Summary
وهنا، يقدم بروتوكول لإنتاج واختبار قبل الإكلينيكية مورين CD19 سيارة تي الخلايا عن طريق توصيل الفيروسات التراجعية واستخدامها كعلاج ضد المنشأة سينجينيك A20 ب-خلية سرطان الغدد الليمفاوية في الفئران بالب/c مع أو بدون ليمفوديبليتينج تكييف مسبقاً.
Abstract
وقد أدى نجاح مذهل السريرية CD19 مستضد تشيميريك مستقبلات (السيارات) تي خلية العلاج بالموافقة على الجيل الثاني اثنين مستضد تشيميريك مستقبلات (السيارات) لسرطان الدم الليمفاوي الحاد (جميع) أندنون-هودجكين الأورام اللمفاوية (NHL). تركيز الميدان الآن على محاكاة هذه النجاحات في سائر الأورام الخبيثة الدموية حيث لوحظت معدلات الاستجابة الكاملة أقل تأثيراً. كذلك هندسة الخلايا T السيارة أو الإدارة المشتركة لطرائق العلاج الأخرى قد بنجاح إلى تذليل العقبات التي تعترض العلاج الناجح في إعدادات أخرى للسرطان.
ولذلك فإننا نقدم نموذجا فيه آخرون يمكن إجراء التجارب قبل الإكلينيكية للخلايا T السيارة CD19. النتائج في هذا النموذج سرطان الغدد الليمفاوية الخلية ب اختبارها جيدا من المحتمل أن تكون غنية بالمعلومات سيارة تي خلية العلاج بصفة عامة.
يسمح هذا البروتوكول إنتاج استنساخه من الماوس الخلايا T السيارة عن طريق فوسفات الكالسيوم تعداء الخلايا منتج ه بلات مع MP71 بنيات للفيروسات الرجعية والإيكولوجية pCL التغليف بلازميد تليها مجموعة من جزيئات الفيروس يفرز و توصيل باستخدام جزء فيبرونيكتين البشري الماشوب والطرد المركزي. التحقق توصيل النسخ العكسي، وتأكيدا لقدرة خلايا "تي سيارة" لقتل الهدف لمفوما الخلايا السابقين فيفو، من خلال استخدام التدفق الخلوي ولومينوميتري والمرتبط بالانزيم المرتبط الاعتداء (ELISA)، وهو كما هو موضح.
يرد الفئران سينجينيك ليمفوديبليتيد، إذ تضع المنهجية المتبعة، وسرطان الغدد الليمفاوية والبروتوكولات لاختبار T سيارات الخلايا في الجسم الحي في ليمفوريبليتي. ويرصد في فيفو الإضاءة الحيوية والمرض تطور نشاط مضاد للسرطان. نعرض النتائج النموذجية للقضاء على المنشأة ب-الخلية اللمفاوية عند استخدامش 1 أو 2nd جيل السيارات في تركيبة مع تكييف ما قبل ليمفوديبليتينج وأقلية من الفئران تحقيق المغفرة طويلة الأجل عند استخدام "السيارة تي" خلايا معربا عن إيل-12 في الفئران ليمفوريبليتي.
يمكن استخدامها لتقييم الخلايا T سيارات CD19 مع التعديل إضافية مختلفة، ومجموعات من خلايا "تي السيارة" وغيرها من العوامل العلاجية هذه البروتوكولات أو تكييفها لاستخدام الخلايا T سيارات ضد المستضدات المستهدفة المختلفة.
Introduction
مستضد تشيميريك مستقبلات (السيارات) تي خلية العلاج قد أظهرت نجاح مذهل السريرية في علاج CD19+ الأورام الخبيثة التي تؤدي إلى الموافقة على تيساجينليكليوسيل لسرطان الدم الليمفاوي الحاد انتكست1 وأكسيكابتاجيني سيلوليوسيل التدريجي كبيرة ب-الخلية اللمفاوية غير هودجكن2 في عام 2017.
تزداد أهمية التفاعلات بين السرطان والجهاز المناعي في المرض والآليات العلاجية المعترف بها على نحو متزايد3،4،5. على سبيل المثال، أنها موثقة جيدا أن ورم المكروية (TME) يفيض بالعوامل التي يمكن أن تقمع وظائف المستجيب للخلايا المناعية6،،من78. وبدلاً من ذلك يمكن فتيلة من الخلايا المناعية الذاتية ونشر حانمه مفتاح في استئصال الورم ومقاومة طويلة الأمد للورم التحدي9،10. لا يمكن تقييم كل من هذه الظواهر في نماذج إكسينوجينيك التي تفتقر إلى نظام المناعة. وبالمثل، نظم استخدام البروتينات المعدلة وراثيا لا تعكس بدقة التحدي المتمثل في كسر التسامح المناعية التي يتطلبها حانمه نشر11،12. ذا، نموذج سينجينيك مع نظام المناعة تعمل بكامل طاقتها القصوى لنمذجة هذه الجوانب الهامة من المداواة المناعية وتطور مرض السرطان.
تحذير هام من السيارة تي خلية العلاج أن تكييف ما قبل ليمفوديبليتينج المطلوبة للنجاح العلاجي13،14. ويتحقق ذلك عادة في المرضى بإدارة العلاج الكيميائي قبل التسريب من15،خلايا "تي السيارة"16. كطريقة قياسية، بغية تقليد ليمفوديبليشن المستخدمة في إعداد المرضى، ونحن إدارة 5 تشعيع الجسم الكلي غراي (تبي) لتحقيق ليمفوديبليشن قبل إقامة خلايا "تي سيارة" العلاجية للفئران إذ تضع منهجية A20 ب-الخلية اللمفاوية.
بينما تكييف ما قبل ليمفوديبليتينج ليس مشكلة بالنسبة الغالبية العظمى من المرضى، السمية التي تأتي مع وكلاء العلاج الكيميائي يعني أن مرضى حالة انخفاض الأداء غير مؤهلة للعلاج بسيارة تي خلية. لإنشاء نظام اختبار الذي يمثل المرضى غير مؤهلة ليمفوديبليشن، قمنا بإنشاء نموذج ماوس سينجينيك ليمفوريبليتي التي نحن نموذج سيارة تي خلية العلاج من سرطان الغدد اللمفاوية. في هذا النموذج، واظهرنا أن إفراز إيل-12 من داخل خلايا "تي السيارات" يمكن أن يؤدي إلى القضاء على الأورام اللمفاوية المنشأة مع معدل نجاح ~ 25%17. وعلاوة على ذلك، نحن وأظهرت أن الخلايا المناعية الذاتية شاركوا في القضاء على السرطان.
هنا نحن تصف بالتفصيل البروتوكول لإنتاج خلايا "تي سيارة" الماوس، إنشاء سرطان الغدد الليمفاوية في الفئران سينجينيك، والعلاج من سرطان الغدد الليمفاوية مع خلايا "تي سيارة" مع أو بدون استخدام تكييف ما قبل ليمفوديبليتينج. يمكن استخدام هذا للدراسات تركيبة الخلايا T السيارة مع عوامل أخرى، اختبار خلايا "تي سيارة" مع أخرى المتسلسلات أو لاستخدام استراتيجيات العلاج أو العلاج المناعي التبني خلية أخرى ضد سرطان الغدد الليمفاوية.
Protocol
وقد أجريت جميع التجارب على الحيوانات تحت رعاية الحيوانات (إجراءات علمية) قانون عام 1986 وفي إطار "لجنة التنسيق في المملكة المتحدة" للمبادئ التوجيهية "أبحاث السرطان". جميع الدراسات الحيوانية قد أجريت في معهد كروك-مانشستر ووافق عليهما رعاية الحيوانات المحلية واستعراض الأخلاقيات الجسم (كروك-مي أويرب).
1-الأعمال التحضيرية
- بناء pMP71 ماكسيبريب الفيروسات التراجعية بلازميد والإيكولوجية pCL لفي التغليف والبلازميدات18.
ملاحظة: pMP71 بترميز متشيري والسيارة مفصولة بتسلسل FMDV2A. هذا للتبادل مع غيرها ثوابت للفيروسات الرجعية. ترميز pCL-الإيكولوجية هفوة وبول والبروتينات مغلف اكوتروبيك. - إعداد كامل تي الخلية المتوسطة (الطب الصيني التقليدي) لاستزراع الخلايا الماوس T باستخدام المتوسط RPMI 1640، FCS 10 ٪، 1 ٪ 100 x البنسلين والستربتوميسين-الجلوتامين (باريس سان جيرمان).
ملاحظة: يحتوي الحل على البنسلين 100 وحدة دولية/مل، 100 ميكروغرام/مل من ستربتوميسين، ومم 2 للأم الجلوتامين)، 50 ميكرومتر β-ميركابتوثانول وحمض-(2-hydroxyethyl)-1-بيبيرازينيثانيسولفونيك 25 مم 4 (حبيس). - ثقافة الخلايا A20 في RPMI 1640، FCS 10% و 0.05 مم β-mercaptoethanol على 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
- الثقافة الخلايا البلاتين-ﻫ (بلات-E) في النسر معدلة المتوسطة كامل دولبيكو (دميم) (دميم مع مصل العجل الجنين 10% (FCS)، 2 مم ل الجلوتامين، 1 ميكروغرام/مل بوروميسين و 10 ميكروغرام/مل بلاستيسيدين) عند 37 درجة مئوية، 5% CO2-
ملاحظة: خلايا ه بلات مشتقة من الخلايا 293T والتعبير عن هفوة وبول اكوتروبيك المغلف للفيروسات التراجعية البروتينات. - إعداد تعداء وسائل الإعلام عن حلول 1 و 2 قبل تعداء مباشرة. إعداد الحل 1 (الرقم الهيدروجيني 7.9) تحتوي على السفح 10% + دميم + 25 مم حبيس، حل 2 (الرقم الهيدروجيني 7.1) لاحتواء دميم + 25 مم حبيس.
- إعداد 10 ميكروغرام/مل فيبرونيكتين البشري الماشوب يفتت الحل عن طريق إضعاف مع المحلول الملحي المعقم مخزنة الفوسفات (PBS) وتخزينها في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- عقيمة تصفية جميع وسائل الإعلام من خلال 0.2 ميكرومتر مرشحات قبل الاستخدام (استثناء فيبرونيكتين البشري الماشوب جزء).
2-الفيروسات التراجعية توصيل الخلايا T
- يوم 1: إعداد تعداء
- الخلايا في أطباق زراعة الأنسجة2 15 سم في 18 مل دميم كاملة البذور 7.5 × 106 البلاتين-ﻫ (بلات-E) واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
- يوم 2: تعداء خط الخلية التغليف للفيروسات التراجعية بلات-E
- إعداد ميكروغرام 20.4 pcl-الإيكولوجية التغليف ناقل الحمض النووي، ميكروغرام 39.6 بلازميد الحمض النووي ترميز بناء سيارة للفيروسات الرجعية وميكروليتر 150 م 1 كاكل2 الحجم النهائي لحل تعداء مل 3 2 الواحدة 15 سم2 طبق يكون ترانسفيكتيد. دوامة 10 s والراحة لمدة 5 دقائق
- قم بإزالة الوسائط دميم من الأطباق2 15 سم واستبدال مع 12 مل من محلول تعداء 1.
تنبيه عند تغيير وسائل الإعلام، يمكن الجاف الأطباق2 15 سم في المركز. وهذا يمكن أن يسبب الموت كبيرة transfected الخلايا بلات-ه. العمل بسرعة وقم بإزالة الوسائط من لوحات فقط 1-2 في وقت واحد. - أضف 3 مل تعداء الحل 2 التي تحتوي على الحمض النووي وكاكل2 لكل 15 سم2 طبق دروبويسي، بالتساوي عبر كل لوحة. لوحات روك برفق مع حركة جنبا إلى جنب إينكوباتي س. 10 في 37 درجة مئوية، 5% CO2 بين عشية وضحاها.
- يوم 3: الإعداد التي تحتوي على الفيروسات طافية لتوصيل
- استبدال وسائط الإعلام transfected الخلايا اللوحة الإلكترونية مع 18 مل إكمال الطب الصيني التقليدي والعودة إلى الحاضنة.
تنبيه عند تغيير الوسائط 15 سم2 الأطباق يمكن الجاف في المركز. وهذا يمكن أن يسبب الموت كبيرة transfected الخلايا بلات-ه. العمل بسرعة وقم بإزالة الوسائط من لوحات فقط 1-2 في وقت واحد.
- استبدال وسائط الإعلام transfected الخلايا اللوحة الإلكترونية مع 18 مل إكمال الطب الصيني التقليدي والعودة إلى الحاضنة.
- يوم 3: تفعيل العزل و في المختبر من خلايا تي الطحال الماوس
- إزالة الطحال من 6-8 أسبوع من العمر بالب/ج الفئران كما تم وصفه سابقا من باركنسون et al. 19 وتزج العقيمة، والمثلج، برنامج تلفزيوني في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل.
- استخدام الملقط لنقل من طحال إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل وتجانسه باستخدام مدقة مع الحد الأدنى من القوة.
- استخدام ماصة 1000 ميكروليتر و ~ 800 برنامج تلفزيوني ميكروليتر لنقل هوموجيناتي إلى 100 ميكرومتر المسامية خلية مصفاة الملصقة على أنبوب 50 مل يحتوي على 5 مل برنامج تلفزيوني لبلوغ تعليق خلية مفردة. كرر الخطوة 2.4.2 الطحال إضافية. لا تتجاوز 3 الطحال كل أنبوب.
تنبيه سبلينوسيتيس التي تم تمريرها من خلال عامل تصفية يمكن تشكيل كتل إذا بقي واقفاً. يدوياً دوامة أنابيب بشكل متقطع في حالة معالجة الطحال عدة لتجنب خلية التثاقل. تبقى الشظايا في مصفاة خلية يمكن أن تكون كذلك هرس استخدام المكبس من حقنه 5 مل باستخدام الحد الأدنى من القوة. - أعلى تصل إلى 20 مل مع برنامج تلفزيوني. طبقة تعليق خلية 20 مل بلطف إلى 20 مل وسائط (جدول المواد) الكثافة المتدرجة في أنبوب 50 مل. الطرد المركزي بتعليق متراكبة الناتجة في 800 x ز لمدة 20 دقيقة مع الفرامل لم تطبق.
- حصاد الخلايا في طبقة واجهة استخدام ماصة باستور معقمة ونقل إلى أنبوب 50 مل. أعلى يصل إلى 50 مل مع برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 800 x ز لمدة 10 دقائق لغسل. تجاهل المادة طافية وتعليق إعادة الخلايا في إكمال الطب الصيني التقليدي.
- حساب عدد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير.
- الثقافة الخلايا في كثافة 5 × 106 خلايا/مل في الطب الصيني التقليدي الكامل مع 30 جسم CD3ε مكافحة نانوغرام/مليلتر (استنساخ 145-2 ج 11)، 30 جسم CD28 مكافحة نانوغرام/مليلتر (37.51 استنساخ)، 100 يو/مليلتر الماشوب البشري إيل-2 والمؤتلف 2 نانوغرام/مليلتر مورين إيل-7. استخدام قارورة زراعة الأنسجة حجم مناسب لحجم الخلايا حصادها.
ملاحظة: مستضد–عرض الخلايا المطلوبة لتنشيط خلايا تي بالأجسام المضادة CD3 و CD28، إذا أنها تعمل مع خلايا تي المنقي ضرورية إلى لوحات معطف مع الأجسام المضادة، أو استخدام الخرز المغناطيسي (جدول المواد) - احتضان سبلينوسيتيس الماوس عند 37 درجة مئوية، 5% CO2 بين عشية وضحاها.
- يوم 3: إعداد لوحات لتوصيل
- معطف زراعة الأنسجة غير لوحات 6-جيدا مع 2 مل من 10 ميكروغرام/مل فيبرونيكتين البشري الماشوب تفتيت واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- يوم 4: توصيل الماوس تي الخلايا
- نقل بلغة فيبرونيكتين البشري المؤتلف من لوحات المغلفة لزراعة الأنسجة غير الطازجة 6-جيدا لوحات. احتضان هذه اللوحات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية للجولة 2 لتوصيل.
- إضافة 2 مل من الطب الصيني التقليدي لكل من لوحات المغلفة بلغة فيبرونيكتين البشري الماشوب الأصلي جيدا وتترك لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لمنع الربط غير محددة.
- حصاد المادة المحتوية على لفي طافية من transfected الخلايا بلات-ه في 15 سم أطباق زرع الأنسجة واستبدال ب 18 مل من إكمال الطب الصيني التقليدي.
تنبيه العمل بسرعة لتجنب تجفيف الخلايا بلات-ه.
ملاحظة: نجاح تعداء يمكن التحقق في هذه المرحلة بالفحص المجهري الأسفار إذا كان استخدام جينات علامة نيون مثل مشري (الشكل 1). - تصفية المادة المحتوية على لفي طافية عن طريق 0.45 ميكرومتر تصفية لإزالة الحطام خلية. إزالة الطب الصيني التقليدي من فيبرونيكتين البشري الماشوب المغلفة بالجزء 6-جيدا لوحات وإضافة 2.5 مل من المصفاة التي تتضمن لفي المادة طافية أو لكل بئر (إكمال استخدام الطب الصيني التقليدي تعداء وهمية). قم بتسمية كل كذلك الإضافة لفي أو وسائط صورية.
- الطرد المركزي اللوحات في 1200 غ س لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- بينما هي الغزل لوحات، جمع تنشيط خلايا تي والعد باستخدام هيموسيتوميتير.
- يتم توصيل مع 5 × 106 تنشيط سبلينوسيتيس في مجموعها 5 مل/جيدا. بيليه على العدد المطلوب من سبلينوسيتيس لصورية/توصيل في أنابيب منفصلة باستخدام الطرد المركزي في ز x 500 لمدة 5 دقائق.
- إعادة تعليق سبلينوسيتيس في كثافة 5 × 106 خلايا الواحدة 2.5 مل من المصفاة المادة المحتوية على لفي طافية من الخطوة 2.6.4 أو الطب الصيني التقليدي كعنصر سلبي. إضافة إيل-2 البشري الماشوب (hIL-2) والماوس المؤتلف إيل-7 (mIL-7) بتركيز نهائي 200 وحدة دولية/مل و 4 نانوغرام/مليلتر على التوالي.
- جمع لوحات 6-جيدا من أجهزة الطرد المركزي في انتهاء الخطوة 2.6.5 وإضافة 2.5 مل/كذلك إعادة علقت سبلينوسيتيس في الآبار المناسبة جعل وحدة تخزين نهائي من 5 مل/حسنا وتركيز نهائي 100 يو/مليلتر hIL-2، و 2 نانوغرام/مل مل-7.
- الطرد المركزي اللوحات في 1200 غ س لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي، احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية، 5% CO2 بين عشية وضحاها.
- اليوم الخامس: جولة 2 لتوصيل
- جمع الجزء فيبرونيكتين البشري المؤتلف من اللوحات كهذه يمكن إعادة استخدامها. كرر الخطوات 2.6.2-2.6.5.
- بينما هي الغزل لوحات، جمع الخلايا من 1st جولة لتوصيل باستخدام ماصة باستور. أشطف كل بئر مع 2 مل برنامج تلفزيوني ودوامه وجمع أي الخلايا المتبقية في كل بئر.
ملاحظة: "الماصة؛" صعودا وهبوطاً لإعادة تعليق رسابة خلايا. جمع كل مجموعة عنصر التحكم/توصيل في أنابيب منفصلة. - أنابيب الطرد المركزي في ز 500 x للخلايا إعادة تعليق 5 كحد أدنى في 2.5 مل في البئر لتوصيل مع 200 وحدة دولية/مل إيل-2 و 4 نانوغرام/مليلتر إيل-7. كرر الخطوات 2.6.7-2.6.8.
- إزالة خلايا من أجهزة الطرد المركزي واحتضان في 37 درجة مئوية، 5% CO2 4 h. ترانسدوسيد جمع الخلايا كما هو الحال في 2.7.2-2.7.3 الخطوات.
- حساب عدد الخلايا والطرد المركزي في ز 500 x لمدة 5 دقائق وإعادة تعليق في إكمال الطب الصيني التقليدي في كثافة 1 × 106 خلايا/مل مع 100 يو/مليلتر hIL-2 و 2ng/مل مل-7. نقل إلى قارورة ثقافة مناسبة حجم واحتضانها في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
- إضافة وسائط الطب الصيني التقليدي الطازجة التي تحتوي على 100U مليلتر hIL-2 و 2ng/mL 7 مل كل يومين، الحفاظ على كثافة خلية 1 × 106 خلايا/مل.
ملاحظة: سبلينوسيتيس المقطوع تحتوي على مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا. في ظل هذه الظروف الثقافة، تموت الخلايا T غير على مدى 2-3 أيام. وبعد ~ 4 أيام في ثقافة الخلية، عادة ما يساوي العدد الإجمالي لحصاد سبلينوسيتيس عدد الخلايا T في اليوم 0.
3-قياس كفاءة توصيل
- في يوم 4 وظيفة توصيل، جمع عينة خلايا T ترانسدوسيد أو غير ترانسدوسيد (حوالي 3 × 105 الخلايا). الطرد المركزي من تعليق خلية في ز 500 x لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية وتغسل الخلايا الأعلاف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني والطرد المركزي مرة أخرى.
- تجاهل المادة طافية وإضافة 100 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على صبغة رد الفعل أمين مناسبة (مثلاً، يعيش الميت وصمة عار، وتمييع 1 في 100) للبئر الواحد. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- تغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني والطرد المركزي في 500 غرام x للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية واحتضان مع 50 ميكروليتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت الذي يحتوي على الماوس المضادة CD16/CD32 الأجسام المضادة لمستقبلات Fc حجب (تمييع 1 في 100). احتضان لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
- إضافة 50 ميكروليتر من جسم تلطيخ مزيج الرئيسي الذي يحتوي على الماوس المضادة خلايا CD4--BV786 والأجسام المضادة CD8-BV711 (تركيز النهائي 1 ميكروليتر/بئر في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية) مباشرة. احتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية في الظلام. كرر الخطوة يغسل 3.3. تعليق إعادة الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت لمنهاج عمل بيجين 1%، وتبقى في الظلام في 4 درجات مئوية حتى التحليل بالتدفق الخلوي.
- تحليل الخلايا بما يعادل سيتوميتير مناسبة باستخدام BV711 و BV785 ومشري fluorescence كعلامات فرعية CD8 و CD4 والتعبير سيارة النابضة على التوالي كما هو الحال في (الشكل 2).
4. في المختبر "التحقق من السيارة تي" خلية نشاط
- استهداف البذور سينجينيك CD19+ الخلايا السرطانية مع أو بدون لوسيفراس التعبير في كثافة 1 × 104 خلايا في 100 ميكروليتر الطب الصيني التقليدي/بئر في 96-جيدا U-قاع لوحة زراعة الأنسجة.
- أضف 1 × 104 CD19 سيارة تي الخلايا/جيدا في حجم 100 ميكروليتر/جيدا لتحقيق المستجيب للهدف (E:T) نسبة 1:1.
ملاحظة: ينبغي وضع نسب E:T لكل سيارة بناء واستهداف خط الخلية. - استخدام تي الخلايا وحدها والخلايا السرطانية وحدها باعتبارها عناصر سلبية وخلايا تي تحفزها phorbol-myristate-خلات (PMA) (50 نانوغرام/ملليلتر) وإيونوميسين (1 ميكروغرام/مل) كمراقبة إيجابية انترفيرون غاما (IFNγ) إطلاق سراح. خلايا الثقافة المشارك في 37 درجة مئوية، 5% CO2 لح 16-24.
- وبعد ثقافة المشارك، الطرد المركزي اللوحات في ز x 500 لمدة 5 دقائق وجمع المادة طافية لمزيد من التحليل IFNγ وايل-12 ف 70 أليسا.
ملاحظة: وهذا يمكن تخزينها في-80 درجة مئوية. - إعادة تعليق الكريات الخلية في 100 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني يتضمن لوسيفرين (تركيز النهائي 1.5 ملغ/مل). احتضان لوحات لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. ثم قياس التﻷلؤ من كل بئر مع لومينوميتير مناسبة.
ملاحظة: يجب أن يكون الأمثل مرات التعرض لخطوط الخلايا والكثافة. وتظهر نتائج الممثل في الشكل 3 ألف. يمكن تعديل السابقين فيفو سيتوتوكسيسيتي خلايا "تي السيارة" لوسيفرين صريحة بثقافة المشارك مع خطوط الخلايا معربا عن مستضد المستهدفة. كما خلايا "تي سيارة" تقتل الخلايا الهدف، هو الإفراج عن لوسيفرين، وبالتالي انخفاضا في إشارة لومينوميتري يرتبط بقتل الخلية. عدم ترانسدوسيد الخلايا يمكن غالباً ما يكون لها تأثير على بقاء الخلية المستهدفة، لا سيما خلال فترات حضانة طويلة. قياس تركيز مورين IFNγ وايل-12 ف 70 في المادة طافية وفقا لبروتوكولات أليسا الخاص بالشركة المصنعة. وتظهر نتائج الممثل في (الشكل 3 و 3 ج). يمكن جزيئي السابقين فيفو تنشيط خلايا "تي السيارة" بثقافة التعاون مع خطوط الخلايا معربا عن مستضد الهدف عن طريق تحليل محتويات طافية باستخدام ELISA. نسبة "سيارات تي" الخلية إلى الخلايا المستهدفة وطول فترة ثقافة المشارك يجب أن يكون الأمثل لبناء كل سيارة وخط الخلية المستهدفة وأكثر. يمكن استخدام العلاج سلطة النقد الفلسطينية وإيونوميسين كعنصر إيجابي لتأكيد الجودة من خلايا تي وقدرتها على الاستجابة.
5-تقييم نشاط مضاد للسرطان في الفئران
-
البروتوكول 1
- أداء التسليم (رابعا) عن طريق الحقن الوريدي 100 مغ/كغ من السيكلوفوسفاميد في الفئران بالب/ج 6 إلى 8 أسابيع. وهذا ما يسمح انجرافتمينت الورم دون ليمفوديبليشن كبيرة17 (الشكل 4).
ملاحظة: إنشاء A20 اللمفاوية يمكن أن ما يزيد على شهرين بمعدل خذ الأمثل. ويمكن تحسين هذا باستخدام السيكلوفوسفاميد يوم 1 قبل تسليم الخلايا اللمفاوية. ومن أجل دراسة الفئران ليمفوريبليتي، حددنا جرعة من السيكلوفوسفاميد التي يمكن أن تزيد كفاءة اللمفاوية دون التسبب في ليمفوديبليشن. - وفي اليوم التالي حقن 100 ميليلتر من 5 × 105 سينجينيك ب-الخلية A20 لمفوما الخلايا المعدلة للتعبير عن لوسيفراس وأخضر نيون البروتين (التجارة والنقل) في الفئران بالحقن (رابعا).
- السماح للفئران لتطوير الأورام اللمفاوية النظمية ل ~ 17 يوما.
- تأكيد وجود الأورام اللمفاوية الجهازية عن طريق الحقن (الملكية الفكرية) داخل من 100 ميكروليتر لوسيفرين 30 ملغ/مل والتصوير باستخدام في فيفو الإضاءة الحيوية نظام التصوير.
- استخدم الفواصل لتجنب امتداد إشارة إلى الفئران المتاخمة. تعرض الفئران ل 1 دقيقة على الجانب البطني مع منطقة حجم ثابت للفائدة.
- عرض وحدات خفيفة نسبيا (رلو) كالفوتونات في الثانية (p/s). يجب أن يكون الأمثل إعدادات لكل طراز الورم؛ استخدام تعرض التي يمكن التقاط الاكتشاف المبكر للأورام ولكن لا يؤدي إلى تشبع الأورام في التوصل إلى نقاط النهاية.
- رلو مجموع السجلات لكل الماوس مع ثابت الحجم منطقة فائدة. (الشكل 5 أ و ب).
- حقن لمفوما جرعة وحيدة من 1 × 106 خلايا "تي السيارة" بحقن الرابع في الفئران ليمفوريبليتي تحمل المنشأة.
ملاحظة: (مهم) ويجب وضع مستويات الجرعات لكل بناء سيارة استخدام جدول تصعيد جرعة لضمان أن أي السمية المحتملة الناشئة عن خلايا "تي سيارة" تتميز ويمكن معالجتها. خلايا T السيارة على الرغم من عدم عرض الماوس المضادة CD19 سيارة تي الخلايا السمية، يمكن أن تؤدي إلى السمية غير متوقعة. حيث يبني السيارة وكفاءة توصيل متعددة ليست متطابقة، العدد الإجمالي لخلايا تي التي تديرها ينبغي إبقاء المساواة بإضافة خلايا تي غير ترانسدوسيد في الأعمال التحضيرية للخلية. - رصد تطور المرض أسبوعيا عن طريق حقن IP من 100 ميكروليتر لوسيفرين 30 ملغ/مل والتصوير باستخدام في فيفو الإضاءة الحيوية التصوير النظام (الشكل 5 ج).
- عن كثب رصد الفئران لعلامات على سمية و euthanize أي الفئران التي تظهر بوادر شلل أطرافهم هند (HLP) أو الأعباء المرضية الورم قبل أن يمكن أن تنشأ أي معاناة.
ملاحظة: يمكن أن تتضمن السمية من الأورام اللمفاوية A20 أطرافهم هند الشلل من خلال غزو الورم السحايا. التحقق من العلامات المبكرة لمشية غيرت بصورة منتظمة. وبالمثل، يمكن أن تنشأ الأورام الملكية الفكرية الكبيرة التي يمكن أن تؤدي إلى إزعاج سيظهر بتغيير السلوك. - رصد بقاء الفئران لأيام 60-100 (الشكل 5 د). تنفيذ القتل الرحيم بأسلوب الجدول-1 عند انتهاء التجربة.
- أداء التسليم (رابعا) عن طريق الحقن الوريدي 100 مغ/كغ من السيكلوفوسفاميد في الفئران بالب/ج 6 إلى 8 أسابيع. وهذا ما يسمح انجرافتمينت الورم دون ليمفوديبليشن كبيرة17 (الشكل 4).
-
بروتوكول 2
- تسليم السيكلوفوسفاميد 200 مغ/كغ إلى 6 إلى 8-الأسبوع القديمة بالب/ج الفئران بحقن الوريد الذيل في 100 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني للماوس.
- اليوم التالي، حقن 5 × 105 سينجينيك ب-الخلية A20 لمفوما الخلايا الإعراب عن لوسيفراس والتجارة والنقل في 100 ميكروليتر برنامج تلفزيوني عن طريق الذيل حقن الوريد.
- السماح للفئران لتطوير الأورام الليمفاوية النظمية ل ~ 7-14 يوما
- تأكيد لمفوما الجهازية عن طريق الحقن IP من 100 ميكروليتر لوسيفرين 30 ملغ/مل والتصوير باستخدام في فيفو الإضاءة الحيوية نظام التصوير.
- إجراء 5 تشعيع الجسم الكلي غراي (تبي) في الدقيقة 0.02 غراي ليمفوديبليشن.
ملاحظة: المرضى الذين يخضعون لعلاجات سيارة تي خلية الخضوع لمجموعة من الأنظمة العلاجية لتحقيق ليمفوديبليشن قبل إقامة خلايا "تي السيارة" الذي يزيد بشكل كبير انجرافتمينت من أدوبتيفيلي نقل الخلايا T السيارة. ويمكن تكرار هذا في الفئران تشعيع الجسم الكلي (تبي) (الشكل 6). - في اليوم التالي، بحقن خلايا "تي السيارة"6 1 x 10 في 100 ميكروليتر برنامج تلفزيوني عن طريق الذيل الوريد الحقن في الفئران التي تحمل المنشأة الأورام.
- جمع عينات الدم عن طريق الذيل الوريد ينزف بعد 7 أيام.
- إضافة المخزن المؤقت لتحلل الخلايا الحمراء لكل عينة الدم، ثم التحضير للتدفق الخلوي كما هو موضح في القسم 3. تحليل "تي السيارة" خلية الثبات في الدورة الدموية بالتدفق الخلوي (الشكل 2).
ملاحظة: إضافة الخرز العد فورا قبل الخلوي يسمح تحديد عدد الخلايا T سيارة في المليلتر من الدم. - رصد التقدم المحرز في المرض كما هو موضح في الخطوات 5.1.5-5.1.8 (الشكل 7).
Representative Results
لتوصيل عالية الكفاءة لخلايا T، من الضروري الحصول على جزيئات الفيروسات التراجعية الطازجة. تعداء خط الخلية بلات-E مع بلازميد منتج pCL-الإيكولوجية و pMP71 لفي بلازميد يثير إفراز جزيئات الفيروس داخل الخلية طافية. عندما يتم ترميز جينات علامة نيون، مثل مشري، لفي، يمكن تأكيد تعداء الناجحة بالأسفار مجهرية (الشكل 1). يستخدم المادة طافية المحتوية على الفيروس من خلايا ه بلات transfected ترانسدوسي خلايا تي عبر 2 طلقة من زيادة ونقصان-فيكتيون على ألواح المغلفة بلغة فيبرونيكتين. يمكن تحديد كفاءة توصيل 4 أيام وظيفة توصيل عن طريق التدفق الخلوي. خلايا ترانسدوسيد بنجاح التعبير عن الجين علامة ترميز بلفي (الشكل 2). تتراوح كفاءة توصيل ~ 50-90% من الكفاءة مع مستقبلات الجيل الأول ل ~ 10-40% مع سيارة بنيات قريبة من قدرة التعبئة والتغليف للفيروسات الرجعية. بينما يظهر التعبير الجيني علامة نجاح توصيل النسخ العكسي، أنه أمر بالغ الأهمية لإظهار وظيفة خلايا T السيارة عند التعامل مع خلايا مستضد أن الهدف الصريح على سطحها. يمكن استخدام خطوط الخلية المستهدفة المعدلة للتعبير عن لوسيفراس في فحوصات لوسيفراس لاختبار درجة القتل خلية من خلايا "تي السيارة" مباشرة (الشكل 3A). يمكن أيضا استخدام الإفراج عن المستجيب السيتوكينات من الخلايا T سيارات بناء ثقافة التعاون مع الخلايا الهدف، يحدده أليسا، كتدبير غير مباشر من "سيارة تي" سيتوتوكسيسيتي الخلية (الشكل 3 وج 3).
يمكن تقييم الخلايا T السيارات المنتجة في هذا البروتوكول في الفئران ليمفوريبليتي بوضع المنهجية A20 اللمفاوية بجرعة 100 مغ/كغ من السيكلوفوسفاميد (حقن الوريد)، يوم واحد قبل الحقن الرابع من 5 × 105 A20 الخلايا (الشكل 4). يمكن استخدام حقن IP مع التقاط لوسيفرين والصورة باستخدام تصوير الإضاءة الحيوية في الجسم الحي لرصد العبء الورم باستخدام وقت العائد على الاستثمار، والتعرض مستمر في جميع أنحاء (الشكل 5 ألف-ج). خلايا T سيارات معدلة للتعبير عن إيل-12 القادرة على القضاء على الأورام اللمفاوية المنهجي مع ليمفوديبليتينج تكييف قبل إعطاء البقاء خالية من المرض في حوالي 25% فئران (الشكل 5). ليمفوديبليتينج preconditioning، تحقق من 5 غراي تبي يوم 1 قبل الإدارة رابعا من خلايا "تي السيارة"، يحسن بشكل ملحوظ انجرافتمينت (الشكل 6). في هذا النموذج، خلايا "تي سيارة" الجيل الأول القادرة على القضاء على الأورام اللمفاوية A20 النظمية، حمل عادة البقاء خالية من المرض بنسبة 100% من الفئران (الشكل 7).
رقم 1. تأكيد نجاح تعداء الخلايا "ه بلات". Transfected الخلايا بلات-E مع الفيروسات التراجعية سيارة بناء و pMP71 والإيكولوجية pcl التغليف ناقلات بلازميد الحمض النووي. تعداء ناجح يرد التعبير عن الجين علامة نيون مشري. A) المجهري الحقل مشرق، ب) المجهري الأسفار و ج) تظهر الصور المدمجة. التكبير = 50 س. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. تحديد كفاءة توصيل بالتدفق الخلوي- يستخدم التدفق الخلوي لتحديد كفاءة توصيل الماوس تي الخلايا تنبيغ بوست يوم 4، باستخدام "الأشعة فوق البنفسجية في غيبوبة" العيش/الميت، مشري، BV711 و BV785 للكشف عن العيش، وسيارات بناء، خلايا CD4 و CD8، على التوالي. نتائج تمثيلية A) عدم-ترانسدوسيد، ب) mCherry.αmCD19.mCD3z و ج) mCherry.αmCD19.mCD3z.mIL12 ترد مع النابضة من 1) 2 نوع) تعيش الخلايا 3) CD4 و CD8 4) و 5) تقييم الخلايا إيجابية مشري معربا عن السيارة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. التحقق من صحة النشاط سيارة تي خلية. ΑmCD19 خلايا "تي سيارة" كانت مثقف يشترك مع الخلايا اللمفاوية A20 تعديل للتعبير عن لوسيفراس (1 × 104: 1 × 104) ح 16 في صفيحة 96 يو-أسفل بئر. بعد ثقافة المشارك، كانت القريبون الخلايا، وجمعت المادة طافية. A) خلايا تم إعادة معلقة في برنامج تلفزيوني واستخدمت لومينوميتري لتقييم صلاحية الخلايا الهدف. وجرى تقييم المادة طافية من ثقافة المشارك لوجود IFNγ (ب) وايل-12 (ج). نسبة "سيارات تي" الخلية إلى الخلايا المستهدفة وطول فترة ثقافة المشارك يجب أن يكون الأمثل لكل سيارة بناء واستهداف خط الخلية. يمكن استخدام العلاج سلطة النقد الفلسطينية وإيونوميسين كعنصر إيجابي لتأكيد الجودة من خلايا تي وخلاياها القدرة على الاستجابة. إظهار أشرطة الخطأ الإحصائي التنمية المستدامة. وأجرى التحليل باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه. ف < 0.001). وقد تم تعديل هذا الرقم من17. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. إنشاء لمفوما A20 دون ليمفوديبليشن- السيكلوفوسفاميد يمكن زيادة الكفاءة لتحريض الأورام اللمفاوية دون التسبب في ليمفوديبليشن. A) تعداد الدم من 6-8 أسبوع من العمر بالب/ج الفئران بعد الولادة الرابعة 100 مغ/كغ من السيكلوفوسفاميد. إظهار أشرطة الخطأ SD ب) عبء لمفوما البالغ من العمر 6-8 أسبوع بالب/ج الفئران بعد تسليم 100 مغ/كغ من السيكلوفوسفاميد أو المالحة-1 في اليوم الرابع والرابع تسليم 5 × 105 A20 خلايا في اليوم 0 تقاس باستخدام لومينوميتير. ج) بقاء الفئران في ب). إظهار أشرطة الخطأ الإحصائي التنمية المستدامة. وأجرى التحليل باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه. * * ف < 0.01، * * * ف < 0.001). وقد تم تعديل هذا الرقم من كويبيرووا et al. 17- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5. رصد العبء الأورام اللمفاوية، والبقاء على قيد الحياة- تلقي 100 ميليلتر داخل الحقن (IP) من 30 ملغ/مل لوسيفرين الفئران تحمل لمفوما A20 الإعراب عن لوسيفراس وتم تصويرها باستخدام في فيفو الإضاءة الحيوية نظام التصوير. A) الفئران المعرضة لمدة 1 دقيقة على الجانب البطني وانقلبت فورا إلى الصورة الظهرية لالتقاط الورم الجماهير على كلا الجانبين من الهيئات (ب). ج) النتائج تمثيلية من عبء لمفوما بالب/ج الفئران تلقي متفاوتة من خلايا "تي سيارة" αmCD19 دون ليمفوديبليشن. إظهار أشرطة الخطأ sem. د) معدل البقاء على قيد الحياة من الفئران نفسها. وقد تم تعديل هذا الرقم من كويبيرووا et al. 17- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6. الآثار المترتبة على ليمفوديبليشن. A) تعداد الدم من 6-8 أسبوع من العمر بالب/ج الفئران بعد تلقي غراي 5 تبي بمعدل جرعة 0.02 غراي في الدقيقة؛ وتظهر أشرطة الخطأ الإحصائي التنمية المستدامة. تحليل ANOVA ثنائي الاتجاه. ف < 0.05، * * ف < 0.01، * * * ف < 0.001. ب) CD8 ورصد CD4+ + "سيارة تي" الخلايا في الدم المحيطي لدى الفئران بالتدفق الخلوي مشري ماركر الجينات 7 أيام وظيفة الإدارة. أشرطة الخطأ تظهر التنمية المستدامة. وقد تم تعديل هذا الرقم من كويبيرووا et al. 17- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 7. نشاط الخلايا T السيارة بتكييف ما قبل ليمفوديبليتينج- يظهر تأثير غراي 5 تبي اليوم قبل سيارة تي خلية إدارة النتائج النموذجية. A) تصوير و (ب) يعرض رسومية لتصوير فئران بعد 100 ميليلتر داخل الحقن (IP) من 30 ملغ/مل لوسيفرين في فيفو الإضاءة الحيوية نظام التصوير باستخدام. إظهار أشرطة الخطأ sem. ج) بقاء الفئران نفسها. هذا الرقم قد تم تعديله فرومكويبيرووا et al. 17- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
نماذج الماوس سينجينيك السماح باختبار تطور المرض والعلاج مع الحفاظ على نظام المناعة سليمة. وهذا بالغ الأهمية عندما يتعلق الأمر بالعلاجات التي تتفاعل مع النظام المناعي، وخاصة لعملاء إيمونوثيرابيوتيك.
البروتوكول هو موضح هنا اتجاهين العمل الحاسم، وأول واحد هو تعديل وراثيا الماوس تي خلية للتعبير عن السيارات. وهذا يتطلب 7 أيام من بدء للتحقق من توصيل. المتزامن مع إنتاج خلايا "تي السيارة" إنشاء لمفوما النظمية في الفئران. ينبغي أن تفشل في إنتاج الخلايا T السيارة، أو يجري نوعية كافية، ليست هناك عادة ما يكفي من الوقت لإنتاج الخلايا استبدال قبل الفئران تستسلم للأورام اللمفاوية. ولذلك من الأهمية بمكان أن الباحثين باستخدام هذه النماذج بدقة أداء الورم الجرعات والمرض تطور الدراسات من أجل نجاح وقت إنتاج خلايا "تي سيارة" للإدارة العلاجية.
الأسباب النموذجية لانخفاض كفاءة توصيل تي خلية تتضمن كفاءة الفقراء تعداء الخلايا المنتجة، وعادة بسبب نقاء بلازميد الفقراء أو تحديد غير دقيق لدرجة الحموضة من تعداء وسائل الإعلام. من المستحسن للتحقق من كفاءة إنتاج الخلية تعداء وقبل أن نمضي مع بروتوكول كامل تعداء الفقيرة سوف تحد من كفاءة توصيل تي خلية. يمكن جمعها شظايا فيبرونيكتين البشري الماشوب والمخزنة في-20 درجة مئوية لإعادة استخدامها، ومع ذلك، نتيجة التجميد يذوب متعددة في توصيل انخفاض الكفاءة. المعالجة السريعة للطحال الماوس بعد جمع مهم أيضا للحصول على ارتفاع غلة من خلايا تي قابلة للحياة.
تجدر الإشارة إلى أن البروتوكول هو موضح هنا تستخدم الخلايا A20 معربا عن لوسيفراس. هذا المفضل لأنه يوفر القدرة على قياس عبء الورم النظامية بتصوير الإضاءة الحيوية. ومع ذلك، حضور المناعي وظيفية، يمكن أن تحرف الردود إلى لوسيفراس النتائج. اختبرناها سابقا ردود فعل المناعة من الباقين على قيد الحياة الفئران إلى علامة المتسلسلات17. فمفتاح لتكرار التجارب الرئيسية استخدام A20 الخلايا الحرة المتسلسلات للتحقق من صحة أن هذه لا تلعب دوراً هاما في القضاء على الورم بالخلايا المناعية.
بينما العوامل السريرية فقط يمكن المستخدمة في فيفو في الفئران التي تفتقر إلى المناعة، استخدام الماوس T سيارات خلايا ضد الخلايا السرطانية الماوس يسمح لنا لتقييم مساهمات المناعي للتقدم العلاجي فعالية أو المرض. ويمكن استخدام هذا البروتوكول للتقييم قبل الإكلينيكية للسيارات تستهدف الأورام اللمفاوية ب-الخلية أو السيارات الأخرى مع تعديلات إضافية مثل إفراز إيل-12 كما هو موضح هنا. تجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من أن يمكن تقييم التفاعل بين الخلايا المناعية في نماذج الماوس سينجينيك، أنهم قد لا الخص دقة التفاعل في البشر في فيفو. خاصة ملاحظة أن البشرية والماوس السيارات سوف تختلف في هذا الهيكل الذي قد تكون له عواقب المتلقين للمعلومات؛ الظروف التنشيط وخلية الثقافة المثلى لنمو الخلايا T مختلفة20، توزيع الأنسجة المستهدفة مستضد التعبير قد تختلف بين البشر والفئران وذوي الخبرة السمية قد تكون مختلفة اختلافاً جذريا. ولذلك من الضروري الاستفادة من السابقين فيفو ونماذج إكسينوجينيك للتأكد من صحة النتائج.
وباختصار، الخص ليمفوديبليتيد سينجينيك ونموذج ليمفوريبليتي من سرطان الغدد الليمفاوية المرضى مع أو بدون سابقة الكيماوي/العلاج الإشعاعي. وهذا يوفر نظام نموذج لمحاكاة إعدادات السريرية للسماح بإجراء التجارب على مجموعة من الاستراتيجيات العلاجية التي سوف يكون من المهم مع الموجه القادمة من وكلاء العلاج المناعي جديدة.
مع استخدام تكييف السابقة، تجدر الإشارة إلى أن جميع الفئران واضحة عادة الأورام اللمفاوية. مع أعلى معدلات الاستجابة الكاملة 90% في البشر، وهذا هو الممثل. غير أن التحديات لسيارة CD19 تي خلية العلاج سوف يتوقف على منع الترددات العالية من الانتكاسات ولاحظ أنه غالباً ما CD19. الانتكاسات لا لوحظت في هذا النموذج تصل إلى، وكثيراً ما تتجاوز 100 يوم. يمكن أن تساعد التعديلات لتقليد الانتكاسات في العيادة مع التحديات المستقبلية لسيارات CD19 تي خلية العلاج.
Disclosures
يعمل Gilham ديفيد سيلياد الذي يشارك في إنتاج خلايا "تي السيارة". بقية الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونود أن نشكر بلودويسي على تمويل هذه البحوث (منحة 13031) وفي "مانشستر كروك" البيولوجي وحدة والتصوير والخلوي والبيولوجيا الجزيئية الأساسية مرافق الموارد لدعم هذا العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm syringe filter | Appleton Woods | FC121 | |
| 0.45 µm syringe filter | Appleton Woods | FC122 | |
| 1.5ml pestle and microtube | VWR | 431-0098 | |
| 100X penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) | Gibco | 10378016 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350-010 | |
| Blasticidine S hydrochloride | Sigma- Aldrich | 15205 | |
| Bottle Top Filter (0.2 µm) | Scientific Laboratory Supplies | FIL8192 | |
| Brilliant Violet 711 anti-mouse CD8a Antibody | BioLegend | 100759 | 1 in 100 staining dilution. Clone 53-6.7 |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse CD4 Antibody | BioLegend | 100552 | 1 in 100 staining dilution. Clone RM4-5 |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma- Aldrich | C7902 | |
| Cell counting beads – CountBright absolute counting beads | Molecular Probes | C36950 | |
| Cell Strainer 100μm | VWR | 734-0004 | |
| Cyclophosphamide Monohydrate | Merck | 239785-1GM | |
| Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) - High Glucose | Sigma Aldrich | D6546 | |
| Dynabeads | Gibco | 11131D | |
| Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | GE17-1440-03 | Sold by Sigma- Aldrich |
| Flow cytometer - LSR Fortessa x20 | BD Biosciences | 658222R1 | |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10270 | |
| Haemacytometer | Appleton Woods | HC001 | |
| HEPES solution | Sigma- Aldrich | H0887 | |
| IL-12 p70 Mouse Uncoated ELISA Kit | Invitrogen | 88-7121-76 | |
| IL2, Proleukin | Novartis | PL 00101/0936 | |
| in vivo bioluminescence imaging system – in vivo xtreme II imaging system | Bruker | T149094 | |
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma- Aldrich | I0634 | |
| Live/dead stain - Zombie Violet Fixable Viability Kit | BioLegend | 423114 | 1 in 100 staining dilution |
| Luminometer - Lumistart Omega | BMG Labtech | 415-301 | |
| Murine IFN-γ ELISA kit | Diaclone | 861.050.010 | |
| Paraformaldehyde | Sigma- Aldrich | 16005 | |
| pCL-Eco | Novus Biologicals | NBP229540 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma- Aldrich | P8139 | |
| Platinum E cell line | Cell Biolabs | RV-101 | (RRID:CVCL_B488) |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 | BD Biosciences | 553294 | Clone 37.51 |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3ε | BD Biosciences | 553057 | Clone 145-2C11 |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | 1 in 100 staining dilution. Clone 2.4G2 |
| Puromycin Dihydrochloride | Sigma- Aldrich | P8833 | |
| Recombinant human fibronectin fragment - RetroNectin Reagent | TaKaRa | T100B | |
| Recombinant Mouse IL-7 (carrier-free) | BioLegend | 577806 | |
| Red cell lysis buffer | eBioscience | 004-4333-57 | |
| RPMI 1640 Medium | Lonza | BE12-167F | |
| Trypsin - EDTA solution | Sigma- Aldrich | T3924 | |
| XenoLight D-Luciferin | Perkin Elmer | 122799 |
References
- Brian, W. Food and Drugs Administration Biologics Licence Application Approval letter. , Available from: https://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/CellularGeneTherapyProducts/ApprovedProducts/UCM574106.pdf (2017).
- Malarkey, M., Brian, W. Food and Drugs Administration Biologics Licence Application Approval letter. , Available from: https://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/cellulargenetherapyproducts/approvedproducts/ucm581259.pdf (2017).
- Liu, Y., Zeng, G. Cancer and Innate Immune System Interactions: Translational Potentials for Cancer Immunotherapy. Journal of Immunotherapy. 35 (4), Hagerstown, Md. 299-308 (2012).
- Janssen, L. M. E., Ramsay, E. E., Logsdon, C. D., Overwijk, W. W. The immune system in cancer metastasis: friend or foe. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5 (1), 79 (2017).
- Pandya, P. H., Murray, M. E., Pollok, K. E., Renbarger, J. L. The Immune System in Cancer Pathogenesis: Potential Therapeutic Approaches. Journal of Immunology Research. 2016, 13 (2016).
- Vinay, D. S., et al. Immune evasion in cancer: Mechanistic basis and therapeutic strategies. Seminars in Cancer Biology. 35, S185-S198 (2015).
- Gajewski, T. F., Meng, Y., Harlin, H. Immune Suppression in the Tumor Microenvironment. Journal of Immunotherapy. 29 (3), 233-240 (2006).
- Munn, D. H., Bronte, V. Immune suppressive mechanisms in the tumor microenvironment. Current opinion in immunology. 39, 1-6 (2016).
- Vanderlugt, C. L., Miller, S. D. Epitope spreading in immune-mediated diseases: implications for immunotherapy. Nature Reviews Immunology. 2, 85 (2002).
- Hardwick, N., Chain, B. Epitope spreading contributes to effective immunotherapy in metastatic melanoma patients. Immunotherapy. 3 (6), 731-733 (2011).
- Makkouk, A., Weiner, G. Cancer Immunotherapy and Breaking Immune Tolerance-New Approaches to an Old Challenge. Cancer research. 75 (1), 5-10 (2015).
- Jackson, S. R., Yuan, J., Teague, R. M. Targeting CD8(+) T-cell tolerance for cancer immunotherapy. Immunotherapy. 6 (7), 833-852 (2014).
- Brentjens, R. J., et al. Lymphodepletion and tumor burden govern clinical responses in patients with B-cell malignancies treated with autologous, CD19-targeted T cells. Journal of Clinical Oncology. 29 (15_suppl), 2534 (2011).
- Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias. Blood. 118 (18), 4817 (2011).
- Hay, K. A., et al. Kinetics and Biomarkers of Severe Cytokine Release Syndrome after CD19 Chimeric Antigen Receptor-modified T Cell Therapy. Blood. 130, 2295-2306 (2017).
- Zhang, T., et al. Efficiency of CD19 chimeric antigen receptor-modified T cells for treatment of B cell malignancies in phase I clinical trials: a meta-analysis. Oncotarget. 6 (32), 33961-33971 (2015).
- Kueberuwa, G., Kalaitsidou, M., Cheadle, E., Hawkins, R. E., Gilham, D. E. CD19 CAR T Cells Expressing IL-12 Eradicate Lymphoma in Fully Lymphoreplete Mice through Induction of Host Immunity. Molecular Therapy - Oncolytics. 8, 41-51 (2018).
- Engels, B., et al. Retroviral vectors for high-level transgene expression in T lymphocytes. Human Gene Therapy. 14 (12), 1155-1168 (2003).
- Parkinson, C. M., et al. Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2966 (2011).
- Kueberuwa, G., et al. CCR7(+) selected gene-modified T cells maintain a central memory phenotype and display enhanced persistence in peripheral blood in vivo. Journal for Immunotherapy of Cancer. 5, 14 (2017).
