Summary
हम साधारण microcomputed टोमोग्राफी स्कैनिंग के लिए उपयुक्त खाद्यान ऊतक के एक्स-रे अवशोषण कंट्रास्ट में सुधार करने के लिए एक उपंयास विधि प्रदान करते हैं । सीटी छवियों के आधार पर, हम प्रभावी ढंग से मक्का के संवहनी बंडलों की सूक्ष्म phenotypes निकालने के लिए अलग मक्का सामग्री के लिए छवि प्रसंस्करण कार्यप्रवाह का एक सेट पेश करते हैं ।
Abstract
यह उच्च प्रवाह छवि विश्लेषण तकनीक के आधार पर मक्का सामग्री की संरचनात्मक संरचनाओं को सही ढंग से ठहराना आवश्यक है । यहां, हम मक्का सामग्री (यानी, स्टेम, पत्ती, और रूट) साधारण microcomputed टोमोग्राफी (माइक्रो सीटी) स्कैनिंग के लिए उपयुक्त के लिए एक ' नमूना तैयारी प्रोटोकॉल ' प्रदान करते हैं । मक्का स्टेम, पत्ती, और जड़ के उच्च संकल्प सीटी छवियों के आधार पर, हम संवहनी बंडलों के phenotypic विश्लेषण के लिए दो प्रोटोकॉल का वर्णन: (1) मक्का स्टेम और पत्ती की सीटी छवि पर आधारित है, हम स्वचालित रूप से 31 निकालने के लिए एक विशिष्ट छवि विश्लेषण पाइपलाइन विकसित और संवहनी बंडलों के ३३ phenotypic लक्षण; (2) मकई जड़ की सीटी छवि श्रृंखला पर आधारित है, हम तीन आयामी (3-डी) metaxylem वाहिकाओं के विभाजन के लिए एक छवि प्रसंस्करण योजना की स्थापना की, और दो-आयामी (2-डी) और 3-डी phenotypic लक्षण, जैसे मात्रा, metaxylem जहाजों की सतह क्षेत्र, आदि मौजूद थे । मक्का सामग्री के संवहनी बंडलों के पारंपरिक मैनुअल माप के साथ तुलना में, प्रस्तावित प्रोटोकॉल काफी दक्षता और माइक्रोन स्केल phenotypic ठहराव की सटीकता में सुधार होगा ।
Introduction
मक्का संवहनी प्रणाली पूरे संयंत्र के माध्यम से चलाता है, जड़ से और पत्तियों को स्टेम, जो पानी पहुंचाने के लिए प्रमुख परिवहन रास्तों रूपों, खनिज पोषक तत्वों, और कार्बनिक पदार्थ1। संवहनी प्रणाली का एक अंय महत्वपूर्ण कार्य के लिए मक्का संयंत्र के लिए यांत्रिक सहायता प्रदान करना है । उदाहरण के लिए, जड़ों और तनों में संवहनी बंडलों की आकृति विज्ञान, संख्या, और वितरण मक्का पौधों2,3के वृद्धाश्रम प्रतिरोध करने के लिए बारीकी से संबंधित हैं । वर्तमान में, संवहनी बंडलों की संरचनात्मक संरचना पर अध्ययन मुख्यतः सूक्ष्म और ultramicroscopic तकनीक का उपयोग करने के लिए स्टेम, पत्ती, या रूट के एक निश्चित हिस्से की संरचनात्मक संरचनाओं को प्रदर्शित करने, और फिर माप और इन संरचनाओं की गिनती मैनुअल जांच द्वारा ब्याज । निस्संदेह, बड़े पैमाने पर microimages में विभिंन सूक्ष्म संरचनाओं के मैनुअल माप एक बहुत ही थकाऊ और अक्षम काम है और गंभीर रूप से microphenotypic लक्षण की परिशुद्धता सीमा, इसके मनोवाद और असंगति 4 के कारण, 5.
खाद्यान की कोई द्वितीयक वृद्धि नहीं है, और कोशिका सामग्री मूलतः प्राथमिक meristem में पानी के होते हैं । बिना किसी उपचार के, मक्का के ऊतकों के ताजा नमूनों को सीधे एक माइक्रो-सीटी डिवाइस का उपयोग करके स्कैन किया जा सकता है; हालांकि, स्कैनिंग के परिणाम शायद गरीब और किसी न किसी । मुख्य कारणों के रूप में संक्षेप में इस प्रकार हैं: (1) संयंत्र के ऊतकों की कम क्षीणन घनत्व, परमाणु संख्या और छवियों में उच्च शोर के एक कम विपरीत में जिसके परिणामस्वरूप; (2) ताजा संयंत्र सामग्री निर्जलीकरण और सामांय स्कैनिंग वातावरण के दौरान हटना करने के लिए प्रवण हैं, के रूप में Du6द्वारा सूचना दी । abovementioned समस्याओं के विकास और मक्का, गेहूं, चावल, और अंय monocotyledons के लिए microphenotyping प्रौद्योगिकी के आवेदन के लिए मुख्य बाधाएं बन गए हैं । यहां, हम मक्का स्टेम, पत्ती, और जड़ के नमूनों का इलाज करने के लिए ' नमूना तैयारी प्रोटोकॉल ' का परिचय । इस प्रोटोकॉल सीटी स्कैनिंग के दौरान निर्जलीकरण और संयंत्र सामग्री की विकृति से बचा जाता है; इस प्रकार nondeformation के साथ पौधे के नमूनों का संरक्षण समय बढ़ाने के लिए लाभकारी है । इसके अलावा, ठोस आयोडीन के आधार पर रंगाई कदम भी संयंत्र सामग्री के विपरीत बढ़ाता है; इस प्रकार, यह माइक्रो सीटी के इमेजिंग गुणवत्ता में महत्वपूर्ण सुधार करता है । इसके अलावा, हम छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर विकसित, VesselParser नाम, मक्का उपजी और पत्तियों की सीटी छवियों को संसाधित करने के लिए. इस सॉफ्टवेयर को एकीकृत करता है छवि प्रसंस्करण पाइपलाइनों का एक सेट करने के लिए उच्च प्रवाह और स्वत: phenotyping विश्लेषण करने के लिए 2-D सीटी विभिन्न संयंत्र के ऊतकों की छवियों. मक्का स्टेम और पत्ती के पूरे पार अनुभाग में संवहनी बंडलों का पता लगाया, निकाले जाते हैं, और एक स्वचालित छवि प्रसंस्करण विधि का उपयोग कर की पहचान की. एक परिणाम के रूप में, हम मक्का स्टेम के 31 सूक्ष्म phenotypes और मक्का पत्ती के ३३ सूक्ष्म phenotypes प्राप्त करते हैं । मक्का रूट की सीटी छवि श्रृंखला के लिए, हम एक छवि प्रसंस्करण योजना metaxylem जहाजों के 3 डी phenotypic लक्षण प्राप्त करने के लिए विकसित की है । यह योजना पारंपरिक तरीकों की तुलना में छवि अधिग्रहण और पुनर्निर्माण की कुशलता में बेहतर है ।
इन परिणामों से संकेत मिलता है कि छवि प्रसंस्करण सामांय एक्स-रे माइक्रो सीटी की इमेजिंग विशेषताओं पर विचार पाइपलाइन संवहनी बंडलों की सूक्ष्म phenotyping के लिए एक प्रभावी तरीका प्रदान करते हैं; यह बहुत संयंत्र विज्ञान में सीटी तकनीक के आवेदनों को चौड़ा और सेलुलर संकल्प6,7पर संयंत्र सामग्री के स्वत: phenotyping में सुधार ।
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Protocol
1. नमूना तैयारी प्रोटोकॉल
- नमूने के लिए, ताजा मक्का पौधों से स्टेम, पत्ती, और जड़ इकट्ठा करने और उन्हें नमूना समूहों के तीन प्रकार (चार प्रतिकृतियां के साथ प्रत्येक समूह) में विभाजित । फिर, उन्हें छोटे खंडों में कटौती निम्नलिखित तरीके से एक शल्य ब्लेड का उपयोग: (1) लंबाई में मध्य स्टेम नोड 1-१.५ सेमी के एक खंड में कटौती; (2) मुख्य नस के साथ ऊर्ध्वाधर दिशा के साथ लंबाई में पत्ती ०.५-3 सेमी की अधिकतम चौड़ाई के एक खंड में कटौती; (3) क्राउन रूट ०.५ cm के एक सेगमेंट को लम्बाई में काटें ।
- faa निर्धारण के लिए, एक faa समाधान में नमूना क्षेत्रों सोख (90:5:5 v/v/v, ७०% इथेनॉल: 100% formaldehyde: 100% एसिटिक एसिड) के लिए ंयूनतम 3 डी ।
- छह क्रमिक इथेनॉल ढाल में निर्जलीकरण प्रक्रिया प्रदर्शन (यानी, 30%, ५०%, ७०%, ८५%, ९५% और १००%) और 30 मिनट के रूप में प्रत्येक इथेनॉल ढाल के प्रसंस्करण समय निर्धारित किया है ।
- एक 3-डी प्रिंटर का उपयोग कर निर्मित इसी नमूना टोकरी में संयंत्र सामग्री प्लेस; फिर, जल्दी से एक सह2 महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने प्रणाली का नमूना सेल को नमूना टोकरी हस्तांतरण । सुखाने पैरामीटर्स निम्नानुसार सेट करें:
(1) सह2 में: तेज गति । धारक भराव: १००% ।
(2) प्रभारी: सह2 चार्ज देरी १२० साइकिल में एस । एक्सचेंज स्पीड: 5. चक्र संख्या: 12 ।
(3) गैस से बाहर: गर्मी, जल्दी । गति: धीरे, ५०% ।- मक्का जड़, स्टेम, और पत्ती, डिजाइन और प्रिंट नमूना एक 3-डी प्रिंटर (जैसे, चित्रा 1) का उपयोग कर टोकरी के रूपात्मक मतभेदों के अनुसार ।
- सूखे संयंत्र सामग्री प्लेस (मक्का रूट, स्टेम, या पत्ती) में एक ५०-ठोस आयोडीन की 2 जी के साथ ट्यूब केंद्रापसारक के लिए अस्थिर आयोडीन वाष्प के साथ संयंत्र सामग्री डाई और, तो, एक lightproof कमरे में ट्यूबों के लिए जगह 4-5 ज ।
2. माइक्रो-सीटी स्कैनिंग प्रोटोकॉल
- कच्चे सीटी डेटा में स्कैन करने के लिए, सीटी स्कैनिंग पैरामीटर सेट निम्नानुसार: ४० केवी/250 µA (स्टेम और पत्ती के लिए) या ३४ केवी/210 µA (रूट के लिए) । उपयोग किए जाने वाले पादप सामग्रियों के विभिंन आकारों और वॉल्यूंस के लिए संगत स्कैनिंग श्रेणियां सेट करें, और इमेजिंग पिक्सेल आकार इस प्रकार समायोजित करे: २.० µm (भुट्टा जड़ के लिए), ६.७७ µm (मक्का स्टेम के लिए), और १०.० µm (मक्का पत्ती के लिए) ।
- स्लाइस छवियों के पुनर्निर्माण के लिए, एक छवि पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक 2k संकल्प (२,००० x २,००० पिक्सल) के साथ सीटी स्लाइस छवियों में कच्चे सीटी डेटा परिवर्तित । अधिक विवरण NRecon उपयोगकर्ता मैनुअल (http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf) में प्रदान की जाती हैं ।
3. एक मक्का स्टेम या पत्ती का एक सीटी छवि के लिए छवि विश्लेषण प्रोटोकॉल
नोट: संवहनी बंडलों के लिए स्वचालित इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें, मक्का स्टेम और पत्ती (चित्रा 2) की सीटी स्लाइस छवियों के भीतर संवहनी बंडलों के phenotyping विश्लेषण का संचालन करने के लिए । सॉफ़्टवेयर उपयोग चरण निंनानुसार बताए गए हैं ।
- भिन्न एल्गोरिथ्म पाइपलाइन प्रारंभ करने के लिए अंग प्रकार नियुक्त करें । विधि पैरामीटर बटन क्लिक करें और पहले ड्रॉप-डाउन बॉक्स में मक्का स्टेम या मक्का पत्ती का चयन ।
- छवियों को आयात करने के लिए, डेटा प्रबंधन बटन क्लिक करें, कार्य निर्देशिका सेट, और इस निर्देशिका में स्वचालित रूप से सभी स्लाइस छवियां आयात । छवि पाइपलाइनों में एकल या बहु-स्लाइस छवियों का चयन करें ।
- छवि का वास्तविक पिक्सेल आकार निर्धारित करें । विधि पैरामीटर बटन पर क्लिक करें और पिक्सेल आकार के संपादित करें आइटम में छवि का वास्तविक पिक्सेल आकार डालें.
- phenotyping अभिकलन के लिए, phenotyping गणना बटन पर क्लिक करें स्वचालित रूप से सभी चयनित स्लाइस छवियों के लिए संवहनी बंडलों के phenotypic लक्षण निकालने के लिए ।
- परिणाम को TXT या CSV फ़ाइल स्वरूप के रूप में आउटपुट करने के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण बटन क्लिक करें ।
4. एक मक्का रूट की सीटी छवि श्रृंखला के लिए छवि विश्लेषण प्रोटोकॉल
ध्यान दें: सीटी की छवि श्रृंखला मक्का जड़ों की छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर metaxylem जहाजों के 3-डी संरचनाओं निकालने के लिए उपयोग किया जाता है । मुख्य कदम इस प्रकार हैं ।
- मक्का जड़ों के पुनर्निर्माण छवियों (BMP फ़ाइल स्वरूप में) आयात और सटीक रिक्ति मापदंडों का निर्धारण (एक voxel के आकार [यानी, एक्स, वाई, जेड]) । छवि गुणवत्ता में सुधार करने के लिए इन छवियों को smoothen करने के लिए पुनरावर्ती गाऊसी उपकरण का उपयोग करें ।
- थ्रेशोल्ड पैरामीटर्स का समायोजन करके metaxylem वाहिकाओं के 3-डी सेगमेंट का संचालन करना; यह प्रत्येक कनेक्टेड metaxylem पोत के लिए एक समान रंग लेबल उत्पंन करता है ।
- सुधारना और metaxylem आकृति विज्ञान, bitwise, और बाढ़-भरने के संचालन का उपयोग करते हुए सक्रिय वाहिकाओं की पहचान ।
- मात्रा दृश्य और जहाजों के पुनर्निर्माण सतह का संचालन । 2-डी और 3-डी के स्तर में एक पोत के phenotypic लक्षण गिनती और मापने के लिए मुखौटा सांख्यिकी उपकरण का प्रयोग करें ।
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Representative Results
नमूना तैयारी साधारण माइक्रो-सीटी स्कैनिंग के लिए उपयुक्त प्रोटोकॉल न केवल संयंत्र के ऊतकों की विकृति को रोकता है, लेकिन यह भी एक्स-रे अवशोषण कंट्रास्ट को बढ़ाता है । इलाज संयंत्र सामग्री उच्च गुणवत्ता स्लाइस छवियों में एक माइक्रो-सीटी प्रणाली का उपयोग कर स्कैन कर रहे हैं, और उच्चतम संकल्प 2 µm/पिक्सेल तक पहुंच सकते हैं । चित्रा 4 स्टेम, पत्ती, और जड़ की स्कैन माइक्रो-सीटी छवियों से पता चलता है, और छवि कंट्रास्ट ताजा संयंत्र सामग्री से स्कैन परिणामों के साथ तुलना में एक महत्वपूर्ण सुधार हुआ है । इन सीटी स्लाइस छवियों में, ग्रे स्तर के मूल्यों में महत्वपूर्ण अंतर संवहनी बंडलों, पैरेन्काइमा कोशिकाओं, जाइलम वाहिकाओं, एपिडर्मिस, और अन्य ऊतकों के बीच चौकस कर रहे हैं.
संवहनी बंडलों के लिए इस इमेजिंग सॉफ्टवेयर के आधार पर, पूरे स्टेम या पत्ती के पार अनुभाग के भीतर संवहनी बंडलों की संरचना और वितरण सुविधाओं को स्वचालित रूप से विश्लेषण और quantified किया जा सकता है । एक उदाहरण के रूप में एक मक्का स्टेम की छवि ले लो, और सॉफ्टवेयर के phenotyping एल्गोरिथ्म पांच कदम के होते हैं: खंड स्लाइस छवि, नाड़ी बंडलों खंड, संवहनी बंडलों के स्थानिक वितरण का विश्लेषण, की पहचान और संवहनी बंडलों में सुधार , और गणना और संवहनी बंडलों के phenotypic लक्षण उत्पादन । छवि में पूरे एपिडर्मिस क्षेत्र है, पहले, विशिष्ट या अनुकूली दहलीज मूल्यों के आधार पर विभाजित है, और समोच्च विश्लेषण तकनीक एपिडर्मिस क्षेत्र निकालने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं अगले, संवहनी बंडलों के विभाजन आयोजित किया जाता है । संवहनी बंडलों एपिडर्मिस में घिरे रहे हैं; इसलिए, एपिडर्मिस क्षेत्र पूर्वनिर्धारित मोटाई के साथ स्लाइस छवि से निकाल दिया गया है । छवि के बाकी केवल उच्च पिक्सेल तीव्रता और कमजोर पिक्सेल तीव्रता के साथ पैरेन्काइमा कोशिकाओं के साथ बिखरे हुए संवहनी बंडलों के होते हैं । उसके बाद, छवि विभाजन निश्चित थ्रेशोल्ड मान पर आधारित संवहनी बंडलों के सभी उम्मीदवार क्षेत्रों को निकालने के लिए किया जाता है, और इन क्षेत्रों आगे क्षेत्र और आकार सुविधाओं की सीमाओं के अनुसार मान्य संवहनी बंडलों के रूप में निर्धारित कर रहे हैं ( चित्रा 3 सी और 3d) ।
संवहनी बंडलों के विभाजन के बाद, स्थानिक वितरण विशेषताओं के संवहनी बंडल निकाले जाते हैं । नोड्स के रूप में बिखरे हुए संवहनी बंडलों के ज्यामितीय केंद्रों लो टुकड़ा छवि में सभी संवहनी बंडलों के लिए त्रिकोण मेष पैदा करने के लिए, और इन जाल पांच प्रकार में संकुल रहे है उनके क्षेत्रों के अनुसार । संवहनी बंडलों के क्षेत्र मक्का स्टेम के किनारे करने के लिए केंद्र से एक महत्वपूर्ण कम प्रवृत्ति प्रकट । त्रिकोणीय और Voronoi मेष स्थानिक वितरण और संवहनी बंडलों के टोपोलॉजिकल कनेक्शन का वर्णन है, और प्रत्येक मेष संवहनी बंडलों (चित्रा 3E - 3H) के संकुल परिणामों के अनुसार एक विशिष्ट रंग के साथ तैयार की है । संवहनी बंडलों कि स्थानिक वितरण की बाधाओं को पूरा (जाल क्षेत्र और आकार महत्वपूर्ण अनुक्रमित कर रहे हैं संवहनी बंडल की उपलब्धता निर्धारित करने के लिए) आरक्षित और अंतिम विभाजन परिणाम (चित्रा 3मैं) उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं.
पिछले पर, इस तरह के ज्यामितीय, आकार, और वितरण जानकारी के रूप में संवहनी बंडलों के phenotypic लक्षण, गणना की जा सकती है ऊपर के विश्लेषण के अनुसार, जो एक TXT या सीएसवी फ़ाइल के उत्पादन में परिणाम (चित्रा 3जे). संवहनी बंडलों के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर के आधार पर, स्टेम के 31 phenotypic लक्षण स्वचालित रूप से विश्लेषण किया जा सकता है; प्रत्येक सीटी छवि के लिए औसत गणना समय ~ 30 एस है । स्टेम के सापेक्ष phenotypic पैरामीटर तालिका 1में दिखाए जाते हैं । इसी प्रकार, पत्ती के ३३ phenotypic लक्षण निकाला जा सकता है, औसत गणना समय ~ ५० s है, और इन पैरामीटर वर्गीकरण तालिका 2में दिखाए जाते हैं । स्लाइस छवियों की एक सूची के लिए, ऊपर छवि विश्लेषण पाइपलाइन स्वचालित निष्पादन के लिए एक बैच संसाधन में एकीकृत कर रहे हैं । यह कार्यप्रवाह एक मक्का स्टेम और पत्ती की एक पूरी टुकड़ा छवि के भीतर सभी संवहनी बंडलों के phenotypic लक्षण का विश्लेषण करने के लिए कुशल है । विशेष रूप से, संवहनी बंडलों के सबसे phenotypic लक्षण, इस तरह के कुल क्षेत्र के रूप में, औसत क्षेत्र, और संवहनी बंडलों के क्षेत्र अनुपात, काफी मुश्किल मैनुअल माप द्वारा मापा जा करने के लिए कर रहे हैं.
क्योंकि मक्का जड़ों के metaxylem जहाजों जड़ विकास की दिशा के साथ स्पष्ट रूपात्मक परिवर्तन दिखाने के लिए, यह और अधिक phenotypic विश्लेषण के लिए metaxylem वाहिकाओं के 3 डी संरचनाओं को निकालने के लिए मूल्यवान है । मक्का रूट की सीटी छवि श्रृंखला के आधार पर, 3-डी विभाजन, सतह पुनर्निर्माण, और मात्रा दृश्य प्रदर्शन कर रहे हैं. सेगमेंट किए गए परिणामों के आधार पर, metaxylem जहाजों के 3-डी संरचनात्मक मापदंडों की गणना स्वचालित रूप से की जा सकती है, जिसमें खंड, सतह क्षेत्र, क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र (बेसल), और कुल metaxylem वाहिकाओं के क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र (बाहर) और प्रत्येक एकल metaxylem पोत । यह वर्कफ़्लो उल्लेखनीयतया 3-डी phenotypic विशेषता विश्लेषण की दक्षता में सुधार करता है । विभाजन के परिणाम, पुनर्निर्माण, और मात्रा दृश्य सीधे मक्का रूट के metaxylem जहाजों की स्थानिक संरचनाओं प्रकट कर सकते हैं, के रूप में चित्रा 5में दिखाया गया है ।
चित्रा 1 : 3-डी प्रिंटर के साथ मुद्रित नमूना बास्केट के विभिंन प्रकार । (a और B) पत्ती के लिए सर्पिल नमूना टोकरी (A1) एक केंद्रीय अंडाकार नाली और (A2) आसपास के सर्पिल नाली के साथ बना है. सर्पिल नाली की चौड़ाई के बारे में 4 मिमी मुख्य नस के साथ पत्ती को समायोजित करने के लिए सेट किया गया है । सर्पिल नाली के sidewall (A5) स्क्वायर ड्रेनेज छेद और (बी-6) परिपत्र नाली छेद के साथ टोकरी के नीचे बनाया गया है । (सी और डी) इन दो पैनलों एक चार अच्छी तरह नमूना स्टेम के लिए उपयुक्त टोकरी, 25 मिमी के व्यास के साथ (C1) नमूना छेद के साथ दिखाने के लिए, और (D2) सात नाली छेद के साथ टोकरी के नीचे । (ई और एफ) इन दो पैनलों एक multiwell नमूना टोकरी रूट के लिए उपयुक्त दिखाने के लिए, के साथ (E1) चार परिपत्र छेद के साथ एक व्यास के साथ 10 मध्य क्षेत्र में मिमी, और (E2) 13 परिपत्र छेद के साथ एक व्यास 8 मिमी टोकरी के किनारे के पास की व्यवस्था की. नमूना टोकरी के नीचे छोटे रूट ऊतक बाहर रिसाव नहीं करता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए 1 मिमी के व्यास के साथ छेद नाली है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 : संवहनी बंडलों के लिए स्वचालित इमेजिंग सॉफ्टवेयर के स्क्रीनशॉट । (क) इस पैनल के डेटा प्रबंधन से पता चलता है किसी भी फ़ाइल निर्देशिका से सीटी छवियों को आयात और बाद में प्रसंस्करण के लिए सीटी स्लाइस छवियों का चयन करें । (ख) इस पैनल विधि मापदंडों सीटी स्लाइस छवियों के अंग प्रकार की पहचान और इसी विधि मापदंडों को विन्यस्त करने के लिए दिखाता है । (ग) इस पैनल phenotyping गणना सीटी स्लाइस छवियों के बैच गणना प्रदर्शन और निष्पादन प्रगति दिखाने के लिए दिखाता है । (घ) इस पैनल के सांख्यिकीय विश्लेषण से पता चलता है गणना के परिणामों को सत्यापित करने और सभी सीटी छवियों के लिए phenotypic लक्षण उत्पंन करते हैं । (ङ) यह पैनल गणनात्मक परिणामों को विश्लेषण परिणामों को TXT या सीवी फ़ाइल के रूप में आउटपुट दिखाता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3 : छवि प्रसंस्करण और phenotyping गणना सीटी स्लाइस छवियों के आधार पर कार्यप्रवाह । (क) मक्का स्टेम की सीटी स्लाइस छवि आयात करें । (B) स्लाइस छवि को एक निश्चित थ्रेशोल्ड मान के साथ सेगमेंट. (ग) मक्का स्टेम का संपूर्ण क्षेत्र निकालें. (घ) मकई के तने के एपिडर्मिस क्षेत्र को हटा दें । (ङ) संवहनी बंडलों के त्रिकोणीय जाल । (च) यह पैनल संवहनी बंडलों के क्षेत्रों के अनुसार एक clustering विश्लेषण से पता चलता है । (छ) यह पैनल त्रिकोणीय जाल के क्षेत्रों के अनुसार एक clustering विश्लेषण से पता चलता है । (ज) इस पैनल Voronoi जाल के क्षेत्रों के अनुसार एक clustering विश्लेषण से पता चलता है । (I) इस पैनल के संवहनी बंडलों के अंतिम खंडों परिणाम दिखाता है । (जंमू) इस पैनल संवहनी बंडलों के स्थानिक वितरण से पता चलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 : Multiplanar पुनर्निर्माण (MPR) मक्का स्टेम, पत्ती, और जड़ की छवियां । बाएं पैनल एक स्टेम पार अनुभाग के एक MPR छवि दिखाता है । मध्य पैनल एक पत्ती पार अनुभाग के एक MPR छवि से पता चलता है । सही पैनल एक जड़ पार अनुभाग के एक MPR छवि को दर्शाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5 : रूट metaxylem जहाजों के 3-डी दृश्य । सलाखों = ०.२ mm. (a और B) ये पैनल एक रूट के 3-डी दृश्य दिखाते हैं । (सी एफ) इन पैनलों metaxylem जहाजों के एक 3 डी दृश्य दिखाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
तालिका 1: मक्का स्टेम के सूक्ष्म phenotypic लक्षण ।
तालिका 2: मक्का पत्ती के सूक्ष्म phenotypic लक्षण ।
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Discussion
जैव चिकित्सा और सामग्री विज्ञान के क्षेत्रों में सीटी प्रौद्योगिकी के सफल आवेदन के साथ, इस तकनीक को धीरे से वनस्पति विज्ञान और कृषि के क्षेत्रों में शुरू किया गया है, एक आशाजनक तकनीकी उपकरण के रूप में संयंत्र जीवन विज्ञान में शोध को बढ़ावा देने . 1990 के दशक के उत्तरार्ध में, सीटी प्रौद्योगिकी पहले रूपात्मक संरचनाओं और संयंत्र जड़ प्रणालियों के विकास का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । पिछले एक दशक में, सिंक्रोट्रॉन HRCT संयंत्र जीव के लिए एक शक्तिशाली, विनाशकारी उपकरण बन गया है, और सफलतापूर्वक अंगूर संवहनी प्रणाली8के ऊतक संरचनाओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, Arabidopsis पत्ती के ऊतक संरचना9 , 10, और बलात्कार के बीज संरचना11। सिंक्रोट्रॉन HRCT के माध्यम से, महान प्रगति संरचना और वुडी पौधों12,13,14में संवहनी बंडलों के समारोह के अध्ययन में किया गया है । हालांकि, मक्का, गेहूं, चावल, और अंय फसलों के लिए HRCT प्रौद्योगिकी के छोटे अनुसंधान15किया गया है । खाद्यान की कोई द्वितीयक वृद्धि नहीं है, और कोशिका मूलतः प्राथमिक meristem में पानी के होते हैं । हालांकि ताजा नमूनों को बिना किसी इलाज के माइक्रो-सीटी द्वारा स्कैन किया जा सकता है, लेकिन स्कैनिंग के परिणाम बहुत खराब होते हैं । मुख्य कारणों से इस प्रकार हैं: (1) संयंत्र के ऊतकों की कम क्षीणन घनत्व, परमाणु संख्या और छवियों में उच्च शोर में एक कम विपरीत में जिसके परिणामस्वरूप; (2) ताजा सामग्री को निर्जलीकरण और स्कैनिंग अवधि के दौरान सिकुड़ जाता है, के रूप में Du6द्वारा सूचना दी । उपर्युक्त कारणों से मक्का, गेहूँ, चावल, और अन्य monocotyledons में इस तकनीक के आवेदन को सीमित करने वाले मुख्य कारक बन गए हैं.
यहां, हम एक सरल और व्यावहारिक नमूना तैयारी प्रोटोकॉल है कि न केवल संयंत्र के ऊतकों की विकृति को रोकता है, लेकिन यह भी एक्स-रे अवशोषण कंट्रास्ट को बढ़ाता है परिचय । उच्च गुणवत्ता और जड़, स्टेम, और पत्ती के उच्च संकल्प सीटी छवियों नमूना तैयारी प्रोटोकॉल और माइक्रो-सीटी इमेजिंग प्रणाली के आधार पर प्राप्त किया गया था, और उच्चतम संकल्प 2 µm/पिक्सेल करने के लिए किया गया था । इस प्रकार, नमूना तैयारी प्रोटोकॉल साधारण माइक्रो सीटी स्कैनिंग के लिए उपयुक्त है और monocot और अंय संयंत्र विज्ञान में व्यापक अनुप्रयोगों के लिए एक महान अवसर प्रदान करता है । इस प्रोटोकॉल को आसानी से इस तरह निर्जलीकरण या सुखाने की प्रक्रिया के रूप में अंय संयंत्र सामग्री को समायोजित संशोधित किया जा सकता है, और इसके पैरामीटर सेटिंग भी सबसे अच्छा परिणाम के लिए विशिष्ट संयंत्र सामग्री के अनुसार समायोजित किया जा सकता है । विशेष रूप से, इस दृष्टिकोण के आकार और संयंत्र नमूना की मात्रा द्वारा सीमित है । एक बहुत मोटी नमूना खंड अपूर्ण सुखाने या विकृति के नमूने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसलिए, इस नमूने की तैयारी प्रोटोकॉल कम 3 सेमी की मोटाई और मक्का कान या ढेला के रूप में बहुत बड़ा मक्का सामग्री के लिए नहीं के साथ छोटे संयंत्र सामग्री के लिए लागू है ।
संयंत्र सामग्री की सूक्ष्म phenotyping प्रौद्योगिकी हाल के वर्षों में संयंत्र phenotypic अध्ययन के गर्म विषयों में से एक है, और यह धीरे-धीरे आनुवंशिक प्रजनन और संयंत्र शरीर क्रिया विज्ञान के लिए बुनियादी समर्थन प्रौद्योगिकियों में से एक होता जा रहा है । पौधों की पारंपरिक सूक्ष्म phenotypic विश्लेषण जटिल नमूना तैयारी और थकाऊ मैनुअल आपरेशनों की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता है । यह बहुत श्रम प्रधान और समय लेने वाली है गिनती और सूक्ष्म लक्षण उपाय; परिणाम भी व्यक्तिपरक त्रुटियों के लिए प्रवण हैं । उदाहरण के लिए, एक मक्का स्टेम में संवहनी बंडलों की phenotypic विशेषताओं का अंदाजा लगाने के लिए, स्टेम नमूना तेल में एंबेडेड और फिर कटा हुआ, दाग, और छवि की जरूरत है । एक सना हुआ स्लाइस छवि के लिए, यह सेल सीमाओं की अस्पष्ट परिभाषा के कारण एक स्वचालित छवि प्रसंस्करण प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल है; इस प्रकार, मैनुअल पहचान और विभाजन अपरिहार्य16है । मकई स्टेम, Legland और Heckwolf के संरचनात्मक लक्षण के लिए बड़े पैमाने पर माप की आवश्यकताओं को संतुष्ट करने के लिए विभिंन छवि प्रसंस्करण तरीकों का परिचय; हालांकि, छिलका में संवहनी बंडलों की संरचनाओं अभी भी एक चुनौती17,18है । इसलिए, उच्च प्रवाह छवि विश्लेषण और मकई के ऊतकों के संरचनात्मक लक्षण के सटीक ठहराव आवश्यक हैं । यहां, हम संवहनी बंडलों के लिए स्वत: इमेजिंग सॉफ्टवेयर प्रदान करते हैं, कि स्वचालित रूप से संवहनी बंडलों में 31 phenotypic लक्षण निकालने कर सकते है मक्का स्टेम और ३३ phenotypic लक्षण के प्रत्येक सीटी छवि के लिए ~ 30 एस में मक्का पत्ती के प्रत्येक सीटी छवि के लिए ~ ५० एस । पूरे उपजी या पत्तियों के पार की धारा के भीतर संवहनी बंडलों की संरचना और वितरण सुविधाओं का स्वचालित रूप से विश्लेषण और quantified किया जा सकता है । इस सॉफ्टवेयर के निम्नलिखित लाभ हैं: (1) यह स्वचालित रूप से मक्का स्टेम और पत्ती की सीटी स्लाइस छवियों प्रक्रियाओं और संवहनी बंडलों के phenotypic लक्षण अर्क; (2) यह विशेष रूप से किनारे पर छोटे संवहनी बंडलों के लिए, सीटी छवि में संवहनी बंडलों की एक उच्च मांयता दर है; (3) एक उपंयास ग्राफिक विश्लेषण विधि संवहनी बंडलों के वितरण विशेषताओं को प्रकट करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
इसके अलावा, एक्स-रे माइक्रो-सीटी स्कैनिंग प्रौद्योगिकी छवि अधिग्रहण और पुनर्निर्माण की क्षमता में स्पष्ट लाभ है पारंपरिक पुनर्निर्माण के साथ तुलना में तेल धारा छवियों पर आधारित तकनीक19,20 ,21. मक्का रूट की सीटी छवि श्रृंखला के आधार पर, एक छवि प्रसंस्करण योजना metaxylem वाहिकाओं के स्थानिक संरचनाओं को निकालने और सूक्ष्म लक्षण के 3-डी माप के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल करने के लिए विकसित की है । इस योजना की मुख्य सीमा है कि 3-डी खंड परिणाम मामूली मैनुअल बातचीत पर निर्भर हैं । भविष्य में, हम 3-डी विभाजन और पुनर्निर्माण की दक्षता में सुधार करने के लिए मक्का की जड़ों के सीटी डेटासेट के लिए स्वचालित 3-डी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का एक सेट विकसित करने का लक्ष्य है ।
अंत में, एक साधारण माइक्रो-सीटी मक्का स्टेम, पत्ती के लिए एक व्यावहारिक नमूना तैयारी प्रोटोकॉल पर आधारित स्कैनिंग, और जड़ उच्च संकल्प सीटी छवियों का उत्पादन करने के लिए निर्माण किया है. यहां प्रदान की नमूना तैयारी प्रोटोकॉल न केवल संयंत्र के ऊतकों की विकृति को रोकता है, लेकिन यह भी एक्स-रे अवशोषण कंट्रास्ट को बढ़ाता है । इस प्रोटोकॉल भी अंय गेहूं, चावल, और अंय monocotyledons में सीटी स्कैनिंग अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है । अब तक, हम संवहनी बंडलों के लिए स्वत: इमेजिंग सॉफ्टवेयर विकसित किया है, कि स्वचालित रूप से सक्षम है और तेजी से मक्का स्टेम और पत्ती की एक सीटी छवि से संवहनी बंडलों के phenotypic लक्षण निकालने । मक्का रूट की सीटी छवि श्रृंखला के आधार पर, एक छवि प्रसंस्करण योजना सफलतापूर्वक metaxylem वाहिकाओं के 3 डी phenotypic लक्षण निकालने के लिए स्थापित किया गया है । एक्स-रे माइक्रो सीटी पर आधारित संयंत्र सामग्री की सूक्ष्म phenotyping तकनीक सटीक और तेजी से ठहराव और मक्का संवहनी बंडलों की पहचान के लिए एक नई संभावना प्रदान करते हैं ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस शोध को राष्ट्रीय प्रकृति विज्ञान फाउंडेशन ऑफ चाइना (No 31671577) द्वारा समर्थित किया गया था, विज्ञान और प्रौद्योगिकी नवाचार विशेष निर्माण वित्त पोषित कार्यक्रम बीजिंग कृषि और वानिकी विज्ञान अकादमी (KJCX20180423), अनुसंधान चीन के विकास कार्यक्रम (2016YFD0300605-01), बीजिंग प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (५१७४०३३), बीजिंग Postdoctoral रिसर्च फाउंडेशन (२०१६ ZZ-६६), और बीजिंग कृषि और वानिकी विज्ञान अनुदान (KJCX20170404) के अकादमी, ( JNKYT201604) ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Skyscan 1172 X-ray computed tomography system | Bruker Corporation, Belgium | NA | For CT scanning |
| CO2 critical point drying system (Leica CPD300) | Leica Corporation, Germany | NA | For sample drying |
| Ethanol | Any | NA | For FAA fixation |
| Formaldehyde | Any | NA | For FAA fixation |
| Acetic acid | Any | NA | For FAA fixation |
| Surgical blade | Any | NA | For cutting the sample sgements |
| 3D printer | Makerbot replicator 2, MakerBot Industries, USA | NA | For printing the sample baskets of maize root, stem, and leaf |
| Centrifuge tube | Corning, USA | NA | Place the root, stem, or leaf materials |
| Solid iodine | Any | NA | For sample dyeing |
| SkyScan Nrecon software | SkyScan NRecon, Version: 1.6.9.4, Bruker Corporation, Belgium | NA | For image reconstruction |
| VesselParser software | VesselParser, Version: 3.0, National Engineering Research Center for Information Technology in Agriculture (NERCITA), Beijing, China | NA | Image analysis protocol for single CT image of maize stem or leaf |
| ScanIP | ScanIP, Version: 7.0; Simpleware, Exeter, UK | NA | 3D image processing software |
| Latex gloves | Any | NA | |
| Tweezers | Any | NA |
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