Summary
ここでは、製造とレトロ ウイルスの伝達と BALB/c マウス lymphodepleting の有無で確立された同系 A20 B 細胞リンパ腫に対する治療としての利用によってマウスの CD19 車 T 細胞の前臨床試験プロトコルを提案します。中古エアコン。
Abstract
CD19 キメラ抗原受容体 (車) T 細胞療法の驚くべき臨床成功は、急性リンパ芽球性白血病 (ALL) 非ホジキン リンパ腫 (NHL) の 2 つの第 2 世代キメラ抗原受容体 (車) の承認につながっています。フィールドのフォーカスがより少なく印象的な完全な応答率が観察されるその他の造血器腫瘍におけるこれらの成功をエミュレートすることになりました。車 T 細胞または他の治療法の共同管理のさらなる技術が他の癌の設定で成功した治療に障害を克服して正常に。
したがって CD19 車 T 細胞の前臨床試験を行うことができます他のモデルを提案します。この十分にテストされた B 細胞リンパ腫モデルの結果が一般に有益な車 T 細胞療法をする可能性があります。
このプロトコルにより、マウスの再現性のある生産 Plat E プロデューサー細胞 MP71 レトロ ウイルスの構造と分泌されたレトロ ウイルス粒子のコレクションに続いて pCL エコ包装プラスミドのリン酸カルシウム トランスフェクション車 T 細胞と組換えの人間のフィブロネクチン フラグメントおよび遠心分離を使用して伝達します。レトロ ウイルスの伝達の検証、対象リンパ腫細胞前のヴィヴォ、フローサイトメトリー、luminometry、酵素抗体を使用してを殺すために車の T 細胞の能力の確認測定法 (ELISA)、説明しています。
トン車を試験のプロトコル細胞の生体内でlymphoreplete で、確立された、全身のリンパを軸受 lymphodepleted 同系マウスが記述されています。抗腫瘍活性は、生体内の生物発光と病気の進行によって監視されます。1stや 2nd世代車 lymphodepleting 中古エアコン、トン車を利用する場合、長期の寛解を達成するマウスの少数との組み合わせで利用する場合確立された B 細胞リンパ腫の撲滅の典型的な結果を示すlymphoreplete マウスにおける IL 12 を発現する細胞。
これらのプロトコルは、別の追加変更、車 T 細胞の組み合わせとその他の治療薬と CD19 車 T 細胞を評価するために使用または別のターゲット抗原に対して車 T 細胞の使用のために適応できます。
Introduction
キメラ抗原受容体 (車) T 細胞療法は、CD19 の治療に驚くべき臨床成功を示している+悪性腫瘍再発急性リンパ芽球性白血病の1と axicabtagene の tisagenlecleucel の承認を進歩的な大型 B 細胞非ホジキン リンパ腫の2 2017 年に ciloleucel。
がんと病気の進行と治療上のメカニズムの両方の免疫系の相互作用の重要性はますます認識3,4、になっている5。たとえば、腫瘍微小環境 (TME) はあふれ、免疫細胞6,7,8のエフェクターの機能を抑制する要因とされています。また内因性の免疫細胞およびエピトープの広がりのプライミングは、腫瘍の根絶と長期的抵抗性腫瘍チャレンジ9,10のキーをすることができます。これらの現象の両方は、免疫システムがない異種モデルで評価できません。同様に、遺伝子組換えタンパク質を利用したシステムを反映していない11,12を拡散エピトープに必要な免疫寛容を壊すの挑戦。したがって、免疫系が完全に機能同系モデルですがん疾患の進行と免疫治療法のこれらの重要な側面をモデル化するために重要。
車 T 細胞療法の重要な注意点は、治療成功13,14lymphodepleting 前処理が要です。これは通常患者の車 T 細胞15,16の注入の前に化学療法を投与することによって達成されます。標準的な方法としては lymphodepletion の患者の設定で使用を模倣するために 5 Gy 全身照射 (TBI) マウス付け全身 A20 B 細胞リンパ腫治療車 T 細胞の投与前に lymphodepletion を達成するためを管理します。
Lymphodepleting 前処理は、大多数の患者のための問題ではない、毒性化学療法のエージェントに付属しているは、低パフォーマンスの状態の患者は車 T 細胞療法の対象でないことを意味します。Lymphodepletion に不適格な患者を表すテスト システムを作成するには、我々 は車 T 細胞リンパ腫の治療をモデル lymphoreplete 同系マウス モデルを確立しました。このモデルで車 T 細胞内からの il-12 の分泌がの成功率で確立されたリンパの根絶につながることを明らかにした ~ 2517。さらに、内因性の免疫細胞ががん撲滅に関与していたことを示した。
ここで述べるマウス車 T 細胞の生産のためのプロトコル同系マウスと lymphodepleting 前処理の使用有無にかかわらず車 T 細胞とリンパ腫の治療でリンパ腫を確立します。これは、組み合わせテスト車 T 細胞その他の遺伝子を他のエージェントと車 T 細胞学やリンパ腫に対して養子細胞療法や免疫療法戦略の他の使用のために使用できます。
Protocol
すべての動物実験を行った動物 (科学的なプロシージャ) の行為 1986 の後援の下、英国の調整委員会の下でがん研究のガイドラインについてすべての動物の研究が CRUK マンチェスター研究所で行われ、動物愛護が承認、倫理審査体 (CRUK MI AWERB)。
1. 準備
- Maxiprep pMP71 レトロ ウイルスは、プラスミッドおよび pCL エコ レトロ包装プラスミド18を構築します。
注: pMP71 は、mCherry と FMDV2A のシーケンスで区切られた車をエンコードします。これは他のレトロ ウイルスの構造に置き換えられます。pCL-エコは、ギャグ、ポルとマウス白血病ウイルスエンベ エンベロープ蛋白質をエンコードします。 - RPMI 1640 媒体、10 %fcs、1 %100 x ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン (PSG) を用いたマウス T 細胞を培養するための完全な T 細胞用培地 (TCM) を準備します。
注:ソリューションに含まれる 100 IU/mL ペニシリン、ストレプトマイシンの 100 μ g/mL と L グルタミンの 2 mM)、50 μ M β-メルカプトエタノール、25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES)。 - 0.05 mM β-メルカプトエタノール 37 ° c、5% CO210% FCS RPMI 1640 A20 の細胞を培養します。
- 5% 完全なダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) (10% ウシ胎仔血清 (FCS)、2 mM 1 G/ml ピューロマイシンと 10 μ g/mL ブラストサイジン L-グルタミンを DMEM) 37 ° c でプラチナ E (ぷらっと-E) 細胞の培養 CO2.
注:ぷらっと-E 細胞 293 t 細胞由来し、ギャグ、ポルとマウス白血病ウイルスエンベ封筒レトロ ウイルス蛋白質を表現します。 - トランスフェクション メディア ソリューション 1、トランスフェクションの直前に 2 を準備します。解決策 1 (pH 7.9) DMEM + 10 %fcs + 25 mM HEPES、ソリューション 2 (pH 7.1) DMEM + 25 mM HEPES を含むを格納する準備をします。
- 滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で希釈することによって 10 G/ml 組換え人間フィブロネクチン フラグメント ソリューションを準備し、使用するまで-20 ° C で保存します。
- 無菌 (除く組換え人間フィブロネクチン フラグメント) を使用する前に 0.2 μ m のフィルターを通してすべてのメディアをフィルターします。
2 T 細胞のレトロ ウイルスの伝達
- 1 日目: 準備の transfection のため
- シード 7.5 x 106プラチナ E (ぷらっと-E) 完全な DMEM の 18 mL で 15 cm2ティッシュの培養皿の細胞し、37 ° C、5% CO2で一晩インキュベートします。
- 2 日目: Plat E レトロ包装細胞のトランスフェクション
- Pcl-エコ包装ベクトル DNA をトランスフェクションするプラスミド DNA エンコード レトロ車構成および 1 M CaCl2 15 cm2皿あたり 3 mL トランスフェクション ソリューション 2 の最終巻の 150 μ L の 39.6 μ g の 20.4 μ g を準備します。10 s および 5 分のための残りの渦
- 15 cm2料理から DMEM メディアを削除し、12 トランスフェクション溶液 1 mL に置き換えます。
注意メディアを変更すると、15 cm2皿がセンターで乾燥することができます。ぷらっと-E transfected セルの実質的な死があります。迅速作業し、同時にちょうど 1-2 のプレートからメディアを削除します。 - 3 mL トランスフェクション ソリューション各プレートの間で drop-wise、均等に各 15 cm2皿に DNA および CaCl2を含む 2 を追加します。37 ° C、5% CO2一晩で 10 s. 加温の左右に動きで優しくロック プレートです。
- 3 日目: 準備のウイルスを含む伝達の上清
- 置換 18 ml transfected プレート E セルのメディアは TCM を完了し、インキュベーターに戻る。
注意ときメディア 15 cm2料理を変更すると、センターで乾燥することができます。ぷらっと-E transfected セルの実質的な死があります。迅速作業し、同時にちょうど 1-2 のプレートからメディアを削除します。
- 置換 18 ml transfected プレート E セルのメディアは TCM を完了し、インキュベーターに戻る。
- マウス脾臓細胞の 3 日目: 分離との in vitro活性化
- パーキンソンらによって前述したように 6-8 週齢 BALB/c マウスから脾臓を削除します。19でそれらを浸すと滅菌、氷冷、50 mL の円錐管に PBS。
- 1.5 mL 遠心チューブに脾臓を転送し、最小限の力で杵を使用して均質化するピンセットを使用します。
- 1000 μ L ピペットを使用して、~ 5 mL 単一細胞懸濁液を達成するために PBS を含む 50 mL のチューブに貼付 100 μ m 孔セル ストレーナーに磨砕液を転送する 800 μ L の PBS。追加の脾臓の 2.4.2 のステップを繰り返します。チューブあたり 3 脾臓を超えないようにします。
注意左立っている場合、フィルターを通した脾細胞は塊を形成できます。細胞凝集を避けるためにいくつかの脾臓を処理する場合チューブを断続的に手動で旋回します。残りのセル ストレーナーにフラグメントことができますさらにマッシュ最小限の力を利用して 5 mL シリンジからのプランジャーを使用しています。 - 最大 20 mL の PBS でトップします。20 mL 50 mL のチューブで密度勾配メディア (材料表) の上に優しく 20 mL 細胞懸濁液を層します。適用ないブレーキで 20 分間 800 x g で結果のオーバーレイされる懸濁液を遠心します。
- 滅菌パスツール ピペットと 50 mL のチューブへの転送を使用してインターフェイス層で細胞を採取します。トップ最大 50 mL の PBS と 10 分間 800 × g で遠心分離を洗浄します。上澄みを廃棄し、再、完全な TCM のセルを中断します。
- 診断を使用してセルの数をカウントします。
- 30 ng/mL 抗 CD3ε 抗体を用いた完全な TCM の 5 x 106セル/ml の密度で細胞の培養 (145-2 C 11 のクローン)、30 ng/mL 抗 CD28 抗体 (クローン 37.51)、100 U/mL 組換えヒト IL-2 ng/mL の 2 遺伝子組換えマウスの IL-7。セル収穫量に適切なサイズの組織培養のフラスコを使用します。
注:-抗原提示細胞抗体付きコート板必要があるそれを精製した T 細胞を用いた作業は、CD28 と CD3 抗体による T 細胞の活性化に必要なまたは磁気ビーズ (資材表) を使用 - 37 ° c、5% CO2一晩マウス脾細胞を孵化させなさい。
- 3 日目: 準備板の伝達
- コート非培養 6 ウェル プレート 2 ml 10 G/ml 組換え人間フィブロネクチンのフラグメントし、4 ° C で一晩インキュベート
- 4 日目: マウス T 細胞の伝達
- 新鮮な非培養 6 ウェル プレートにコーティング プレートから遺伝子組換えの人間フィブロネクチン フラグメントを転送します。伝達の第 2 ラウンドの 4 ° C で一晩のこれらの版を孵化させなさい。
- オリジナル組換え人間フィブロネクチン フラグメント コーティング プレートの各ウェルに TCM の 2 mL を追加し、非特異的結合をブロックするために室温で 30 分のまま。
- 15 cm ティッシュの培養皿の完全な TCM の 18 mL 置換 transfected Plat E セルからレトロ ウイルスを含む上清を収穫します。
注意ぷらっと-E 細胞の乾燥を避けるために迅速に動作します。
注:トランスフェクションの成功は、mCherry (図 1) などの蛍光マーカー遺伝子を利用した場合に、蛍光顕微鏡でこの段階で確認できます。 - 細胞の残骸を削除する 0.45 μ m のフィルターを通してレトロ ウイルスを含む上清をフィルターします。組換えひとフィブロネクチン フラグメント コーティング 6 ウェル プレートから TCM を削除し、フィルター処理されたレトロ ウイルスを含む上清の各ウェルに 2.5 mL を追加 (使用模擬 transfection のために完了する TCM)。レトロ ウイルスや模擬メディアの追加、各ウェルにラベルを付けます。
- 室温で 30 分間 1200 x g でプレートを遠心します。
- プレートが回転しながら、活性化 T 細胞を収集し、診断を数えます。
- 伝達は 5 mL/ウェルの合計で 5 x 106アクティブ脾細胞を用いて実施されます。5 分 500 × g で遠心分離によっての個別のチューブでモック/伝達の脾細胞の必要な数をペレットします。
- 再陰性対照としてステップ 2.6.4 からフィルター処理されたレトロ ウイルスを含む上清の 2.5 mL あたり 5 x 10 の6セルの密度で脾細胞または TCM を中断します。組換えヒト IL-2 (hIL-2) と IL-7 (mIL-7) 遺伝子組換えマウスを最終濃度 200 IU/mL と 4 ng/mL にそれぞれ追加します。
- 2.6.5 のステップの完了時に遠心から 6 ウェル プレートを収集し、5 mL の最終巻/よく適切な井戸と 100 の U/mL hIL-2 および 2 ng/mL ミル-7 の最終的な集中に 2.5 mL/井戸再懸濁の脾細胞を追加します。
- 室温で 90 分 1200 x g でプレートを遠心します。遠心分離の後 37 ° C、5% CO2一晩で版を孵化させなさい。
- 5 日目: 伝達のラウンド 2
- これは再利用することができます、プレートから遺伝子組換えの人間フィブロネクチン フラグメントを収集します。2.6.2 - 2.6.5 の手順を繰り返します。
- プレートが回転しながら、パスツール ピペットを使用して伝達のラウンド 1stから細胞を収集します。2 ml の PBS 各ウェルを洗浄、旋回し、各ウェルで残りのセルを収集します。
注:再沈殿細胞を中断する上下のピペットします。個別のチューブ内の各コントロール/伝達グループを収集します。 - 200 IU/mL IL-2 と 4 ng/mL IL-7 の伝達の井戸あたり 2.5 mL で 5 分再中断セル 500 × g で遠心チューブ。2.6.7 - 2.6.8 の手順を繰り返します。
- 遠心分離機からセルを削除し、37 ° c、5% CO2 4h 収集導入手順 2.7.2-2.7.3 のように細胞間加温します。
- セルをカウント、5 分 500 × g で遠心分離機および再 100 U/mL hIL-2 2ng/mL と 1 x 106セル/ml の密度で完全な TCM で中断ミル-7。適切な規模の培養フラスコに移し、37 ° C、5% CO2で孵化させなさい。
- 新鮮な TCM メディア 100U/mL hIL 2 と 2ng/mL を含む追加ミル 7 2 日ごと 1 x 106セル/mL の細胞密度を維持します。
注:収穫した脾細胞には、さまざまな種類の細胞が含まれています。これらの培養条件下以外の T 細胞は 2-3 日間にわたってオフに死にます。後 〜 細胞培養 4 日間 T 細胞数は 0 日目に通常収穫された脾細胞数の合計に相当します。
3. 伝達効率の測定
- 4 日目記事伝達に導入されたまたは非導入 T 細胞 (約 3 x 10 の5セル) のサンプルを収集します。500 x g で 5 分で細胞懸濁液を遠心分離機、上澄みを廃棄、小球形にされた PBS で 1 回洗浄し、再び遠心分離機します。
- 上澄みを廃棄し、適切なアミン反応性染料 (例えば、ライブ/死者の汚れ、1 の 100 倍希釈液) ウェルあたりを含む pbs 100 μ L を追加します。暗闇の中で室温で 15 分間インキュベートします。
- PBS で 2 回洗うし、500 x g で 5 分間破棄上清の遠心分離機を FACS バッファー (1 の 100 倍希釈液) をブロック Fc 受容体抗マウス CD16/CD32 抗体を含む 50 μ l インキュベートします。4 ° C で 10 分間インキュベートします。
- 抗マウス BV786 CD4 と CD8 BV711 抗体 (FACS バッファーに 1 μ L/ウェルの最終濃度) を含むマスター ミックスを汚す抗体の 50 μ L を直接追加します。暗闇の中で 4 ° C で 30 分間インキュベートします。3.3 洗浄手順を繰り返します。1 %pfa バッファー内セルを再停止し、フローサイトメトリーによる解析まで 4 ° C で暗闇の中。
- CD4 および CD8 のサブセットと (図 2) のようにそれぞれゲート車式のマーカーとして BV711、BV785、mCherry の蛍光を使用して同等の適した cytometer で細胞を分析します。
4.体外検証車 T 細胞活性
- 同系種対象 CD19+腫瘍細胞密度で 100 μ L で 1 x 10 の4セルのルシフェラーゼ発現の有無 TCM/96 ウェルの U 底によく組織培養プレート。
- ターゲット (E:T) 比が 1:1 にエフェクターを達成するために 100 μ L/ウェルのボリュームで 1 × 104 CD19 車 T 細胞/ウェルを追加します。
注:E:T 比を確立する必要がありますそれぞれの車を構築し、細胞をターゲットします。 - 使用 T 細胞と腫瘍細胞陰性対照として単独で、フォルボールエステル (PMA) で刺激した T 細胞 (50 ng/mL) とインターフェロン γ (肝腎) リリースのための肯定的な制御としてイオノマイシン (1 μ g/mL)。37 ° c、5% CO2 16-24 時間の培養細胞。
- 共培養後 5 分 500 x g でプレートを遠心し、さらに肝腎と IL-12 p 70 ELISA 分析上清を収集します。
注:これは-80 ° C で保存できます。 - 再のルシフェリン (1.5 mg/mL の最終濃度) を含む PBS 100 μ l 細胞ペレットを中断します。37 ° C で 10 分間の版を孵化させなさい適したルミノの各ウェルからの発光を測定しなさい。
注:露光時間は、細胞の密度最適化されなければなりません。代表的な結果を図 3 aに示します。車 T 細胞の細胞毒性のEx vivoは、ターゲット抗原を発現する細胞と共培養による特急ルシフェリンに変更できます。車の T 細胞は、標的細胞を殺すため、ルシフェリンがリリースされる、したがって luminometry 信号の減少は細胞死と相関します。非導入細胞はしばしば長い潜伏期間特にターゲット細胞生存率に及ぼす影響を持つことができます。製造元の ELISA のプロトコルによると清のマウスの肝腎と IL-12 p 70 の濃度を測定します。代表的な結果は、(図 3 b 3 c) に表示されます。ターゲット抗原を発現する細胞との共培養による車の T 細胞の体外活性化は、elisa 法を用いた培養上清中の内容を分析することによって試金することができます。標的細胞車 T 細胞の比率と共培養期間の長さは、車構成、ターゲット細胞ラインおよび検体の最適化されなければなりません。PMA およびイオノマイシン治療は、T 細胞と対応する能力の品質を確認する肯定的な制御として使用できます。
5. マウスで抗腫瘍活性を評価します。
-
プロトコル 1
- シクロホスファミドの 6-8 週 BALB/c マウスに静脈内 (IV) 配信を 100 mg/kg を実行します。これにより、腫瘍生着せず重要な lymphodepletion17 (図 4)。
注:A20 を確立するリンパ腫は、最適率で 2 ヶ月以上かかります。これは、リンパ腫細胞の配信前に 1 日シクロホスファミドの使用によって改善できます。Lymphoreplete マウスを研究するために lymphodepletion を発生させることがなくリンパ腫の効率を上げることができるシクロホスファミドの投与量を同定しました。 - 次の日、マウス静脈内 (IV) 注射で 5 × 105同系 A20 B 細胞リンパ腫細胞ルシフェラーゼと緑の蛍光蛋白質 (GFP) を表現する変更の 100 μ L を注入します。
- 全身のリンパ腫を開発するマウスを許可する 〜 17 日。
- 100 μ L 30 mg/mL ルシフェリン ・ イメージング システム体内の発光イメージングの腹腔内 (IP) 投与による全身リンパ腫の存在を確認します。
- 隣接するマウスに信号の波及を避けるために区切り記号を使用します。興味の一定の大きさで分類された地域と腹側に 1 分のマウスを公開します。
- (P/秒) 光子として相対的なライト ユニット (RLU) を表示します。各腫瘍モデルの設定を最適化する必要があります。腫瘍の早期発見を拾うことができますが、腫瘍のエンドポイントに達すると飽和にはつながらない露出を使用します。
- 定数と各マウスのレコードの合計 RLU 関心領域のサイズ。(図 5 aとb)。
- 確立された軸受 lymphoreplete マウスに静脈注射による 1 x 106車 T 細胞の単回投与リンパ腫を注入します。
注: (重要)レベルを投与する必要があります確立ごと車建設車 T 細胞から生じるすべての可能な毒性の特徴は、対処できることを確保するため線量エスカレーション スケジュールを使用しています。抗マウス CD19 車 T 細胞に毒性が表示されないが、車 T 細胞は予期しない毒性に上昇を与えることができます。ここで複数の車の構成要素と伝達効率が同一ではない T 細胞投与の合計数おきましょう等しいセル準備に T 細胞の非導入の付加によって。 - 30 mg/mL ルシフェリン ・ イメージング システム (図 5 c)体内の発光イメージングの毎週 100 μ L の IP 注射を通して病気の進行を監視します。
- 密接に毒性の印をマウスを監視し、任意の苦しみが生じる前に、後肢麻痺 (HLP) または病理学的腫瘍負荷の初期の兆候を示すマウスを安楽死させます。
注:A20 リンパ腫から毒性は、髄膜の腫瘍浸潤による後肢麻痺を含めることができます。変更された歩行の初期の兆候を定期的にチェックします。同様に、大規模な IP の腫瘍は、行動変化によって示されている不快感につながることができますが発生します。 - 60-100 日間 (図 5 d) のマウスの生存率を監視します。実験の結論にスケジュール 1 法による安楽死を実行します。
- シクロホスファミドの 6-8 週 BALB/c マウスに静脈内 (IV) 配信を 100 mg/kg を実行します。これにより、腫瘍生着せず重要な lymphodepletion17 (図 4)。
-
プロトコル 2
- 6 には、8 週間の古い BALB/c マウス尾静脈注射 100 μ L の PBS のマウスごとに 200 mg/kg のシクロホスファミドを提供します。
- 次の日に 5 × 105同系 A20 B 細胞リンパ腫細胞 100 μ L PBSで尾静脈注射で GFP とルシフェラーゼを表現するを注入します。
- 全身のリンパ腫を開発するマウスを許可する 〜 7-14 日
- IP 30 mg/mL ルシフェリン ・ イメージング システム体内の発光イメージングの 100 μ L 注入して全身のリンパ腫を確認します。
- Lymphodepletion 0.02 Gy/分 5 Gy 全身照射 (TBI) を実行します。
注:車 T 細胞治療を受けている患者を受ける車 T 細胞に対しての生着が大幅増加の管理転送車 T 細胞前に lymphodepletion を達成するために療法の範囲。これは、総ボディ照射 (TBI) (図 6) を持つマウスでレプリケートできます。 - 次の日に 100 μ L の PBSで尾静脈設立軸受マウス注入腫瘍で 1 x 106トン車のセルを挿入します。
- 7 日後血液サンプルで尾静脈出血を収集します。
- 各血液サンプルに赤セル換散バッファーを追加し、セクション 3 で説明したようにフローサイトメトリーの準備します。フローサイトメトリー (図 2) によって循環の車 T 細胞の永続性を分析します。
注:フローサイトメトリー直前カウント ビーズの血液 1 ミリリットルあたり車 T 細胞数の決定できます。 - 5.1.5 - 5.1.8 (図 7) の手順で説明するよう、病気の進行状況を監視します。
Representative Results
T 細胞の高効率伝達、新鮮なレトロ ウイルス粒子を得る必要です。PCL-エコ プロデューサー プラスミドと pMP71 レトロ ウイルス プラスミド Plat E セルラインの transfection 細胞培養上清にレトロ ウイルス粒子の分泌を生じさせる。レトロ ウイルスには mCherry などの蛍光マーカー遺伝子、エンコード、蛍光顕微鏡 (図 1) によって成功したトランスフェクションを確認できます。Transfected Plat E 細胞からウイルスを含む上清を使用して、T 細胞を介して2 スピン fection フィブロネクチン フラグメント コーティング プレート ラウンドを変換します。4 日後にフローサイトメトリーを介して伝達、情報伝達の効率を決定できます。正常に導入された細胞は、レトロ ウイルス (図 2) でエンコードされたマーカー遺伝子を表現します。伝達効率の範囲から 〜 50-90% 効率を第一世代受容体 〜 レトロ包装容量に近い車との 10-40% を構築します。マーカー遺伝子の発現を示して成功したレトロ ウイルス伝達、エクスプレス ターゲット抗原を表面に細胞に車 T 細胞の機能に重要です。特急ルシフェラーゼに変更ターゲット細胞は、車 T 細胞直接 (図 3 a) による細胞死の程度をテストするルシフェラーゼ アッセイに使用できます。車 T 細胞共培養と標的細胞、ELISA、によって決まりますからエフェクター サイトカインの放出は車 T 細胞細胞毒性 (図 3 b 3 C) の間接的な指標としても使用できます。
このプロトコルで生産車 T 細胞は、シクロホスファミド (注射)、5 x 10 の5の A20 のセル (図 4) の点滴前に 1 日の 100 mg/kg の投与で全身の A20 リンパを確立することにより lymphoreplete マウスで評価できます。体内の発光イメージャを用いたルシフェリンとイメージのキャプチャと IP 注入 (図 5 a-C) を通して一定の投資収益率と露出時間を使用して腫瘍負荷を監視する使用できます。特急 IL 12 に変更車 T 細胞 lymphodepleting プレコンディショニング マウス (図 5) の約 25% で無病生存率を与えることで全身のリンパを根絶することが可能です。Lymphodepleting 前処理、5 により Gy TBI 車 T 細胞の IV 投与前 1 日大幅に向上生着 (図 6)。このモデルでは、第一世代車 T 細胞は通常のマウス (図 7) 100% で無病生存率を誘導する全身の A20 リンパを根絶することが可能です。
図 1。E ぷらっと細胞の正常なトランスフェクションの確認。ぷらっと-E 細胞をトランスフェクトした pcl エコ包装ベクトル プラスミド DNA と pMP71 レトロ車構造。MCherry 蛍光マーカー遺伝子の発現による成功したトランスフェクションが表示されます。A)明視野顕微鏡B)蛍光顕微鏡とC)マージされた画像が表示されます。倍率 = 50 X。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。フローサイトメトリーによる伝達効率を決定する。フローサイトメトリーを使用して 4 日目の記事の伝達、ゾンビ UV ライブ/デッド、mCherry、BV711 を使用してのマウス T 細胞の伝達効率が決定し、ライブの検出のための BV785、車構築、CD4 および CD8 細胞それぞれ。代表の結果A) 非導入B) mCherry.αmCD19.mCD3z とC) mCherry.αmCD19.mCD3z.mIL12 が表示されます 1 のゲート) シングレット 2) 細胞 3) CD4 と CD8 4) と 5) 評価車を表現する mCherry 陽性細胞の。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。車 T 細胞活性の検証します。ΑmCD19 車 T 細胞は、特急のルシフェラーゼに変更 A20 リンパ腫細胞共培養 (1 x 10 の4: 1 x 10 の4) U 下 96年ウェル プレートで 16 時間。共培養後細胞が小球形し、上澄みが収集されました。A)セル、PBS に再懸濁と luminometry が標的細胞の生存率を評価するために使用されました。培養上清を肝腎 (B) および (C) の il-12 の存在を評価しました。標的細胞車 T 細胞の比率と共培養期間の長さを最適化する必要がありますそれぞれの車を構築し、細胞をターゲットします。PMA およびイオノマイシン治療は、T 細胞と対応する彼らの機能細胞の品質を確認する肯定的な制御として使用できます。エラー バー表示 SD. 統計的一方通行 ANOVA を使用して分析を行った。p < 0.001)。この図は、17 日から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。Lymphodepletion なし A20 リンパ腫を確立します。シクロホスファミドは、lymphodepletion を発生させることがなくリンパ誘導の効率を増やすことができます。A)シクロホスファミドの 100 mg/kg の IV 配信後 6-8 週齢 BALB/c マウスの血球数測定。誤差範囲を示す SD B)シクロホスファミドまたは-1 の日に生理食塩水の 100 mg/kg の IV 配信と、ルミノを用いて 0 日目に 5 × 105 A20 のセルの IV 配信後 6-8 週齢 BALB/c マウスのリンパ腫負担。C) マウスの生存B)。エラー バー表示 SD. 統計的分散分析 2 ウェイを使用して分析を行った。* * p < 0.01 * * * p < 0.001)。この図は、Kueberuwaらから変更されています。17.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5。リンパ腫の負担と生存率を監視します。ルシフェラーゼを表現する A20 リンパ腫を軸受マウス 100 μ L 30 mg/mL ルシフェリンの腹腔内 (IP) 注射を受けるし、体内の生物発光イメージング システムを使用してをイメージしました。A)マウスいた腹側上で 1 分間さらされ、すぐにイメージ(B)体の両側に腫瘍塊をピックアップして背側に横転します。C) BALB/c マウス受信 lymphodepletion なしのさまざまな αmCD19 車 T 細胞のリンパ腫負担の代表の結果。誤差範囲を示す SEM. D)同じのマウスの生存率。この図は、Kueberuwaらから変更されています。17.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6。Lymphodepletion の効果。A) 0.02 Gy/分; の線量率で 5 Gy TBI を受け取った後の 6-8 週齢 BALB/c マウスの血球数誤差範囲は、二元によって SD. 統計的分析を示します。p < 0.05 * * p < 0.01 * * * p < 0.001。B) + cd4 陽性の監視および CD8 mCherry マーカー遺伝子の 7 日間の記事管理のフローサイトメトリーによるマウスの末梢血細胞の+トン車。エラー バーが表示の SDこの図は、Kueberuwaらから変更されています。17.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7。Lymphodepleting 前処理と車 T 細胞活性。車 T 細胞の投与前日 5 Gy TBI の効果を示す典型的な結果。A) 30 mg/mL ルシフェリン、体内の生物発光イメージング システムを使用しての 100 μ L 腹腔内 (IP) 注射後マウスのイメージングの画像と(B)のグラフィカルな表示。誤差範囲を示す SEM. C)同じのマウスの生存率。この図は、変更された fromKueberuwaらをされています。17.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
同系マウス モデルは、無傷の免疫システムを維持しながら病気の進行と治療のテストを許可します。それは免疫システムや特に免疫療法剤のためとの対話セラピーに来るとき、これは重要です。
ここで説明されているプロトコルは 2 つの重要な作業の流れは、最初の 1 つは車を表現するマウス T 細胞に遺伝子改変します。これには、情報伝達系の検証開始から 7 日間が必要です。付随車 T 細胞の生産と、マウスの全身のリンパ腫の施設です。必要があります車の T 細胞の生産が失敗するか、品質が不十分なマウスの前に交換用電池を製造する時間が通常ないリンパ腫に負けます。したがって、正確にこれらのモデルを用いた研究者が治療的投与の時間車の T 細胞の生産を正常にするために腫瘍の投与と病気進行の研究を実行することが重要です。
典型的な T 細胞伝達効率が低い理由には、プロデューサー細胞、貧しいプラスミド純度やトランスフェクション メディアの pH の不正確な決定によって引き起こされる通常の貧しいトランスフェクション効率が含まれています。貧しいトランスフェクションが T 細胞伝達の効率性を制限するように、完全なプロトコルに進む前にプロデューサー細胞トランスフェクションの効率を確認することをお勧めします。組換えの人間のフィブロネクチン断片化物も回収し再利用、-20 ° C で保存されているただし、減らされた伝達効率の複数の凍結・解凍の繰り返しは結果。コレクションも高くするため重要です後のマウス脾臓の迅速な処理が可能な T 細胞の生成されます。
ルシフェラーゼを発現する A20 細胞をここで説明したプロトコルに利用されるに注意してください。これは最寄り生物発光イメージングによる全身の腫瘍量を測定する機能を提供します。ただし、機能の免疫システムの存在下でルシフェラーゼ レスポンス結果のスキューでした。我々 は以前、存続マーカー遺伝子17にマウスの免疫反応をテストしています。これらは免疫細胞によって腫瘍根絶に重要な役割を再生しない transgenes の無料 A20 のセルを使用して、検証するキーの実験を複製するキーです。
臨床エージェントことができます使用される生体内で免疫欠損マウスがのみ、マウス癌細胞に対してマウス車 T 細胞の使用は、免疫治療の有効性や病気の進行の貢献を評価する私たちことができます。このプロトコルは、B 細胞性リンパ腫または他の車と IL-12 ここで説明の分泌など追加の変更を対象と車の前臨床評価に利用できます。同系マウス モデルで免疫細胞間の相互作用を評価できるが可能性がありますいない正確に要約する生体内で人間の相互作用に注意する必要があります。特定の人間に注意し、下流の結果; 可能性のある構造で変わるマウス車T 細胞の成長のための最適な活性化と細胞培養条件が異なる20人間とマウスのターゲット抗原の発現の組織分布が異なる場合があります、経験豊富な毒性は根本的に異なる場合があります。つまり、前のヴィヴォと結果を確証する異種モデルを使用するため。
要約すると、同系 lymphodepleted とリンパ腫の lymphoreplete モデルは、前化学療法/放射線療法と患者を要約します。これは、新しい免疫療法剤の到来波で重要となる治療戦略の範囲をテストできるように臨床現場を模倣するためのモデル システムを提供します。
前処理の使用、すべてのマウスが通常リンパ腫をオフことが注意されます。人間の 90% 完全な回収率にこれは代表です。ただし、CD19 車 T 細胞療法の課題は, 再発の高周波を防止にかかって CD19 では多い。再発がみられないこのモデルと多くの場合 100 日を超える。クリニックで見られる再発を模倣する変更は、CD19 車 T 細胞療法の今後の課題と助けることができます。
Disclosures
デビッド満田車 T 細胞の産生に関与する Celyad のために働きます。著者の残りの部分を開示するものがあります。
Acknowledgments
この研究 (グラント 13031)、この作業を支援する CRUK マンチェスターの生物資源の分子生物学とフローサイトメトリー イメージング ユニット コアの設備資金を調達のため Bloodwise に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm syringe filter | Appleton Woods | FC121 | |
| 0.45 µm syringe filter | Appleton Woods | FC122 | |
| 1.5ml pestle and microtube | VWR | 431-0098 | |
| 100X penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) | Gibco | 10378016 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350-010 | |
| Blasticidine S hydrochloride | Sigma- Aldrich | 15205 | |
| Bottle Top Filter (0.2 µm) | Scientific Laboratory Supplies | FIL8192 | |
| Brilliant Violet 711 anti-mouse CD8a Antibody | BioLegend | 100759 | 1 in 100 staining dilution. Clone 53-6.7 |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse CD4 Antibody | BioLegend | 100552 | 1 in 100 staining dilution. Clone RM4-5 |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma- Aldrich | C7902 | |
| Cell counting beads – CountBright absolute counting beads | Molecular Probes | C36950 | |
| Cell Strainer 100μm | VWR | 734-0004 | |
| Cyclophosphamide Monohydrate | Merck | 239785-1GM | |
| Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) - High Glucose | Sigma Aldrich | D6546 | |
| Dynabeads | Gibco | 11131D | |
| Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | GE17-1440-03 | Sold by Sigma- Aldrich |
| Flow cytometer - LSR Fortessa x20 | BD Biosciences | 658222R1 | |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10270 | |
| Haemacytometer | Appleton Woods | HC001 | |
| HEPES solution | Sigma- Aldrich | H0887 | |
| IL-12 p70 Mouse Uncoated ELISA Kit | Invitrogen | 88-7121-76 | |
| IL2, Proleukin | Novartis | PL 00101/0936 | |
| in vivo bioluminescence imaging system – in vivo xtreme II imaging system | Bruker | T149094 | |
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma- Aldrich | I0634 | |
| Live/dead stain - Zombie Violet Fixable Viability Kit | BioLegend | 423114 | 1 in 100 staining dilution |
| Luminometer - Lumistart Omega | BMG Labtech | 415-301 | |
| Murine IFN-γ ELISA kit | Diaclone | 861.050.010 | |
| Paraformaldehyde | Sigma- Aldrich | 16005 | |
| pCL-Eco | Novus Biologicals | NBP229540 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma- Aldrich | P8139 | |
| Platinum E cell line | Cell Biolabs | RV-101 | (RRID:CVCL_B488) |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 | BD Biosciences | 553294 | Clone 37.51 |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3ε | BD Biosciences | 553057 | Clone 145-2C11 |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | 1 in 100 staining dilution. Clone 2.4G2 |
| Puromycin Dihydrochloride | Sigma- Aldrich | P8833 | |
| Recombinant human fibronectin fragment - RetroNectin Reagent | TaKaRa | T100B | |
| Recombinant Mouse IL-7 (carrier-free) | BioLegend | 577806 | |
| Red cell lysis buffer | eBioscience | 004-4333-57 | |
| RPMI 1640 Medium | Lonza | BE12-167F | |
| Trypsin - EDTA solution | Sigma- Aldrich | T3924 | |
| XenoLight D-Luciferin | Perkin Elmer | 122799 |
References
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