Summary
本议定书的目的是通过高通量的方式, 测量荧光标记食物在斑马鱼肠道中的转运时间。
Abstract
斑马鱼被用作药物安全测试的替代模型生物体。斑马鱼胃肠道 (GI) 有遗传、神经元和药理相似的哺乳动物。在药物候选者的临床测试中胃肠道不耐受是常见的, 可能对人类健康构成严重威胁。临床前哺乳动物模型中对胃肠毒性的测试在时间、测试化合物和人工方面都可能很昂贵。此处提供的高通量方法可用于预测 GI 安全问题。与哺乳动物模型相比, 这种方法可以在使用少量化合物的同时, 更方便地评估胃肠道转运中的试验复合效应。在这种方法中, 幼虫斑马鱼 (7 天后受精) 被喂食含有荧光标签的食物。喂食后, 每条幼虫鱼被放入一个96圆锥底孔板的井中, 并用测试化合物 (溶解在水中) 或车辆进行剂量。当肠道转运发生时, 粪便物质在井底积聚, 而这种情况发生的速率是通过使用平板分光光度仪反复测量井底的荧光来监测的。在给定的治疗组中, 幼虫的荧光是平均的, 这些值与标准误差一起绘制, 每个测量时间, 产生一条曲线, 表示食物随着时间的平均转运。通过将各治疗组曲线下的面积与车辆处理组的比较, 确定对肠道转运时间的影响。该方法检测了已知临床胃肠道效应药物诱导的斑马鱼胃肠转运时间的变化;它可以被用来审问许多治疗胃肠道效果每天。因此, 更安全的化合物可以快速地优先于哺乳动物测试, 这加速了发现和杜仲3Rs 的进步。
Introduction
斑马鱼 (斑马斑马) 用于模拟脊椎动物生物学并预测药物毒性和/或功效;这些领域的新应用每年涌现。斑马鱼在哺乳动物模型上的优势包括它们的繁殖力、小尺寸和器官发生的透明度。斑马鱼用于预测药物候选急性毒性, 以及评估对器官功能的复合影响,如心脏, 眼, 胃肠道 (GI)1,2。斑马鱼的发展和生理学类似于哺乳动物的许多方式3和80% 与人类疾病相关的基因有斑马鱼同源4。
斑马鱼的胃肠道有类似的生理学的哺乳动物 GI 道, 但有一个简单的体系结构5。斑马鱼没有胃;前肠道灯泡充当食物库。斑马鱼肠道的基因表达与哺乳动物5有许多相似之处。像哺乳动物一样, 斑马鱼的肠道神经系统控制肠道运动, 肠道神经支配反映其他脊椎动物6,7。基于这些相似性, 使用从哺乳动物模型8中获得的方法, 在斑马鱼中研究了肠道功能紊乱。
在药物候选者的临床测试中胃肠道不耐受是常见的, 可能对人类健康构成严重威胁。2005–2010在一家大型制药公司进行的项目审查显示, GI 安全是9% 临床研究终止9的主要原因。在临床前哺乳动物模型中对 GI 毒性的测试在时间、化合物和人工方面可能很昂贵。胃肠道转运的预测高通量检测可为复合毒性测试提供灵活性, 并提供3Rs 影响。本文所述的协议提出了一种提供此类检测的新方法。这种高通量检测可在药物开发早期使用, 以确定候选者的优先级, 并有助于减少较大物种的 GI 安全性测试。
Protocol
此处描述的所有方法均已由艾伯维的机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准. 艾伯维在国家卫生研究院的指导下, 负责实验室动物的护理和使用, 该设施由协会认可。实验室动物护理 (AAALAC) 的评估和认可。在这些研究中没有观察到动物健康问题。
1. 培育成人斑马鱼和收集胚胎
- 使用一般的畜牧业和育种实践来饲养成人斑马鱼。例如, 请参阅韦斯特菲尔德10。
- 在60毫克/升浓度的去离子水中溶解脱水海盐 (见材料表), 准备胚胎培养基。
- 从成人繁殖室收集受精卵, 用胚胎培养基和室内胚胎在大约50毫升的胚胎培养基中进行冲洗, 10 厘米培养皿 (每道50个胚胎) 在 1 h 光的28±14:10 摄氏度: 暗循环。
- 24小时后取出未存活的胚胎, 并辅以存活的胚胎, 使每道菜包含50个胚胎每道菜。
2. 利用非染色食品培养幼虫饲料
- 在4天后受精 (4 dpf), 饲料的幼虫在每个培养皿2毫克的粉状幼虫鱼食物 (见材料表) 通过洒在水面上的食物。
- 允许幼虫 3–4 h 饲料, 然后转移到一个干净 (没有食物) 培养皿包含约50毫升新鲜胚胎培养基。
- 为了帮助尽可能少的食物转移, 在最终转移到新菜之前, 在含有大约50毫升新鲜胚胎培养基的培养皿中冲洗每个幼虫。
- 在 5 dpf 和 6 dpf 上重复喂食和冲洗幼虫。
3. 在 6 dpf 上准备荧光食品, 并在 7 dpf 上喂食幼虫
- 根据田间等方法制备含有荧光标签的食品 (以下简称荧光食品)。3). 简要地, 混合300µL 荧光标签 (见材料表), 100 µL 的去离子水, 和200毫克的粉状幼虫食物在10厘米的手表玻璃。
- 将生成的粘贴物分散到手表玻璃上的薄层中。允许粘贴在室温下干燥在黑暗中 > 8 小时。
- 将干燥的混合物从手表玻璃上刮下来, 粉碎成粉末, 在室温下储存在黑暗中。现在, 荧光食品已经准备好喂养幼虫了。
- 在 7 dpf, 饲料的荧光食物与以前的喂食相同的方式, 这是提供2毫克荧光食品每菜 (参见步骤 2.1–2.2. 1)。
注意: 确保食物被细磨成粉末。在拇指和食指之间摩擦用称重纸包裹的荧光食品是确保研磨食物的有效方法。
4. 准备测试化合物的浓缩配料解决方案
- 将胚胎培养基中的每个测试化合物溶解到2x 靶剂量的浓度。如果需要对剂量范围进行测试, 请为所需剂量准备多个浓缩剂量的适当浓度的溶液。
- 准备足够的每一个集中的剂量解决方案, 使24幼虫可以治疗。每个幼虫将需要100µL 剂量溶液 (最终容积为200µL), 所以在最起码, 每个治疗组需要2.4 毫升剂量溶液;2.5 毫升将是一个适当的体积。
- 如果溶剂 (即二甲基亚砜) 用于测试化合物的初始增溶, 则准备适当的车辆控制剂量 (即,相同量的溶剂作为化合物处理, 但不含化合物)。并且, 为每一个复合治疗组, 准备足够的车辆解决方案, 以治疗24幼虫。
5. 将幼虫转移到96孔板并应用治疗
- 幼虫被允许在荧光食品上喂食2小时后, 使用转移移液器将其移到漂洗皿中, 如前几天进食后做的那样。
- 每个幼虫冲洗后, 取出它连同100µL 胚胎培养基, 并将其移动到一个96孔聚苯乙烯圆锥底多孔板的井 (见材料表), 分配完整的100µL 胚胎培养基到井与幼虫。
- 一旦所需的幼虫数量已转移到96孔板, 添加100µL 的2×浓缩定量的解决方案, 每井。
注: 使用12通道多通道移液器有助于快速添加幼虫 (每次12次)。为了避免意外添加错误的治疗, 保持密切跟踪哪些幼虫已被剂量与治疗, 并确保改变移液器在治疗之间的提示。
6. 测量每个油井的初始和后续荧光
- 添加剂量解决方案后, 将96孔板放入能够刺激和检测荧光标签排放的板分光光度计中。
注: 对于使用的黄绿色标签 (参见材料表), 适当波长的光在 505 nm 时令人兴奋, 检测在 515 nm。 - 立即从底部5次读取96孔板的荧光, 而不摇动板。使用5个读数从井中的初始荧光的最小值。
注: 当阅读板被读取时, 5 读数的原因是幼虫有时会在激发光的路径中游动, 而肠道中的食物会发出非常大的信号, 这是释放出的粪便的代表性。以最少的5次读取可以帮助避免使用人为的高测量从非过境食品。 - 阅读96孔板的荧光 (如初始读数所做的) 每20分钟为第一个 2 h 后剂量, 每30分钟3和4后的剂量, 然后每小时为小时 5, 6, 7 和8后剂量。
- 注意不要打扰 (通过摇动96孔板) 解决粪便之间的读取和孵化幼虫在28±1°c 之间的读取。
- 在夜间孵育幼虫28±1摄氏度, 并从96孔板上的荧光在第二天早上, 在幼虫被剂量前的同一时间读。使用此测量作为24小时后剂量荧光。
7. 分析数据
注: 在这里, 我们计算每个井的累积量和每个时间点的组平均值。
- 要计算每个井的累积量, 仅使用5次读取中每一个的最小值, 从每个时间点的值中减去初始值。对初始值也执行此计算 (这将导致每个井的初始累积为零)。
- 如果在 24 h 时间点的井中积累量小于150相对荧光单元, 则从进一步分析中排除;这些低值很可能是由于幼虫在喂食过程中低或不摄入荧光食物, 因此这些幼虫不是测量转运时间的好科目。
- 对于每个时间点, 计算包含共同处理的幼虫的井的平均累积量, 以及这些平均值的标准误差。
- 绘制每个处理组的 Y 轴上的平均堆积与 X 轴上的时间, 并比较这些曲线下的区域 (AUCs)。
注意: 明显减慢或加速运输时间的治疗, 将比车辆治疗组 AUCs 显著地小或大。
Representative Results
该方法采用板基分光光度法对 GI 转运进行评估, 可作为一种高通量替代荧光显微术, 这是评估同一功能的低吞吐率方法 (图 1)。要生成图 1中的数据, 可使用荧光显微镜 (显示的代表性图像) 或分光光度法 (在4时间点、0、4、8和 24 h 后加药) 分析相同处理的鱼的胃肠道转运;这些实验数据的比较给出了高度相关的结果 (数据的线性回归 r2 = 0.95)。线性回归有一个负斜率, 因为显微测量保留的荧光信号和分光光度测量的过渡信号。
使用分光光度法检测斑马鱼的不同机制的化合物的影响, 在人类中已经建立了良好的 GI 活性 (图 2)。与车辆处理的控制相比, 阿托品 (4.2 µM) 和阿米替林 (5 µM) 减慢了胃肠道转运, 而替加色罗 (3.3 µM) 和胃复安 (33 µM) 加速了转运时间。红霉素 (14 µM), 预计加速转运时间没有影响, 以此方法测量。治疗组的大小为 24, 然后从没有或非常低信号的幼虫中取出数据。采用 Tukey 对 type-1-error 控制的诚实显著差异, 对每时间点的平均信号的 AUC 进行了比较。只有当 p ≤ 0.05, 效果才被认为是重要的。用于上述治疗的浓度是最大耐受剂量, 在先前的试验中确定, 并定义为最高剂量, 没有观察到的不良影响。
分光光度法可以测量化合物的剂量依赖性效应。图 3提供的数据表明阿托品减慢了斑马鱼幼虫中的胃肠道转运剂量依赖性。最低剂量的阿托品测试, 0.042 µM, 没有显著的效果, 而两个更高的浓度分别有显著的影响, 0.42 µM 有小于4.2 µM 的效果。
一种新的检测方法可以通过测试阳性和阴性对照来评估, 即已知在目标系统中分别处于活动状态和非活动状态的化合物 (在这种情况下, 目标系统是哺乳动物 GI 转运)。对于分光光度法, 测试了18主动 (阳性) 控制和6非活动 (阴性) 控制。在这些实验的基础上, 分光光度法具有高阳性预测值 (90.9%), 但灵敏度低 (55.6%) 和负预测值 (38.5%)。这些值是从表 1中所示的数据派生而来的。他们在实践中反映, 如果斑马鱼转运时间受到治疗的影响, 哺乳动物转运可能会受到影响。然而, 如果对斑马鱼的转运时间没有影响, 这不是对哺乳动物效果的预测。
图 1:荧光食品转运被检测为从显微成像的信号的损失和在信号的相应增益通过板基分光光度法.(A) 从阿托品分析 (4.2 µM) 对胃肠道转运时间的影响的代表性显微图像。(B) 从微观图像中量化的平均信号与来自相同处理鱼的无效粪便物质 (分光光度法) 的信号高度 (负) 相关。阿托品处理的鱼的数据是红色的。此图复制的权限从卡萨尔等。11.请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2: 分析多孔板时间内的荧光信号积累, 可以识别改变 GI 转运速率的治疗方法.星号 (*) 指示的 AUC 明显不同于车辆处理的鱼。误差条表示每个时间点治疗组中幼虫平均信号的标准误差。此图已被重复使用卡萨尔等的许可。11.请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 3: 阿托品剂量依赖性减慢斑马鱼肠道转运时间, 如荧光分光光度法所反映的粪便积累随着时间的推移.星号 (*) 指示的 AUC 明显不同于车辆处理的鱼。误差条表示每个时间点治疗组中幼虫平均信号的标准误差。这个数字是重复使用卡萨尔等的权限。11.请点击这里查看这个数字的更大版本.
表 1:哺乳动物和鱼类中24种化合物的 GI 活性.此表是在卡萨尔等权限下重用的。11。
Discussion
本文介绍了一种测定斑马鱼幼虫胃肠转运时间的新的分光光度法, 它是一种有效的检测方法, 可预测治疗对哺乳动物胃肠功能的影响。虽然该检测具有低灵敏度, 但它具有高阳性准绳, 这是用于减少基于毒性12的候选治疗数量的第一层分析是可以接受的。此方法更易于执行, 具有更高的吞吐量, 并且使用比荧光显微镜更少的动物处理步骤。
这种方法固有的技术挑战。在喂食荧光食物并将它们转移到单个油井后, 首先要捕捉到单个幼虫是很有挑战性的。然而, 在实践中, 熟练的技术人员可以在不到15分钟内填补96孔板。如果在某一特定时间点, 板被意外震动, 粪便在读数前从井底不稳定, 则堆积会出现下降。这可以避免通过移动板 (s) 小心, 不摇晃。在我们的经验中, 正常运动, 包括平板分光光度计电动抽屉, 没有干扰检测。配有加热器的平板阅读器 (即, 在测量之间不需要将板返回到孵化器中), 并且位于检测实验室工作台附近可以优化以降低干扰几率, 但这在我们的经验中是没有必要的。
这种方法的早期尝试不包括在测定前几天进食。没有这些 ' 实践 ' 喂养, 较少的幼虫消耗足够的荧光食物在治疗前允许的时间。在这些尝试中, 治疗组内的变化较大, 并且随着时间的推移, 由于低/无信号积累, 更多的数据无法使用。即使在实践喂养, 一些幼虫不消耗足够数量的荧光食物, 不包括这些幼虫的数据减少组内的变化, 并提高识别治疗效果的能力。从较大的组大小 (即24 对 12) 开始, 可以使足够数量的幼虫为分析提供有用的数据。
荧光显微镜显示, 在阿托品处理的幼虫中, 食物转运几乎完成了24小时 (未示出), 然而从最后时间点的微孔板数据反映阿托品组的低最终信号, 与车辆组相比。相反, 更高的最终的微孔板荧光与加速转运时间的处理相关联, 尽管经过车辆处理的幼虫显然在最后时间点之前已经将其胃肠道作废。根据随机分配治疗幼虫的荧光食物, 我们假设在治疗组中平均食用荧光食品。鉴于此, 并根据上述模式, 粪便中的荧光随着时间的推移而下降, 在幼虫胃肠道或更快的转运中增加了荧光的粪便。实际的原因是未知的, 并没有被审问, 然而, 检测仍然能够测量和比较各组之间的转运时间。
这种方法用于检测小分子化合物的毒性 GI 效应是一种应用。其他可能的应用包括疾病建模 (如肠易激综合症) 和新的治疗发现这种疾病, 或发现亲动能化合物。此外, 结合转基因模型, 该方法可用于询问基因在正常胃肠道转运中的作用, 以及转运紊乱, 包括肠道神经元缺乏。斑马鱼幼虫提供了一个与细胞培养接近的规模的整个有机体平台, 但由于有多个组织和无数细胞类型在斑马鱼一起运作, 系统生物学问题可以问和回答使用此模型。
随着技术的进步和新的应用, 斑马鱼毒性测试的效率将继续提高。斑马鱼的处理方法和检测在更高的吞吐量13,14继续提高。这里提出的新方法是一个改进的例子, 这可能使斑马鱼的研究更有影响力。
Disclosures
本研究的设计、研究行为及财务支持均由艾伯维提供。艾伯维参与了对手稿的数据、审查和批准的解释。卡萨尔, x 黄, 和科尔是艾伯维的雇员, 没有其他利益冲突披露。
Acknowledgments
西蒙卡萨尔的 carpetbones.com 设计并创建了用于演示 GI 转运试验的生命过程的动画图。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wild type zebrafish breeding pair | Various sources - for example ZIRC (Zebrafish International Resource Center) | ZL-1 | Adult wild type zebrafish of AB lineage |
| 1.7 L Breeding Tank - Beach Style Design | Tecniplast | 1.7L SLOPED | Breeding tank |
| Instant Ocean sea salt | Intant Ocean | SS15-10 | Dehydrated sea salt |
| First Bites larval fish food | Hikari | 20095 | Powdered larval fish food |
| Yellow-green (505/515) Fluospheres | Invitrogen | F8827 | Fluorescent label |
| V-bottom 96-well polystyrene microplates | Thermo Fisher Scientific | 249570 | Multiwell microplate with V-shaped bottom in each well |
| Atropine | Sigma Aldrich | A0132 | |
| Amitriptyline | Sigma Aldrich | A8404 | |
| Tegaserod | Sigma Aldrich | SML1504 | |
| Metoclopramide | Sigma Aldrich | M0763 | |
| Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
| Spectramax M2e microplate reader | Molecular Devices | Spectramax M2e | A multi-well plate spectrophotometer capable of fluorescent excitation and emission detection. |
| SoftMax Pro | Molecular Devices | SoftMax Pro | Software for spectrophotometer data acquisition |
References
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