Summary
El objetivo de este protocolo es medir el tiempo de tránsito de fluorescencia etiquetada alimentos a través del intestino del pez cebra larval en forma de alto rendimiento.
Abstract
Pez cebra se utilizan como organismos modelo alternativo para pruebas de seguridad de drogas. El tracto gastrointestinal (GI) de pez cebra tiene similitudes genéticas, neuronales y farmacológicas a la de los mamíferos. Intolerancia GI durante ensayos clínicos de medicamentos es común y puede representar una grave amenaza para la salud humana. Pruebas de toxicidad gastrointestinal en modelos preclínicos de mamíferos pueden ser costosos en términos de tiempo, sustancia de ensayo y trabajo. El método de alto rendimiento presentado aquí puede utilizarse para predecir los problemas de seguridad GI. Comparado con modelos mamíferos, este método permite la evaluación más conveniente de prueba compuesto efectos sobre el tránsito GI durante el uso de bajas cantidades de compuesto. En este método, pez cebra larval (7 días post fertilización) son alimentadas con alimentos que contienen una etiqueta fluorescente. Después de la alimentación, cada pez larval es colocado en un pocillo de una placa de 96-cónico-parte inferior-bien y dosificar con sustancia de ensayo (disuelto en agua) o vehículo. Como se produce el tránsito del intestino, materia fecal se acumula en el fondo de los pozos, y la tasa a la cual esto sucede se controla midiendo la fluorescencia del fondo del pozo varias veces con el tiempo usando un espectrofotómetro de placa. La fluorescencia de las larvas en un grupo determinado tratamiento son promedio y se graficaron estos valores junto con el error estándar, para cada tiempo de medición, produciendo una curva que representa el tránsito promedio de alimentos en el tiempo. Efectos en el tiempo de tránsito intestinal se identifican comparando el área bajo la curva para cada grupo de tratamiento a el grupo tratado con vehículo. Este método detecta cambios en el tiempo de tránsito GI pez cebra inducido por fármacos con efectos GI clínicos conocidos; puede ser empleado para interrogar a decenas de tratamientos para efectos GI por día. Como tal, más seguros compuestos pueden rápidamente priorizarse para pruebas de mamíferos, que acelera el avance de 3R de descubrimiento y puedeo.
Introduction
Pez cebra (Danio rerio) se utilizan para modelo biología vertebrado y predecir la toxicidad de la droga o eficacia; nuevas aplicaciones en estos campos surgen cada año. Las ventajas del pez cebra en modelos de mamíferos incluyen su fecundidad, tamaño pequeño y la transparencia a través de la organogénesis. Pez cebra se utilizan para predecir candidato aguda toxicidad de la droga, así como para evaluar impacto compuesto en función del órgano, por ejemplo, cardiaca, ocular, gastrointestinal (GI)1,2. Fisiología y desarrollo del pez cebra son similares a los de los mamíferos en muchas maneras3 y 80% de los genes que están asociados con enfermedad humana tienen un pez cebra homólogo4.
El tubo digestivo del pez cebra tiene fisiología similar al tracto GI mamífero pero tiene una sencilla arquitectura5. Pez cebra no tienen estómago; el anterior foco intestinal actúa como un depósito de alimentos. Expresión génica en el intestino del pez cebra tiene muchas similitudes a la de los mamíferos5. Como los mamíferos, el sistema nervioso entérico del pez cebra controla la motilidad intestinal y la inervación intestinal refleja la de otros vertebrados6,7. En base a estas semejanzas, trastornos funcionales del intestino humano han sido estudiados en el pez cebra, mediante métodos derivados de modelos mamíferos8.
Intolerancia GI durante ensayos clínicos de medicamentos es común y puede representar una grave amenaza para la salud humana. Una revisión de los programas en una importante empresa farmacéutica durante 2005 – 2010 reveló seguridad GI como la causa principal del estudio clínico terminaciones9el 9%. Pruebas de toxicidad gastrointestinal en modelos preclínicos de mamíferos pueden ser costosos en términos de tiempo, compuesto y mano de obra. Un análisis predictivo de alto rendimiento para el tránsito GI puede proporcionar flexibilidad para pruebas de toxicidad de compuestos y brindan un impacto de 3R. El protocolo descrito en el presente documento presenta un método novedoso que ofrece un análisis de tal. Este ensayo de alto rendimiento podría emplearse temprano en el desarrollo de drogas para dar prioridad a los candidatos y contribuir a la reducción de seguridad GI en especies mayores.
Protocol
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional de Animal y el Comité uso (IACUC) de AbbVie.Abbvie opera bajo los institutos nacionales de salud guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio en un centro acreditado por la Asociación para Cuidado de la evaluación y acreditación de Animal de laboratorio (AAALAC). No hay problemas de salud animal se observaron en estos estudios.
1. criar pez cebra adulto y recoger embriones
- Casa y raza pez cebra adulto utilizando agricultura general y prácticas de crianza. Por ejemplo, véase Westerfield10.
- Preparar medio embrión disolviendo deshidratado sal marina (véase Tabla de materiales) desionizada en agua a una concentración de 60 mg/L.
- Recoge fertilizan los huevos de la cámara de cría adulta, enjuague bien con medio embrión y casa embriones en 50 mL de medio de embriones en placas Petri de 10 cm (50 embriones por plato) a 28 ± 1 ° C sobre un 14:10 h luz: oscuridad.
- Eliminar embriones no sobreviven después de 24 h y suplemento con sobrevivir embriones para que cada plato contiene 50 embriones por plato.
2. entrenar a las larvas a alimentar con alimento no teñido
- En el 4th día post fecundación (4 dpf), alimentación de las larvas en cada plato de Petri 2 mg de alimento larval en polvo (véase Tabla de materiales) por aspersión la comida encima del agua.
- Permitir que las larvas 3 – 4 h para alimentar y luego transferirlos a una limpia (sin alimentos) plato de Petri que contiene aproximadamente 50 mL medio de embriones frescos.
- Para ayudar en la transferencia como poca comida como sea posible, enjuague cada larva en una placa Petri que contiene aproximadamente 50 mL medio de embriones frescos antes del traslado definitivo a la nueva placa.
- Repetición de alimentación y de enjuague de las larvas en 5 PD y el PD 6.
3. preparar alimentos fluorescente en el 6 PD y alimento a las larvas en el PD 7
- Preparar alimentos que contienen una etiqueta fluorescente (en lo sucesivo para como fluorescente, según métodos de campo et al. 3). brevemente, mezclar 300 μL de fluorescentes (véase Tabla de materiales), 100 μl de agua desionizada de la etiqueta, y 200 mg de polvo de alimento larval en un vidrio de reloj de 10 cm.
- Extiende la pasta resultante en una fina capa sobre el vidrio de reloj. Deje que la pasta se seque a temperatura ambiente en la oscuridad para > 8 h.
- Raspe la mezcla seca del vidrio de reloj, aplastar para polvo y almacenar a temperatura ambiente en la oscuridad. La comida fluorescente está ahora lista para alimentar a las larvas.
- En el PD 7, alimentar el fluorescente alimento a las larvas de la misma manera como hecho para la alimentación anterior, que es proporcionar 2 mg alimentos fluorescente por plato (vea los pasos 2.1, 2.2.1).
Nota: Asegúrese de que el alimento está finamente molido a un polvo. Frotamiento alimentos fluorescente que se envuelven en papel entre el pulgar y el índice de peso es un método útil para finalmente asegurando alimentos de la tierra.
4. Preparar soluciones concentradas dosis de prueba compuestos
- Disolver cada prueba en medio del embrión a una concentración que es 2 x la dosis objetivo. Si se desea la prueba de un rango de dosis, preparar varias soluciones concentradas de dosificación de las concentraciones apropiadas para las dosis deseadas.
- Preparar suficiente cantidad de cada solución concentrada de dosificación 24 larvas pueden ser tratadas. Cada larva requiere 100 μl solución (el volumen final por pocillo 200 μL), la dosificación en la dosis de 2,4 mL menos, solución necesaria para cada grupo de tratamiento; 2,5 mL sería un volumen adecuado.
- Si un solvente (por ejemplo, dimetil-sulfóxido) fue utilizado para solubilizar inicial de sustancia de ensayo, preparar la dosis de control de vehículo apropiado (es decir, misma cantidad de solvente como el tratamiento compuesto pero sin el compuesto). Y, como se hizo para cada grupo tratado compuesto, preparar suficiente solución de vehículo para el tratamiento de larvas de 24.
5. transferencia de larvas a una placa de 96 pocillos y aplicar tratamientos
- Después de que las larvas han podido alimentarse de alimentos fluorescente por 2 h, utilizar una pipeta para moverlos a un plato de lavado, como se hizo después de alimentarse de días anteriores.
- Después de cada larva se enjuaga, retirarla junto con 100 μl de medio de embrión, y moverlo a un pozo de una placa varios pocillos de poliestireno de 96 pocillos cónico-parte inferior (véase Tabla de materiales), distribución medio embrión completo 100 μL en el pozo con la larva.
- Una vez que el número requerido de larvas ha sido transferido a la placa de 96 pocillos, agregar 100 μl de la 2 × concentrado dosificación soluciones a cada pocillo.
Nota: El uso de una pipeta multicanal de 12 canales facilita la dosificación rápida de las larvas (12 en el tiempo). Para evitar accidentalmente agregar el tratamiento incorrecto, hacer un seguimiento cercano de larvas han sido dosificadas con que tratamiento y asegúrese de cambiar las puntas de pipeta entre los tratamientos.
6. medir fluorescencia inicial y posterior de cada pozo
- Después de agregar las soluciones de dosis, coloque la placa de 96 pozos en un espectrofotómetro de placa capaz de excitar y detectar las emisiones de la etiqueta fluorescente.
Nota: Para el etiqueta de color verde amarillo utilizado (véase la Tabla de materiales), las correspondientes longitudes de onda de luz son emocionantes a 505 nm y detección en 515 nm. - Leer la fluorescencia de la placa de 96 pozos de fondo 5 veces en sucesión inmediata sin agitar la placa. Utilice el valor mínimo de las 5 lecturas de cada pozo como la fluorescencia inicial del pozo.
Nota: La razón por la que se toman 5 lecturas cada vez que la placa se lee es que larvas nadan a veces en el camino de la luz de excitación y los alimentos en su intestino emite una señal muy grande que es representativa de las heces liberadas. Tomando el mínimo de 5 Lee puede ayudar a evitar el uso de mediciones artificialmente altas de los alimentos sin tránsito. - Leer la fluorescencia de la placa de 96 pozos (como fue hecho para la lectura inicial) cada 20 minutos para las primeras 2 h después de dosificación, cada 30 minutos por horas 3 y 4 después de dosificación y luego una vez cada hora durante horas 5, 6, 7 y 8 post dosificación.
- Tenga cuidado para no perturbar (sacudiendo la placa de 96 pozos) colocó la materia fecal entre Lee e incuban las larvas en 28 ± 1 ° C entre lecturas.
- Incubar las larvas durante la noche a 28 ± 1 ° C y leer la fluorescencia de la placa de 96 pozos a la vez que las larvas se dosificación el día antes a la mañana siguiente. Use esta medida como la fluorescencia de la dosis después de 24 h.
7. analizar los datos
Nota: Aquí se calcula la acumulación por pozo y grupo promedios para cada punto del tiempo.
- Para calcular la acumulación por pozo, usando valores sólo mínimos de cada una de las 5 lecturas, reste el valor inicial del valor de cada punto del tiempo. Realizar este cálculo para el valor inicial así (esto resulta en una acumulación inicial de cero para cada bien).
- Si la acumulación en un pozo en el punto de tiempo de 24 horas es menos de 150 unidades fluorescentes relativas, excluir que bien de mayor análisis; Estos valores bajos son más probablemente debido a la baja o ninguna ingesta de los alimentos fluorescentes por las larvas durante la alimentación, y así ésos larvas no son buenos sujetos para medir el tiempo de tránsito.
- Para cada punto del tiempo, calcular la acumulación promedio de pozos que contienen larvas tratadas conjuntamente, así como el error estándar de los promedios.
- Parcela la acumulación promedio en el eje y versus tiempo en el eje x para cada grupo de tratamiento y comparar las áreas bajo las curvas (AUC).
Nota: Tratamientos que significativamente ralentizar o aceleran el tiempo de tránsito tendrá AUC significativamente menor o mayor, respectivamente, que el grupo tratado con vehículo.
Representative Results
Este método, que utiliza la espectrofotometría de la placa base para evaluar el tránsito GI, puede utilizarse como un reemplazo de alto rendimiento de la microscopia fluorescente, que es un método de rendimiento más bajo para la evaluación de la misma función (figura 1). Para generar los datos en la figura 1, se analizaron peces idénticamente tratadas para tránsito GI mediante microscopía de fluorescencia (representante imágenes mostradas) o espectrofotometría en 4 puntos del tiempo, 0, 4, 8 y 24 h post dosificación; comparación de los datos de los experimentos dieron resultados altamente correlacionadas (regresión lineal de datos r2 = 0.95). La regresión tiene una pendiente negativa porque microscopia mide la señal de fluorescencia retenidas y espectrofotometría mide la señal de tránsito.
Los efectos de compuestos de diferentes mecanismos, con actividad de GI bien establecida en los seres humanos, pueden ser detectados en el pez cebra usando el análisis de Espectrofotometría (figura 2). En comparación con los controles tratados con vehículo, atropina (4.2 μm) y amitriptilina (5 μm) redujo el tránsito GI, mientras que tegaserod (3.3 μm) y metoclopramida (33 μm) aceleró el tiempo de tránsito. Eritromicina (14 μm), pretende acelerar el tiempo de tránsito no tuvo efecto medido por este método. Tamaños de grupo de tratamiento fueron 24 antes de eliminar datos de larvas con no o muy baja señal. El AUC para la señal promedio por momento se comparó entre los grupos tratados con compuesto y tratados con vehículo uso diferencia honestamente significativa de Tukey para el control de error de tipo 1. Efectos se consideraron significativa cuando p ≤ 0.05. Las concentraciones que se utilizan para los tratamientos anteriores fueron el máximo tolerado dosis, determina en un experimento previo y definido como dosis máxima sin efecto adverso observable mediante observación bruto.
El ensayo de Espectrofotometría puede medir efectos dosis dependiente de los compuestos. La figura 3 muestra datos que demuestran que la atropina disminuye tránsito GI dosis-dependiente en las larvas de pez cebra. La dosis más baja de atropina probado, 0.042 μm, no tuvo efectos significativos, mientras que las dos mayores concentraciones cada tenían un impacto significativo, 0.42 μm con menos de un efecto a 4,2 μm.
Un nuevo ensayo puede evaluarse por la prueba de controles positivos y negativos, es decir, compuestos conocidos por ser activos e inactivos en el sistema de destino (en este caso el sistema de destino es el tránsito GI mamífero). Para el análisis de espectrofotometría, se analizaron 18 activados (positivos) controles y 6 inactivo (negativo). Basándose en estos experimentos, el análisis de Espectrofotometría tiene alto valor predictivo positivo (90.9%), pero baja sensibilidad (55,6%) y valor predictivo negativo (38.5%). Estos valores se derivan de los datos presentados en la tabla 1. Reflejan, en la práctica, si el tiempo de tránsito del pez cebra se ve afectado por un tratamiento, tránsito mamífero es probable que sea afectado. Sin embargo, si no hay ningún efecto sobre el tiempo de tránsito de pez cebra, esto no es predictivo de efecto mamífero.
Figura 1: tránsito de alimentos fluorescente se detecta como una pérdida de la señal de la proyección de imagen microscópica y un correspondiente aumento en la señal por espectrofotometría de la placa base. (A) representante imágenes microscópicas del análisis del efecto de la atropina (4.2 μm) en el tiempo de tránsito GI. (B) media señal cuantificada de imágenes microscópicas es altamente correlacionadas (negativamente) con la señal de la materia fecal evacuada (espectrofotometría) de peces tratados idénticamente. Datos de peces tratados con atropina están en rojo. Esta figura copiada con permiso de Cassar et al. 11. por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Análisis de acumulación de la señal fluorescente en el tiempo de una placa de un bien permite la identificación de tratamientos que cambian la tasa de tránsito GI. Asterisco (*) indica que las AUC significativamente diferente de peces tratados con vehículo. Barras de error representan el error estándar de la señal media de larvas en el grupo de tratamiento por punto de tiempo. Esta figura ha reutilizado con permiso de Cassar et al. 11. por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Atropina dosis dependiente disminuye tiempo de tránsito de la tripa de pez cebra como se refleja por espectrometría fluorescente de acumulación fecal en el tiempo. Asterisco (*) indica que las AUC significativamente diferente de peces tratados con vehículo. Barras de error representan el error estándar de la señal media de larvas en el grupo de tratamiento por punto de tiempo. Esta figura es reutilizada con permiso de Cassar et al. 11. por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Actividad de GI de los 24 compuestos en mamíferos y peces. Esta tabla es reutilizada con permiso de Cassar et al. 11.
Discussion
El método de Espectrofotometría novela de medición del larvas de pez cebra GI tiempo para tránsito, presentada aquí, es un análisis eficiente que puede predecir los efectos del tratamiento sobre mamífero GI-función. Aunque la prueba tiene baja sensibilidad, tiene alta predecibilidad positivo, que es aceptable para los primeros ensayos de nivel empleados para pelado abajo el número de tratamientos de candidato basado en toxicidad12. Este método es más fácil de ejecutar, tiene un mayor rendimiento y utiliza menos animal manejo pasos que microscopia fluorescente.
Hay desafíos técnicos inherentes a este método. Captura de larvas individuales después de alimentación los alimentos fluorescente y transferirlos en pocillos individuales es difícil al principio. Sin embargo, con la práctica, un técnico especializado puede llenar una placa de 96 pozos en menos de 15 minutos. Si, en un momento dado, la placa accidentalmente se sacude y la materia fecal sin resolver desde el fondo de los pozos antes de la lectura, la acumulación parece disminuir. Esto puede evitarse mediante el movimiento de la placa con cuidado, sin agitar. En nuestra experiencia, el movimiento normal, incluido el de la placa espectrofotómetro motorizado el cajón, no molestar el ensayo. Los lectores equipados con un calentador de la placa (es decir, la placa no tiene que devolverse a la incubadora entre mediciones) y situado cerca del ensayo de banco de laboratorio podría optimizar para menor posibilidad de disturbio, pero esto no era necesario en nuestra experiencia.
Primeros intentos en el método no incluye la alimentación en los días antes del ensayo. Sin las alimentaciones de la 'práctica', un menor número de larvas consume suficiente alimento fluorescente durante el tiempo permitido antes de la aplicación del tratamiento. En esos intentos, variación dentro de grupos de tratamiento fue mayor, y más datos fueron inservibles debido a la acumulación de bajo/sin señal en el tiempo. Incluso con la práctica de alimentación, algunas larvas no consumen cantidades suficientes de los alimentos fluorescente, excluyendo los datos de esas larvas disminuye la variación dentro de grupos y aumenta la capacidad para identificar los efectos del tratamiento. A partir de tamaños de grupo más grandes (es decir, 24 versus 12) permite un número suficiente de larvas aportando datos útiles para el análisis.
La microscopía fluorescente revela que el tránsito de alimentos fue casi completo por 24 h en larvas tratadas con atropina (no mostrado), sin embargo los datos de microplacas desde el punto de tiempo final reflejan menor señal final en el grupo de la atropina, en comparación con el grupo vehículo. Por el contrario, mayor fluorescencia final microplacas se asoció con tratamientos que aceleran el tiempo de tránsito, a pesar de que las larvas tratadas con vehículo al parecer han anulado su tracto GI antes del tiempo final. En base a la asignación aleatoria al tratamiento de larvas alimentada alimentos fluorescente, asumimos equivalente consumo de los alimentos fluorescente, en promedio, entre grupos de tratamiento. En vista de ello y basado en los patrones descritos anteriormente, fluorescencia de materia fecal disminuye con la permanencia en el tracto gastrointestinal larval o tránsito rápido agrega fluorescencia a las heces de alguna manera. La causa real es desconocida y no ha sido interrogada, sin embargo, el análisis todavía es capaz de medir y comparar el tiempo de tránsito entre los grupos.
El empleo de este método en la detección de efectos tóxicos de la GI de compuestos de pequeñas moléculas es una aplicación. Otras posibles aplicaciones incluyen modelado de enfermedad (p. ej., síndrome del intestino irritable) y descubrimiento de nueva terapia para este tipo de enfermedades, o para descubrir compuestos pro-kinetic. Además, junto con modelos transgénicos, este método podría utilizarse para cuestionar el papel de los genes en el normal tránsito GI, así como trastornos de tránsito, incluyendo deficiencia de neuronas entéricas. La larva de pez cebra ofrece una plataforma de todo organismo a escala que se aproxima a la de cultivo celular, pero ya que hay varios tejidos y tipos de células múltiples funcionando juntos en el pez cebra, preguntas de Biología de sistemas se le pueden pedir y contestar usando esto modelo.
Con los avances en la tecnología y sus nuevas aplicaciones, eficiencia en la realización de pruebas de toxicidad del pez cebra continuará mejorando. Pez cebra larvas manejo de métodos y ensayos continúan mejorar en términos de mayor rendimiento13,14. El nuevo método presentado aquí es un ejemplo de una mejora que haga estudios de pez cebra más impactantes.
Disclosures
Diseño, realización de estudio y apoyo financiero para esta investigación fueron proporcionados por AbbVie. AbbVie participó en la interpretación de datos, revisión y aprobación del manuscrito. Cassar S., X. Huang y T. Cole son empleados de AbbVie y no tienen más conflictos de interés divulgar.
Acknowledgments
Simon Cassar de carpetbones.com diseñó y creó la figura de animación utilizada para demostrar el procedimiento en la vida de la prueba de tránsito GI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wild type zebrafish breeding pair | Various sources - for example ZIRC (Zebrafish International Resource Center) | ZL-1 | Adult wild type zebrafish of AB lineage |
| 1.7 L Breeding Tank - Beach Style Design | Tecniplast | 1.7L SLOPED | Breeding tank |
| Instant Ocean sea salt | Intant Ocean | SS15-10 | Dehydrated sea salt |
| First Bites larval fish food | Hikari | 20095 | Powdered larval fish food |
| Yellow-green (505/515) Fluospheres | Invitrogen | F8827 | Fluorescent label |
| V-bottom 96-well polystyrene microplates | Thermo Fisher Scientific | 249570 | Multiwell microplate with V-shaped bottom in each well |
| Atropine | Sigma Aldrich | A0132 | |
| Amitriptyline | Sigma Aldrich | A8404 | |
| Tegaserod | Sigma Aldrich | SML1504 | |
| Metoclopramide | Sigma Aldrich | M0763 | |
| Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
| Spectramax M2e microplate reader | Molecular Devices | Spectramax M2e | A multi-well plate spectrophotometer capable of fluorescent excitation and emission detection. |
| SoftMax Pro | Molecular Devices | SoftMax Pro | Software for spectrophotometer data acquisition |
References
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