Summary
このプロトコルの目的は、高スループット方法でゼブラフィッシュ稚魚の腸を介して蛍光に分類された食物の通過時間を測定することです。
Abstract
ゼブラフィッシュは、医薬品安全性試験代替モデル有機体として使用されます。ゼブラフィッシュの胃腸 (GI) は哺乳類の遺伝的、神経細胞、および薬理学的類似点です。新薬候補の臨床試験中に消化不耐症は一般的であり、人の健康に深刻な脅威をもたらす可能性があります。哺乳類モデルで臨床消化管毒性のためのテストは、テスト混合物の時間と労力の面で高価なことができます。ここで紹介した高スループット方法を使用 GI 安全性の問題を予測する可能性があります。このメソッドは哺乳類モデルと比較して、化合物の少量を使用している間テスト消化管輸送の複合効果の適切な評価のためことができます。このメソッドは、ゼブラフィッシュ稚魚で (7 日後に受精) 蛍光ラベルを含んでいる食糧が供給されます。授乳後それぞれの仔魚は 96 円錐底ウェル プレートのウェルに配置、テスト混合物 (水に溶ける) または車両と投薬します。腸の通過が発生して糞便が、井戸の底に蓄積、井戸の底からの蛍光を測定することによってこれが起こる率を監視、プレート分光光度計を使用して時間をかけて繰り返し。特定治療群の幼虫から蛍光が平均化され、これらの値をグラフ化標準誤差とともに各計測時間の時間をかけて食品の平均通過を表す曲線を降伏します。腸通過時間に及ぼす影響は、車両投与群の各治療群の曲線下面積を比較することで識別されます。このメソッドは、知られている臨床 GI 効果と薬物によるゼブラフィッシュ消化管通過時間の変更を検出1 日あたり GI 効果のための治療の数十を尋問する使用できます。より安全な化合物できますすぐに優先的に哺乳動物テスト、発見と渡して 3 r 推進を効率化します。
Introduction
ゼブラフィッシュ (動脈分布) を使用してモデル脊椎動物の生物学および薬物の毒性および/または有効性の予測これらのフィールドの新しいアプリケーションは、毎年出現します。ゼブラフィッシュの哺乳類モデル上の利点には、多産、小さなサイズ、および器官形成を通じて透明性があります。ゼブラフィッシュを使用すると、臓器の機能、例えば心臓、眼、胃腸の (GI)1,2の化合物の影響を評価する、薬物候補急性毒性, 同様の予測します。ゼブラフィッシュの開発および生理学は多くの方法3の哺乳類のそれらに類似して 80% のヒトの疾患に関連付けられている遺伝子ゼブラフィッシュ相同物4。
ゼブラフィッシュの消化管と同様の生理学は、哺乳類の消化管が単純なアーキテクチャ5があります。ゼブラフィッシュがある胃前部腸電球は、食品庫として機能します。ゼブラフィッシュ腸における遺伝子発現哺乳類5の多くの類似点があります。哺乳類のようなゼブラフィッシュの腸神経系は消化管運動を制御、腸神経支配は他の脊椎動物6、7のミラーします。これらの類似性に基づいて、人間の腸の機能障害は、ゼブラフィッシュ、哺乳類モデル8から派生したメソッドを使用して研究されている.
新薬候補の臨床試験中に消化不耐症は一般的であり、人の健康に深刻な脅威をもたらす可能性があります。2005 年-2010 年中に大手製薬会社でのプログラムの見直しでは、臨床研究終了9の 9% の主な原因として消化管の安全性を明らかにしました。哺乳類モデルで臨床消化管毒性のためのテストは、化合物、及び労働時間の面で高価なことができます。GI トランジットのための予測の高スループット試金は、化合物の毒性試験、柔軟性を提供し、3 r インパクトを実現できます。このような分析を提供している手法が記載プロトコルによって表示されます。この高スループット試金は候補者の優先順位、GI での安全検査より大きい種の削減に貢献する医薬品開発の初期段階で採用できるでしょう。
Protocol
ここで説明するすべての方法は、制度上の動物のケアによって承認されているし、AbbVie.Abbvie の使用委員会 (IACUC) が傘下健康ガイドの国立機関の協会によってみなされている施設でケアと実験動物の使用のため評価および実験動物の資格認定は気 (AAALAC) です。これらの研究で動物の健康上の懸念は認められなかった。
1. 繁殖アダルト ゼブラフィッシュ胚を収集し、
- 家および品種大人ゼブラフィッシュ一般的な飼育をして練習を生み出します。たとえば、ウェスター フィールド10を参照してください。
- 脱水を溶解することにより胚メディアの準備海の塩 (材料の表を参照してください) に脱イオン水 60 mg/L の濃度で
- 収集アダルト繁殖室、リンスから卵を受精と胚中よく、14:10 28 ± 1 ° C で約 50 mL 10 cm シャーレ (皿あたり 50 胚) で胚の中の胚に家 h: 明暗サイクル。
- 24 時間とそれぞれの料理が一皿 50 胚を含むように胚を存続と補足後非存続の胚を削除します。
2. 幼虫に非染め食品を使用して供給の列車します。
- 4th日後受精 (4 dpf)、各シャーレ粉餌の 2 mg の幼虫をフィード (材料の表を参照) によって水の上に食品を散水します。
- 幼虫を許可するフィードし、きれいにそれらを転送する 3-4 h (食事なし) ペトリ料理約 50 mL の新鮮な胚媒体を含んでいます。
- できるだけ小さな食品として転送することを支援するため、新しい料理の最終的な転送する前に約 50 mL の新鮮な胚媒体を含んでいるシャーレに各幼虫をすすぐ。
- 餌と dpf の 5 と 6 の dpf の幼虫の洗浄を繰り返します。
3. 6 dpf の蛍光食品と 7 の dpf の幼虫にフィードを準備します。
- (以下フィールドらの方法に従って、蛍光食品として蛍光ラベルを含んでいる食品を準備します。3). 簡単に言えば、ミックス 300 μ L の蛍光ラベル (材料の表を参照)、100 μ L の脱イオン水と 200 mg の粉末 10 cm 時計ガラスに幼虫の餌。
- 時計のガラスに薄い層に結果の貼り付けを広めます。室温、暗所で乾燥する貼り付けを許可 > 8 h。
- 時計ガラスを離れて乾燥した混合物をこすり、粉、暗闇の中で常温で保存してつぶします。蛍光食品は、幼虫に供給する準備が整いました。
- 前の授乳のように同様に幼虫に蛍光の食糧を与える 7 の dpf には提供する 2 mg 皿あたり蛍光食品 (2.1-2.2.1 の手順を参照してください)。
注: は、食べ物は細かく粉であることを確認します。細かくグランド食べ物を確保するための有用な方法は、親指と人差し指の間に紙の重さで包まれた蛍光食品をこすりします。
4. テスト混合物の集中投与のソリューションを準備します。
- 各テストの目標用量 × 2 は、濃度胚中化合物を溶解します。ドーズ量の範囲のテストが必要な場合は、目的の用量の適切な濃度の複数の集中投与のソリューションを準備します。
- 24 幼虫を扱うことができるように十分に各投与溶液を準備します。各幼虫 100 が必要になります μ L 注入ソリューション (ウェルあたり最終巻は 200 μ L)、非常に少なくとも、2.4 mL の用量で治療グループごとに解決策が必要2.5 mL は、適切なボリュームになります。
- テスト混合物の初期可の溶媒 (すなわちジメチルスルホキシド) を使用した場合の準備の適切な車両制御線量 (すなわち、化合物ではなく複合治療としての溶剤量が同じ)。そして、各化合物投与群で行われていた 24 幼虫を治療するために十分な車両ソリューションの準備します。
5. 転送幼虫 96 ウェル プレートと治療の適用
- 幼虫は、2 h の蛍光食品を餌に許可されている後、に前の日に授乳後行われた洗浄の皿に移動するのに転送ピペットを使用します。
- 各幼虫が洗浄された後、100 μ L 胚中と共に撤退し、96 ウェル スチロール円錐底ウェル プレートのウェルに移動 (材料の表を参照)、幼虫と同様に完全に 100 μ L の胚中を調剤します。
- 必要な幼虫数は、96 ウェル プレートに転送されている、2 × 100 μ L 集中投与のソリューションを各ウェルに追加します。
注: 12 ch マルチ チャンネル ピペットの使用を容易に幼虫 (12-で--時間) の急速な投与します。間違った治療を誤って追加されないように、追跡で幼虫、どの治療と投薬されて、治療の間ピペット チップを変更してください。
6. 各ウェルからメジャー初期とその後の蛍光
- 線量のソリューションを追加すると後、に 96 ウェル プレート プレート分光光度計のエキサイティングで蛍光ラベルからの排出量を検出できます。
注: 黄緑色のラベルに使用される (参照材料表)、適切な波長の光が 505 でエキサイティングな nm と 515 で検出 nm。 - プレートを振ることがなく 5 回連続の底から 96 ウェル プレートの蛍光を読み取る。井戸から初期の蛍光として各ウェルから 5 測定値の最小値を使用します。
注: プレートを読むたびに、5 測定値が取られる理由は幼虫が励起光のパスで泳ぐことも、彼らの腸内で食べ物がリリースされた糞便の典型的でない場合非常に大きな信号を発する。非移行された食品から人工的に高い測定を避けるために助けることができる 5 の読み取りの最小値を取るします。 - (初期の読書のために行われていた)、96 ウェル プレートの蛍光を読み取る投与、30 分毎に 3、4 時間後の投与、その後後最初の 2 時間 20 分毎時間 5、6、7、および投与後 8 時間ごと。
- (96 ウェル プレートを揺れ) で邪魔しないように取る注意は読み取りの間糞便を落ち着いた 28 ± 1 ° C の読み取りで幼虫を孵化させなさい。
- 28 ± 1 ° C で一晩幼虫を孵化し、幼虫は前に、の日が投与された同じ時期に次の朝 96 ウェル プレートから蛍光を読み取る。24 h 後線量蛍光としてこの測定を使用します。
7. データを分析します。
注: ここで我々 はウェルあたり蓄積計算し、グループの各時点の平均します。
- 好評につき、5 の読み取りのそれぞれからの唯一の最小値を使用して蓄積を計算するには、各時点の値から初期値を減算します。初期値だけでなく (これは各ウェルのゼロの最初蓄積の結果) のこの計算を行います。
- 24 h の時点でよく蓄積が 150 未満の相対的な蛍光単位の場合はさらに分析からよくを除外します。これらの低値可能性があります低または幼虫による蛍光食品のない摂取量授乳中に、したがってそれらの幼虫はない良い科目通過時間を測定するため。
- 各時点の共同処理の幼虫だけでなく、それらの平均値の標準誤差を含む井戸の平均蓄積を計算します。
- 各治療群の x 軸に時間対の y 軸に平均蓄積をプロットし、(Auc) これらの曲線の下の領域を比較します。
メモ: 大幅低下または乗り継ぎ時間を短縮する治療法があります Auc 大幅拡大または縮小車両投与群よりも、それぞれ。
Representative Results
プレートを用いた吸光光度法を使用して、消化管の通過を評価する、このメソッドは、同じ関数 (図 1) を評価するため低いスループット方法である蛍光顕微鏡の高スループットの交換として使用できます。図 1に、データを生成する同じ扱われる魚を GI 中継地点 4 時間蛍光顕微鏡 (代表的な画像が表示されます) または吸光光度法のいずれかを使用して行った 0、4、8、および 24 h 後投与。これらの実験からのデータの比較は、相関性の高い結果を与えた (線形回帰データ r2 = 0.95)。線形回帰は、負の傾き保有蛍光信号を測定する顕微鏡、吸光光度法測定移行された信号。
ヒトでは、老舗の GI の活動と、異なるメカニズムの化合物の影響は、ゼブラフィッシュの吸光光度定量法 (図 2) を使用して検出できます。車両処理コントロールに比べて、アトロピン (4.2 μ M) と、アミトリプチリン (5 μ M) tegaserod (3.3 μ M) 中の GI トランジットに鈍化し、メトクロプラミド (33 μ M) の輸送時間の短縮します。エリスロマイシン (14 μ M)、通過時間を加速すると予想この法による測定と、効果がなかった。信号の低なしまたは非常に幼虫からデータを削除する前に、治療グループ サイズは 24 をだった。時間ポイントごとの平均信号の AUC は、タイプ 1 エラー制御のテューキー正直差を使用して化合物扱われ、車両処理グループ間比較しました。効果は重要な場合にのみと考えられていた p ≤ 0.05。上記の治療に使用される濃度が最大線量を容認、事前実験で決定、肉眼観察による観察可能な副作用で最高の線量として定義されています。
吸光光度法分析では、化合物の用量依存的効果を測定できます。図 3は、アトロピンがゼブラフィッシュの幼虫に用量依存的 GI 通過を遅らせることを示すデータを提供します。低用量のアトロピンのテスト、0.042 μ M、2 つの高濃度は 0.42 μ M 4.2 μ M よりも効果のより少ない重大な影響を持っていた一方、効果がなかった。
新しいアッセイは、アクティブおよび非アクティブ ターゲット システムにそれぞれ知られている化合物は、正と負のコントロールをテストすることによって評価できます (この場合、ターゲット ・ システムは哺乳類の消化管通過)。吸光光度法測定 18 アクティブな (正) コントロールと 6 アクティブでない (負の) コントロールがテストされました。これらの実験を基に、吸光光度法分析が高い肯定的な予言する値 (90.9%)、しかし低感度 (55.6%) と負の予測値 (38.5%)。これらの値は、表 1に示したデータから派生します。彼らは反映、練習、処理によるゼブラフィッシュの通過時間に影響が生じた場合、哺乳類の輸送は影響を受ける可能性があります。ただし、ゼブラフィッシュ トランジット時間に影響がない場合これ哺乳類の効果の予測ではありません。
図 1:蛍光食品輸送は、プレートを用いた吸光光度法による顕微鏡イメージングと信号に対応する利得からの信号の損失として検出されます。アトロピン (4.2 μ M) に及ぼす消化管通過時間の分析から (A) 代表的な顕微鏡画像。非常に顕微鏡画像から定量化 (B) 平均信号 (否定的に) 同じ扱われる魚から排尿糞便 (吸光光度法) からの信号と相関します。アトロピン投与魚からのデータは、赤です。Cassarらから許可を得てコピーこの図11.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 消化管通過速度を変更処置を識別できますウェル プレートから時間をかけて蛍光信号蓄積を分析します。アスタリスク (*) は、魚の治療よりも大幅に異なる AUC を示します。誤差範囲は、時点あたり治療群の幼虫の平均信号の標準エラーを表します。この図が Cassarらの許可を得て再使用されました。11.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 時間の経過と共に糞便の蓄積の蛍光吸光光度法を反映してアトロピン投与-独立してゼブラフィッシュ腸内通過時間が遅くなります。アスタリスク (*) は、魚の治療よりも大幅に異なる AUC を示します。誤差範囲は、時点あたり治療群の幼虫の平均信号の標準エラーを表します。この図は Cassarらの許可を得て再利用します。11.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
表 1:哺乳類と魚 24 化合物の消化管活動。このテーブルは Cassarらの許可を得て再利用します。11。
Discussion
ゼブラフィッシュ幼虫消化管通過時間には、ここで紹介を測定するため新規吸光光度法は、哺乳類消化管機能に、治療効果を予測できる効率的な分析です。アッセイは、低感度を持つ、肯定的な予測性、高毒性12に基づいて候補者治療の数を皮をむくために採用最初の層の試金で使用できるがあります。このメソッドを実行する方が簡単です、スループットの高い、蛍光顕微鏡よりもステップの処理以下の動物を使用します。
本手法の技術的な課題があります。蛍光食品を供給し、個々 の井戸にそれらを転送することに最初に挑戦した後は、個々 の幼虫をキャッチします。しかし、練習では、熟練した技術者は 15 分未満の 96 ウェル プレートを埋めることができます。プレートが誤って動揺与えられた時点で、読む前に井戸の底から未解決の糞便蓄積が減少に表示されます。これを振ることがなく、慎重にプレートを移動することによって回避できます。我々 の経験でプレート分光光度計電動引き出しを含む、通常の動きはアッセイを乱さなかった。プレート ヒーター装備リーダー (すなわちプレートがない測定間インキュベーターに返却する)、アッセイ近くラボベンチ障害の低いチャンスを最適化する可能性があるがこれは我々 の経験で必要ではなかった。
メソッドでの初期の試みは、アッセイの前に、の日に餌を含みませんでした。これらの '練習' 授乳せず幼虫の低い数字は処理前に許可される時間の間に十分な蛍光食品を消費しました。それらの試みの治療群内変動が大きかったとより多くのデータが時間の経過とともに低/いいえ信号蓄積のため使用できませんでした。練習が給餌してもいくつかの幼虫は蛍光食品の十分な量を消費しない、それらの幼虫からデータを除くグループ内での変動を減少、治療の効果を識別する機能を高めます。幼虫の貢献の分析に有用なデータの十分な数 (すなわち24対12) サイズの大きなグループを開始できます。
蛍光顕微鏡の最終時点からマイクロ プレート データ反映車グループと比較してアトロピン群下の最終的な信号しかし食品輸送がアトロピン投与の幼虫 (図示せず)、24 h でほぼ完了したこと明らかにします。逆に、高い最終的なマイクロ プレート蛍光は、にもかかわらず、車両処理幼虫がどうやら最後の時間ポイントの前に、消化管を無効との輸送時間の短縮を治療と関連付けられました。幼虫蛍光食品の供給の治療へランダムな割り当てに基づく、仮定蛍光食品の相当消費平均では、試験治療グループ間で。糞便からの蛍光が幼虫の消化管で過ごした時間とともに低下する、これを考えるし、上記パターンに基づいて、または高速トランジットは何とか糞便に蛍光を追加します。実際の原因は不明と尋問されていない、アッセイはまだしかし測定してグループ間の通過時間を比較することが可能です。
低分子化合物から消化管毒性の検出でこのメソッドの雇用は、1 つのアプリケーションです。他の可能なアプリケーションは、病モデル (例えば、過敏性腸症候群) と新たな治療法発見のような病気またはプロ運動化合物を発見するために含まれます。さらに、トランスジェニック モデルと相まって、このメソッドされる可能性があります通常の消化管輸送だけでなく、通過障害、腸溶性ニューロンの欠乏を含む遺伝子の役割を調査します。ゼブラフィッシュ幼虫が近似した細胞培養のスケールに全体の生物プラットフォームを提供が複数の組織や無数のセル型、ゼブラフィッシュで一緒に機能しているので、システム生物学の質問尋ねたことができますこれを使用して応答モデル。
技術とその新しい応用の進歩によって、ゼブラフィッシュ毒性試験の実施の効率は向上していきます。運用方法やアッセイ ゼブラフィッシュ稚魚は、高いスループット13,14面で改善を続けています。ここで紹介する手法は、もっとインパクトの強いゼブラフィッシュの研究をすることができる改善の一例です。
Disclosures
設計、試験の実施、およびこの研究支援は、AbbVie によって提供されました。AbbVie は、原稿の承認、レビュー、データの解釈に参加しました。T. コール、X. Huang、s. Cassar AbbVie の従業員であるしていない追加利益相反を開示します。
Acknowledgments
Carpetbones.com のサイモン Cassar 設計し、アニメ フィギュア GI 輸送アッセイの人生で手順を示すために使用を作成します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wild type zebrafish breeding pair | Various sources - for example ZIRC (Zebrafish International Resource Center) | ZL-1 | Adult wild type zebrafish of AB lineage |
| 1.7 L Breeding Tank - Beach Style Design | Tecniplast | 1.7L SLOPED | Breeding tank |
| Instant Ocean sea salt | Intant Ocean | SS15-10 | Dehydrated sea salt |
| First Bites larval fish food | Hikari | 20095 | Powdered larval fish food |
| Yellow-green (505/515) Fluospheres | Invitrogen | F8827 | Fluorescent label |
| V-bottom 96-well polystyrene microplates | Thermo Fisher Scientific | 249570 | Multiwell microplate with V-shaped bottom in each well |
| Atropine | Sigma Aldrich | A0132 | |
| Amitriptyline | Sigma Aldrich | A8404 | |
| Tegaserod | Sigma Aldrich | SML1504 | |
| Metoclopramide | Sigma Aldrich | M0763 | |
| Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
| Spectramax M2e microplate reader | Molecular Devices | Spectramax M2e | A multi-well plate spectrophotometer capable of fluorescent excitation and emission detection. |
| SoftMax Pro | Molecular Devices | SoftMax Pro | Software for spectrophotometer data acquisition |
References
- Berghmans, S., et al. Zebrafish based assays for the assessment of cardiac, visual, and gut function - Potential safety screens for early drug discovery. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 58 (1), 59-68 (2008).
- Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish. Neurogastroenterology and Motility. 21, 304-312 (2009).
- Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S., Paule, M. G. Zebrafish model in drug safety assessment. Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
- Shepherd, I., Eisen, J. Development of the zebrafish enteric nervous system. Methods in Cell Biology. 101, 143-160 (2011).
- Holmberg, A., Olsson, C., Holmgren, S. The effects of endogenous and exogenous nitric oxide on gut motility in zebrafish Danio rerio embryos and larvae. The Journal of Experimental Biology. 209, 2472-2479 (2006).
- Olsson, C., Holmber, A., Holmgren, S. Development of enteric and vagal innervation of the zebrafish (Danio rerio) gut. The Journal of Comparative Neurology. 508, 756-770 (2008).
- Fleming, A., Jankowski, J., Goldsmith, P. In vivo analysis of gut function and disease changes in a zebrafish larvae model of inflammatory bowel disease: A feasibility study. Inflammatory Bowel Disease. 16 (7), 1162-1172 (2010).
- Cook, D., et al. Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: A five-dimensional framework. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 419-431 (2014).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. Eugene, OR, USA. (2000).
- Cassar, S., Huang, X., Cole, T. A high-throughput method for predicting drug effects on gut transit time using larval zebrafish. Journal of Pharmacolical and Toxicological Methods. 76, 72-75 (2015).
- McKim, J. M. Building a tiered approach to in vitro predictive toxicity screening: A focus on assays with in vivo relevance. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 13 (2), 188-206 (2010).
- Bruni, G., Lakhani, P., Kokel, D. Discovering novel neuroactive drugs through high-throughput behavior-based chemical screening in the zebrafish. Frontiers in Pharmacology. 5, 153 (2014).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17, 66-74 (2012).
