Summary
O objetivo do presente protocolo é medir o tempo de trânsito de fluorescente etiquetado alimento através do intestino de zebrafish larval de forma alto throughput.
Abstract
Zebrafish são utilizados como organismos modelo alternativo para testes de segurança de drogas. O trato gastrointestinal (GI) de zebrafish tem semelhanças genéticas, neuronais e farmacológicas dos mamíferos. SOLDADO intolerância durante os testes clínicos de candidatos da droga é comum e pode representar uma séria ameaça para a saúde humana. Ensaios de toxicidade de GI em modelos pré-clínicos de mamíferos podem ser caro em termos de tempo, composto de teste e mão de obra. O método de alto rendimento apresentado aqui pode ser usado para prever a GI questões de segurança. Comparado aos modelos de mamíferos, este método permite a avaliação mais exaustivo dos efeitos compostos de teste no trânsito GI enquanto estiver usando baixas quantidades de composto. Neste método, o zebrafish larval (7 dias após a fecundação) são alimentados com alimentos contendo uma etiqueta fluorescente. Após a alimentação, cada peixe larval é colocado em um poço de uma placa de 96-cónico-fundo-bem e dosado com composto de teste (dissolvido em água) ou o veículo. Como ocorre o trânsito do intestino, matéria fecal se acumula no fundo dos poços, e a taxa na qual isto acontece é monitorizada pela medição de fluorescência do fundo do poço repetidamente ao longo do tempo usando um Espectrofotômetro de placa. A fluorescência de larvas em um grupo determinado de tratamento são média e esses valores são graficamente juntamente com o erro-padrão, para cada tempo de medição, produzindo uma curva que representa a médio trânsito dos alimentos ao longo do tempo. Efeitos sobre o tempo de trânsito do intestino são identificados, comparando a área sob a curva para cada grupo de tratamento para que do grupo tratados com veículo. Esse método detectou alterações no tempo de trânsito GI zebrafish induzido por drogas com efeitos clínicos conhecidos de GI; pode ser empregado para interrogar dezenas de tratamentos para efeitos GI por dia. Como tal, compostos mais seguros podem ser rapidamente priorizados para testes dos mamíferos, que acelera a descoberta e profere avanço dos 3R.
Introduction
Peixe-zebra (Danio rerio) são usados para modelar a biologia vertebrada e prever a toxicidade de drogas e/ou eficácia; novas aplicações nestes campos surgem a cada ano. As vantagens do zebrafish em modelos mamíferos incluem sua fecundidade, tamanho pequeno e transparência através da organogênese. Zebrafish são usados para prever a droga candidato toxicidade aguda, também como para avaliar o impacto de composto na função do órgão, por exemplo, cardíaco, ocular, gastrointestinais (GI)1,2. Fisiologia e desenvolvimento Zebrafish são semelhantes dos mamíferos em muitas maneiras3 e 80% dos genes que estão associados com doenças humanas têm um zebrafish do homólogo4.
O trato Gastrintestinal do zebrafish tem fisiologia semelhante para o trato gastrointestinal dos mamíferos, mas tem um mais simples arquitetura5. Zebrafish não têm estômago; o bulbo intestinal anterior atua como um depósito de alimentos. Expressão gênica em zebrafish intestino tem muitas semelhanças com isso do mamífero5. Como mamíferos, o sistema nervoso entérico do zebrafish controla a motilidade do intestino, e inervação intestinal espelhos de outros vertebrados6,7. Com base em semelhanças, distúrbios funcionais do intestino humano têm sido estudados em zebrafish, usando métodos derivados de modelos mamíferos8.
SOLDADO intolerância durante os testes clínicos de candidatos da droga é comum e pode representar uma séria ameaça para a saúde humana. Uma revisão de programas em uma grande empresa farmacêutica durante 2005 – 2010 revelou GI segurança como a principal causa para 9% do estudo clínico terminações9. Ensaios de toxicidade de GI em modelos pré-clínicos de mamíferos podem ser caro em termos de tempo, composto e trabalhista. Um ensaio de alta produtividade preditivo para trânsito GI pode fornecer flexibilidade para testes de toxicidade de compostos e produzir impacto dos 3R. Um método novo, oferecendo tal um ensaio é apresentado pelo protocolo descrito neste documento. Este ensaio de alto rendimento pode ser empregado no início do desenvolvimento de drogas para priorizar os candidatos e contribuir para a redução de GI segurança testes em espécies maiores.
Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado Animal institucional e uso Comité (IACUC) da AbbVie.Abbvie opera sob os institutos nacionais de saúde guia para o cuidado e uso de animais de laboratório em uma instituição credenciada pela Associação de a avaliação e acreditação do laboratório Animal conta (AAALAC). Sem preocupações de saúde animal foram observadas nesses estudos.
1. raça adulto Zebrafish e coletar embriões
- Casa e raça adultos do zebrafish usando o maneio geral e as práticas de criação. Por exemplo, ver Westerfield10.
- Prepare o suporte de embrião dissolvendo-se desidratado sal marinho (ver Tabela de materiais) em água deionizada água na concentração de 60mg/L.
- Fertilizados recolher ovos da câmara de reprodutores adultos, enxaguar bem com média de embriões e embriões em cerca de 50 mL do meio de embrião em pratos de Petri de 10 cm (50 embriões por prato) da casa a 28 ± 1 ° C em um 14:10 ciclo h luz: escuro.
- Remova os embriões não-sobreviventes após 24h e suplemento com sobreviventes de embriões para que cada prato contém 50 embriões por prato.
2. Treine as larvas para alimentar usando comida não-tingida
- 4th dia pós-sobre a fertilização em (4 dpf), alimentar as larvas em cada placa de Petri 2mg de larvas de peixe em pó (ver Tabela de materiais) polvilhando a comida em cima da água.
- Permitir que as larvas 3 – 4 h para alimentar e depois transferi-los para um ambiente limpo (sem comida) Petri dish contendo cerca de 50 mL de meio de embrião fresco.
- Para ajudar na transferência como pouca comida possível, enxágue cada larva em uma placa de Petri contendo cerca de 50 mL de meio fresco embrião antes da transferência final para o novo prato.
- Repeti a alimentação e lavagem das larvas na dpf 5 e 6 do dpf.
3. preparar comida fluorescente sobre o 6 dpf e alimento para as larvas sobre o dpf 7
- Preparar o alimento que contém uma etiqueta fluorescente (doravante referida como comida fluorescente, de acordo com métodos de campo et al 3). brevemente, misturar 300 µ l de fluorescente rótulo (veja Tabela de materiais), 100 µ l de água deionizada e 200 mg de pó de alimento larval em um vidro de relógio 10cm.
- Espalhe a massa resultante em uma camada fina sobre o vidro de relógio. Deixe a pasta secar à temperatura ambiente no escuro para > 8 h.
- Raspar a mistura seca fora do vidro de relógio e esmagar para pó e armazenar à temperatura ambiente no escuro. A comida fluorescente está agora pronta para ser alimentado para as larvas.
- Sobre o dpf 7, alimentar o fluorescente alimento para as larvas da mesma forma como feito para as mamadas anteriores, que é fornecer 2mg fluorescente comida por prato (ver passos 2.1 – 2.2.1).
Nota: Certifique-se que o alimento é finamente terreno a um pó. Esfregar comida fluorescente que é envolto em papel entre o polegar e o indicador de pesagem é um método útil para assegurar finamente comida do chão.
4. Preparar soluções concentradas de dosagens de compostos de teste
- Dissolva cada teste composto médio/embrião para uma concentração que é de 2 x a dose de alvo. Se o teste de um intervalo de dose é desejada, prepare várias soluções concentradas de dosagens das concentrações adequadas para as doses desejadas.
- Prepare o suficiente de cada solução concentrada de dosagem para que 24 larvas podem ser tratadas. Cada larva exigirá 100 µ l de solução (volume final por alvéolo é 200 µ l), de dosagem então com a dose de 2,4 mL a menos, solução é necessária para cada grupo de tratamento; 2,5 mL seria um volume adequado.
- Se um solvente (ou seja, Dimetilsulfóxido) foi usado para solubilizing inicial de teste composto, preparar a dose de controle do veículo apropriado (ou seja, mesma quantidade de solvente, como o tratamento composto, mas sem o composto). E, como foi feito para cada grupo composto-tratados, preparar suficiente solução veículo para tratar 24 larvas.
5. transferência de larvas para uma placa de 96 poços e aplicar tratamentos
- Depois que as larvas foram autorizadas a se alimentam de comida fluorescente para 2 h, use uma pipeta de transferência para movê-los para um prato de lavagem, como foi feito após a alimentação no dias anteriores.
- Depois de cada larva é enxaguada, retirá-la juntamente com a média de embrião 100 µ l, e mova-o para um poço de uma placa de multi bem-parte inferior cónica de poliestireno de 96 poços (ver Tabela de materiais), o meio do embrião completo 100 µ l de distribuição dentro do poço com a larva.
- Uma vez que os números necessários de larvas foram transferidos para o 96--placa, adicione 100 µ l do 2 × concentrou-se soluções de dosagens para cada poço.
Nota: O uso de uma pipeta multicanal 12 canais facilita a dosagem rápida das larvas (12-em-um-tempo). Para evitar acidentalmente adicionando o tratamento errado, mantenha estreita faixa dos quais larvas têm sido dosadas com qual tratamento e certifique-se de mudar pontas de pipetas entre os tratamentos.
6. a medida inicial e subsequente fluorescência de cada poço
- Depois de adicionar as soluções de dose, coloque a placa de 96-bem em um Espectrofotômetro de placa capaz de emocionante e detectar as emissões do rótulo da fluorescente.
Nota: Para o rótulo de verde-amarelo utilizado (ver a Tabela de materiais), os comprimentos de onda adequados da luz são emocionantes em 505 nm e detectar em 515 nm. - Ler a fluorescência da 96-bem-chapa do fundo 5 vezes em sucessão imediata sem tremer a placa. Use o valor mínimo das 5 leituras de cada poço como a fluorescência inicial do poço.
Nota: A razão pela qual 5 leituras são tomadas sempre que a placa é lido é que larvas às vezes nadam no caminho da luz a excitação e a comida nas suas entranhas emite um sinal muito grande que é representativo das fezes lançadas. Ter o mínimo das 5 leituras pode ajudar a evitar usando medições artificialmente elevadas de comida un-transitada. - Lê a fluorescência da 96-bem-placa (como foi feito para a leitura inicial) cada 20min para as primeiras 2 horas pós-dosagem, cada 30 min para horas 3 e 4 pós-dosagem e quando cada hora por horas, 5, 6, 7 e 8 pós-dosagem.
- Tome cuidado para não incomodar (agitando a 96--placa) estabeleceu-se matéria fecal entre leituras e incubar as larvas a 28 ± 1 ° C entre leituras.
- Incubar as larvas durante a noite a 28 ± 1 ° C e lê a fluorescência da placa de 96-bem na manhã seguinte, ao mesmo tempo que as larvas foram dosadas no dia anterior. Use essa medida como a fluorescência de dose após 24 h.
7. analisar os dados
Nota: Aqui podemos calcular o acúmulo por alvéolo e grupo média para cada ponto de tempo.
- Para calcular o acúmulo por bem, usando apenas mínimos valores de cada um a 5 diz, subtrai o valor inicial do valor do cada ponto tempo. Execute este cálculo para o valor inicial também (isso resulta em uma acumulação inicial de zero para cada poço).
- Se o acúmulo em um poço no ponto de tempo de 24 h é inferior a 150 unidades fluorescentes relativas, excluir tão bem de uma análise mais aprofundada; Estes baixos valores são provavelmente devido a baixa ou nenhuma ingestão do alimento por larvas fluorescente durante a alimentação, e, portanto, essas larvas não são bons assuntos para medir o tempo de trânsito.
- Para cada ponto de tempo, calcule o acúmulo médio para poços contendo larvas co tratadas, bem como o erro padrão dessas médias.
- Plotar o acúmulo médio no eixo y versus tempo no eixo x para cada grupo de tratamento e comparar as áreas sob as curvas (AUCs).
Nota: Tratamentos que significativamente retardar ou aceleram o tempo de trânsito terá AUCs significativamente menores ou maiores, respectivamente, do que o grupo de veículo-tratados.
Representative Results
Esse método, que utiliza espectrofotometria baseados na placa para avaliar trânsito GI, pode ser usado como um substituto do elevado-throughput de microscopia fluorescente, que é um método de taxa de transferência inferior para avaliar a mesma função (Figura 1). Para gerar os dados na Figura 1, peixe identicamente tratados foram analisados para trânsito GI usando microscopia de fluorescência (representante imagens mostradas) ou espectrofotometria em 4 pontos de tempo, 0, 4, 8 e 24 h pós-dosagem; comparação dos dados a partir dessas experiências deu resultados altamente correlacionados (regressão linear dos dados r2 = 0,95). A regressão linear tem uma inclinação negativa porque microscopia mede o sinal de fluorescência retidos e espectrofotometria mede o sinal transitado.
Os efeitos dos compostos de diferentes mecanismos, com atividade de GI bem estabelecida em humanos, podem ser detectados no zebrafish usando o ensaio de espectrofotometria (Figura 2). Comparados aos controles tratados com veículo, atropina (4.2 µM) e amitriptilina (5 µM) diminuiu o trânsito GI, enquanto tegaserod (3,3 µM) e metoclopramida (33 µM) acelerou o tempo de trânsito. Eritromicina (14 µM), espera-se que aceleram o tempo de trânsito não teve qualquer efeito, como medido por esse método. Tamanho dos grupos de tratamento foram 24 antes de remover dados de larvas com n ou muito baixo sinal. A AUC para o sinal de médio por ponto de tempo foi comparado entre grupos tratados com composto e tratados com veículo usando honestamente diferença de Tukey significativa para o controle de erro de tipo-1. Os efeitos foram considerados significativo somente quando p ≤ 0,05. As concentrações utilizadas para os tratamentos acima foram o máximo tolerado doses, determinada em uma experiência prévia e definida como a dose mais elevada sem nenhum efeito adverso observável pela observação grosseira.
O ensaio de espectrofotometria pode medir os efeitos de dose-dependente dos compostos. A Figura 3 fornece dados que demonstrem que a atropina diminui trânsito GI dose-dependente em larvas de peixe-zebra. A menor dose de atropina testado, 0.042 µM, não teve nenhum efeito significativo, enquanto as duas maiores concentrações cada tiveram impacto significativo, 0,42 µM, tendo menos de um efeito de 4,2 µM.
Um novo ensaio pode ser avaliado pelo teste de controles positivos e negativos, ou seja, compostos conhecidos por serem ativos e inativos, respectivamente, no sistema de destino (neste caso o sistema de destino é o trânsito GI mamíferos). Para o ensaio de espectrofotometria, foram testados 18 ativos controles (positivos) e 6 controles (negativos) inativos. Estas experiências, o ensaio de espectrofotometria tem alto valor preditivo positivo (90,9%), mas baixa sensibilidade (55,6%) e valor preditivo negativo (38,5%). Esses valores são derivados a partir dos dados apresentados na tabela 1. Eles refletem, na prática, que, se o tempo de trânsito de zebrafish é impactado por um tratamento, trânsito mamíferos é susceptível de ser impactado. No entanto, se não há nenhum efeito sobre o tempo de trânsito de zebrafish, isto não é preditivo do efeito dos mamíferos.
Figura 1: trânsito alimentar fluorescente é detectado como uma perda de sinal de imagem microscópica e um correspondente ganho de sinal por espectrofotometria de placa-base. (A) representante imagens microscópicas de análise de efeito de atropina (4.2 µM) no tempo de trânsito GI. (B) média sinal quantificado de imagens microscópicas é altamente correlacionados (negativamente) com sinal da matéria fecal anulada (espectrofotometria) dos peixes tratados identicamente. Dados de peixes tratados com atropina estão em vermelho. Esta figura copiada com a permissão de carneiro et al . 11. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Analisar o sinal fluorescente acumulação ao longo do tempo de uma placa multi bem permite a identificação de tratamentos que alteram a taxa de trânsito GI. Asterisco (*) indica AUC significativamente diferente do que peixes tratados com veículo. Barras de erro representam o erro padrão do mau sinal para larvas no grupo de tratamento por ponto de tempo. Esta figura tem sido reutilizada com a permissão de carneiro et al 11. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Atropina dose-dependente diminui o tempo de trânsito de intestino zebrafish como refletido por espectrofotometria fluorescente de acumulação fecal ao longo do tempo. Asterisco (*) indica AUC significativamente diferente do que peixes tratados com veículo. Barras de erro representam o erro padrão do mau sinal para larvas no grupo de tratamento por ponto de tempo. Esta figura é reutilizada com a permissão de carneiro et al . 11. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: GI atividade 24 compostos em mamíferos e peixes. Esta tabela é reutilizada com a permissão de carneiro et al . 11.
Discussion
O método de espectrofotometria de romance para medir o tempo de trânsito de zebrafish de GI larvas, apresentado aqui, é um ensaio eficiente que pode prever os efeitos do tratamento sobre mamíferos GI-função. Embora o ensaio tem baixa sensibilidade, ele tem alta previsibilidade positiva, que é aceitável para primeira camada ensaios empregados para enxugamento do número de tratamentos de candidato baseado em toxicidade12. Este método é mais fácil de executar, tem uma taxa de transferência e usa menos animal manipulação etapas do que a microscopia fluorescente.
Existem desafios técnicos inerentes a este método. Captura de larvas individuais depois de alimentar o fluorescente e transferi-las para poços individuais é difícil no começo. No entanto, com a prática, um técnico especializado pode preencher uma placa de 96 poços em menos de 15 min. Se, em um ponto determinado do tempo, a placa é acidentalmente abalada e a matéria fecal inquietos do fundo dos poços antes da leitura, a acumulação aparecerá para diminuir. Isto pode ser evitado, movendo as placas cuidadosamente, sem tremer. Em nossa experiência, movimento normal, incluindo o de gaveta motorizado de Espectrofotômetro de placa, não perturbou o ensaio. Leitores, equipados com um aquecedor da placa (isto é, a placa não tem de ser devolvida a incubadora entre medições) e localizado perto de ensaio banco de laboratório pode otimizar para menor chance de perturbação, mas isso não era necessário em nossa experiência.
Tentativas iniciais do método não inclui alimentação nos dias antes do ensaio. Sem aqueles feedings 'prática', menor número de larvas consumido alimentos fluorescente suficiente durante o tempo permitido antes da aplicação do tratamento. Essas tentativas, variação dentro dos grupos de tratamento foi maior, e mais dados estavam inutilizáveis devido a baixa/não sinal acumulação ao longo do tempo. Mesmo com a prática de alimentação, algumas larvas não consumir quantidades suficientes de alimentos fluorescente, excluindo dados dessas larvas diminui a variação dentro dos grupos e aumenta a capacidade de identificar os efeitos do tratamento. Começando com tamanhos maiores do grupo (ou seja, 24 contra 12) permite que um número suficiente de larvas contribuindo dados úteis para a análise.
A microscopia fluorescente revela que o trânsito de alimentos foi quase completo por 24h em larvas tratados com atropina (não mostrado), no entanto, os dados de microplacas do ponto final de tempo refletem sinal final inferior no grupo de atropina, comparado ao grupo de veículo. Por outro lado, maior fluorescência de microplacas final foi associada com tratamentos que acelerou o tempo de trânsito, mesmo que as larvas tratados com veículo aparentemente tem anulado seu trato gastrointestinal antes do ponto final do tempo. Com base na atribuição aleatória para tratamento de larvas deu comida fluorescente, assumimos consumo equivalente do alimento fluorescente, em média, entre os grupos de tratamento. Dado isto e com base em padrões descritos acima, a fluorescência de matéria fecal declina com o tempo gasto no trato GI larval ou trânsito rápido adiciona fluorescência para as fezes de alguma forma. A causa é desconhecida e não tem sido interrogada, no entanto, o ensaio ainda é capaz de medir e comparar o tempo de trânsito entre os grupos.
O emprego desse método na detecção de efeitos tóxicos do GI de pequena molécula compostos é uma aplicação. Outras aplicações possíveis incluem modelagem de doença (por exemplo, síndrome do intestino irritável) e descoberta de romance terapia para tais doenças, ou para descobrir compostos pro-cinético. Além disso, juntamente com modelos transgénicos, esse método pode ser usado para interrogar o papel dos genes no trânsito de GI normal, bem como transtornos de trânsito, incluindo deficiência de neurônios entéricos. A larva de zebrafish oferece uma plataforma de todo organismo em uma escala que se aproxima a de cultivo celular, mas uma vez que existem vários tecidos e tipos de inumeráveis células funcionando juntos no zebrafish, perguntas de biologia de sistemas podem ser perguntadas e responderam a usando este modelo.
Com os avanços na tecnologia, novas aplicações e respectivas, a eficiência na realização de ensaios de toxicidade de zebrafish vai continuar a melhorar. Zebrafish larval manipulação métodos e ensaios estão continuando a melhorar em termos de maior taxa de transferência13,14. O novo método apresentado aqui é um exemplo de uma melhoria que pode fazer estudos de zebrafish mais impactante.
Disclosures
O projeto, realização de estudo e apoio financeiro para esta pesquisa foram fornecidos por AbbVie. AbbVie participou na interpretação dos dados, revisão e aprovação do manuscrito. S. Cassar, X. Huang e T. Cole são empregados da AbbVie e já não há conflitos de interesses adicionais para divulgar.
Acknowledgments
Simon Cassar de carpetbones.com projetado e criado a figura animada usada para demonstrar o procedimento na vida do ensaio do trânsito GI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wild type zebrafish breeding pair | Various sources - for example ZIRC (Zebrafish International Resource Center) | ZL-1 | Adult wild type zebrafish of AB lineage |
| 1.7 L Breeding Tank - Beach Style Design | Tecniplast | 1.7L SLOPED | Breeding tank |
| Instant Ocean sea salt | Intant Ocean | SS15-10 | Dehydrated sea salt |
| First Bites larval fish food | Hikari | 20095 | Powdered larval fish food |
| Yellow-green (505/515) Fluospheres | Invitrogen | F8827 | Fluorescent label |
| V-bottom 96-well polystyrene microplates | Thermo Fisher Scientific | 249570 | Multiwell microplate with V-shaped bottom in each well |
| Atropine | Sigma Aldrich | A0132 | |
| Amitriptyline | Sigma Aldrich | A8404 | |
| Tegaserod | Sigma Aldrich | SML1504 | |
| Metoclopramide | Sigma Aldrich | M0763 | |
| Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
| Spectramax M2e microplate reader | Molecular Devices | Spectramax M2e | A multi-well plate spectrophotometer capable of fluorescent excitation and emission detection. |
| SoftMax Pro | Molecular Devices | SoftMax Pro | Software for spectrophotometer data acquisition |
References
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