Summary
Hier presenteren we een protocol voor de productie en de preklinische beproeving van lymfkliertest CD19 auto T-cellen door retrovirale transductie en gebruik als een therapie tegen gevestigde syngeneic A20 B-cel lymfoom in BALB/c muizen met of zonder lymphodepleting Preconditionering.
Abstract
Het verbazingwekkende klinische succes van CD19 chimeer antigeen receptor (auto) T-cel therapie heeft geleid tot de goedkeuring van twee tweede generatie chimeer antigeen receptoren (auto's) voor acute lymfatische leukemie (ALL) andnon-Hodgkin lymfoom (NHL). De focus van het veld is nu op emuleren deze successen in andere hematologische maligniteiten waar minder indrukwekkend volledige berekening van responsrates in acht worden genomen. Verder engineering van auto T-cellen of andere behandelmodaliteiten co rechtsbedeling kan met succes belemmeringen voor succesvolle therapie in de instellingen van andere kanker.
Daarom presenteren we een model waarin anderen kunnen voeren preklinische testen van CD19 auto T-cellen. Resultaten in dit goed geteste model van de B-cel lymfoom dreigen te worden informatieve auto T-cel therapie in het algemeen.
Dit protocol staat toe de reproduceerbare productie van muis auto T cellen via de transfectie van het calciumfosfaat Plat-E producent cellen met MP71 retrovirale constructies en pCL-Eco verpakking plasmide gevolgd door verzameling van secreted retrovirale deeltjes en transductie gebruik van recombinante menselijke fibronectine fragment en centrifugeren. Validatie van retrovirale signaaltransductie, en bevestiging van de mogelijkheid van auto T cellen te doden doel lymfoom cellen ex vivo, door het gebruik van stroom cytometry, luminometry en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), is ook beschreven.
Protocollen voor het testen van auto T cellen in vivo in lymphoreplete en lymphodepleted syngeneic muizen, rekening houdend met gevestigde, systemische lymfoom worden beschreven. Antikanker activiteit wordt gecontroleerd door de in vivo bioluminescentie en ziekte progressie. Tonen we typische resultaten van uitroeiing van gevestigde B-cel lymfoom bij gebruik van 1st of 2nd generatie auto's in combinatie met de lymphodepleting pre-conditionering en een minderheid van muizen bereiken lange termijn remissies bij gebruik van auto T cellen uiten van IL-12 bij lymphoreplete muizen.
Deze protocollen kunnen worden gebruikt voor het evalueren van CD19 auto T cellen met verschillende extra wijziging, combinaties van auto T-cellen en andere therapeutische agenten of aangepast voor het gebruik van auto T cellen tegen antigenen van de verschillende doelgroepen.
Introduction
Chimeer antigeen receptor (auto) T-cel therapie blijkt verbazingwekkend klinische succes in de behandeling van CD19+ maligniteiten leiden tot de goedkeuring van tisagenlecleucel voor recidiverende acute lymfatische leukemie1 en axicabtagene ciloleucel voor progressieve large B-cel non-Hodgkin lymfoom2 in 2017.
Het belang van interacties tussen kanker en het immuunsysteem in zowel de progressie van de ziekte en de therapeutische mechanismen wordt steeds meer erkend3,4,5. Het is bijvoorbeeld goed gedocumenteerd dat de tumor communicatie (TME) wordt overspoeld met factoren die de effector functies van immuuncellen6,7,8kunnen onderdrukken. Als alternatief kunnen priming endogene immune cellen en de verspreiding van epitoop sleutel in de uitroeiing van de tumor en lange termijn verzet tegen tumor uitdaging9,10. Beide van deze fenomenen kunnen niet worden geëvalueerd in XENOGENECELLEN modellen dat het gebrek aan een immuunsysteem. Ook komen systemen met behulp van transgene eiwitten niet nauwkeurig overeen met de uitdaging van het breken van immuun tolerantie die is vereist voor epitoop verspreiding van11,12. Een syngeneic model met een volledig functionele immuunsysteem is daarom primordiaal voor het modelleren van deze belangrijke aspecten van kanker ziekte progressie en het immuunsysteem therapeutics.
Een belangrijk voorbehoud van auto T-cel therapie is dat lymphodepleting pre-conditionering vereist voor therapeutische succes13,14 is. Dit gebeurt meestal bij patiënten door het toedienen van chemotherapie vóór infusie van auto T cellen15,16. Als een standaard methode, om na te bootsen lymphodepletion gebruikt in de instelling van de patiënt, beheren we 5 Gy totale lichaam bestraling (TBI) om de lymphodepletion vóór de toediening van therapeutische auto T cellen aan muizen die systemische A20 B-cel lymfoom.
Hoewel lymphodepleting pre-conditionering niet een probleem voor de meerderheid van de patiënten is, betekent toxiciteit die wordt geleverd met chemotherapeutische agenten dat patiënten van lage performance status niet in aanmerking voor auto T-cel therapie komen. Een om testsysteem te maken dat de patiënten niet in aanmerking voor lymphodepletion vertegenwoordigt, opgericht wij een lymphoreplete syngeneic muismodel waarin we model auto T-cel therapie van lymfoom. In dit model, we toonden dat de secretie van IL-12 van binnen auto T cellen tot uitroeiing van gevestigde lymfoom met een slagingspercentage van leiden kan ~ 25%17. Bovendien toonden we dat endogene immune cellen bij de uitroeiing van de kanker betrokken waren.
Hier beschrijven we in detail het protocol voor de productie van muis auto T-cellen, tot oprichting van lymfoom in syngeneic muizen en behandeling van het lymfoom met auto T cellen met of zonder het gebruik van lymphodepleting pre-conditionering. Dit kan gebruikt worden voor combinatie studies van auto T cellen met andere stoffen, testen van auto T cellen met andere transgenen of voor het gebruik van andere adoptief cel therapie of immunotherapie strategieën tegen lymfoom.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd onder auspiciën van de dieren (wetenschappelijke Procedures) Act 1986 en onder UK Coordinating Committee voor kankeronderzoek richtsnoeren. Alle dierlijke studies werden uitgevoerd bij de CRUK-Manchester institute en goedgekeurd door de lokale dierenwelzijn en ethiek Bekijk lichaam (CRUK-MI AWERB).
1. voorbereiding
- Maxiprep pMP71 retrovirale construeren plasmide en pCL-Eco retrovirus verpakking plasmiden18.
Opmerking: pMP71 mCherry en de auto gescheiden door een FMDV2A-sequentie codeert. Dit is uitwisselbaar met andere retrovirale constructies. pCL-Eco codeert gag, pol en de ecotropic envelop eiwitten. - Voorbereiden op volledige T cel medium (TCM) kweken muis T cellen met behulp van RPMI 1640 medium, 10% FCS, 1% 100 x penicilline-streptomycine-glutamine (PSG).
Opmerking: De oplossing bevat 100 IU/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine en 2 mM van L-glutamine), 50 μM β-mercaptoethanol en 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES). - Cultuur A20 cellen in RPMI 1640, 10% FCS en 0.05 mM β-mercaptoethanol bij 37 ° C, 5% CO2.
- Cultuur van de Platinum-E (Plat-E) cellen in volledige Dulbecco van gemodificeerde eagle medium (DMEM) (DMEM met 10% foetaal kalfsserum (FCS), 2 mM L-glutamine, 1 μg/mL puromycin en 10 μg/mL blasticidin) bij 37 ° C, 5% CO2.
Opmerking: Plat-E cellen zijn afgeleid van 293T cellen en express gag, pol en ecotropic envelop retrovirale eiwitten. - Bereiden transfectie mediaoplossingen 1en 2 onmiddellijk voorafgaand aan de transfectie. Oplossing 1 (pH 7,9) bevatten DMEM + 10% FCS + 25 mM HEPES, oplossing 2 (pH 7.1) bevatten DMEM + 25 mM HEPES bereiden.
- 10 μg/mL recombinante menselijke fibronectine fragment oplossing bereid door verdunnen met steriele-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en bewaren bij-20 ° C tot gebruik.
- Steriel filter alle media door middel van 0,2 micrometer filters vóór gebruik (exclusief recombinante menselijke fibronectine fragment).
2. retrovirale transductie van T cellen
- Dag 1: Voorbereiding voor Transfectie
- Zaad 7,5 x 106 Platinum-E (Plat-E) cellen in 15 cm2 weefselkweek gerechten in 18 mL van volledige DMEM en na een nacht bebroeden bij 37 ° C, 5% CO2.
- Dag 2: Transfectie van Plat-E retrovirale verpakkingslijn cel
- Bereiden 20.4 μg van pcl-Eco verpakking vector DNA, 39.6 μg plasmide DNA retrovirale auto construct en 150 μl van 1 M CaCl2 bij eindvolume van 3 mL transfectie oplossing 2 per 15 cm2 schotel-codering om te zijn transfected. Vortex voor 10 s en rest voor 5 min
- DMEM media uit de 15 cm2 gerechten verwijderen en vervangen door 12 mL van transfectie oplossing 1.
Let op Bij het wijzigen van de media, kunnen de 15 cm2 gerechten drogen in het midden. Dit kan leiden tot aanzienlijke dood van transfected cellen van Plat-E. Werk snel en media van slechts 1-2 platen tegelijk verwijderen. - Voeg 3 mL transfectie oplossing 2 met DNA en CaCl2 aan elk gerecht 15 cm2 drop-wise, gelijkmatig over elke plaat. Zachtjes rock platen met een beweging van links naar rechts voor 10 s. Incubate bij 37 ° C, 5% CO2 's nachts.
- Dag 3: Bereiding van het virus-bevattende supernatant voor signaaltransductie
- Vervang de media van transfected cellen van de plaat-E met 18 mL TCM voltooien en terugkeren naar de couveuse.
Let op Wanneer de media 15 cm2 gerechten wijzigen kan droog in het midden. Dit kan leiden tot aanzienlijke dood van transfected cellen van Plat-E. Werk snel en media van slechts 1-2 platen tegelijk verwijderen.
- Vervang de media van transfected cellen van de plaat-E met 18 mL TCM voltooien en terugkeren naar de couveuse.
- Dag 3: Isolatie en in vitro activatie van muis milt T cellen
- Verwijderen van de milt van 6-8-week-oude BALB/c muizen zoals eerder beschreven door Parkinson et al. 19 en dompel ze in steriele, ijskoud, PBS in een conische tube van 50 mL.
- Gebruik pincet een milt overbrengen naar een microcentrifuge van 1,5 mL tube en meng met behulp van een stamper met minimale kracht.
- Gebruik een 1000 μL pipet en ~ 800 μL PBS homogenaat overbrengen naar een 100 μm porie cel zeef op een tube van 50 mL met 5 mL PBS voor de verwezenlijking van een interne celsuspensie aangebracht. Herhaal stap 2.4.2 voor de extra milt. 3 milt per buis niet overschrijden.
Let op Splenocytes filter gepasseerd kan vormen bosjes als staande. Handmatig swirl buizen met tussenpozen als de verwerking van verschillende milt Voorkom cel samendoen. Resterende fragmenten op de zeef van de cel kan worden verder puree met behulp van een zuiger uit een 5 mL-spuit met minimale kracht. - Top met PBS tot 20 mL. Laag de 20 mL celsuspensie zachtjes op 20 mL dichtheid kleurovergang media (Tabel van materialen) in een tube van 50 mL. Centrifugeer de resulterende overlay schorsing bij 800 x g gedurende 20 min met geen rem toegepast.
- Oogsten van cellen op interfacelaag met behulp van een steriele Pipet van Pasteur en overdracht aan een tube van 50 mL. Top tot 50 mL met PBS en centrifuge bij 800 x g gedurende 10 minuten om te wassen. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in volledige TCM.
- Het aantal cellen met behulp van een hemocytometer.
- Cultuur van cellen bij een dichtheid van 5 x 106 cellen/mL in volledige TCM met 30 ng/mL anti-CD3ε antistof (kloon 145-2 C 11), 30 ng/mL anti-CD28 antilichaam (kloon 37.51), 100 U/mL recombinante menselijke IL-2 en 2 ng/mL recombinant lymfkliertest IL-7. Een gepaste afmetingen weefselkweek kolf gebruikt voor de hoeveelheid cellen geoogst.
Opmerking: Antigeen-voorstellende cellen nodig zijn voor T-cel activatie door CD3 en CD28 antilichamen, indien werken met gezuiverde T cellen het noodzakelijk om jas platen met antilichamen is of gebruiken magnetische kralen (Tabel van materialen) - Incubeer muis splenocytes bij 37 ° C, 5% CO2 's nachts.
- Dag 3: Bereiding van platen voor signaaltransductie
- Vacht niet-weefsel-cultuur 6-Wells-platen met 2 mL 10 μg/mL recombinante menselijke fibronectine fragment en na een nacht bebroeden bij 4 ° C.
- Dag 4: Transductie van muis T cellen
- Transfer recombinante menselijke fibronectine fragment van gecoate platen naar verse niet-weefsel-cultuur 6-Wells-platen. Deze platen 's nachts bij 4 ° C voor ronde 2 van signaaltransductie uit te broeden.
- Voeg 2 mL TCM aan elk putje van de oorspronkelijke recombinante menselijke fibronectine fragment beklede platen en laat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur te blokkeren van niet-specifieke binding.
- Retrovirus-bevattende supernatant van transfected cellen van de Plat-E 15 cm weefselkweek gerechten en vervangen met 18 mL voor volledige TCM oogsten.
Let op Werk snel om te voorkomen dat drogen van Plat-E cellen.
Opmerking: Succes van transfectie kan in dit stadium worden gecontroleerd door fluorescentie microscopie als met behulp van een fluorescerende marker-gen zoals mCherry (Figuur 1). - Filtreer het supernatant retrovirus-bevattende door 0,45 micrometer filter verwijderen cel puin. TCM van recombinante menselijke fibronectine fragment beklede 6-Wells-platen verwijderen en toevoegen van 2.5 mL van het supernatans dat gefilterde retrovirus-bevattende of aan elk putje (gebruik compleet TCM voor mock transfectie). Label elk putje over de toevoeging van retrovirus of mock media.
- Centrifugeer de platen bij 1200 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Hoewel de platen zijn spinnen, verzamelen van geactiveerde T-cellen en tellen met behulp van een hemocytometer.
- Transductie is uitgevoerd met 5 x 106 geactiveerd splenocytes in een totaal van 5 mL/putje. Pellet het vereiste aantal splenocytes voor mock/signaaltransductie in afzonderlijke buizen door centrifugeren bij 500 x g gedurende 5 min.
- Resuspendeer splenocytes bij een dichtheid van 5 x 106 cellen per 2,5 mL van gefilterde retrovirus-bevattende supernatans uit stap 2.6.4 of TCM als negatieve controle. Recombinante menselijke IL-2 (hIL-2) en recombinant muis IL-7 (mIL-7) aan toevoegen een eindconcentratie van 200 IU/mL en 4 ng/mL respectievelijk.
- 6-Wells-platen van de centrifuge bij de voltooiing van stap 2.6.5 verzamelen en toevoegen van 2.5 mL per putje opnieuw gesuspendeerde splenocytes in passende wells maken een eindvolume van 5 mL / goed en een eindconcentratie van 100 U/mL hIL-2 en 2 ng/mL mIL-7.
- Centrifugeer de platen bij 1200 x g gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur. Incubeer de platen bij 37 ° C, 5% CO2 's nachts na het centrifugeren.
- Dag 5: Ronde 2 van signaaltransductie
- De recombinante menselijke fibronectine fragment van de platen verzamelen zoals dit hergebruikt worden kan. Herhaal stap 2.6.2 - 2.6.5.
- Terwijl platen zijn spinnen, de cellen van de 1st ronde van signaaltransductie met behulp van een precisiepipet Pasteur verzamelen. Spoel elk putje met 2 mL PBS, swirl en verzamelen alle resterende cellen in elk putje.
Opmerking: Pipetteer omhoog en omlaag om resuspendeer gesedimenteerd cellen. Verzamelen van elke groep van de controle/signaaltransductie in afzonderlijke buizen. - Centrifuge buizen bij 500 x g gedurende 5 min. resuspendeer cellen in 2.5 mL per putje van signaaltransductie met 200 IU/mL IL-2 en 4 ng/mL IL-7. Herhaal stap v2.6.7 - 2.6.8.
- Cellen verwijderen uit de centrifuge en Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 voor 4 h. verzamelen getransduceerde cellen zoals in stappen 2.7.2-2.7.3.
- Cellen tellen, centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min en resuspendeer in volledige TCM bij een dichtheid van 1 x 106 cellen/mL met 100 U/mL hIL-2 en 2ng/mL mIL-7. Breng in een maatkolf van voldoende grootte cultuur en Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2.
- Voeg verse TCM media met 100U/mL hIL-2 en 2ng/mL mIL-7 om de 2 dagen, behoud van een celdichtheid van 1 x 106 cellen/mL.
Opmerking: Geoogstvan splenocytes bevatten een aantal celtypes. Onder deze cultuuromstandigheden niet T cellen sterven af in de loop van 2-3 dagen. Na ~ 4 dagen in de cultuur van de cel, het aantal T-cel is meestal gelijk aan het totale aantal geoogste splenocytes op dag 0.
3. meting van de transductie efficiëntie
- Op dag 4 post signaaltransductie, verzamelen een steekproef van getransduceerde of niet-getransduceerde T-cellen (ongeveer 3 x 105 cellen). Centrifugeer de celsuspensie bij 500 x g gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant, wassen de Ingehuld cellen een keer met PBS en Centrifugeer nogmaals.
- Verwijder het supernatant en voeg 100 μl van PBS met een geschikt amine reactieve kleurstof (bv, live/dode vlek, 1 op de 100 verdunning) per putje. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Spoel tweemaal met PBS en centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min. negeren het supernatant en incubeer met 50 μl van FACS buffer met anti-muis CD16/CD32 antilichamen voor Fc receptor blokkeren (1 op de 100 verdunning). Incubeer gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Direct toevoegen 50 μl van antilichaam kleuring master mix met anti-muis CD4-BV786 en CD8-BV711 antilichamen (eindconcentratie van 1 μl per putje in FACS buffer). Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C in het donker. Herhaal de wassen stap 3.3. Resuspendeer de cellen in 1% PFA buffer en houden het in het donker bij 4 ° C tot analyse door stroom cytometry.
- Het analyseren van cellen met gelijkwaardige geschikte cytometer met behulp van BV711, BV785 en mCherry fluorescentie als markeringen van CD4 en CD8 subset en auto meningsuiting respectievelijk gating zoals in (Figuur 2).
4. in vitro validatie van auto T cel activiteit
- Zaad syngeneic target CD19+ tumorcellen met of zonder luciferase uitdrukking bij een dichtheid van 1 x 104 cellen in 100 μl TCM per putje in een 96-Wells U-bodem weefselkweek plaat.
- 1 x 104 CD19 auto T cellen per putje toevoegen in een volume van 100 μl per putje te bereiken een effector target (E:T) / ratio van 1:1.
Opmerking: E:T ratio's moeten worden vastgesteld voor elke auto construeren en cellijn richten. - Gebruik T cellen alleen en tumorcellen alleen als negatieve controles en T cellen gestimuleerd door phorbol-myristaat-acetaat (PMA) (50 ng/mL) en ionomycin (1 μg/mL) als positieve controle voor Interferon gamma (IFNγ) versie. Co cultuur cellen bij 37 ° C, 5% CO2 voor 16-24 uur.
- Na co cultuur, centrifugeren van de platen bij 500 x g gedurende 5 min en verzamelen van het supernatant voor verdere analyse van IFNγ en IL - 12 p 70 ELISA.
Opmerking: Dit kan worden achtergelaten bij-80 ° C. - Resuspendeer cel pellets op in 100 μl van PBS met luciferine (eindconcentratie van 1,5 mg/mL). Incubeer de platen gedurende 10 minuten bij 37 ° C. Meet vervolgens de luminescentie van elk putje met een geschikt luminometer.
Opmerking: Belichtingstijden moeten worden geoptimaliseerd voor cellijnen en dichtheid. Representatieve resultaten worden weergegeven in Figuur 3a. Ex-vivo cytotoxiciteit van auto T cellen kan aan uitdrukkelijke luciferine door co cultuur met cellijnen uiten doel antigeen worden gewijzigd. Als auto T cellen doden doelcellen, luciferine is vrijgegeven, dus een vermindering van luminometry signaal is gecorreleerd met cel doden. Non-getransduceerde cellen kunnen vaak een effect hebben op de levensvatbaarheid van de cellen van de doelstelling, met name gedurende perioden van de lange incubatietijd. Het meten van de concentratie van lymfkliertest IFNγ en IL - 12p 70 in het supernatant volgens protocollen van de ELISA van de fabrikant. Representatieve resultaten staan in (Figuur 3b en 3 c). Ex-vivo activering van auto T cellen door co cultuur met cellijnen uiten doel antigeen kan worden bepaald door het analyseren van supernatant inhoud met behulp van ELISA. De verhouding van auto T cel naar de doelcellen en lengte van de periode van de co cultuur moeten worden geoptimaliseerd voor elke auto construct, doel cellijn en analyt. PMA en ionomycin behandeling kan als positieve controle worden gebruikt ter bevestiging van de kwaliteit van T-cellen en hun vermogen om te reageren.
5. beoordeling van de anti-kanker activiteit in muizen
-
Protocol 1
- Uitvoeren van 100 mg/kg intraveneuze (IV) levering van cyclophosphamide in 6 tot 8 weken durende BALB/c muizen. Hierdoor kan de tumor engraftment zonder significante lymphodepletion17 (Figuur 4).
Opmerking: Tot oprichting van de A20 kun lymfoom je meer dan 2 maanden met een suboptimaal nemen koers. Dit kan worden verbeterd door het gebruik van cyclophosphamide 1 dag voorafgaand aan de levering van cellen van het lymfoom. Om te kunnen studeren lymphoreplete muizen, we geconstateerd dat een dosis van cyclophosphamide waardoor efficiëntie van lymfoom zonder lymphodepletion. - De volgende dag, injecteren 100 µL van 5 x 105 syngeneic A20 B-cel lymfoom cellen aangepast express luciferase en groen fluorescente proteïne (GFP) muizen door intraveneuze (IV) injectie.
- Toestaan dat de muizen te ontwikkelen van systemische lymfoom voor ~ 17 dagen.
- De aanwezigheid van systemische lymfoom bevestigen door intraperitoneale injectie van (IP) van 100 μl van 30 mg/mL luciferine en beeldvorming met behulp van een in vivo bioluminescentie imaging systeem.
- Scheidingstekens gebruiken om te voorkomen dat signaal spillover naar aangrenzende muizen. Bloot muizen voor 1 min aan de ventrale zijde met een constante formaat regio van belang.
- Relatieve licht eenheden (RLU) als de fotonen per seconde (p/s) weergegeven. Instellingen moeten worden geoptimaliseerd voor elk model van de tumor; Gebruik een blootstelling die vroegtijdige opsporing van tumoren kan halen maar leidt niet tot verzadiging zoals tumoren eindpunten bereiken.
- Record totale RLU voor elke muis met een constante formaat regio van belang. (Figuur 5a en b).
- Het injecteren van een enkelvoudige dosis van 1 x 106 auto T cellen door IV injectie in lymphoreplete muizen die gevestigde lymfoom.
Opmerking: (belangrijk) Dosering van niveaus moet worden vastgesteld voor elk auto bouwen met behulp van een dosis escalatie schema om ervoor te zorgen dat elke mogelijke toxicities die voortvloeien uit de auto T-cellen worden gekenmerkt en kunnen worden aangepakt. Hoewel anti-muis CD19 auto T-cellen toxicities niet wordt weergegeven, kan auto T cellen aanleiding kunnen geven tot onverwachte toxicities. Waar meerdere auto constructies en transductie efficiëntie niet identiek zijn, moet het totale aantal T-cellen toegediend worden bewaard gelijk door de toevoeging van niet-getransduceerde T-cellen in de voorbereidingen van de cel. - Monitoren van de progressie van de ziekte wekelijks via IP-injectie van 100 μl van 30 mg/mL luciferine en beeldvorming met behulp van een in vivo bioluminescentie imaging systeem (Figuur 5 c).
- Monitoren van muizen op tekenen van toxiciteit en euthanaseren van alle muizen die vroege symptomen van hind-limb verlamming (HLP) of pathologische tumor last vertonen voordat elk lijden kan ontstaan.
Opmerking: Toxicities van A20 lymfoom kunnen opnemen hind-limb verlamming door invasie van de tumor van de hersenvliezen. Controleer regelmatig op vroege tekenen van gewijzigde gait. Grote IP-tumoren kunnen ook ontstaan die kan leiden tot ongemak getoond door veranderde gedrag. - Toezicht op overleving van muizen voor 60-100 dagen (Figuur 5 d). Euthanasie uitvoeren door de methode van een schema-1 na beëindiging van het experiment.
- Uitvoeren van 100 mg/kg intraveneuze (IV) levering van cyclophosphamide in 6 tot 8 weken durende BALB/c muizen. Hierdoor kan de tumor engraftment zonder significante lymphodepletion17 (Figuur 4).
-
Protocol 2
- 200 mg/kg cyclofosfamide aan 6 tot en met 8 - weken oude BALB/c muizen door staart veneuze injectie in 100 μl van PBS per muis leveren.
- De volgende dag, injecteren van 5 x 105 syngeneic A20 B-cel lymfoom cellen uiten luciferase en GFP in 100 μl PBS via staart veneuze injectie.
- Toestaan dat de muizen te ontwikkelen van systemische lymfomen voor ~ 7-14 dagen
- Systemische lymfoom bevestigen door IP-injectie van 100 μl van 30 mg/mL luciferine en beeldvorming met behulp van een in vivo bioluminescentie imaging systeem.
- 5 Gy totale lichaam bestraling (TBI) bij 0,02 Gy/min voor lymphodepletion uitvoeren.
Opmerking: Patiënten die een auto T-cel-behandelingen ondergaan tal van regimes te bereiken lymphodepletion voordat de administratie van auto T cellen die aanzienlijk verhoogt de engraftment van adoptively auto T-cellen overgedragen. Dit kan worden gerepliceerd in muizen met totale lichaam bestraling (TBI) (Figuur 6). - Injecteren op de volgende dag, 1 x 106 auto T-cellen in 100 μl van PBS via staart veneuze injectie in muizen die gevestigde tumoren.
- Het verzamelen van bloed monsters via staart ader afloop na 7 dagen.
- Rode cellysis-buffermengsel toevoegen aan elke bloedmonster, dan stroom cytometry voorbereiden zoals beschreven in sectie 3. Het analyseren van auto T cel persistentie in de omloop door stroom cytometry (Figuur 2).
Opmerking: Toevoeging van tellen kralen vóór cytometry kunt bepalen van het aantal auto-T cellen per milliliter bloed. - Voortgang ziekte zoals beschreven in stappen 5.1.5 - 5.1.8 (Figuur 7).
Representative Results
Hoogrenderende transductie van T-cellen is het noodzakelijk om verse retrovirale deeltjes. De transfectie van het Plat-E cellijn met pCL-Eco producent plasmide en pMP71 retrovirus plasmide geeft aanleiding tot de afscheiding van retrovirale deeltjes in de cel bezinken. Wanneer een fluorescerende marker-gen, zoals mCherry, is gecodeerd in het retrovirus, kan succesvolle transfectie worden bevestigd door fluorescentie microscopie (Figuur 1). Virus-bevattende supernatant van transfected cellen van Plat-E wordt gebruikt om de transduce van T cellen via 2 rondes van spin-fection op fibronectine fragment beklede platen. De efficiëntie van signaaltransductie kan worden bepaald 4 dagen post signaaltransductie via stroom cytometry. Succesvol getransduceerde cellen express het marker-gen gecodeerd in het retrovirus (Figuur 2). Transductie efficiëntie variëren van ~ 50-90% rendement met eerste generatie receptoren te ~ 10-40% met auto construeert dichtbij de retrovirale verpakking capaciteit. Terwijl marker genexpressie succesvolle retrovirale signaaltransductie toont, is het essentieel om te laten zien van de functionaliteit van auto T-cellen bij boeiende met cellen dat uitdrukkelijke doel antigeen op hun oppervlak. Doel cellijnen aan uitdrukkelijke luciferase gewijzigd kunnen worden gebruikt in luciferase testen om te testen de mate van cel-kill door auto T cellen rechtstreeks (figuur 3A). Het vrijkomen van effector cytokines uit auto T-cellen bij co cultuur met doelcellen, bepaald door ELISA, kan ook worden gebruikt als een indirecte maat voor de cytotoxiciteit voor auto T-cel (figuur 3B en 3 C).
AUTO T-cellen geproduceerd in dit protocol kunnen worden geëvalueerd in lymphoreplete muizen door de oprichting van systemische A20 lymfoom met een dosis van 100 mg/kg van Cyclofosfamide (geïnjecteerd intraveneus), 1 dag vóór IV injectie van 5 x 105 A20 cellen (Figuur 4). IP-injectie met luciferine en beeld vastleggen met behulp van een in vivo bioluminescentie imager kan worden gebruikt om te controleren op last van de tumor met behulp van een constant rendement en blootstelling tijd hele (figuur 5A-C). AUTO T cellen aangepast aan uitdrukkelijke IL-12 zijn geschikt voor het uitroeien van systemische lymfoom met lymphodepleting preconditionering ziektevrije overleving geven in ongeveer 25% van muizen (5D van de figuur). Lymphodepleting conditionering, verbetert bereikt door 5 Gy TBI 1 dag vóór de de IV toediening van auto T-cellen, aanzienlijk engraftment (Figuur 6). In dit model zijn eerste generatie auto T-cellen geschikt voor het uitroeien van systemische A20 lymfoom, meestal inducerende ziektevrije overleving in 100% van muizen (Figuur 7).
Figuur 1. Bevestiging van succesvolle transfectie van Plat E cellen. Plat-E cellen transfected met retrovirale auto construct en pMP71 en pcl-Eco verpakking vector plasmide DNA. Succesvolle transfectie wordt aangegeven door expressie van het mCherry fluorescerende marker-gen. A) helder veld microscopie, B) fluorescentie microscopie en C) samengevoegde afbeeldingen worden weergegeven. Vergroting = 50 X. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Bepaling van signaaltransductie rendement door stroom cytometry. Stroom cytometry wordt gebruikt om de efficiëntie van de transductie van de muis T-cellen op dag 4 post signaaltransductie, met behulp van Zombie UV leven/dood, mCherry, BV711 en BV785 voor de opsporing van de live, auto bouwen, CD4 en CD8 cellen, respectievelijk. Representatieve resultaten van A) Non-getransduceerde, B) mCherry.αmCD19.mCD3z en C) mCherry.αmCD19.mCD3z.mIL12 worden weergegeven met het gating van 1) Singlets 2) levende cellen 3) CD4 en CD8 4) en 5) evaluatie van mCherry positieve cellen uiten van de auto. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Validatie van auto T-cel activiteit. ΑmCD19 auto T-cellen werden mede gekweekte met A20 lymfoom cellen aangepast aan uitdrukkelijke luciferase (1 x 10,4: 1 x 10-4) voor 16 h in een U-onder 96-wells-plaat. Na co cultuur, cellen werden Ingehuld en supernatant werd verzameld. A) cellen werden opnieuw geschorst in PBS en luminometry werd gebruikt voor het beoordelen van de levensvatbaarheid van de doelcellen. Supernatant van co cultuur evalueerden voor de aanwezigheid van IFNγ (B) en IL-12 (C). De verhouding van auto T cel naar de doelcellen en lengte van de periode van de co cultuur moeten worden geoptimaliseerd voor elke auto construeren en cellijn richten. PMA en ionomycin behandeling kan als positieve controle worden gebruikt ter bevestiging van de kwaliteit van T-cellen en de cellen van hun vermogen om te reageren. Foutbalken Toon SD. statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van one-way ANOVA. p < 0,001). Dit cijfer is gewijzigd van17. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Tot oprichting van de A20 lymfoom zonder lymphodepletion. Cyclofosfamide kan verhogen efficiency van lymfoom inductie zonder veroorzaakt lymphodepletion. A) bloed graven van 6-8-week-oude BALB/c muizen na IV levering van 100 mg/kg van cyclophosphamide. Foutbalken Toon SD B) lymfoom last van 6-8-week-oude BALB/c muizen na IV levering van 100 mg/kg cyclofosfamide of zoutoplossing op dag -1 en IV levering van 5 x 105 A20 cellen op dag 0 gemeten met behulp van een luminometer. C) voortbestaan van muizen in B). Foutbalken Toon SD. statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van 2-way ANOVA. ** p < 0,01, *** p < 0,001). Dit cijfer is gewijzigd van Kueberuwa et al. 17. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5. Toezicht op lymfoom last en overleving. Muizen die A20 lymfoom uiten luciferase ontvangen 100 µL intraperitoneaal (IP) injecties van 30 mg/mL luciferine en werden beeld met behulp van een in vivo bioluminescentie imaging systeem. A) muizen werden blootgesteld voor 1 min aan de ventrale zijde en onmiddellijk omgedraaid naar afbeelding dorsale te halen tumor massa's aan beide zijden van de organen (B). C) representatieve resultaten van het lymfoom last van muizen van de BALB/c ontvangen van verschillende αmCD19 auto T cellen zonder lymphodepletion. Foutbalken Toon SEM. D) overlevingspercentage van de dezelfde muizen. Dit cijfer is gewijzigd van Kueberuwa et al. 17. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6. Effecten van lymphodepletion. A) bloed graven van 6-8-week-oude BALB/c muizen na ontvangst van 5 Gy TBI bij een dosering van 0,02 Gy/min; Foutbalken Toon SD. statistische analyse door two-way ANOVA. p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. B) Monitoring van CD4+ en CD8+ auto T cellen in het perifere bloed van muizen door stroom cytometry voor de mCherry marker gene 7 dagen post administratie. Foutbalken Toon SD. Dit cijfer is gewijzigd van Kueberuwa et al. 17. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7. AUTO T cel activiteit met lymphodepleting pre-conditionering. Typische resultaten tonen het effect van 5 Gy TBI de dag vóór de toediening van auto T-cel. A) Imaging en (B) grafische weergaven van beeldvorming van muizen na 100 µL intraperitoneaal (IP) injecties van 30 mg/mL luciferine met behulp van een in vivo bioluminescentie imaging systeem. Foutbalken Toon SEM. C) voortbestaan van de dezelfde muizen. Dit cijfer is geweest gewijzigde fromKueberuwa et al. 17. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Syngeneic Muismodellen toestaan het testen van de progressie van de ziekte en therapie met behoud van een intact immuunsysteem. Dit is essentieel als het gaat om therapieën die interactie met het immuunsysteem en in het bijzonder voor immunotherapeutische agenten.
Het protocol hier beschreven heeft twee kritische werkstromen, de ene is genetisch muis T cel om het uiten van de auto's wijzigen. Hiervoor 7 dagen vanaf de inleiding tot de validatie van de transductie. Gelijktijdig met de productie van auto T-cellen is de oprichting van systemische lymfoom in muizen. Moet auto T celproductie mislukt of kwaliteit zijn onvoldoende, er is meestal niet genoeg tijd om te produceren vervanging cellen voordat muizen bezwijken aan lymfoom. Het is daarom cruciaal dat onderzoekers met behulp van deze modellen nauwkeurig tumor doseren en ziekte progressie studies uitvoeren om tijd met succes de productie van auto T cellen voor therapeutische administratie.
Voorkomende oorzaken van lage T-cel transductie efficiëntie omvat arme transfectie efficiëntie van producent cellen, meestal veroorzaakt door een slechte plasmide zuiverheid of onjuiste bepaling van de pH van transfectie media. Het wordt aanbevolen om de efficiëntie van producent cel transfectie alvorens met het volledige protocol zoals slechte transfectie Beperk de efficiëntie van de transductie van T-cel te controleren. Recombinante menselijke fibronectine fragmenten kunnen worden verzameld en opgeslagen bij-20 ° C voor hergebruik, echter meerdere freeze-watervalen leiden tot verminderde transductie efficiëntie. Snelle verwerking van de milt van de muis na collectie ook belangrijk is voor het verkrijgen van hoge rendementen van levensvatbare T-cellen.
Opgemerkt moet worden dat het protocol hier beschreven gebruik maakt van A20 cellen luciferase uitdrukken. Dit heeft de voorkeur als het biedt de mogelijkheid voor het meten van systemische tumor last door bioluminescentie imaging. Echter in de aanwezigheid van een functionele immuunsysteem, kon reacties op luciferase vertekenen de resultaten. We hebben eerder getest immuunreacties muizen tot markering transgenen17te overleven. Het is sleutel tot het repliceren van belangrijke experimenten cuvetten A20 gratis transgenen om te valideren die deze niet een belangrijke rol in de uitroeiing van de tumor door immune cellen spelen.
Terwijl klinische agenten alleen gebruikt in vivo bij immuun-deficiënte muizen worden kunnen, kan het gebruik van muis auto T cellen tegen muis kankercellen we de bijdragen van het immuunsysteem te therapeutische werkzaamheid of ziekte progressie evalueren. Dit protocol kan worden gebruikt voor de pre-klinische evaluatie van auto's die zijn gericht op de B-cel lymfoom of andere auto's met aanvullende wijzigingen zoals secretie van IL-12 zoals hier beschreven. Hierbij moet worden opgemerkt dat hoewel het samenspel tussen immune cellen kan worden geëvalueerd in syngeneic muismodellen, ze niet nauwkeurig interactie in mens in vivo recapituleren kunnen. Bijzondere opmerking, menselijke en muis auto's zal variëren in de structuur die stroomafwaartse gevolgen wellicht; optimale activering en cel cultuur voorwaarden voor groei van T-cellen zijn verschillende20, weefsel verdeling van doel antigeen expressie kan variëren tussen mensen en muizen en ervaren toxicities radicaal afwijken. Het is daarom essentieel om ex vivo en XENOGENECELLEN modellen te bevestigen de resultaten te gebruiken.
Kortom recapituleren het syngeneic lymphodepleted en lymphoreplete model van lymfoom patiënten met en zonder voorafgaande chemo/radiotherapie. Dit biedt een modelsysteem waarin na te bootsen de klinische instellingen zodat het testen van een aantal therapeutische strategieën die belangrijke met de komende golf van nieuwe immuun therapie agenten zullen.
Met het gebruik van pre-conditionering, zal opgemerkt worden dat alle de muizen meestal duidelijk het lymfoom. Met is tot 90% volledig respons bij de mens, dit vertegenwoordiger. Nochtans, de uitdagingen voor CD19 auto T-cel therapie zal afhangen van het voorkomen van de hoge frequentie van hervallen waargenomen die zijn vaak CD19. Hervallen zijn niet waargenomen in dit model tot, en vaak meer dan 100 dagen. Wijzigingen na te bootsen de hervallen gezien in de kliniek kon helpen de toekomstige uitdagingen van CD19 auto T-cel therapie.
Disclosures
David Gilham werkt voor Celyad die bij de productie van auto T-cellen betrokken is. De rest van de auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zouden graag bedanken Bloodwise voor financiering van dit onderzoek (grant 13031) en de CRUK Manchester biologische resource eenheid, beeldvorming en cytometry en moleculaire biologie core faciliteiten voor de ondersteuning van dit werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm syringe filter | Appleton Woods | FC121 | |
| 0.45 µm syringe filter | Appleton Woods | FC122 | |
| 1.5ml pestle and microtube | VWR | 431-0098 | |
| 100X penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) | Gibco | 10378016 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350-010 | |
| Blasticidine S hydrochloride | Sigma- Aldrich | 15205 | |
| Bottle Top Filter (0.2 µm) | Scientific Laboratory Supplies | FIL8192 | |
| Brilliant Violet 711 anti-mouse CD8a Antibody | BioLegend | 100759 | 1 in 100 staining dilution. Clone 53-6.7 |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse CD4 Antibody | BioLegend | 100552 | 1 in 100 staining dilution. Clone RM4-5 |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma- Aldrich | C7902 | |
| Cell counting beads – CountBright absolute counting beads | Molecular Probes | C36950 | |
| Cell Strainer 100μm | VWR | 734-0004 | |
| Cyclophosphamide Monohydrate | Merck | 239785-1GM | |
| Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) - High Glucose | Sigma Aldrich | D6546 | |
| Dynabeads | Gibco | 11131D | |
| Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | GE17-1440-03 | Sold by Sigma- Aldrich |
| Flow cytometer - LSR Fortessa x20 | BD Biosciences | 658222R1 | |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10270 | |
| Haemacytometer | Appleton Woods | HC001 | |
| HEPES solution | Sigma- Aldrich | H0887 | |
| IL-12 p70 Mouse Uncoated ELISA Kit | Invitrogen | 88-7121-76 | |
| IL2, Proleukin | Novartis | PL 00101/0936 | |
| in vivo bioluminescence imaging system – in vivo xtreme II imaging system | Bruker | T149094 | |
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma- Aldrich | I0634 | |
| Live/dead stain - Zombie Violet Fixable Viability Kit | BioLegend | 423114 | 1 in 100 staining dilution |
| Luminometer - Lumistart Omega | BMG Labtech | 415-301 | |
| Murine IFN-γ ELISA kit | Diaclone | 861.050.010 | |
| Paraformaldehyde | Sigma- Aldrich | 16005 | |
| pCL-Eco | Novus Biologicals | NBP229540 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma- Aldrich | P8139 | |
| Platinum E cell line | Cell Biolabs | RV-101 | (RRID:CVCL_B488) |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 | BD Biosciences | 553294 | Clone 37.51 |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3ε | BD Biosciences | 553057 | Clone 145-2C11 |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | 1 in 100 staining dilution. Clone 2.4G2 |
| Puromycin Dihydrochloride | Sigma- Aldrich | P8833 | |
| Recombinant human fibronectin fragment - RetroNectin Reagent | TaKaRa | T100B | |
| Recombinant Mouse IL-7 (carrier-free) | BioLegend | 577806 | |
| Red cell lysis buffer | eBioscience | 004-4333-57 | |
| RPMI 1640 Medium | Lonza | BE12-167F | |
| Trypsin - EDTA solution | Sigma- Aldrich | T3924 | |
| XenoLight D-Luciferin | Perkin Elmer | 122799 |
References
- Brian, W. Food and Drugs Administration Biologics Licence Application Approval letter. , Available from: https://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/CellularGeneTherapyProducts/ApprovedProducts/UCM574106.pdf (2017).
- Malarkey, M., Brian, W. Food and Drugs Administration Biologics Licence Application Approval letter. , Available from: https://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/cellulargenetherapyproducts/approvedproducts/ucm581259.pdf (2017).
- Liu, Y., Zeng, G. Cancer and Innate Immune System Interactions: Translational Potentials for Cancer Immunotherapy. Journal of Immunotherapy. 35 (4), Hagerstown, Md. 299-308 (2012).
- Janssen, L. M. E., Ramsay, E. E., Logsdon, C. D., Overwijk, W. W. The immune system in cancer metastasis: friend or foe. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5 (1), 79 (2017).
- Pandya, P. H., Murray, M. E., Pollok, K. E., Renbarger, J. L. The Immune System in Cancer Pathogenesis: Potential Therapeutic Approaches. Journal of Immunology Research. 2016, 13 (2016).
- Vinay, D. S., et al. Immune evasion in cancer: Mechanistic basis and therapeutic strategies. Seminars in Cancer Biology. 35, S185-S198 (2015).
- Gajewski, T. F., Meng, Y., Harlin, H. Immune Suppression in the Tumor Microenvironment. Journal of Immunotherapy. 29 (3), 233-240 (2006).
- Munn, D. H., Bronte, V. Immune suppressive mechanisms in the tumor microenvironment. Current opinion in immunology. 39, 1-6 (2016).
- Vanderlugt, C. L., Miller, S. D. Epitope spreading in immune-mediated diseases: implications for immunotherapy. Nature Reviews Immunology. 2, 85 (2002).
- Hardwick, N., Chain, B. Epitope spreading contributes to effective immunotherapy in metastatic melanoma patients. Immunotherapy. 3 (6), 731-733 (2011).
- Makkouk, A., Weiner, G. Cancer Immunotherapy and Breaking Immune Tolerance-New Approaches to an Old Challenge. Cancer research. 75 (1), 5-10 (2015).
- Jackson, S. R., Yuan, J., Teague, R. M. Targeting CD8(+) T-cell tolerance for cancer immunotherapy. Immunotherapy. 6 (7), 833-852 (2014).
- Brentjens, R. J., et al. Lymphodepletion and tumor burden govern clinical responses in patients with B-cell malignancies treated with autologous, CD19-targeted T cells. Journal of Clinical Oncology. 29 (15_suppl), 2534 (2011).
- Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias. Blood. 118 (18), 4817 (2011).
- Hay, K. A., et al. Kinetics and Biomarkers of Severe Cytokine Release Syndrome after CD19 Chimeric Antigen Receptor-modified T Cell Therapy. Blood. 130, 2295-2306 (2017).
- Zhang, T., et al. Efficiency of CD19 chimeric antigen receptor-modified T cells for treatment of B cell malignancies in phase I clinical trials: a meta-analysis. Oncotarget. 6 (32), 33961-33971 (2015).
- Kueberuwa, G., Kalaitsidou, M., Cheadle, E., Hawkins, R. E., Gilham, D. E. CD19 CAR T Cells Expressing IL-12 Eradicate Lymphoma in Fully Lymphoreplete Mice through Induction of Host Immunity. Molecular Therapy - Oncolytics. 8, 41-51 (2018).
- Engels, B., et al. Retroviral vectors for high-level transgene expression in T lymphocytes. Human Gene Therapy. 14 (12), 1155-1168 (2003).
- Parkinson, C. M., et al. Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2966 (2011).
- Kueberuwa, G., et al. CCR7(+) selected gene-modified T cells maintain a central memory phenotype and display enhanced persistence in peripheral blood in vivo. Journal for Immunotherapy of Cancer. 5, 14 (2017).
