Summary
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול עבור ייצור ובדיקות קדם-קליניות של תאי T המכונית CD19 מאתר על ידי התמרה חושית retroviral וסילוק כטיפול נגד לימפומה A20 B-cell syngeneic שהוקמו בעכברים BALB/c עם או בלי lymphodepleting מיזוג מראש.
Abstract
להצלחת קליני מדהים CD19 chimeric אנטיגן קולטן (מכונית) T-cell טיפול הוביל לאישור של הדור השני שני רצפטורים chimeric אנטיגן (מכוניות) עבור לוקמיה לימפובלסטית חריפה (ALL) andnon הודג'קין (NHL). המוקד של השדה הוא עכשיו על חיקוי הצלחות אלה אחרים ממאירות hematological היכן שנצפו המחירים מענה מלא פחות מרשים. הנדסה נוספים של תאי T רכב או ניהול משותף של אחרים לטיפול לאופנים עשוי בהצלחה להתגבר על מכשולים בפני טיפול מוצלח בהגדרות אחרות סרטן.
לכן נציג מודל שבו אחרים יכולים לנהל בדיקות קדם-קליניות של תאי T המכונית CD19. תוצאות ב B-cell לימפומה המודל גם בדקה נוטים להיות אינפורמטיבי המכונית T-cell טיפול באופן כללי.
פרוטוקול זה מאפשר ייצור לשחזור של העכבר בתאי T המכונית דרך סידן פוספט תרביות תאים, התאים מפיק Plat-E עם בונה retroviral MP71 ו- pCL-Eco אריזה פלסמיד ואחריו אוסף של חלקיקים retroviral המופרש, התמרה חושית באמצעות המקטע fibronectin האנושי רקומביננטי וגם צנטריפוגה. אימות של retroviral התמרה חושית, אישור על היכולת של תאי T המכונית להרוג היעד לימפומה תאים ex-vivo, באמצעות cytometry זרימה, luminometry ו- immunosorbent מקושרים-אנזים assay (אליסה), גם מתואר.
פרוטוקולים לבדיקת רכב T תאים ויוו ב lymphoreplete, עכברים syngeneic lymphodepleted, הנושאת לימפומה הוקמה, מערכתית מתוארים. פעילות נגד סרטן נמצא בפיקוח ויוו ביולומינסנציה ומחלות התקדמות. אנחנו מראים תוצאות טיפוסיות של מיגור הוקמה B-cell לימפומה כאשר ניצול 1סנט או דור 2nd מכוניות בשילוב עם מיזוג טרום lymphodepleting, מיעוט של עכברים בהשגת הפוגות לטווח ארוך כאשר ניצול המכונית T תאים המבטאים IL-12 בעכברים lymphoreplete.
פרוטוקולים אלה ניתן להשתמש כדי להעריך בתאי T המכונית CD19 בשינוי נוספים שונים, שילובים של תאי T רכב וסוכני טיפוליים אחרים או הותאם לשימוש של תאי T מכונית נגד אנטיגנים היעד שונה.
Introduction
Chimeric אנטיגן קולטן (מכונית) T-cell טיפול הראו הצלחה קלינית מדהים לטיפול CD19+ ממאירות מובילים לאישור tisagenlecleucel הישנות לוקמיה לימפובלסטית חריפה1 , axicabtagene ciloleucel מתקדמת גדולים B-cell לימפומה שאינה הודג'קין2 -2017.
החשיבות של אינטראקציות בין סרטן לבין המערכת החיסונית התקדמות המחלה והן מנגנונים טיפולית הופך להיות מוכר יותר ויותר3,4,5. לדוגמה, זה מתועד היטב כי הגידול microenvironment (טיים) הוא מוצף הגורמים יכול לדכא את הפונקציות אפקטור של תאים חיסוניים-6,-7,-8. לחלופין לקרקע של תאים חיסוניים אנדוגני והפצת epitope יכול להיות המפתח הגידול מיגור עמידות לטווח ארוך הגידול אתגר9,10. שתי תופעות אלו לא ניתן להעריך בדגמי xenogeneic חוסר מערכת חיסונית. באופן דומה, למערכות ניצול חלבונים הטרנסגניים אינן משקפות במדויק את האתגר של שבירת סובלנות המערכת החיסונית, אשר נדרש עבור epitope הפצת11,12. דגם syngeneic עם מערכת החיסון מתפקדת במלואה, לפיכך, הוא בעל חשיבות עליונה עבור מידול היבטים חשובים אלה של הרפוי התקדמות, החיסון של מחלות סרטן.
הקונה חשוב של המכונית T-cell טיפול הוא מיזוג מראש lymphodepleting נדרש עבור הצלחה טיפולית13,14. זו מושגת בדרך כלל בחולים על ידי מתן כימותרפיה לפני אינפוזיה של המכונית T תאים15,16. בתור שיטה סטנדרטית, כדי לחקות lymphodepletion נעשה שימוש בהגדרה החולה, אנחנו מפקחים על 5 Gy גופית (TBI) כדי להשיג את lymphodepletion לפני ניהול של תאי T המכונית טיפולית לעכברים הנושאת מערכתית A20 B-cell לימפומה.
בעוד lymphodepleting מיזוג מראש אינה בעיה עבור רוב החולים, רעילות שמגיע עם סוכנים כימותרפיות אומר כי מטופלים של מצב ביצועים נמוכים אינם זכאים לטיפול המכונית T-cell. כדי ליצור מערכת הבדיקה המייצג את המטופלים מושעים. lymphodepletion, הקמנו העכבר syngeneic lymphoreplete מודל שבו אנחנו דגם המכונית T-cell טיפול של לימפומה. במודל זה, הראינו כי ההפרשה של IL-12 מ בתוך תאי T המכונית יכול להוביל מיגור לימפומה הוקמה עם שיעור הצלחה של ~ 25%17. יתר על כן, הראינו כי תאים חיסוניים אנדוגני היו מעורבים מיגור הסרטן.
כאן נתאר בפירוט הפרוטוקול עבור הייצור של תאי T רכב העכבר, הקמת לימפומה עכברים syngeneic, וטיפול של לימפומה עם המכונית T תאים עם או ללא שימוש lymphodepleting מיזוג מראש. זה יכול לשמש ללימודי שילוב של תאי T המכונית עם סוכנים אחרים, בדיקות רכב T תאים עם אחרים transgenes או לשימוש של אסטרטגיות טיפול או חיסוני אחרים בתא המאמצת נגד לימפומה.
Protocol
כל הניסויים נערכו תחת חסותה של המעשה חיות (וצפייה) 1986 ותחת ועדת תיאום בבריטניה לקבלת הנחיות לחקר הסרטן. מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל היו שנערך במכון CRUK-מנצ'סטר ואושרו על-ידי רווחת בעלי חיים מקומיים וסקור אתיקה הגוף (AWERB CRUK-MI).
1. תכשירים
- Maxiprep pMP71 retroviral לבנות פלסמיד ו- pCL-Eco הרטרווירוס אריזה פלסמידים18.
הערה: pMP71 מקודד mCherry והמכונית מופרדות מרצף FMDV2A. . זה להחלפה עם בונה retroviral אחרים. pCL-Eco מקודד איסור פרסום, פול פוט, החלבונים מעטפה ecotropic. - היכונו culturing העכבר T תאים באמצעות RPMI 1640 בינוני, FCS 10%, 1% 100 x פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין (פריז סן ז'רמן) תא T שלם בינוני (TCM).
הערה: הפתרון מכיל 100 IU/mL פניצילין, µg/mL 100 של סטרפטומיצין, 2 מ מ של L-גלוטמין), 50 μM β-mercaptoethanol וחומצה 25 מ מ 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES). - תרבות בתאים A20 RPMI 1640, FCS 10% וβ-mercaptoethanol מ מ 0.05-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
- התרבות התאים פלטינה-E (Plat-E) של Dulbecco מלאה נשר ששונה בינוני (DMEM) (DMEM עם 10% עגל עוברית סרום (FCS), 2 מ מגלוטמין, 1 μg/mL puromycin ו- blasticidin μg/mL 10) ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2-
הערה: Plat-E תאים נגזרים מתאי 293T ולבטא את הבדיחה, פול פוט, ecotropic מעטפה retroviral חלבוני. - הכנת תקנים פתרונות מדיה 1 ו- 2 מייד לפני תרביות תאים. להכין פתרון 1 (pH 7.9) כדי להכיל DMEM + 10% FCS + 25 מ מ HEPES, פתרון 2 (pH 7.1) כדי להכיל DMEM + 25 מ מ HEPES.
- להכין 10 μg/mL fibronectin האנושי רקומביננטי פרגמנט פתרון על ידי דילול עם סליין סטרילי באגירה פוספט (PBS) ולאחסן ב-20 ° C עד השימוש.
- סטרילי לסנן כל המדיה דרך מסננים μm 0.2 לפני השימוש (למעט קטע רקומביננטי fibronectin אנושי).
2. retroviral התמרה חושית של תאי T
- יום 1: הכנה תרביות תאים
- זרע 7.5 x 106 פלטינה-E (Plat-E) תאים במנות 15 ס מ2 תרביות רקמה ב 18 מ של DMEM מלאה, דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
- יום 2: תקנים של פלאט-E אריזה retroviral תא קו
- להכין μg 20.4 של pcl-Eco אריזה וקטור ה-DNA, μg 39.6 של DNA פלסמיד קידוד retroviral לבנות מכונית ו 150 μL של 1 מ' CaCl2 לנפח סופי של 3 mL תרביות תאים פתרון 2 לכל מנה2 15 ס מ כדי להיות transfected. מערבולת עבור 10 s ו לנוח 5 דקות
- הסר DMEM מדיה של 15 ס מ2 הכלים והחלף 12 מ של תרביות תאים פתרון 1.
זהירות בעת שינוי בתקשורת, יכול לייבש הכלים2 15 ס מ במרכז. זה יכול לגרום מוות משמעותי transfected תאים Plat-E. לעבוד במהירות, להסיר מדיה רק 1-2 צלחות בכל פעם. - להוסיף 3 מ"ל תרביות תאים פתרון 2 המכילה DNA ו CaCl2 על כל מנה2 15 ס מ drop-wise, באופן שווה על פני כל צלחת. בעדינות לוחות אבן עם תנועה מצד לצד על Incubate ס' 10 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 בן לילה.
- יום 3: הכנת המכיל וירוס supernatant עבור התמרה חושית
- החלף המדיה של תאים בצלחת-E transfected עם 18 mL להשלים TCM ולחזור חממה.
זהירות מתי לשנות את המדיה 15 ס מ2 הכלים יכול לייבש במרכז. זה יכול לגרום מוות משמעותי transfected תאים Plat-E. לעבוד במהירות, להסיר מדיה רק 1-2 צלחות בכל פעם.
- החלף המדיה של תאים בצלחת-E transfected עם 18 mL להשלים TCM ולחזור חממה.
- יום 3: בידוד, במבחנה הפעלה של תאי T הטחול העכבר
- הסר טחולים עכברים BALB/c 6-8-בת שבוע כאמור מתוארת על ידי פרקינסון. et al. 19 , לטבול אותם סטרילי, קר כקרח, PBS צינור חרוטי 50 מ ל.
- השתמש פינצטה כדי להעביר על הטחול צינור microcentrifuge 1.5 mL ו- homogenize באמצעות כבעלי כוח מינימלי.
- להשתמש על פיפטה 1000 μL ו ~ 800 PBS μL להעביר homogenate מסננת תא נקבובית 100 μm למוט שפופרת 50 מ ל המכיל 5 מ"ל PBS להשיג השעיה תא בודד. חזור על צעד 2.4.2 טחולים נוספים. לא יעלה על 3 טחולים למחזור.
זהירות Splenocytes עברו סינון יכולים ליצור גושים אם נותרו על עומדם. באופן ידני מערבולת צינורות לסירוגין אם עיבוד טחולים מספר כדי להימנע תא הצליעה. הנותרים קטעים על מסננת התא יכול עוד להמחץ בעזרת פומפה של מזרק 5 מ ל באמצעות כוח מינימלי. - למעלה עד 20 מ"ל עם PBS. שכבת התליה תא 20 מ"ל בעדינות על גבי 20 מ"ל של התקשורת הדרגתיות צפיפות (טבלה של חומרים) שפופרת 50 מ. Centrifuge התליה הלשונית תוצאות ב g x 800 כעשרים דקות עם בלי בלמים מוחל.
- הקציר התאים בשכבת ממשק באמצעות פיפטה פסטר סטרילי העברת צינור 50 מ. למעלה עד 50 מ עם PBS, צנטריפוגה ב g 800 x 10 דקות לשטוף. למחוק את תגובת שיקוע והשהה מחדש את התאים ב- TCM מלאה.
- לספור את מספר תאים באמצעות של hemocytometer.
- התרבות תאים על צפיפות של 5 x 106 תאים/מ ל TCM להשלים עם 30 נוגדן anti-CD3ε ng/mL (כפיל 145-2 ג 11), 30 נוגדן anti-CD28 ng/mL (שיבוט 37.51), 100 U/mL רקומביננטי האנושי il-2, 2 ng/mL רקומביננטי מאתר IL-7. השתמש הבקבוקון של תרביות רקמה בגודל מתאים עבור אמצעי האחסון של תאים שנקטפו.
הערה: תאים המציג אנטיגן–נדרשים להפעלת T-cell באמצעות נוגדנים CD3 ו- CD28, אם עובדים עם תאי T מזוכך זה יש צורך המעיל צלחות עם נוגדנים, או להשתמש beads מגנטי (טבלה של חומרים) - דגירה העכבר splenocytes ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 בן לילה.
- יום 3: הכנת לוחות עבור התמרה חושית
- מעיל הלא-רקמה-תרבות 6-ובכן צלחות עם 2 מיליליטר 10 μg/mL fibronectin האנושי רקומביננטי קטע, דגירה בין לילה ב 4 º C.
- יום 4: התמרה חושית של העכבר T תאים
- להעביר פרגמנט רקומביננטי fibronectin אנושי מ מצופה לוחות ללוחות 6-ובכן טריים שאינם-רקמה-תרבות. דגירה הצלחות האלה בין לילה ב 4 ° C עבור סיבוב שני של התמרה חושית.
- להוסיף 2 מ ל TCM כל טוב של צלחות מצופה פרגמנט רקומביננטי fibronectin האנושי המקורי ולהשאיר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לחסום את הכריכה לא ספציפית.
- הקציר המכילות הרטרווירוס תגובת שיקוע מתאי transfected Plat-E בהחלף מ 18 ל TCM מלאה ומנות תרביות רקמה של 15 ס מ.
זהירות לפעול במהירות כדי למנוע ייבוש של תאים Plat-E.
הערה: ניתן לבדוק ההצלחה של תרביות תאים בשלב זה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ אם ניצול גנים סמן פלורסנט כגון mCherry (איור 1). - לסנן את תגובת שיקוע המכילות הרטרו וירוס דרך מסנן μm 0.45 כדי להסיר שאריות תאים. הסר TCM fibronectin האנושי רקומביננטי מצופים פרגמנט 6-ובכן צלחות ולהוסיף 2.5 מ של תגובת שיקוע המכילות הרטרווירוס מסוננים או מכל קידוח (שימוש להשלים TCM עבור תקנים מעושה). תווית בכל טוב עד כדי התוספת של רטרווירוס או מדיה מעושה.
- Centrifuge הלוחות ב g x 1200 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- בעוד צלחות מתחילים להסתובב, לאסוף תאי T מופעל ולספור באמצעות של hemocytometer.
- התמרה חושית מבוצע עם 5 x 10 splenocytes6 מופעל סך של 5 מ"ל/טוב. גלולה את המספר הנדרש של splenocytes עבור ואימץ/התמרה חושית צינורות נפרד על ידי צנטריפוגה ב 500 g x במשך 5 דקות.
- להשעות מחדש splenocytes על צפיפות של תאים6 5 x 10 לכל 2.5 מ של מסוננים תגובת המכילות הרטרווירוס שיקוע מהשלב 2.6.4 או TCM כפקד שלילי. להוסיף רקומביננטי il-2 בני אדם (היל-2) ועכבר רקומביננטי IL-7 (mIL-7) ריכוז סופי של 200 IU/mL ו- 4 ננוגרם למ"ל בהתאמה.
- לאסוף. ובכן 6 צלחות לצנטריפוגה בסיום שלב 2.6.5 ולהוסיף 2.5 splenocytes mL/טוב מחדש מושעה ולס המתאימות כדי ליצור נפח הסופי של 5 מ"ל/טוב, ריכוז סופי של 100 U/mL היל-2 ו- 2 ng/mL mIL-7.
- Centrifuge הלוחות ב g x 1200 במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה, דגירה הצלחות ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 בן לילה.
- יום 5: 2 בסיבוב של התמרה חושית
- לאסוף השבר fibronectin האנושי רקומביננטי הצלחות כמו זה יכול להיות שימוש חוזר. חזור על שלבים 2.6.2 - 2.6.5.
- בעוד צלחות מסתובבים, לאסוף תאים 1סנט עגול של התמרה חושית באמצעות פיפטה של פסטר. לשטוף כל טוב עם 2 מ"ל PBS, מערבולת ולאסוף את כל התאים הנותרים מכל קידוח.
הערה: פיפטה למעלה ולמטה כדי להשעות מחדש תאים sedimented. לאסוף את כל קבוצת הבקרה/התמרה חושית צינורות נפרדת. - צנטריפוגה צינורות ב 500 x g עבור 5 דק להשעות מחדש תאים 2.5 מ לכל טוב של התמרה חושית עם 200 IU/mL il-2 ו- 4 ננוגרם למ"ל IL-7. חזור על שלבים 2.6.7 - 2.6.8.
- להסיר תאים לצנטריפוגה, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 עבור תאים 4 h. transduced לאסוף כמו צעדים 2.7.2-2.7.3.
- לספור תאים, צנטריפוגה ב 500 x g למשך 5 דקות, להשעות מחדש ב- TCM מלאה על צפיפות של עונה 1 פרק 106 תאים למ"ל עם 100 U/mL היל-2 ו- 2ng/mL mIL-7. להעביר בקבוקון תרבות בגודל כראוי, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
- הוסף מדיה TCM טריים המכילים 100U/mL היל-2 ו- 2ng/mL mIL-7 כל יומיים, שמירה על צפיפות התאים של עונה 1 פרק 106 תאים/מ ל....
הערה: Splenocytes שנקטפו מכילים מגוון רחב של סוגי תאים. בתנאים אלה התרבות תאי T שאינם מתים ככה במשך 2-3 ימים. לאחר ~ 4 ימים בתרבות תא, המספר של תא T שווה בדרך כלל המספר הכולל של splenocytes שנקטפו ביום 0.
3. מדידה של יעילות התמרה חושית
- על יום 4 פוסט התמרה חושית, לאסוף דגימת תאי T transduced או אי-transduced (כ 3 x 105 תאים). Centrifuge התליה תא ב 500 x g למשך 5 דקות, למחוק את תגובת שיקוע, לשטוף את התאים pelleted פעם אחת עם PBS, צנטריפוגה שוב.
- למחוק את תגובת שיקוע והוסף μL 100 ל- PBS המכיל amine מתאימים תגובתי צבע (למשל, חי/מת הכתם, דילול 1 ל-100) לכל טוב. תקופת דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
- לשטוף פעמיים עם PBS צנטריפוגה ב 500 g x עבור 5 דק. להשליך תגובת שיקוע, דגירה עם μL 50 FACS מאגר המכיל אנטי עכבר נוגדנים CD16/CD32 עבור קולטן Fc חסימת (דילול 1 ל-100). תקופת דגירה של מינימום 10-4 מעלות צלזיוס.
- להוסיף ישירות μL 50 של נוגדן מכתים מיקס מאסטר המכילים אנטי עכבר CD4-BV786 ו CD8-BV711 נוגדנים (סופי ריכוז 1 μL הבאר במאגר FACS). תקופת דגירה של 30 דקות ב 4 ° C בחושך. חזור על השלב שטיפת 3.3. מחדש להשעות את התאים במאגר PFA 1% ולשמור בחושך ב 4 ° C עד ניתוח לפי cytometry זרימה.
- לנתח תאים עם המקבילה cytometer מתאים באמצעות קרינה פלואורסצנטית BV711, BV785 ו- mCherry כמו סמנים של CD4 ו CD8 משנה וביטוי המכונית בהתאמה gating כמו (איור 2).
4. במבחנה אימות של המכונית T cell פעילות
- זרעי syngeneic היעד CD19+ תאים סרטניים עם או בלי ביטוי לוציפראז צפיפות של עונה 1 פרק 10 תאים4 ב 100 μL TCM/טוב ב 96-ובכן U-תחתון צלחת תרביות רקמה.
- להוסיף 1 x 104 CD19 המכונית T תאים/טוב נפח של 100 μL טוב כדי להשיג אפקטור של היעד (E:T) יחס של 1:1.
הערה: E:T יחסי גלובאלים לכל מכונית לבנות והקצו שורת התאים. - שימוש T תאים לבד, תאים סרטניים לבד כפקדי שלילי ותאי T מגורה על ידי פעילים-phorbol-אצטט (PMA) (50 ng/mL), ionomycin (1 μg/mL) כפקד חיובי לשחרור אינטרפרון גמא (IFNγ). תרבות משותפת תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ב 16-24 שעות.
- בעקבות תרבות משותפת, centrifuge הלוחות ב 500 g x עבור 5 דקות ולאסוף את תגובת שיקוע לצורך ניתוח IFNγ ואליסה IL - 12 p 70 נוסף.
הערה: זה ניתן לאחסן ב- 80 ° c - מחדש להשעות תא כדורי ב- 100 μL ל- PBS המכילים luciferin (הריכוז הסופי של 1.5 mg/mL). דגירה הלוחות 10 דקות ב 37 º C. ואז למדוד את לומינסנציה מכל קידוח עם luminometer מתאים.
הערה: פעמים חשיפה חייב להיות אופטימיזציה עבור שורות תאים וצפיפות. התוצאות נציג מוצגים באיור 3 א. לשעבר-ויוו cytotoxicity של תאי T רכב יכול להיות שונה כדי luciferin אקספרס על-ידי תרבות משותפת עם שורות תאים המבטאים אנטיגן מטרה. כמו תאי T המכונית להרוג תאים היעד, luciferin הוא שוחרר, ולכן צמצום luminometry אות הוא מתואם עם תא להרוג. תאים transduced-שאינו יכול לעיתים קרובות יש השפעה על יכולת הקיום של תא המטרה, במיוחד על פני תקופות זמן הדגירה. מודדים את ריכוז מאתר IFNγ ו- IL - 12p 70 ב- תגובת שיקוע על פי פרוטוקולים אליסה של היצרן. התוצאות נציג מוצגים (איור 3b ו- 3 c). לשעבר-vivo הפעלה של המכונית T תאים על-ידי תרבות משותפת עם שורות תאים המבטאים אנטיגן מטרה ניתן לבדיקה באמצעות ניתוח תוכן supernatant באמצעות אליסה. היחס של תא T המכונית לתאי המטרה, אורך תקופת תרבות משותפת חייב להיות אופטימיזציה עבור בניית כל רכב, קו תא היעד או analyte. ובחום וטיפול ionomycin יכול לשמש כפקד חיובי כדי לוודא איכות תאי T והיכולת שלהם להגיב.
5. להעריך את פעילות אנטי סרטניים בעכברים
-
פרוטוקול 1
- לבצע 100 מ ג/ק ג תוך ורידי (IV) מסירת ציקלופוספמיד לתוך עכברים BALB/c 6 עד 8 שבועות. דבר זה מאפשר גידול engraftment ללא lymphodepletion משמעותי17 (איור 4).
הערה: הקמת A20 לימפומה יכול לקחת מעל חודשיים עם קצב שיוצרת לקחת. זה ניתן לשפר על ידי שימוש ציקלופוספמיד עד יום אחד לפני המסירה של תאים לימפומה. על מנת ללמוד lymphoreplete עכברים, זיהינו מנה של ציקלופוספאמיד זה יכול להגביר את היעילות של לימפומה מבלי לגרום lymphodepletion. - למחרת, להזריק 100 µL של 5 x 105 syngeneic A20 B-cell לימפומה תאים שונה כדי לבטא חלבון פלואורסצנטי, לוציפראז ו ירוק (GFP) לתוך עכברים בזריקה תוך ורידי (IV).
- לאפשר העכברים לפתח לימפומה מערכתית עבור ~ 17 ימים.
- לאשר הנוכחות של לימפומה מערכתית על ידי הזרקה בקרום הבטן (IP) של 100 μL של 30 מ"ג/מ"ל luciferin והדמיה באמצעות ביולומינסנציה של ויוו מערכת הדמיה.
- השתמש במפרידי כדי להימנע אות והתאמת לתוך עכברים סמוכים. לחשוף עכברים עבור 1 דקות בצד הגחוני עם אזור בגודל קבוע של עניין.
- מציגים יחידות קלות יחסית (RLU) פוטונים לשניה (p/s). הגדרות חייב להיות מותאם עבור כל דגם הגידול; השתמש של חשיפה יכולה לאסוף גילוי מוקדם של גידולים, אך לא תוביל רוויה כמו גידולים להגיע נקודות הקצה.
- RLU סה כ רשומות עבור כל עכבר עם קבוע בגודל אזור בעל עניין. (איור 5 א ו- b).
- תזריק מנה אחת של עונה 1 פרק 106 תאי T המכונית בזריקה הרביעי לתוך עכברים lymphoreplete הנושאת הוקמה לימפומה.
הערה: (חשוב) מינון רמות יש ליצור עבור כל מכונית לבנות בהתאם ללוח זמנים הסלמה מנה על מנת להבטיח כי כל רעילות אפשריות הנובעות בתאי T המכונית מאופיינים, ניתן לטפל. למרות אנטי-העכבר CD19 המכונית T תאים אינם מציגים רעילות, המכונית T תאים יכולים להצמיח רעילות בלתי צפויות. איפה המכונית בונה מרובים, התמרה חושית היעילות אינם זהים, המספר הכולל של תאי T מנוהל יש לשמור שווה על ידי התוספת של תאי T-transduced לתוך התא ההכנות. - לפקח על התקדמות המחלה שבועי דרך IP הזרקה של 100 μL של 30 מ"ג/מ"ל luciferin והדמיה באמצעות ביולומינסנציה של ויוו מערכת (איור 5 c) הדמיה.
- מקרוב לפקח על עכברים סימנים של רעילות, המתת חסד כל העכברים שמראים סימנים מוקדמים של שיתוק גפיים הינד (HLP) או נטל הגידול פתולוגיים לפני כל הסבל יכול להיווצר.
הערה: רעילות מ A20 לימפומה יכולה לכלול שיתוק גפיים הינד דרך הגידול הפלישה של קרומי המוח. בדוק בקביעות סימנים מוקדמים של דהירה מסולף. באופן דומה, גידולים גדולים IP יכול להיווצר אשר עלול לגרום אי נוחות שמוצג על ידי התנהגות שונה. - לפקח על הישרדות של עכברים 60-100 ימים (איור 5 d). לבצע המתת חסד על ידי שיטת תזמון-1 בתום הניסוי.
- לבצע 100 מ ג/ק ג תוך ורידי (IV) מסירת ציקלופוספמיד לתוך עכברים BALB/c 6 עד 8 שבועות. דבר זה מאפשר גידול engraftment ללא lymphodepletion משמעותי17 (איור 4).
-
פרוטוקול 2
- לספק ציקלופוספמיד 200 מ"ג/ק"ג ל- 6 - 8, בן שבועיים BALB/c לעכברים בזריקה הזנב וריד ב 100 μL ל- PBS לכל העכבר.
- למחרת, להזריק 5 x 105 syngeneic A20 B-cell לימפומה תאים המבטאים לוציפראז ו- GFP 100 μL PBS דרך הזנב וריד הזרקת.
- לאפשר העכברים לפתח לימפומה מערכתית עבור ~ 7-14 ימים
- לאשר לימפומה מערכתית על ידי הזרקת ה-IP של μL 100 של 30 מ"ג/מ"ל luciferin והדמיה באמצעות ביולומינסנציה של ויוו מערכת הדמיה.
- בצע 5 Gy גופית (TBI) ב- Gy 0.02 נקודות/דקה עבור lymphodepletion.
הערה: בחולים שעברו טיפולי רכב T-cell עוברים מגוון של משטרי כדי להשיג lymphodepletion לפני הממשל של תאי T רכב אשר מגביר באופן משמעותי את engraftment של adoptively הועבר הרכב T תאים. זה ניתן לשכפל אותו אצל עכברים עם גופית (TBI) (איור 6). - ביום הבא, להזריק עונה 1 פרק 106 תאי T רכב ב- 100 μL של גידולים PBS דרך הזנב וריד הזרקה לתוך עכברים הנושאת הוקמה.
- לאסוף דם דגימות דרך הזנב וריד דימומים לאחר 7 ימים.
- להוסיף מאגר פירוק תא אדום כדי שכל דוגמית דם ולאחר מכן להכין עבור cytometry זרימה כמתואר בסעיף 3. לנתח את המכונית T התמדה תא במחזור מאת cytometry זרימה (איור 2).
הערה: תוספת של חרוזים הספירה מייד לפני cytometry מאפשר קביעת המספר של הרכב T תאים למיליליטר דם. - לפקח על התקדמות המחלה כפי שתואר בשלבים 5.1.5 - 5.1.8 (איור 7).
Representative Results
עבור התמרה חושית של תאי T יעילות גבוהה, יש צורך להשיג את חלקיקי retroviral טריים. תרביות תאים של הקו תא Plat-E עם pCL-Eco מפיק פלסמיד, pMP71 הרטרווירוס פלסמיד מעורר הפרשת חלקיקים retroviral לתוך התא supernatant. כאשר הגן סמן פלורסנט, כגון mCherry, מקודד את הרטרווירוס, תרביות תאים מוצלח יכול להיות מאושרות על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ (איור 1). תגובת שיקוע המכיל וירוס מתאי Plat-E transfected משמש מגלי בתאי T באמצעות 2 סיבובים של ספין-fection על צלחות מצופה פרגמנט fibronectin. ניתן לקבוע את היעילות של התמרה חושית 4 ימים פוסט התמרה חושית ויה cytometry זרימה. בהצלחה transduced התאים לבטא את הגן סמן המקודדת את הרטרווירוס (איור 2). התמרה חושית יעילות בטווח שבין ~ 50-90% יעילות עם קולטני הדור הראשון ~ 10-40% עם המכונית בונה קרוב הקיבולת retroviral אריזה. בעוד התבטאות גנים מרקר מראה התמרה חושית retroviral מוצלח, הוא בעל חשיבות עליונה כדי להציג את הפונקציונליות של תאי T המכונית בעת עיסוק עם תאים זה אנטיגן מטרה מפורשת על פני השטח שלהם. שורות תאים יעד שונה כדי לוציפראז אקספרס יכולים לשמש לוציפראז מבחני כדי לבדוק את מידת תא-להרוג על-ידי תאי T רכב ישירות (איור 3 א). שחרורו של אפקטור ציטוקינים מתאי T המכונית על תרבות משותפת עם תאי היעד, נקבע על ידי אליסה, יכול לשמש גם כאמצעי עקיף של המכונית T תא cytotoxicity (איור 3B ו- 3 C).
תאי T רכב מיוצר פרוטוקול זה ניתן להעריך בעכברים lymphoreplete על ידי הקמת לימפומה A20 מערכתית עם מנה 100 מ"ג/ק"ג של ציקלופוספאמיד (מוזרק לווריד), עד יום אחד לפני הזרקת הרביעי של 5 x 105 A20 תאים (איור 4). הזרקת ה-IP עם luciferin ו לכידת תמונה באמצעות של imager ביולומינסנציה ויוו ניתן לעקוב אחר נטל הגידול באמצעות זמן ROI וחשיפה קבועים לאורך (איור 5 א-ג). תאי T מכונית שונה כדי express IL-12 מסוגלים ולחסל לימפומה מערכתית עם lymphodepleting מראש מיזוג נותן הישרדות ללא מחלה בכ-25% של עכברים (איור 5D). Lymphodepleting preconditioning, מושגת על ידי 5 Gy TBI עד יום אחד לפני המינהל הרביעי של תאי T המכונית, משפר באופן משמעותי engraftment (איור 6). במודל זה, דור ראשון רכב T תאים המסוגלים ולחסל מערכתית לימפומה A20, בדרך כלל גרימת מחלות הישרדות ב- 100% של עכברים (איור 7).
איור 1. אישור תקנים מוצלחת של תאים Plat E. Plat-E תאים transfected עם retroviral לבנות מכונית וזה pMP71 pcl-Eco אריזה וקטור פלסמיד ה-DNA. תרביות תאים מוצלחת מוצג על ידי ביטוי של הגן סמן פלורסנט mCherry. א) מיקרוסקופיית שדה בהיר, B) קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ ו ג) התמונות הממוזגות מוצגים. הגדלה = 50 X. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. קביעת התמרה חושית יעילות על ידי cytometry זרימה. Cytometry זרימה משמש כדי לקבוע את היעילות התמרה חושית של התאים בעכבר כדי אינטראקצ על פוסט יום 4 התמרה חושית, באמצעות UV זומבי חי/מת, mCherry, BV711, BV785 איתור חיים, מכונית לבנות, תאי CD4 ו CD8, בהתאמה. התוצאות נציג של א) Non-transduced, ב) mCherry.αmCD19.mCD3z ו ג) mCherry.αmCD19.mCD3z.mIL12 מוצגים עם gating 1) ללבישה 2) לחיות תאים 3) CD4 ו CD8 4) ו- 5) הערכה של mCherry תאים חיובית המבטאת את המכונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. אימות של המכונית T-cell פעילות. תאי T המכונית αmCD19 היו בתרבית במשותף עם תאים לימפומה A20 שונה כדי לוציפראז אקספרס (1 x 104: 1 x 104) עבור h 16 בצלחת התחתונה U 96-ובכן. אחרי תרבות משותפת, התאים היו מגורען, ואת תגובת שיקוע נאסף. A) התאים היו מתיחה מחדש ב- PBS, luminometry שימש להערכת הכדאיות של תאי היעד. תגובת שיקוע מתרבות שיתוף הוערכה לנוכחות של IFNγ (B) ו- IL-12 (ג). היחס של תא T המכונית לתאי המטרה, אורך תקופת תרבות משותפת חייב להיות מותאם לכל מכונית לבנות והקצו שורת התאים. ובחום וטיפול ionomycin יכול לשמש כפקד חיובי כדי לוודא איכות תאי T ותאי שלהם יכולת להגיב. קווי שגיאה הצג SD. Statistical והניתוח נעשה שימוש חד-כיווני אנובה. p < 0.001). איור זה השתנה מ17. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. הקמת A20 לימפומה בלי lymphodepletion. ציקלופוספמיד יכול להגביר את היעילות של לימפומה אינדוקציה מבלי לגרום lymphodepletion. A) ספירת דם של עכברים BALB/c 6-8-בת שבוע לאחר מסירת 100 מ"ג/ק"ג של ציקלופוספאמיד IV. קווי שגיאה הצג SD B) לימפומה הנטל של 6-8-בת שבוע עכברים BALB/c לאחר משלוח הרביעי של 100 מ"ג לק"ג ציקלופוספאמיד או תמיסת מלח ביום-1 ואספקה הרביעי של 5 x 105 A20 תאים ביום 0 הנמדד באמצעות luminometer של. C) הישרדות של עכברים ב- B). קווי שגיאה הצג SD. Statistical והניתוח נעשה באמצעות 2-way ANOVA. * * p < 0.01, * * * p < 0.001). דמות זו שונתה מ. Kueberuwa et al. 17. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5. ניטור נטל לימפומה הישרדות. עכברים הנושאת לימפומה A20 לבטא לוציפראז מקבלים 100 µL בקרום הבטן (IP) זריקות של 30 מ"ג/מ"ל luciferin, היו עם תמונה באמצעות ביולומינסנציה של ויוו מערכת הדמיה. א) עכברים היו חשופים ב 1 דקות על הצד הבטני, מיד התהפכה התמונה הגבי לאסוף את ההמונים גידול משני הצדדים של הגופים (B). C) התוצאות נציג מנטל לימפומה BALB/c עכברים שקיבלו αmCD19 משתנות המכונית T תאים ללא lymphodepletion. קווי שגיאה הצג ב- SEM D) שיעור ההישרדות של העכברים אותו. דמות זו שונתה מ. Kueberuwa et al. 17. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6. השפעות lymphodepletion. A) ספירת דם של עכברים BALB/c 6-8-בת שבוע לאחר קבלת 5 Gy TBI בקצב במינון של 0.02 נקודות Gy/דקה; קווי שגיאה הצג SD. Statistical ניתוח מאת אנובה דו-כיווני. p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001. B) ניטור של CD4+ ו CD8+ המכונית T תאים בדם ההיקפי של עכברים מאת cytometry זרימה עבור המינהל פוסט mCherry 7 ימים ג'ין סמן. קווי שגיאה להראות SD. דמות זו שונתה מ. Kueberuwa et al. 17. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7. רכב תא T פעילות עם מיזוג מראש lymphodepleting. תוצאות טיפוסי שמראה את השפעת 5 Gy TBI ביום שלפני מינהל הרכב T-cell. א) גרפית הדמיה ו- (ב) הדמיה של עכברים לאחר 100 µL בקרום הבטן (IP) זריקות של 30 מ"ג/מ"ל luciferin באמצעות ביולומינסנציה של ויוו מערכת הדמיה. קווי שגיאה הצג ב- SEM C) ההישרדות של העכברים אותו. איור זה היה. שונה fromKueberuwa et al. 17. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
עכבר syngeneic מודלים לאפשר בדיקה של התקדמות המחלה וטיפול תוך שמירה על מערכת חיסונית ללא פגע. זה הוא בעל חשיבות עליונה בכל הנוגע טיפולים המקיימים אינטראקציה עם מערכת החיסון, ובעיקר עבור סוכני immunotherapeutic.
הפרוטוקול המתואר כאן יש שני זרמים לעבודה חיונית, הראשון הוא שינוי גנטית עכבר תא T לבטא מכוניות. פעולה זו דורשת 7 ימים ממועד חניכה ובבטיחות התמרה חושית. בו-זמני עם הייצור של תאי T המכונית הוא הקמתה של לימפומה מערכתית בעכברים. צריך ייצור תאי T המכונית להיכשל או להיות באיכות מספיקה, זה בדרך כלל לא מספיק זמן כדי לייצר החלפת תאים לפני עכברים להיכנע לימפומה. לכן חיוני כי חוקרים באמצעות מודלים אלה במדויק לבצע הגידול מינון ומחלות התקדמות מחקרים על מנת בהצלחה זמן הייצור של תאי T רכב עבור ניהול טיפולית.
סיבות אופייניות ליעילות נמוכה של התמרה חושית T-cell כולל תרביות תאים עניים היעילות של תאים מפיק, לרוב הדבר נגרם בשל טוהר פלסמיד עני או לא מדויק קביעה של רמת ה-pH של תרביות תאים מדיה. מומלץ לבדוק את היעילות של תרביות תאים תאים מפיק לפני שתמשיך עם פרוטוקול מלא כפי תרביות תאים עניים יגביל את היעילות של T-cell התמרה חושית. שברי רקומביננטי fibronectin האנושי יכול להיות שנאספו, המאוחסנים ב-20 ° C לשימוש חוזר, עם זאת, התוצאה ההקפאה-thaws מרובים התמרה חושית מופחתת יעילות. עיבוד מהיר של העכבר טחולים לאחר אוסף חשוב גם להשגת גבוהה מניבה תאי T בר קיימא.
יצוין, כי הפרוטוקול המתואר כאן מנצל תאים A20 לבטא לוציפראז. זה המועדף הוא מספק את היכולת למדוד נטל גידול סיסטמי על ידי ביולומינסנציה הדמיה. עם זאת, בנוכחות מערכת החיסון פונקציונלי, התגובות לוציפראז יכול להטות את התוצאות. בדקנו בעבר החיסון תגובות לשרוד עכברים סמן transgenes17. זה המפתח כדי לשכפל מפתח ניסויים באמצעות תאים A20 חינם של transgenes כדי לאמת כי אלה לא לשחק תפקיד משמעותי מיגור הגידול על ידי תאים חיסוניים.
בעוד סוכנים הקליני יכול להיות רק בשימוש ב- vivo בעכברים חיסונית לקויה, השימוש בעכבר בתאי T מכונית נגד תאים סרטניים העכבר מאפשר לנו להעריך התרומות של המערכת החיסונית כדי התקדמות טיפולית יעילות או מחלה. פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל על הערכה טרום קליניים של מכוניות מיקוד B-cell לימפומה או מכוניות אחרות עם שינויים נוספים כגון הפרשת IL-12 כפי שמתואר כאן. יש לציין כי למרות יחסי הגומלין בין תאים חיסוניים שניתן להעריכו במודלים של העכבר syngeneic, הם אולי לא במדויק מסכם את הדברים אינטראקציה עם בני אדם אין ויוו. במיוחד הערה, אנושי, עכבר מכוניות ישתנו במבנה אשר עשויות להיות השלכות במורד הזרם; הפעלת ותא תרבות תנאים אופטימליים צמיחה של תאי T שונים20, הפצה רקמת המטרה אנטיגן הביטוי עשוי להשתנות בין בני אדם ועכברים, רעילות מנוסים עשויים להיות שונים בתכלית. לכן חיוני כדי לנצל ex-vivo ומודלים xenogeneic כדי לאמת את התוצאות.
לסיכום, syngeneic lymphodepleted ואת lymphoreplete הדגם של לימפומה מסכם את הדברים מטופלים עם או בלי כימותרפיה קודמת/הקרנות. זה מספק מערכת מודל שבו לחקות את ההגדרות קליניים כדי לאפשר בדיקה של מגוון של אסטרטגיות טיפוליות אשר יהיה חשוב עם הגל הקרוב של סוכנים חדשים טיפול המערכת החיסונית.
עם השימוש של מיזוג מראש, יש לציין כי כל העכברים נקה בדרך כלל הלימפומה. עם למעלה מענה מלא 90% תעריפי בבני אדם, זהו נציג. אולם, האתגרים לטיפול CD19 המכונית T-cell נתלו. על מניעת התדר של הישנות ציין כי הם לעיתים קרובות CD19. תיקרנה מדי לא נצפו במודל זה עד, ולעתים קרובות מעבר 100 ימים. שינויים כדי לחקות את הישנות ראיתי במרפאה יכול לעזור עם האתגרים העתידיים של טיפול רכב CD19 T-cell.
Disclosures
דוד Gilham עובדת עבור Celyad שבה הוא מעורב בייצור של תאי T המכונית. שאר המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות Bloodwise על מימון מחקר זה (גרנט 13031) ואת מנצ'סטר CRUK משאב ביולוגי יחידה, הדמיה של cytometry וביולוגיה מולקולרית הליבה המתקנים לתמיכה עבודה זו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm syringe filter | Appleton Woods | FC121 | |
| 0.45 µm syringe filter | Appleton Woods | FC122 | |
| 1.5ml pestle and microtube | VWR | 431-0098 | |
| 100X penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) | Gibco | 10378016 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350-010 | |
| Blasticidine S hydrochloride | Sigma- Aldrich | 15205 | |
| Bottle Top Filter (0.2 µm) | Scientific Laboratory Supplies | FIL8192 | |
| Brilliant Violet 711 anti-mouse CD8a Antibody | BioLegend | 100759 | 1 in 100 staining dilution. Clone 53-6.7 |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse CD4 Antibody | BioLegend | 100552 | 1 in 100 staining dilution. Clone RM4-5 |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma- Aldrich | C7902 | |
| Cell counting beads – CountBright absolute counting beads | Molecular Probes | C36950 | |
| Cell Strainer 100μm | VWR | 734-0004 | |
| Cyclophosphamide Monohydrate | Merck | 239785-1GM | |
| Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) - High Glucose | Sigma Aldrich | D6546 | |
| Dynabeads | Gibco | 11131D | |
| Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | GE17-1440-03 | Sold by Sigma- Aldrich |
| Flow cytometer - LSR Fortessa x20 | BD Biosciences | 658222R1 | |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10270 | |
| Haemacytometer | Appleton Woods | HC001 | |
| HEPES solution | Sigma- Aldrich | H0887 | |
| IL-12 p70 Mouse Uncoated ELISA Kit | Invitrogen | 88-7121-76 | |
| IL2, Proleukin | Novartis | PL 00101/0936 | |
| in vivo bioluminescence imaging system – in vivo xtreme II imaging system | Bruker | T149094 | |
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma- Aldrich | I0634 | |
| Live/dead stain - Zombie Violet Fixable Viability Kit | BioLegend | 423114 | 1 in 100 staining dilution |
| Luminometer - Lumistart Omega | BMG Labtech | 415-301 | |
| Murine IFN-γ ELISA kit | Diaclone | 861.050.010 | |
| Paraformaldehyde | Sigma- Aldrich | 16005 | |
| pCL-Eco | Novus Biologicals | NBP229540 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma- Aldrich | P8139 | |
| Platinum E cell line | Cell Biolabs | RV-101 | (RRID:CVCL_B488) |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 | BD Biosciences | 553294 | Clone 37.51 |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3ε | BD Biosciences | 553057 | Clone 145-2C11 |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | 1 in 100 staining dilution. Clone 2.4G2 |
| Puromycin Dihydrochloride | Sigma- Aldrich | P8833 | |
| Recombinant human fibronectin fragment - RetroNectin Reagent | TaKaRa | T100B | |
| Recombinant Mouse IL-7 (carrier-free) | BioLegend | 577806 | |
| Red cell lysis buffer | eBioscience | 004-4333-57 | |
| RPMI 1640 Medium | Lonza | BE12-167F | |
| Trypsin - EDTA solution | Sigma- Aldrich | T3924 | |
| XenoLight D-Luciferin | Perkin Elmer | 122799 |
References
- Brian, W. Food and Drugs Administration Biologics Licence Application Approval letter. , Available from: https://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/CellularGeneTherapyProducts/ApprovedProducts/UCM574106.pdf (2017).
- Malarkey, M., Brian, W. Food and Drugs Administration Biologics Licence Application Approval letter. , Available from: https://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/cellulargenetherapyproducts/approvedproducts/ucm581259.pdf (2017).
- Liu, Y., Zeng, G. Cancer and Innate Immune System Interactions: Translational Potentials for Cancer Immunotherapy. Journal of Immunotherapy. 35 (4), Hagerstown, Md. 299-308 (2012).
- Janssen, L. M. E., Ramsay, E. E., Logsdon, C. D., Overwijk, W. W. The immune system in cancer metastasis: friend or foe. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5 (1), 79 (2017).
- Pandya, P. H., Murray, M. E., Pollok, K. E., Renbarger, J. L. The Immune System in Cancer Pathogenesis: Potential Therapeutic Approaches. Journal of Immunology Research. 2016, 13 (2016).
- Vinay, D. S., et al. Immune evasion in cancer: Mechanistic basis and therapeutic strategies. Seminars in Cancer Biology. 35, S185-S198 (2015).
- Gajewski, T. F., Meng, Y., Harlin, H. Immune Suppression in the Tumor Microenvironment. Journal of Immunotherapy. 29 (3), 233-240 (2006).
- Munn, D. H., Bronte, V. Immune suppressive mechanisms in the tumor microenvironment. Current opinion in immunology. 39, 1-6 (2016).
- Vanderlugt, C. L., Miller, S. D. Epitope spreading in immune-mediated diseases: implications for immunotherapy. Nature Reviews Immunology. 2, 85 (2002).
- Hardwick, N., Chain, B. Epitope spreading contributes to effective immunotherapy in metastatic melanoma patients. Immunotherapy. 3 (6), 731-733 (2011).
- Makkouk, A., Weiner, G. Cancer Immunotherapy and Breaking Immune Tolerance-New Approaches to an Old Challenge. Cancer research. 75 (1), 5-10 (2015).
- Jackson, S. R., Yuan, J., Teague, R. M. Targeting CD8(+) T-cell tolerance for cancer immunotherapy. Immunotherapy. 6 (7), 833-852 (2014).
- Brentjens, R. J., et al. Lymphodepletion and tumor burden govern clinical responses in patients with B-cell malignancies treated with autologous, CD19-targeted T cells. Journal of Clinical Oncology. 29 (15_suppl), 2534 (2011).
- Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias. Blood. 118 (18), 4817 (2011).
- Hay, K. A., et al. Kinetics and Biomarkers of Severe Cytokine Release Syndrome after CD19 Chimeric Antigen Receptor-modified T Cell Therapy. Blood. 130, 2295-2306 (2017).
- Zhang, T., et al. Efficiency of CD19 chimeric antigen receptor-modified T cells for treatment of B cell malignancies in phase I clinical trials: a meta-analysis. Oncotarget. 6 (32), 33961-33971 (2015).
- Kueberuwa, G., Kalaitsidou, M., Cheadle, E., Hawkins, R. E., Gilham, D. E. CD19 CAR T Cells Expressing IL-12 Eradicate Lymphoma in Fully Lymphoreplete Mice through Induction of Host Immunity. Molecular Therapy - Oncolytics. 8, 41-51 (2018).
- Engels, B., et al. Retroviral vectors for high-level transgene expression in T lymphocytes. Human Gene Therapy. 14 (12), 1155-1168 (2003).
- Parkinson, C. M., et al. Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2966 (2011).
- Kueberuwa, G., et al. CCR7(+) selected gene-modified T cells maintain a central memory phenotype and display enhanced persistence in peripheral blood in vivo. Journal for Immunotherapy of Cancer. 5, 14 (2017).
