakika için 125-150 rpm sürekli ajitasyon ile dikey olarak yerleştirin. Bu arada, 50 mL tüpler yeni bir dizi hazırlamak ve bir 40 µm hücre süzgeç hangi aracılığıyla tek hücre süspansiyon hazırlanacak her tüpün üstünde yer.
Not: (i ajitasyon adım-ecek çıkarmak kalan bağırsak içeriği, mukus ve hücre artıkları, hangi hücre canlılığı ve kurtarma PP lenfositlerin azaltmak değil kaldırıldı. (II) sindirim süreci dramatik CXCR5 ifade hücre yüzeyine gelen kaybolmasına neden çünkü sindirim enzimleri her türlü PP doku üzerinde uygulanmaz. - Ajitasyon sonra PPs yeni hazırlanan konik 50 mL tüpler üstüne yerleştirilen 40 µm hücre süzgeç aktarın. 10 mL şırınga dalgıç yuvarlak yan kullanarak, yavaşça PPs tek hücre süspansiyon oluşturmak için hücre süzgeç aracılığıyla bozabilir. 15-20 mL soğuk RPMI + % 10 ile süzgeç durulama FBS.
Not: filtre (i) uygulamadan önce PPs yatay olarak içeren tüpler sallamak. Bu kısa shake PPs transfer içine hücre süzgeçler kolaylaştıracaktır. (ii) lenfoid bağışıklık hücreleri yalıtım için 70 µm hücre süzgeç kullanarak (Örn., monositler, makrofajlar, DCs) önerilir. - Tek hücre süspansiyonlar, 350-400 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi
- Dikkatle süpernatant atın ve 10 x 106 hücre/mL bir konsantrasyon hücreleri resuspend. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
Not: hücre sayımı (i) önce için her fare s grubu için toplam cep numarası yaklaşık olarak aşağıdaki formülü kullanarak tahmin edilebilir: "0.5-1 x 106 hücreler (PPs sayısı) x Toplam hücre sayısı =". Trypan hücre sayımı için mavi ile daha fazla dilutions gerekli olabilir. (II) elle sayım alternatif olarak otomatik hücre sayaçları kullanabilirsiniz. - 2-2. 5 x 106 hücreler uygun toplu aktarım (Örn., 200 µL) bir 96-şey yuvarlak-alt plaka içine.
Not: tek renkli ve negatif kontrol örnekleri için 0.5-1 x 106 hücreler yeterli olabilir. - 350 x g 4 ° C'de 5 min için plaka santrifüj kapasitesi Plaka fiske.
- Boyama arabelleği 200 µL hücrelerde yıkayın.
- Yavaşça forseps kullanarak mezenterik yağlı sürükleyici bir kağıt havlu üzerinde ince bağırsak aktarmak ve mezenterik yüzü kağıt havlu bakacak şekilde yerleştirin. Bütün bağırsak segment soğuk RPMI + % 10 ile nemlendirin FBS doku dehidratasyon ve yapışkanlık önlemek için.
3. yüzey antikor boyama
- Canlılığı boyama:
- Son yıkama sonra PBS (1:1, 000) seyreltilmiş tamir edilebilir canlılığı boya 100 μL hücrelerde resuspend. Buz üzerinde veya karanlıkta 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya.
Not: (i) hücre içi anahtar transkripsiyon tespiti için boyama Foxp3 gibi faktörler veya hücreleri fiksasyonu Bcl-6 gerektirir. Bu durumda, düzeltilebilir canlılık Boyayıcılar (Örn., 7-AAD, DAPI) kullanılamaz. (ii) düzeltilebilir canlılığı boya sulandırmak için protein içeren herhangi bir boyama arabelleği kullanmayın. Bu adımda kullanılan ortam protein ücretsiz olmalıdır. (iii) dışlama boyama canlılık kullanarak ölü hücreleri çok önemli çünkü ölü hücreleri Akış Sitometresi Analizi autofluorescence yayan ve nonspecifically, yüzey antikorlar bağlama false olarak yol açabilecek ciddi teknik sorunlar neden olabilir olumlu sonuçlar. - Hücreleri iki kez tampon boyama ile yıkayın. 4 ° C'de 5 min için 350 x g, santrifüj Plaka fiske.
- Son yıkama sonra PBS (1:1, 000) seyreltilmiş tamir edilebilir canlılığı boya 100 μL hücrelerde resuspend. Buz üzerinde veya karanlıkta 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya.
- FC blok ve yüzey - ı: katman
- Fc-blok çözüm anti-CD16/32 antikor (1: 200) arabellek boyama sulandrarak hazırlayın.
- Hazırlanan Fc-blok çözüm 20 μL hücrelerde resuspend. 15 dakika buz üzerinde kuluçkaya.
- Çamaşır olmadan, yüzey antikor kokteyl 80 μL (bkz. Tablo 1 Özet antikor için) uygun dilutions hazır ekleyin. En az 30 dakika buz üzerinde kuluçkaya.
- İki kez aşırı boyama arabelleği ekleyerek yıkayın. 4 ° C'de 5 min için 350 x g, santrifüj Plaka fiske.
- Yüzey - Katman II:
- Streptavidin boyama çözüm fluorochrome Birleşik Streptavidin boyama arabelleği sulandrarak hazırlayın.
- Son yıkama sonra çözüm boyama öncesi seyreltilmiş Streptavidin (1: 100) 100 μL hücrelerle resuspend. En az 15 dakika karanlıkta buz üzerinde kuluçkaya.
- İki kez tampon boyama ile yıkayın. 4° C'de 5 min için 350 x g, santrifüj Plaka fiske.
İsteğe bağlı: hücre içi foliküler düzenleyici T hücre algılama için boyama, son yıkama sonra istenmiyorsa tampon ve akış sitometresi verileri elde etmek için transfer uygun tüpler içine boyama 200 μL hücrelerde resuspend. Örnekleri sabit değildir zaman, veri akış sitometresi tarafından edinimi içinde 3-4 h-doğru sonuçlar elde etmek için yapılmalıdır.
4. hücre fiksasyon
- Fiksasyon/permeabilization (düzeltme/Perm) çalışma çözüm Foxp3/transkripsiyon faktörü boyama arabellek kümesi'nden reaktifler kullanarak hazırlayın. Fiksasyon/permeabilization tek parça konsantre fiksasyon/permeabilization için istenen son hacim Dilüent üç bölümden karıştırın.
- Son yıkama sonra düzeltme/Perm çalışma çözüm 200 μL hücrelerde resuspend.
- Plaka buz üzerinde veya 20 dk için 4 ° C'de kuluçkaya. Bu adım için 20 dk fazla olamaz. Daha uzun kuluçka süresi ciddi hücre kurtarma düşürebilir.
- 4 ° C'de 5 min için 350 x g, santrifüj Plaka fiske. (İsteğe bağlı) Bu adımdan sonra birkaç gün içinde sığır serum albumin (BSA) içeren bir arabellek boyama 4 ° c sabit hücreleri depolanabilir veya sonraki hücre içi boyama veya akış sitometresi edinme kadar FBS.
- Permeabilization arabellek taze önceden arıtılmış deiyonize suyla seyreltik (x1) 200 μL hücrelerde resuspend.
- 350 x g (RT) Oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi.
- Bir kez permeabilization arabellek ve RT., 5 min için 350 x g, santrifüj 200 μL yıkayın
5. hücre içi boyama
- Fc-blok çözüm permeabilization arabellekte anti-CD16/32 antikor (1: 200) sulandrarak hazırlayın.
Not: fiksasyon adımdan sonra hücreleri hücre içi boyama işleminin sonuna kadar permeabilization arabellekte sürdürülmelidir. - Son yıkama sonra Fc-blok çözüm 20 μL hücrelerde resuspend. RT, 10-15 dk içinde belgili tanımlık karanlık için kuluçkaya.
- Çamaşır olmadan, hücre içi antikor kokteyl (100 μL son hacim) permeabilization arabellekte önceden seyreltilmiş 80 μL ekleyin. 30 dk RT. az için kuluçkaya
- Perm arabellek ve santrifüj 100 μL RT., 5 min için 350 x g ekleyin
- Bir kez permeabilization arabellek 200 μL ile yıkayın, 350 x g RT., 5 min için de santrifüj kapasitesi
- Son yıkama sonra arabellek boyama 200 μL hücrelerde resuspend ve uygun tüpler (son hacmi 400 μL boyama arabelleği) içine hücreleri transfer ve veri akış sitometresi tarafından elde. 96-şey plaka lekeli örnekleri bir akış sitometresi ile plaka okuyucu seçeneği kullanılabiliyorsa, tüpler içine aktarmadan da çalıştırabilirsiniz. Bu adımı hücre kaybı hücre aktarımı sırasında en aza indirir.
- En az 5 x 105 toplam hücre TFH, TFR tekrarlanabilir analizini gerçekleştirmek için akış sitometresi üzerinde elde yanı sıra GC B hücreleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir önceki iletişim kuralı20aksine, biz PPs SI eşit olarak dağıtılır değil ancak gösterildiği gibi SI distal ve proksimal sonuna doğru daha yoğun yerelleştirilmiş gözlemledim Şekil 1A. Akış sitometrik çözümleme göstermek doğru izlediyseniz, PP lenfosit Vaha'da ileri tarafı dağılım dağıtım splenocytes (Şekil 2AE ve 2D, H) ile benzer gösterir verir bizim protokolü > % 95 hücre canlılık (Şekil 2B ve 2F). Diğer ikincil lenfoid organlara aksine (SLOs), C57BL/6 farelerde toplam PP lenfositler yaklaşık % 70-80'i oluşur B hücreleri, oysa CD4+ T hücreleri lenfositlerin toplam s (Şekil 2C ve 2 G) sadece 10-%15 oluşturmaktadır.
Unutmayın ki bu CD4+ CD19+ Çift Kişilik pozitif (DP) hücreleri %1 Toplam PP lenfositlerin ≈ oluşturmaktadır. Fc-blok B hücreleri Fc reseptörü karşı performans ve birini, CD4 hariç gibi hücre hazırlık sırasında bazı önlemler ile+ CD19+ DP hücre nüfus-ebil var olmak en aza indirgemek (Şekil 3A ve B). Ancak, ileri dağılım (FSC) özelliklerini birini göstermek değil bir kısmını DPs kaçınılmazdır ve dışarı tek olumlu T ve B hücre kapıları geçişli (Şekil 3B). DP hücreleri içinde B hücreleri CD4 CXCR5 ifadede ayarlanır TFH kapısında yanlış pozitif sonuçlar neden olabilir onların yüzeyi (Şekil 3 c) son derece hızlı CXCR5 temel aldığımız sonuçlar ortaya+ T hücreleri. Öte yandan, biz GL7, bir işaretleyici aktif B hücrelerinin de CD4 içinde ifade bulundu+ CD19+ DP hücreleri (şekil 3D), GC B hücre geçişi ile girişime neden olabilir.
Algoritmalar çoğunluğuna TFH ve GC B hücre örnekleri Şekil 4' te. tasvir edilmektedir GC B hücre geçişi için kullandığımız GL7 GC B hücreleri GL7 tanımlayan CD38 karşı etiketleme+ CD38- B hücreleri (Şekil 4A-B). PNA etiketleme olmak kullanılmış yerine GL723 CD38 bir aşağıdaki işaretleri tarafından değiştirilebilir, ancak: IgD, Bcl-6 ve CD95. Alternatif stratejileri için GC B hücreleri içinde gösterilen çoğunluğuna Şekil S1. GC B hücre oranı PPs içinde C57BL/6 farelerde büyük değişkenlik gösterir. Ancak, diğer SLOs için karşılaştırıldığında, PPs anlamlı olarak daha yüksek GC B hücre oranı 2-%10 toplam B hücre kararlı durum koşullar altında bir dizi var. PP TFH hücreler için strateji çoğunluğuna CD19 anlatılan- CD4+ PD-1Merhaba CXCR5+ T hücreleri (Şekil 4A, C). "Zebra çıkart" discretely diğer Arsa Tipleri (Şekil 4 c) göre PD-1Merhaba nüfus daha fazla gösteriyor gibi TFH geçişi için bir en iyi gösteri yöntemi bulundu. TFR, Foxp3, ifade TFH hücre alt grubunu CD19 kapı- CD4+ PD-1Merhaba CXCR5+ Foxp3+ T hücreleri (Şekil 4 d). GC B hücreleri gibi TFH hücre kesir de toplam CD19% 10-20'si bir dizi unimmunized fare bireylerde değişir- CD4+ PP lenfositler. TFH hücreler için alternatif gating algoritmaları ayrıntılarını Şekil 4E, F ve Şekil S1C, ö. açıklanan
Arka plan boyama ve autofluorescence nedeniyle yanlış pozitif önlemek için izotip veya alternatif eşdeğer denetimleri gibi floresan eksi bir (FMO) boyama panelinde bir negatif kontrol TFH ve GC B hücre işaretleri ( olarak dahil edilmelidir Şekil 4 g-J).
PPs bir bireysel fareden toplanmıştır ve anatomik kökenlerine bağlı olarak ayrı ayrı havuza alınmış bir roman dahili olarak kontrollü deneysel strateji, geliştirdiğimiz koşulları PP doku hazırlık için en iyi duruma getirmek için (Örn., duodenal, ileal). Deneyler yapmak için havuza alınan PPs bireysel gruplarına kadar ki her deneysel ayrıldı ve PPs her anatomik bölge (Şekil 5A) eşit sayıda kontrol grubuna dahil. Bu yaklaşım tarafından o collagenase tabanlı enzimatik sindirim bulduk (37.5 mg collagenase II veya IV test sindirim mix 25 mL 1.5 mg/mL =), çeşitli mukozal doku, önemli ölçüde azaltılmış CXCR5 lenfosit izolasyonu için yaygın olarak kullanılan PP lenfositler (Şekil 5B), özellikle TFH hücrelerdeki ifadede (Şekil 5F-ben), süre diğer yüzey molekülleri ifade (Örneğin., CD19, CD4) sağlam (Şekil 5 C-E) kaldı. CXCR5 algılama azalma CXCR5 collagenase tedavi TFH hücrelerde ifade izotip denetiminden neredeyse ayırt edilemez olduğu kadar önemli (Şekil 5F-ben). Daha fazla deney enzimatik sindirim CXCR5 ifade ile etkileşim düzeyini kullanılan CXCR5 antikor klon üzerinde (6A-F rakam) bağımlı olduğunu gösterdi. Özellikle, collagenase II tedavi CXCR5 antikor klon 2 g 8 algılama kapasitesini daha da önemlisi görme, algılama kapasitesini CXCR5 antikor klon L138D7 (Şekil 6A-D).
Enzimatik sindirim sadece CXCR5 ifade aynı zamanda ileri sergilenen sindirilir PPs ve yan izole hücreler önemli bir kısmını ise FSC-SSC özellikleri tarafından belirlenen s hücrelerin içindeki toplam lenfosit oranı azaltılmış dağılım PP lenfositler daha yüksek bir yoğunluk (Şekil 7A-C). Hücre kurtarma collagenase etkilerini bir doz bağımlı şekilde (şekil 7A, H-J)oluştu. Enzimatik sindirim (Şekil 7 d, E)hücre canlılığı arttı. Collagenase olmadan ajitasyon sonra PPs izole hücreler aynı şekilde tercih çünkü ancak, bu yarar causatively collagenase sindirim için bağlantılı değil (şekil 7F). Genellikle TFR hücreleri tanımlamak için TFH yalıtım sırasında değerlendirilir bu çünkü burada özel ilgi, nükleer transkripsiyon faktörü Foxp3, algılama collagenase sindirim (Şekil 7 g bağımsız olarak 37 ° C'de ajitasyon tarafından geliştirildi ).
Şekil 1: makroskopik yapısı ve fare Peyer's yamalar anatomik dağılımı. (A). bir görüntü elde küçük bağırsak mide ile duodenal ucundan. İki yakından bulunan PPs duodenum içinde siyah oklarla gösterilir. (B). on C57BL/6 fare toplanan PPs ayrı ayrı 12 iyi tabak içinde saklanan. (C). taze eksize fare PPs 40 µm hücre süzgeç üzerinde görüntülenen görüntü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: akış sitometrik karakterizasyonu ve PP lenfositler için temel gating algoritması. (A). nokta araziler taze izole sabitlenmemiş PP lenfositler (D) tasvir splenocytes için büyük benzerlik gösteren FSC ve SSC eksenler boyunca dağılımını göstermektedir. (B). 7AAD ifade yoluyla ölü hücreleri hariç. 7AAD- hücreleri gösteren canlı hücreler. (C). CD19 ve CD4 tabanlı immunophenotyping T ve B hücreleri arasında önceden canlı PP hücrelere geçişli. (E-G). Sabit PP lenfositlerin temsilcisi akışı analizi. (H). sabit splenocytes temsilcisi akışı özellikleri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: CD4+ CD19+ Çift Kişilik pozitif (DP) TFH ve GC B hücre çoğunluğuna içinde neden yanlış pozitif hücreler. (A). CD4+CD19+ DP içinde canlı PP hücreleri lenfositler gösterdi. (B). ayrılık DP hücreleri alan FSC özelliklerine birini ve tekli. (C,D). CXCR5 ve GL7 ifade DP hücre çubuk grafik araziler içinde tasvir edilmektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: temsilcisi TFH ve GC B hücre gating strateji. PPs 3 - ay eski bir fareden toplanmıştır ve lenfositler Protokolü bölümünde açıklandığı gibi izole edildi. (A)CD19 ve CD4 canlı PP lenfositler etiketleme tasvir. (B) CD38lo GL7MerhabaCD19+ B hücreleri GC B hücreleri geçişli. (C) TFH hücreleri geçişli CXCR5+PD-1Merhaba CD4+ hücreleri. (D) TFR hücreleri düzenleyici hücre özgü transkripsiyon faktörü Foxp3 TFH işaretleri ile birlikte ifade TFH hücreleri bir kısmını vardır ve CXCR5 kapı+ PD-1Merhaba Foxp3+ CD4+ T hücreleri. (E-F) TFH için strateji çoğunluğuna yüzey işaretleyicileri splenocytes içinde doğruladı BCL-6 ifade yoluyla NP-OVA-aşı fareden izole. (G-J) Floresans eksi bir (FMO) denetimleri için anahtar TFH-TFR ve GC hücre işaretleri tasvir edilmektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: enzimatik sindirim Collagenase tabanlı CXCR5 algılama büyük bir azalma olur. (A)PPs duodenum (≈ 1/3 proksimal) değişir bulunan 2 aylık fare üzerinden (≈ 1/3 orta) ve ileum (≈ 1/3 distal) toplanmış ve ayrı ayrı havuza alınmış. Havuza alınan PPs eşit deneysel gruplara dağıtıldı. 1.5 mg/mL konsantrasyonu, collagenase II veya IV ile enzimatik sindirim ajitasyon 37 ° C'de 10 dakika ile gerçekleştirildi (B-E) Collagenase tabanlı sindirim için tabi tutuldu PPs dan izole hücre yüzey moleküllerin (CXCR5, CD19, PD-1, CD4) ifade gösteren çubuk grafik çizer. (F-ı) Collagenase tarafından idare edilen içinde TFH çoğunluğuna ve kontrol grubu zebra araziler içinde gösterdi. Verileri üç bağımsız deneyler temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: collagenase etki CXCR5 ifadeye bağlı olarak anti-CXCR5 antikor klon büyük fark gösterdi. PP lenfositler antikor ile ilgili havuza alınmış ve ayrı içine farklı gruplar bir 6 aylık fareden toplanan kullanılan ve enzimatik sindirim uygulama klon. (A-F) TFH hücre oranı zebra araziler içinde tasvir içinde canlı, CD19 ön kapı- CD4+ T hücreleri. (A, C ve E) s hücreleri Biotin Birleşik Anti-fare CXCR5 antikor ile lekeli (2 g 8 klonu), ve Streptavidin Birleşik BV421 fluorochrome ile. (B, D ve F) PP hücreleri bir birincil konjuge anti-fare CXCR5 antikor ile (L138D7 klon) lekeli. (A-B) TFH araziler sindirilmemiş PP lenfositler üzerinden geçişi. Collagenase II (20 mg/25 mL sindirim Mix) ile sindirmek ve 37 ° C'de 10 dakika için heyecanlı (C-D) PPs İki bağımsız deney verileri temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: sindirim Collagenase tabanlı ve ajitasyon 37 ° C'de etkileyen hücre canlılığı, kurtarma ve hücre içi boyama verimlilik. 3 aylık C57BL/6 fare kurban edildi; PPs toplanmış ve 5A rakamaçıklandığı gibi havuza alınmış. (Sonra PPs, belgili tanımlık doku topluluğu tedirgin collagenase II (37.5 mg/25 mL sindirim Mix) 10 dk varlığında, FSC ve SSC özellikleri sabit PP hücre (A) tasvir edilir ve arsa boyama canlılık tasvir edilir () içindeA) D). (B, E) PPs koleksiyonu sonra dokular ajitasyon veya enzimatik sindirim; olmadan buzda tutuldu FSC ve SSC özellikleri sabit PPs hücre (B) tasvir edilir ve canlılığı boyama (E) tasvir edilmiştir. (C, F) PPs koleksiyonu sonra doku 125-150 devirde collagenase yokluğunda 37 ° C'de 10 dakika için heyecanlı; FSC ve SSC özellikleri ve canlılığı sabit PP hücreleri boyama (C, F), sırasıyla tasvir. Heyecanlı ve unagitated PPs collagenase yönetim olmadan dan izole düzenleyici T hücreleri ifadede Foxp3 karşılaştırılması (G) çubuk grafik mezarlığına tasvir edilir. (H-J) PPs 6 - aylık bir C57BL/6 fare toplanan ve collagenase II farklı konsantrasyonları ile tedavi edildi: 25 mg-25 mL sindirim mix, 15 mg-25 mL sindirim karışımı veya hiç collagenase. PP hücre kurtarma ve verim enzimatik sindirim etkileri ortaya FSC ve SSC araziler tasvir edilmektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8: moleküler model ve CXCR5 tam amino asit dizisi. (A)yedi taramalı transmembran protein yapısını CXCR5 örnek alınarak. (B) CXCR5 tam amino asit dizisi gösterdi. Hücre dışı bölgeler dizisi kırmızı ile gösterilen ve tahminen collagenase hassas kimyasal bağları ile hücre dışı amino asitleri içinde sarı renk ile gösterilen. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Antijen | Klon | Fluourochrome | Seyreltme |
| CD4 | GK1.5, RM4-5 | APC, PECy7, PerCpCy5.5, FITC | 1: 100 |
| CD19 | 6D 5 | FITC, APC/Cy7 | 1: 100 |
| PD-1 | J43 | PE ef 610 (Texas kırmızı) | 1: 100 |
| ICOS | 15 F9, 7E.17G9 | PE | 1: 100 |
| GL7 | GL7 | PerCp/Cy5.5 | 1:75 |
| CXCR5 | 2 g 8,L138D7 * | Biotin | 1:50 |
| BCL-6 | 7 D 1 | PE/Cy7 | 1:50 |
| FOXP3 | FJK-16 | APC, PE | 1: 100 |
| Streptavidin | - | BV421, PE | 1: 100 |
| FixableViability boya | - | BV 510(AQUA) | 1:1,000 |
| 7AAD | - | PerCp/Cy5.5 | 1:500 |
| FcBlock (CD16/32) | 2.4G2 | - | 1: 200 |
Tablo 1: antikor Özeti. Dilutions, klonlar ve fluorochrome conjugations ilgili antikorlar ve canlılığı boyalar için gösterilir. En iyi seyreltme deneysel koşullar ve ürünün kalitesini çok bağlı olarak değişebilir. Birincil BV421 Birleşik L138D7 klon burada 2:20 seyreltme gösterdi karşılaştırılabilir CXCR5 algılama kapasitesi biotin Birleşik 2 g 8 ile 1:50 klon seyreltme. Bu nedenle, birincil Birleşik L138D7-ebilmek var olmak kullanılmış için biotin Birleşik alternatif 2 g 8 olarak klon.
Resim ek 1 (S1): alternatif stratejileri TFH ve GC B hücreleri için geçişi. (A)Live PP lenfositler bir 3 aylık fareden C57BL/6 arka plan olarak adı geçen. (B-C) GC B hücreleri CD38 kapı- GL7+ (B) ve BCL-6+ GL7+ B hücreleri (C). (D-E) TFH hücreleri tasvir PD-1Merhaba olarak CXCR5+ (D) ve ICOS+CXCR5 olarak+ CD4 + T hücreleri (E). Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, akış sitometrik karakterizasyonu TFH ve GC B hücreleri için en iyi duruma getirilmiş bir protokol açıklayın. Bizim Protokolü'nün en büyük avantajlarından biri herhangi bir sindirim süreci en çok 107 (ortalama 4 – 5 x 106 hücreler) Toplam PP hücre tek bir fare (C57BL/6 zorlanma) yalıtım sağlar olduğunu. Biz toplam hücre verim olumlu PPs numarası ile ilişkili ve deneysel planlama için yararlı olan aşağıdaki basit denklemi tahmin edilebilir gözlenen: "Toplam PP hücre sayısı başına fare = 0.5-1 x (eksize PP sayısı fare) x 106". Bu yüksek hücre verim Gelişmiş hücre canlılığı ile tamamlanmaktadır (> % 95). Gelişmiş hücre kurtarma ve canlılığı PPs çeşitli antikor paneller paralel boyama kullanarak çeşitli lenfosit alt grupları akış sitometrik analizinde performans izin.
De Jesus ve arktarafından yayınlanan bir son PP yalıtım protokolü ile karşılaştırıldığında. 20 ve önceki raporlar19,21, bizim protokol önemli ölçüde daha yüksek toplam hücre verim ve canlılığı, sindirim collagenase ile yokluğu rağmen verdi. PPs tanımlaması "ilk kez müfettişler için zor" olabilir, ancak bu iletişim kuralı için öğrenme eğrisi çok dik ve hakim, bizim teknik tanımlama ve PPs cerrahi eksizyon bağırsağın üzerinden kısa bir sağlar zaman. İstenen sayfa numarası ilk girişimi sonrasında ulaşmak değil, sı distal ve proksimal ucunda odaklanan s kimlik adım yinelenen öneririz. Bizim pratikte her fare neredeyse iki yakından bulunduğu PPs duodenal sonunda (Şekil 1A) ve en az 2-3 PPs ileum son 5 cm tespit edildi.
TFH boyama diğer hücre alt kümeleri içinde böylece ekstra dikkat18gerektiren PPs, daha daha zorlu olabilir. Belirli adımları doku işleme ve hücre izolasyon sırasında kaçırdıysanız, sonuçlar oldukça yanıltıcı olabilir. Bu nedenle, aşağıdaki deneysel "ipuçları" dikkat araştırmacılar öneririz. B ve T hücreleri, CXCR5 ve GL7 ifade edilebilir gibi anahtar TFH ve GC B hücre işaretleri beri bu bulaşıcı CD19 nedeniyle yanlış pozitif sonuçlar önlemek için antikor panelleri bir B hücre işaretçisi eklemek önemlidir+CD4+ DP hücreleri24 ( Şekil 2). Unutmayın ki bu hücreler de son derece hızlı T hücre işaretleri CD3 dahil olmak üzere bu yana25 DP hücreleri yeterli dışlanma vermez sadece stratejileri çoğunluğuna T hücre işaretleri üzerinde dayalı (veri gösterilmez) ve CD4. DP hücreleri hariç ek olarak, akış sitometresi sonuçları olmalı doğrulanmış ve uygun negatif denetimleri istihdam ederek teyit (Örn., izotip kontrol eder, FMOs). Sadece da yanlış yerleştirilmiş TFH kapı yanlış pozitif yanlış sonuçlar ve sonuçlara yol açabilir. Özellikle TFH hücre nüfus akış sitometresi ayrı bir nüfus olarak beliren böylece değil bol, yoksa TFH kapısı düzeltilmesi bazen zor. Bu sınırlama, birden çok TFH işaretleri ilavesi aşmak için (Örn., BCL-6, PD-1, ICOS) antikor panel alternatif gating fırsatlar sağlar ve doğruluk26artırmak. Pratik nedenlerden dolayı BCL-6 GC B geçişi için kullanılabilir gibi alternatif TFH geçişi için ideal bir ortak boyama işaretleyici aynı anda16 (Şekil S1C) hücreleri bulundu.
Ayrıca, yüksek bir TFH oran içeren bir olumlu denetim örnek olan araştırmacılar TFH kapı doğru bir şekilde yerleştirmek için navigasyon iyi sağlayabilir. Bizim deneyler, PP örnekleri kullanılan yaşlanma toplam CD4% 40 kadar geliştirme PPs içindeki TFH hücreleri neden bulduk beri Yaşlı fareler (6-aydan daha eski) pozitif kontrol olarak gelen+ T kararlı duruma (veri gösterilmez) hücreleri. Biz de daha fazla yayımlanmış Protokolü kitaptaki yöntemleri TFH hücre18boyama için bakmak için boyama TFH teknik ayrıntılarını ilgi var araştırmacılar öneririz.
PP test deneysel hipotezler nispeten zor olabilir ve fareler her grubu istatistiksel anlamlılık21ulaşmak için çok yüksek bir dizi gereksinim duyabilir. Yüksek hücre verim bizim protokolünün avantajlarından yararlanarak, biz bu engeli aşağıdaki deneysel stratejiler ile atlatılabilirdi. İlk olarak, PPs varlığına ve onları ayrı olarak anatomik kökenlerine bağlı olarak sıralanır (Örn., duodenal, jejunal ve ileal). O zaman, aynı derecede bu havuza alınan PPs farklı içine deneysel ve kontrol grubu Dağıtılmış. Bu dahili olarak kontrollü deneysel strateji tüm hücreleri tek bir fareden elde iken fare arası bireysel farklılığı en aza indirmek için bize etkin.
Ayrıca, farklı bağırsak bölmeleri arasında değişkenlik (e.g., oniki parmak bağırsağı vs. ileum)-daha önce bildirilen önemli2 — deneysel olarak engellendi ve kontrol grubu oluşuyordu PPs eşit sayıda gelen anatomik bölge (Şekil 5A). Çoğaltır bağımsız deney aynı yaklaşımı kullanarak gerçekleştirerek, biz güvenilirlik ve sonuçlarımız önemini geliştirilmiş. Nonspesifik varyasyonları ortadan yanı sıra, bu yöntem de yedek fareler, reaktifler ve zaman yardımcı olur.
Geliştirme ve bizim iletişim kuralı iyi duruma getirilmesi sırasında collagenase II ve IV temel sindirim çarpıcı CXCR5 ifade (Şekil 5B) diğer yüzey molekülleri algılama TFH için süre azaltılmış ve GC B hücreleri () olduğu gibi kaldı bizim sonuçları ortaya Şekil 5C -E) . Bir son zamanlarda bildirilen Jüpiter Protokolü19', collagenase II çok PPs ve LPs lenfosit izolasyonu için etkili olduğu gösterilmiştir. Ancak, collagenase II içinde çeşitli yüzey moleküllerin bölünme sonuç yüksek bir tryptic etkinlikleri için daha önce bildirilmiştir. Alt tryptic etkinlik ve daha yaygın kullanımı nedeniyle yüzey-molekül dostu yapısı27 edebiyat28,29,30' u göz önüne alındığında, Collagenase IV de collagenase II ek olarak dahil olmuştu içinde Bizim çalışma ve bu önceki raporlarda önerildiği gibi konsantrasyonlarda kullanılır. Collagenase ve eşdeğer enzimler kullanımı bağışıklık hücreleri gibi değişmiş yüzey molekülü ifade31,27sindirim istenmeyen etkileri nedeniyle mukozal İmmünoloji çelişkili bir sorunu olmuştur.
Bu daha önce collagenase farklı türde kullanımı akış sitometrik insan gut32 ve bademcik örnekleri18içinde CXCR5 algılaması ile engelleyebilir bildirildi. Diğer taraftan, diğer çalışmalar TFH ve GC B hücre izolasyon PPs collagenases24,33kullanmadan gösterdi. Karşılaştırmalı bir yaklaşım değerlendirmek içerme veya dışlama collagenase sindirim yalıtım CXCR5 ifade TFH hücre için en uygun koşul fare PPS fare CXCR5 temsil edeceğini için üstlenmiş oldu şimdi kadar 374 bir amino asit be CD4, bol bol PPs (UniProt alınan verileri) lenfoid hücrelerde ifade edilir CD19 gibi diğer transmembran proteinler karşılaştırıldığında görece kısa ekstraselüler bölgeleriyle uzun yedi taramalı membran protein. Şekil 8A-B, moleküler model ve fare CXCR5 olarak adı geçen toplam amino asit dizisi ile sindirim collagenase tabanlı varsayılan hedef dizisi içinde olan glisin (Gly) ve nötr amino arasındaki kimyasal bağları ayırmak eğilimi asitler34. Yedi taramalı transmembran moleküler yapısı elde edilen kısa ekstrasellüler etki CXCR5 molekül enzimatik sindirim (Şekil 8A) karşı savunmasız yapmaktan sorumlu olabilir. Collagenase tedavi kullanılan antikor klon bağlıdır sonra çoğu intriguingly konularda, bu algılama CXCR5 ifade bulduk. 2 g 8 ve L138D7 klonlar benzer performans sindirilmemiş PP grubunda, sindirilmiş PP grubunda, karşılaştırılabilir TFH kesirler tespiti bilgisi tarafından belirtildiği gibi olsa da L138D7 klon yaklaşık 3 x (≈ % 9) daha yüksek kısmını TFH hücreleri CD4 içinde ortaya+ T hücrelerinin 2 g 8'den clone (≈ % 3) (Şekil 6). Bu bulgu azaltılmış CXCR5 boyama collagenase enzimatik aktivite tarafından değiştirilmiş üç boyutlu epitope yapılandırma için ikincil olabilir göstermektedir. Bizim sonuçları, sindirim collagenase tabanlı PP hazırlık sırasında kaçınılmalıdır gösterir.
Collagenase ayrılma CXCR5 molekül algılama ile parazit sindirim adım hariç tutarak hile. Ancak, mendil gibi LP için mekanik bozulma hücreleri izole etmek yeterli değildir ve böyle dokular için gerekli19enzimatik sindirim olacaktır unutulmamalıdır. Gelecekte, enzimatik sindirim süreçleri gerektiren dokular için teknik bu sınırlama atlamak için sindirim uyumlu antikor klonlar yanı sıra alternatif sindirim koşulları test etmek için gerekli olacak. O zamana kadar bağışıklık floresans mikroskobu gibi görüntüleme teknikleri bu dokularda TFH algılama için seçim yöntemi olarak kalacak. LP hücreleri izole ek olarak, bazı hematopoietik hücre alt kümeleri DCs ve PPs plazma hücreleri gibi yalıtım enzimatik sindirim35gerektirir. Ne zaman bizim protokol istihdam, bu hücre alt kümeleri PPs dan izole etmek isteyen araştırmacılar uygun enzimatik sindirim adım20içermelidir. Enzimatik sindirim DC işaretleri ifade ile olası girişim dikkate alınması gereken ve sindirim koşulları gerektiği gibi optimize edilmelidir. Ne zaman yalıtım TFH ve GC B hücrelerinin collagenase sindirim36, her fare toplanan PPs gerektirir bir hücre alt yanı sıra istenen işleme ve collagenase tedavi paralel panelleri olmadan için iki gruplar halinde ayrılmış.
Collagenase etkisi s lenfositler yüzey molekülü ifade için sınırlı değildi. Sonuçlarımız enzimatik sindirim bir doz bağımlı şekilde (Şekil 7) PP hücrelerin içindeki lenfosit oranı göreli bir düşüş neden olduğu saptandı. Lenfosit kesir azalma collagenase-aracılı sürümünden hematopoietik hücre alt kümeleri fagositler ve DCs gibi diğer türleri daha büyük ve daha ayrıntılı lenfoid hücre daha PPs bir sonucu olabilir. Collagenase sindirim LP komşu gelen hücre yayın aracılı ve intraepitelyal bölmeleri FSC-SSC profil değişikliği için katkıda bulunabileceğini olanağı da sağlar. Bu hücre kirlenme--dan diğer gut bölmeleri Ayrıca PP lenfositler akışı analizi girişime neden. Bu temelde, hücre saflık, en üst düzeye çıkarmak için biz de epitel hücreleri ve mukus20, ayıklamak için yaygın olarak kullanılan reaktifler EDTA veya DTT gibi ek olarak fizyolojik ve mümkün olduğunca unmanipulated doku hazırlık koşullar tutmak kaçının. Enzimatik sindirim bu olumsuz etkilerin rağmen PP lenfositler üzerinde olumlu etkileri de boyama hücre içi ve hücre canlılığı (Şekil 7 d-F, G) geliştirilmesi gibi keşfedildi. Ancak, daha fazla ortaya analizleri hücreleri içinde heyecanlı ne zaman hücre canlılık ve hücre içi Foxp3 boyama karşılaştırılabilir bir ölçüde tercih çünkü bu efektleri ajitasyon sürecine enzimatik sindirim bağımsız olarak 37 ° C'de atfedilmiştir collagenase olmaması. Mechanistically, ajitasyon faydalı etkisini bağırsak içeriği ve mukus PPs dan geliştirilmiş kaldırılması nedeniyle olabilir.
Özetle, biz PPS hücreleri akış sitometrik karakterizasyonu birkaç hücre alt kümeleri için lekeli veya olabilir hücre sıralamaya tabi ve daha sonra çeşitli istihdam Isolated üzerinden lenfositlerin yalıtım için akıcı bir protokol tarif var Tüp bebek ve in vivo fonksiyonel deneyleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbir çıkar çatışmaları ilan etti.
Acknowledgments
Akış Sitometresi Analizi ile destek ve Laura Strauss ve Peter adaçayı yararlı tartışmalar için teşekkür etmek istiyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD4 antibody | eBioscience, Biolegend* | 17-0041-81 ,10054* | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CD19 antibody | eBioscience | MA5-16536 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse PD-1 antibody | eBioscience | 61-9985-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse ICOS antibody | eBioscience | 12-9942-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse GL7 antibody | Biolegend | 144610 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CXCR5 antibody | Biolegend*, BD Bioscience | 145512*, 551960 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse BCL-6 antibody | Biolegend | 358512 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse Foxp3 antibody | eBioscience | 17-5773-82 | For detailed information see Table 1 |
| Streptavidin-BV421 | BD Bioscience | 563259 | For detailed information see Table 1 |
| FixableViability Dye | eBioscience | L34957 | For detailed information see Table 1 |
| 7AAD | Biolegend | 420404 | For detailed information see Table 1 |
| FcBlock (CD16/32) | BD Bioscience | 553141 | For detailed information see Table 1 |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 6-well,12-well & 96-well plates | Falcon/Corning | 353046,353043/3596 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 10 mL syringe-plunger | Exel INT | 26265 | |
| RPMI | Corning | 15-040-CV | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Orbital shaker | VWR | Model 200 | |
| Curved-end scissor | |||
| Fine Serrated Forceps | |||
| Small curved scissor |
References
- van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPα interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer’s patches: Organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).
- Heel, K. A., McCauley, R. D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. Review: Peyer’s patches. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 122-136 (1997).
- Fagarasan, S., Kinoshita, K., Muramatsu, M., Ikuta, K., Honjo, T. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413 (6856), 639-643 (2001).
- Hopkins, S. A., Niedergang, F., Corthesy-Theulaz, I. E., Kraehenbuhl, J. P. A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer’s patch dendritic cells. Cellular Microbiology. 2 (1), 59-68 (2000).
- Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches. Infection and Immunity. 71 (1), 504-509 (2003).
- Sato, A., Iwasaki, A. Peyer’s patch dendritic cells as regulators of mucosal adaptive immunity. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1333-1338 (2005).
- Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Y. Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways. Annals of the New York Academy of Sciences. 1247 (1), 97-116 (2012).
- Fagarasan, S., Kawamoto, S., Kanagawa, O., Suzuki, K. Adaptive Immune Regulation in the Gut: T Cell-Dependent and T Cell-Independent IgA Synthesis. Annual Review of Immunology. 28, 243-273 (2010).
- Hase, K., et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH + bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).
- Wu, H., et al. An Inhibitory Role for the Transcription Factor Stat3 in Controlling IL-4 and Bcl6 Expression in Follicular Helper T Cells. Journal of Immunology. 195 (5), 2080-2089 (2015).
- Vinuesa, C. G., Tangye, S. G., Moser, B., Mackay, C. R. Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity. Nature Reviews Immunology. 5 (11), 853-865 (2005).
- Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal Centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
- Vaeth, M., et al. Store-Operated Ca2+Entry in Follicular T Cells Controls Humoral Immune Responses and Autoimmunity. Immunity. 44 (6), 1350-1364 (2016).
- Meli, A. P., et al. The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance. Immunity. 45 (4), 831-846 (2016).
- Fu, W., et al. Deficiency in T follicular regulatory cells promotes autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 815-825 (2018).
- Espéli, M., Walker, J. M. T follicular helper cells - Methods and Protocols. , (2015).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visual Experiments. (111), e54114 (2016).
- De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer’s Patches. Journal of Visual Experiments. (73), e50167 (2013).
- Pastori, C., Lopalco, L. Isolation and in vitro Activation of Mouse Peyer’s Patch Cells from Small Intestine Tissue. Bio-protocol. 4 (21), e1282 (2014).
- Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. Journal of Visual Experiments. (58), 3225 (2011).
- Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).
- Bollig, N., et al. Transcription factor {IRF4} determines germinal center formation through follicular T-helper cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Science of U. S. A. 109 (22), 8664-8669 (2012).
- Pérez-Mazliah, D., et al. Follicular Helper T Cells are Essential for the Elimination of Plasmodium Infection. EBioMedicine. 24, 216-230 (2017).
- Sage, P. T., Sharpe, A. H. T follicular regulatory cells in the regulation of B cell responses. Trends Immunology. 36 (7), 410-418 (2015).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. Journal of Immunological Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
- Meenan, J., et al. Altered expression of alpha 4 beta 7, a gut homing integrin, by circulating and mucosal T cells in colonic mucosal inflammation. Gut. 40 (2), 241-246 (1997).
- Cao, A. T., et al. Interleukin (IL) -21 promotes intestinal IgA response to microbiota. Mucosal Immunology. 8 (5), 1072-1082 (2015).
- Wei, J., et al. Autophagy enforces functional integrity of regulatory T cells by coupling environmental cues and metabolic homeostasis. Nature Immunology. 17 (3), 277-285 (2016).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. 33 (S1), (2017).
- Bergqvist, P., Gardby, E., Stensson, A., Bemark, M., Lycke, N. Y. Gut IgA Class Switch Recombination in the Absence of CD40 Does Not Occur in the Lamina Propria and Is Independent of Germinal Centers. Journal of Immunology. 177 (11), 7772-7783 (2006).
- Keil, B., Gilles, A. M., Lecroisey, A., Hurion, N., Tong, N. T. Specificity of collagenase from Achromobacter iophagus. FEBS Letters. 56 (2), 292-296 (1975).
- Mora, J. R., et al. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer’s patch dendritic cells. Nature. 424 (6944), 88-93 (2003).
- Reboldi, A., et al. Mucosal immunology: IgA production requires B cell interaction with subepithelial dendritic cells in Peyer’s patches. Science. 352 (6287), (2016).
