Summary
نحن نقدم طريقة جديدة لتحسين تباين امتصاص الأشعة السينية الذرة الأنسجة مناسبة لفحص التصوير المقطعي ميكروكومبوتيد العادية. استناداً إلى صور الأشعة المقطعية، نقدم مجموعة من مهام سير العمل في تجهيز الصور لمختلف المواد الذرة لاستخراج فعالة تعمل مجهرية من حزم وعائية من الذرة.
Abstract
من الضروري أن دقة قياس الهياكل التشريحية الذرة المواد استناداً إلى تقنيات تحليل الصورة الفائق. هنا، نحن نقدم إعداد نموذج 'بروتوكول' لمواد الذرة (أي، الجذعية، ورقة، وجذر) مناسبة للعاديين ميكروكومبوتيد التصوير المقطعي (الصغرى-CT) المسح الضوئي. استناداً إلى صور عالية الاستبانة الأشعة المقطعية الجذعية الذرة وأوراق وجذور، يصف لنا بروتوكولين لتحليل حزم وعائية المظهرية: (1) استناداً إلى صورة الأشعة المقطعية الجذعية الذرة ونبات، قمنا بتطوير خط أنابيب تحليل صورة معينة استخراج تلقائياً 31 والسمات المظهرية 33 من حزم وعائية؛ (2) استناداً إلى سلسلة صورة الأشعة المقطعية لجذر الذرة، علينا إعداد نظام تجهيز صورة للتجزئة (ثلاثي الأبعاد) ثلاثية الأبعاد للسفن ميتاكسيليم، واستخراج ثنائي الأبعاد (2-d) والسمات المظهرية ثلاثي الأبعاد، مثل الحجم والمساحة للسفن ميتاكسيليم، إلخ بالمقارنة مع القياس اليدوية التقليدية من حزم وعائية المواد الذرة، البروتوكولات المقترحة إلى حد كبير تحسين كفاءة ودقة ميكرون-المقياس الكمي المظهرية.
Introduction
يعمل النظام بالأوعية الدموية الذرة من خلال مصنع كامل، من الجذر والساق للأوراق، التي تشكل مسارات النقل الرئيسية لإيصال المياه والمغذيات المعدنية والمواد العضوية1. وظيفة هامة أخرى من الأوعية الدموية لتوفير الدعم الميكانيكي لنبات الذرة. على سبيل المثال، ارتباطاً وثيقا التشكل وعدد وتوزيع حزم وعائية في الجذور والسيقان المقاومة السكن لنباتات الذرة2،3. في الوقت الحاضر، دراسات عن التشريحي من حزم وعائية أساسا استخدام التقنيات المجهرية وأولتراميكروسكوبيك لعرض الهياكل التشريحية لجزء معين من جذع، أوراق، أو الجذر، وثم قياس وحساب هذه الهياكل من مصلحة التحقيق اليدوي. ولا شك أن القياس اليدوي لمختلف هياكل مجهرية في ميكرويماجيس على نطاق واسع هو عمل شاقة للغاية وغير فعالة ويحد بشدة من دقة الصفات ميكروفينوتيبيك، نظراً لعدم الموضوعية وعدم تناسق4، 5.
الذرة لا النمو الثانوي، ومحتوى الخلية يتكون أساسا من الماء في أرض الابتدائية. دون أي معالجة مسبقة، عينات جديدة من الذرة الأنسجة يمكن مباشرة مسحها ضوئياً باستخدام جهاز الأشعة المقطعية الصغرى؛ ومع ذلك، نتائج المسح ربما الفقراء والخام. الأسباب الرئيسية التي تتلخص فيما يلي: كثافة التوهين منخفضة (1) من الأنسجة النباتية، أسفر على النقيض منخفضة العدد الذري والضوضاء عالية في الصور؛ (2) المواد النباتية الطازجة المعرضة ليذوي ويتقلص خلال البيئة المسح العادي، كما أفاد دو6. وقد أصبحت المشاكل المذكورة أعلاه القيود الرئيسية لتطوير وتطبيق تكنولوجيا ميكروفينوتيبينج للذرة والقمح، والأرز، وأخرى مونوكوتيليدونس. نقدم لك هنا، في 'بروتوكول إعداد نموذج' بريتريات العينات الجذعية الذرة وأوراق وجذور. يتجنب هذا البروتوكول بالجفاف والتشوه للمواد النباتية أثناء التصوير المقطعي المسح؛ وهكذا، أنها مفيدة لزيادة وقت حفظ العينات النباتية مع نونديفورميشن. وعلاوة على ذلك، يعزز خطوة الصباغة استناداً إلى اليود الصلبة أيضا على النقيض المواد النباتية؛ وهكذا، فإنه يجعل تحسينات كبيرة في نوعية التصوير الجزئي-قيراط وعلاوة على ذلك، قمنا بتطوير برامج معالجة الصورة، اسمه فيسيلبارسير، معالجة الصور المقطعية للذرة السيقان والأوراق. يدمج هذا البرنامج مجموعة من أنابيب تجهيز الصور لإجراء تحليل phenotyping الفائق والتلقائي للصور المقطعية 2-د من الأنسجة النباتية المختلفة. الحزم الوعائية في المقطع العرضي كامل الجذعية الذرة وأوراق يتم الكشف عن واستخراج وتحديد باستخدام أسلوب معالجة الصور تلقائي. نتيجة لذلك نحصل على 31 تعمل مجهرية الجذعية الذرة وتعمل مجهرية 33 نبات الذرة. سلسلة الصور المقطعية جذر الذرة، قمنا بتطوير نظام معالجة الصور لاكتساب الصفات المظهرية ثلاثي الأبعاد للسفن ميتاكسيليم. هذا المخطط أعلى في الكفاءة للحصول على الصور وإعادة الإعمار مقارنة بالأساليب التقليدية.
تشير هذه النتائج إلى أن الصورة تجهيز أنابيب النظر في خصائص التصوير للأشعة السينية العادية الصغيرة-CT توفر وسيلة فعالة ل phenotyping مجهرية من حزم وعائية؛ الغاية هذا يوسع تطبيقات تقنيات الأشعة المقطعية في علم النبات، ويحسن phenotyping التلقائي للمواد النباتية في القرار الخلوي6،7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-نموذج إعداد بروتوكول
- لأخذ العينات، جمع الساق، ليف، والجذر من نباتات الذرة الطازجة وتقسيمها إلى ثلاثة أنواع من مجموعات العينة (كل مجموعة مع تكرار أربعة). ثم قطع منها إلى شرائح صغيرة باستخدام شفرة جراحة على النحو التالي: (1) خفض جزء الأوسط تنبع internode 1-1.5 سم في الطول؛ (2) قطع جزء من العرض الأقصى لنبات 0.5-3 سم في الطول على طول الاتجاه الرأسي مع المنطلق الرئيسي؛ (3) قطع جزء من جذر التاج 0.5 سم في الطول.
- لتثبيت القوات المسلحة اﻷنغولية، نقع في الجزء المتعلق بعينه في التوصل إلى حل القوات المسلحة اﻷنغولية (90:5:5 v/v/v، 70% إيثانول: 100% فورمالدهايد: 100% حمض الخليك) على الأقل 3 د.
- تنفيذ الإجراء الجفاف في التدرجات متسلسلة الإيثانول الستة (أي، 30%، 50%، 70%، 85%، 95% و 100%)، وتعيين وقت تجهيز كل معامل الإيثانول ك 30 دقيقة.
- ضع المواد النباتية في سلال عينة المقابلة مصنعة باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد؛ بعد ذلك، نقل بسرعة سلال عينة إلى خلية نموذج نظام تجفيف نقطة حرجة2 CO. تعيين معلمات التجفيف كما يلي:
(1) CO2 في: سرعة. حامل الحشو: 100%.
(2) تهمة: CO2 رسوم تأخير 120 s في الدورة. تبادل السرعة: 5-دورة رقم: 12.
(3) الغاز بها: الحرارة، سريع. السرعة: بطيئة، 50%.- ووفقا للاختلافات المورفولوجية لجذر الذرة، الجذعية، وأوراق، والتصميم وسلال عينة الطباعة باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد (مثلاً، الشكل 1).
- ضع المواد النباتية المجففة (جذر الذرة، ووقف، أو أوراق) في أنبوب 50 مل الطرد مركزي مع 2 غرام اليود الصلبة صبغ المواد النباتية مع بخار اليود متقلبة، وبعد ذلك، وضع الأنابيب في غرفة معتمة ح 4-5.
2-الصغرى-ط م المسح الضوئي البروتوكول
- إجراء مسح ضوئي إلى البيانات المقطعية الخام، تعيين ط م المسح الضوئي المعلمات على النحو التالي: 40 كيلو فولت/250 µA (للساق والأوراق) أو 34 كيلوفولت/210 µA (للجذر). تعيين المقابلة فحص النطاقات لأحجام مختلفة وكميات من المواد النباتية المستخدمة، وضبط أحجام بكسل التصوير على النحو التالي: 2، 0 ميكرومتر (لجذر الذرة) و 6.77 ميكرومتر (لوقف الذرة) 10.0 ميكرومتر (بالنسبة لنبات الذرة الصفراء).
- لإعادة بناء صور شريحة، تحويل البيانات المقطعية الخام إلى CT شريحة الصور بدقة 2 ك (2,000 x 2,000 بكسل) استخدام برنامج إعادة بناء صورة. وترد تفاصيل أكثر في "دليل المستخدم نريكون" (http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf).
3-صورة بروتوكول تحليل لصورة الأشعة المقطعية واحدة الجذعية الذرة أو نبات
ملاحظة: استخدم برامج التصوير التلقائي لحزم وعائية إجراء تحليل فينوتيبينج لحزم وعائية داخل الصور المقطعية شريحة الجذعية الذرة ونبات (الشكل 2). يتم وصف الخطوات استخدام البرمجيات كما يلي.
- تعيين نوع الجهاز تهيئة خوارزمية مختلفة خطوط الأنابيب. انقر فوق الزر معلمات الأسلوب وحدد الجذعية الذرة أو نبات الذرة في مربع القائمة المنسدلة الأولى.
- لاستيراد الصور، انقر فوق الزر إدارة البيانات وتعيين دليل عمل، واستيراد تلقائياً جميع الصور الشريحة في هذا الدليل. حدد واحد أو شريحة متعددة من الصور في صورة خطوط الأنابيب.
- تحديد حجم بكسل الفعلي للصورة. انقر فوق الزر معلمات الأسلوب وقم بإدخال حجم بكسل الفعلي للصورة في عنصر تحرير لحجم بكسل.
- لحساب فينوتيبينج، انقر فوق الزر حساب فينوتيبينج لاستخراج السمات المظهرية الحزم الوعائية لكل شريحة مختارة الصور تلقائياً.
- انقر فوق الزر التحليل الإحصائي لإخراج النتائج كتنسيق ملف TXT أو CSV.
4-صورة تحليل البروتوكول لسلسلة صورة الأشعة المقطعية لجذر الذرة
ملاحظة: تستخدم سلسلة صورة الأشعة المقطعية لجذور الذرة لاستخراج هياكل السفن ميتاكسيليم باستخدام برنامج معالجة الصور ثلاثية الأبعاد. فيما يلي الخطوات الرئيسية.
- استيراد الصور أعيد بناؤها من جذور الذرة (في تنسيق ملف BMP) وتحديد معالم تباعد دقيقة (حجم فوكسل [أي، x, y, z]). استخدم أداة غاوسي العودية لتنعيم هذه الصور لتحسين جودة الصورة.
- إجراء تقسيم ثلاثي الأبعاد للسفن ميتاكسيليم بضبط معايير الحد الأدنى؛ يقوم هذا بإنشاء تسمية لون موحد لكل سفينة ميتاكسيليم متصلة.
- تحسين وتحديد السفن ميتاكسيليم بشكل تبادلي باستخدام مورفولوجيا، أحادي المعامل، وعمليات ملء الفيضانات.
- القيام بالتعمير حجم التصور وسطح السفن. استخدام أداة قناع الإحصاءات لعد وقياس السمات المظهرية سفينة في مستويات ثنائي الأبعاد وثلاثي الأبعاد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بروتوكول إعداد نموذج مناسب للمسح الجزئي-الأشعة المقطعية العادية لا يمنع تشوه الأنسجة النباتية، بل يعزز أيضا على النقيض من امتصاص الأشعة السينية. يتم تفحص المواد النباتية pretreated باستخدام نظام الأشعة المقطعية الصغرى إلى صور شريحة عالية الجودة، وأعلى دقة يمكن أن تصل إلى 2 ميكرومتر/بكسل. ويبين الشكل 4 مايكرو-CT الصور الممسوحة ضوئياً الجذعية، ورقة، وجذر، وعلى النقيض من الصورة تحسنا كبيرا بالمقارنة مع النتائج التي تم مسحها ضوئياً من المواد النباتية الطازجة. في هذه الصور شريحة الأشعة المقطعية واختلافات في قيم مستوى رمادي يمكن ملاحظتها بين الحزم الوعائية وخلايا حمة وسفن الخشب، والبشرة والأنسجة الأخرى.
استناداً إلى هذه البرمجيات والتصوير لحزم وعائية، ملامح هيكل وتوزيع حزم وعائية داخل المقطع العرضي لجذع كامل أو أوراق يمكن تلقائياً بتحليل وكمياً. تأخذ صورة جذع الذرة كمثال، وخوارزميه فينوتيبينج للبرمجيات وتتألف من خمس خطوات: الجزء صورة الشريحة، الجزء الحزم الوعائية، وتحليل التوزيع المكاني للحزم الوعائية، وتحديد وتحسين حزم وعائية ، وتحسب وإخراج الصفات المظهرية الحزم الوعائية. هو، أولاً، مجزأة منطقة البشرة كاملة في الصورة استناداً إلى قيم العتبة المحددة أو التكيف، وتحليل كفاف تقنيات تتم لاستخراج منطقة البشرة (الشكل 3 ألف و 3 باء). وبعد ذلك، تتم تجزئة الحزم الوعائية. حزم وعائية محاصرون في البشرة؛ ولذلك، تتم إزالة منطقة البشرة بسماكة محددة مسبقاً من صورة الشريحة. بقية الصورة يتكون فقط من vascular bundles المنتشرة بكثافة بكسل عالية وخلايا حمة بكثافة بكسل ضعيفة. ثم تتم تجزئة الصورة استناداً إلى قيمة عتبة ثابتة لاستخراج جميع المناطق المرشحة من الحزم الوعائية، وكذلك تحدد هذه المناطق كحزم وعائية صالحة وفقا للقيود المفروضة على ميزات المنطقة والشكل ( الشكل 3 و 3D).
بعد تجزئة حزم وعائية، يتم استخراج خصائص التوزيع المكاني للحزم الوعائية. تتخذ مراكز هندسية من حزم وعائية مبعثرة كعقد لتوليد تنسجم المثلث لجميع حزم وعائية في صورة شريحة، وتتجمع هذه الشبكات إلى خمسة أنواع وفقا للمجالات. مجالات حزم وعائية المجاهرة باتجاه تنازلي كبير من المركز إلى حافة الجذعية الذرة. الثلاثي وتنسجم Voronoi وصف التوزيع المكاني واتصالات طوبولوجي الحزم الوعائية، ويوجه كل شبكة مع لون محدد وفقا لنتائج متفاوت المسافات من حزم وعائية (الرقم 3E - 3 ح). الحزم الوعائية التي تفي بالقيود على التوزيع المكاني (شبكة المنطقة والشكل هي الفهارس الهامة تحديد مدى توافر حزمة وعائية) محفوظة وتستخدم لتوليد نتائج تجزئة النهائية (الشكل 3أنا).
في الصفات المظهرية، وآخر من حزم وعائية، مثل الشكل الهندسي،، وتوزيع المعلومات، يمكن أن تحسب وفقا للتحليل الوارد أعلاه، مما يؤدي إلى إخراج ملف TXT أو CSV (الشكل 3ي). تستند برامج التصوير لحزم وعائية، السمات المظهرية 31 الجذعية يمكن تلقائياً تحليلها؛ يتم حساب متوسط الوقت لكل صورة من صور الأشعة المقطعية ~ 30 ثانية. معلمات المظهرية النسبية تنبع ترد في الجدول 1. وبالمثل، يمكن استخلاص السمات المظهرية 33 ورقة، يتم حساب متوسط الوقت ~ 50 s، وهذه التصنيفات المعلمة مبينة في الجدول 2. للحصول على قائمة صور شريحة، تتكامل الصورة أعلاه تحليل خطوط الأنابيب في دفعة تجهيز للتنفيذ التلقائي. يقوم سير العمل هذا فعالة لتحليل السمات المظهرية جميع الحزم الوعائية داخل صورة شريحة كاملة الجذعية الذرة وأوراق. جدير بالذكر أن معظم الصفات المظهرية من حزم وعائية، مثل المساحة الإجمالية، ومتوسط المساحة، ونسبة من حزم وعائية، يصعب إلى حد كبير التي تقاس بالمقاييس اليدوية.
للسفن ميتاكسيليم من جذور الذرة إظهار التغييرات الشكلية الواضحة على طول اتجاه نمو الجذر، وأكثر قيمة لاستخراج هياكل ثلاثية الأبعاد للسفن ميتاكسيليم لتحليل المظهرية. استناداً إلى سلسلة الصور المقطعية جذر الذرة، يتم تنفيذ تقسيم ثلاثي الأبعاد والتعمير السطحية، وحجم التصور. استناداً إلى نتائج مجزأة، المعلمات ثلاثي الأبعاد الهيكلية للسفن ميتاكسيليم يمكن تلقائياً حساب، بما في ذلك حجم ومساحة السطح، ومساحة مقطعية (القاعدية)، ومنطقة مستعرضة (القاصي) للسفن ميتاكسيليم الكلي وكل السفينة ميتاكسيليم واحد. يقوم سير العمل هذا تحسن كبير في كفاءة تحليل السمات المظهرية ثلاثي الأبعاد. يمكن أن تظهر نتائج التصور تجزئة وإعادة الإعمار ووحدة التخزين مباشرة المكانية هياكل السفن ميتاكسيليم من جذر الذرة، كما هو مبين في الشكل 5.
الشكل 1 : أنواع مختلفة من سلال عينة طباعتها باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد- (أ و ب) تتكون سلة دوامة عينة للنبات مع (A1) شكل بيضاوي وسط الاخدود والأخدود دوامة المحيطة بها (A2). يتم تعيين العرض للاخدود دوامة في حوالي 4 مم لاستيعاب الورقة مع الاتجاه الرئيسي. جدار groove دوامة من ثقوب التصريف مربعا تم إنشاؤه مع (A5) والجزء السفلي من السلة مع ثقوب استنزاف دائرية (B6). (ج ود) هذان الفريقان هما إظهار سلة أربعة آبار عينة مناسبة للساق، مع (C1) عينة ثقوب بقطر 25 مم، والجزء السفلي من السلة مع (D2) سبعة استنزاف ثقوب. (E و F) هذان الفريقان هما إظهار سلة عينة مولتيويل مناسبة للجذر، مع أربع فتحات دائرية (E1) التي يبلغ قطرها 10 ملم في المنطقة الوسطى، و (E2) 13 ثقوب دائرية يبلغ قطرها 8 مم مرتبة بالقرب من حافة السلة. الجزء السفلي من سلة عينة قد الثقوب استنزاف التي يبلغ قطرها 1 مم لضمان أن تسرب الأنسجة الجذرية الصغيرة لا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : لقطات برامج التصوير التلقائي لحزم وعائية. (أ) هذا الفريق يوضح إدارة البيانات استيراد الصور المقطعية من أي دليل ملف وحدد الصور المقطعية شريحة للمعالجة اللاحقة. (ب) هذا الفريق يوضح معلمات الأسلوب لتحديد نوع جهاز التصوير المقطعي شريحة الصور وتكوين معلمات الأسلوب المطابق. (ج) هذا الفريق يظهر في حساب فينوتيبينج إجراء العملية الحسابية دفعة من الصور المقطعية شريحة وإظهار تقدم التنفيذ. (د) هذا الفريق يظهر التحليل الإحصائي للتحقق من النتائج الحسابية وتوليد الصفات المظهرية لجميع الصور المقطعية. (ه) يظهر هذا الفريق النتائج الحسابية لإخراج نتائج التحليل كملف TXT أو السير الذاتية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : سير العمل لتجهيز الصور و phenotyping حساب استناداً إلى صور شريحة CT. (أ) استيراد صورة شريحة CT الجذعية الذرة. (ب) الجزء صورة الشريحة بقيمة عتبة ثابتة. (ج) استخراج المنطقة بأسرها من الساق الذرة. (د) حذف منطقة البشرة الجذعية الذرة. (ﻫ) تنسجم الثلاثي من حزم وعائية. (و) هذا الفريق تعرض تحليل المجموعات وفقا لمجالات الحزم الوعائية. (ز) هذا الفريق تعرض تحليل المجموعات وفقا لمجالات تنسجم الثلاثي. (ح) يظهر هذا الفريق بتحليل المجموعات وفقا لمجالات Voronoi تنسجم. (أنا) هذا الفريق يوضح النتائج النهائية مجزأة من الحزم الوعائية. (ي) الفريق هذا يبين التوزيع المكاني للحزم الوعائية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : الصور الإعمار مولتيبلانار (MPR) من الذرة، وأوراق، وتنبع الجذر. وتبين اللوحة اليسرى صورة MPR شريحة الجذعية. الفريق الأوسط يظهر صورة MPR شريحة ليف. اللوحة اليسرى يظهر صورة MPR شريحة الجذر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : التصور ثلاثي الأبعاد للسفن ميتاكسيليم الجذر. الأشرطة = 0.2 مم. (أ و ب) تظهر هذه اللوحات تصور ثلاثي الأبعاد للجذر. (ج - و) تظهر هذه اللوحات تصور ثلاثي الأبعاد للسفن ميتاكسيليم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الجدول 1: السمات المظهرية مجهرية الجذعية الذرة.
الجدول 2: السمات المظهرية مجهرية من نبات الذرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مع التطبيق الناجح لتكنولوجيا الأشعة المقطعية في مجالات الطب الحيوي وعلوم المواد، هذه التكنولوجيا قد تم تدريجيا في مجالات علم النبات والزراعة، وتشجيع البحوث في علوم الحياة النباتية كأداة تقنية واعدة . في أواخر التسعينات، استخدمت تكنولوجيا الأشعة المقطعية أولاً لدراسة هياكل المورفولوجية وتطوير نظم جذور النباتات. في العقد الماضي، أصبحت أداة قوية وغير تدميري لعلماء الأحياء النباتية السنكروتروني حركة، وقد استخدمت بنجاح للتعرف على هياكل الأنسجة من العنب الأوعية الدموية8وهيكل الأنسجة من أوراق نبات 9 , 10، والبذور بنية الاغتصاب11. من خلال السنكروتروني HRCT، أحرز تقدم كبير في دراسة هيكل ووظيفة الحزم الوعائية في النباتات الخشبية12،،من1314. ومع ذلك، سوى القليل من البحوث للتكنولوجيا هركت للذرة والقمح والأرز ومحاصيل أخرى قد أنجز15. الذرة لا النمو الثانوي، والخلية يتكون أساسا من الماء في أرض الابتدائية. على الرغم من أن يمكن تفحص عينات جديدة من مايكرو-CT دون أي معالجة مسبقة، نتائج المسح سيئة للغاية. الأسباب الرئيسية كما يلي: كثافة التوهين منخفضة (1) من الأنسجة النباتية، مما أدى إلى تباين منخفض في العدد الذري والضوضاء عالية في الصور؛ (2) مادة الطازجة يميل إلى يذوي ويتقلص خلال فترة المسح، كما أفاد دو6. الأسباب المذكورة أعلاه قد أصبحت العوامل الرئيسية التي تحد من تطبيق هذه التكنولوجيا في الذرة والقمح، والأرز، وأخرى مونوكوتيليدونس.
نقدم لك هنا، هو بروتوكول إعداد نموذج بسيط وعملي لا يمنع تشوه الأنسجة النباتية فحسب بل يعزز أيضا على النقيض من امتصاص الأشعة السينية. تم الحصول على صور الأشعة المقطعية عالية الجودة وعالية الدقة من الجذر، الساق، والأوراق استناداً إلى نموذج إعداد بروتوكول ونظام التصوير بالأشعة المقطعية الصغرى، وأعلى دقة تصل إلى 2 ميكرومتر/بكسل. وهكذا، بروتوكول إعداد نموذج مناسب للمسح الجزئي-الأشعة المقطعية العادية ويوفر فرصة كبيرة لتطبيقات أوسع نطاقا في مونوكوت وغيرها من العلوم النباتية. وهذا البروتوكول يمكن تعديلها بسهولة لاستيعاب المواد النباتية الأخرى مثل الجفاف أو إجراء التجفيف، ويمكن أيضا تعديل إعداد المعلمة به طبقاً للمواد النباتية محددة للحصول أفضل النتائج. جدير بالذكر أن هذا النهج يحد حجم وحجم العينة النباتية. شريحة عينة سميكة جداً قد يؤدي إلى تجفيف ناقصة أو تشوه للعينة. ولذلك، ينطبق هذا البروتوكول إعداد نموذج للمواد النباتية الصغيرة مع سماكة أقل من 3 سم وليس لكثير مواد الذرة أكبر مثل الذرة الإذن أو الكوز.
التكنولوجيا فينوتيبينج المجهري للمواد النباتية أحد الموضوعات الساخنة للدراسات النباتية المظهرية في السنوات الأخيرة، وتدريجيا أصبح واحدة من التكنولوجيات الأساسية الدعم لفسيولوجيا النبات وتربية الوراثية. التحليل المظهرية المجهري التقليدي للنباتات يتطلب عدد كبير من عينة مجمع الأعمال التحضيرية والعمليات اليدوية مملة. أنها كثيفة العمالة للغاية وتستغرق وقتاً طويلاً لحساب وقياس الصفات المجهرية؛ النتائج أيضا عرضه للأخطاء الذاتية. على سبيل المثال، لتحديد خواص الحزم الوعائية في ساق ذرة، العينة الجذعية يحتاج إلى أن يكون جزءا لا يتجزأ من البارافين ثم شرائح، الملون، وتصويرها. لصورة شريحة الملون، من الصعب القيام بصورة تلقائية التجهيز بسبب تعريف غامض لحدود الخلية؛ وهكذا، هي تحديد يدوي وتجزئة لا غنى عنه16. لتلبية متطلبات القياسات على نطاق واسع للصفات التشريحية للساق الذرة، ليجلاند وهيكوولف بعرض مختلف أساليب معالجة الصور؛ ومع ذلك، هياكل الحزم الوعائية في القشرة لا تزال تحدي17،18. ومن ثم تحليل الصورة الفائق والكمي الدقيق للصفات التشريحية للأنسجة الذرة ضرورية. هنا، نحن نقدم برامج التصوير التلقائي لحزم الأوعية الدموية، التي يمكن استخراجها تلقائياً السمات المظهرية 31 من حزم وعائية في ~ 30 ثانية لكل صورة الأشعة المقطعية الجذعية الذرة والسمات المظهرية 33 في ~ 50 ثانية لكل صورة من صور الأشعة المقطعية لنبات الذرة. ويمكن تحليل ملامح هيكل وتوزيع حزم وعائية داخل المقطع العرضي لينبع كامل أو يترك تلقائياً وكمياً. هذا البرنامج لديه المزايا التالية: (1) أنها تلقائياً بمعالجة الصور المقطعية شريحة الجذعية الذرة وأوراق ومقتطفات الصفات المظهرية من حزم وعائية؛ (2) لديها أعلى معدل اعتراف بحزم وعائية في صورة الأشعة المقطعية، خاصة بالنسبة لحزم وعائية صغيرة على الحافة؛ (3) أسلوب رواية بيانية تحليل يستخدم للكشف عن خصائص توزيع حزم وعائية.
علاوة على ذلك، وتكنولوجيا المسح الجزئي-CT الأشعة السينية مزايا واضحة في الكفاءة للحصول على الصور وإعادة الإعمار بالمقارنة مع التقنيات التقليدية الإعمار استناداً إلى البارافين قسم الصور19،20 ،21. استناداً إلى سلسلة الصور المقطعية جذر الذرة، هو مخطط لمعالجة الصور المتقدمة لاستخراج هياكل السفن ميتاكسيليم المكانية واستخدمت بنجاح لقياس ثلاثي الأبعاد من الصفات المجهرية. القيد الرئيسي من هذه الخطة أن نتائج مجزأة ثلاثية الأبعاد تعتمد على التفاعل دليل طفيف. في المستقبل، ونحن نهدف إلى تطوير مجموعة من البرمجيات التحليل الآلي صورة ثلاثية الأبعاد ل dataset CT من جذور الذرة لتحسين كفاءة تجزئة ثلاثي الأبعاد وإعادة الإعمار.
وفي الختام، مسح CT الصغرى العادية استناداً إلى بروتوكول إعداد نموذج عملي لوقف الذرة، ليف، ويتكون الجذر لإنتاج صور الأشعة المقطعية عالية الوضوح. بروتوكول إعداد العينة المقدمة هنا لا يمنع تشوه الأنسجة النباتية بل يعزز أيضا على النقيض من امتصاص الأشعة السينية. هذا البروتوكول أيضا مناسبة للأخرى CT مسح التطبيقات في القمح والأرز وغيرها مونوكوتيليدونس. وحتى الآن، قمنا بتطوير برامج التصوير التلقائي لحزم وعائية، قادرة على استخراج تلقائياً وسريعا الصفات المظهرية من حزم وعائية من صورة الأشعة المقطعية واحدة من الذرة الساق والأوراق. استناداً إلى سلسلة الصور المقطعية جذر الذرة، نظام معالجة الصور هو إعداد بنجاح لاستخراج الصفات المظهرية ثلاثي الأبعاد للسفن ميتاكسيليم. توفر تقنيات phenotyping المجهري للمواد النباتية استناداً إلى الأشعة السينية الصغرى-CT بآفاق جديدة للقياس الكمي الدقيق والسريع وتحديد حزم وعائية الذرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
أيد هذا البحث الوطني طبيعة العلم مؤسسة في الصين (No.31671577)، العلم والتكنولوجيا الابتكار الخاص البناء يمول البرنامج من بكين أكاديمية الزراعة والغابات Sciences(KJCX20180423)، البحوث برنامج التنمية للصين (2016YFD0300605-01)، ومؤسسة العلوم الطبيعية بكين (5174033)، بكين بعد الدكتوراه بحوث مؤسسة (2016 ZZ-66)، وأكاديمية بكين للزراعة والحراجة العلوم منحة (KJCX20170404)، ( JNKYT201604).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Skyscan 1172 X-ray computed tomography system | Bruker Corporation, Belgium | NA | For CT scanning |
| CO2 critical point drying system (Leica CPD300) | Leica Corporation, Germany | NA | For sample drying |
| Ethanol | Any | NA | For FAA fixation |
| Formaldehyde | Any | NA | For FAA fixation |
| Acetic acid | Any | NA | For FAA fixation |
| Surgical blade | Any | NA | For cutting the sample sgements |
| 3D printer | Makerbot replicator 2, MakerBot Industries, USA | NA | For printing the sample baskets of maize root, stem, and leaf |
| Centrifuge tube | Corning, USA | NA | Place the root, stem, or leaf materials |
| Solid iodine | Any | NA | For sample dyeing |
| SkyScan Nrecon software | SkyScan NRecon, Version: 1.6.9.4, Bruker Corporation, Belgium | NA | For image reconstruction |
| VesselParser software | VesselParser, Version: 3.0, National Engineering Research Center for Information Technology in Agriculture (NERCITA), Beijing, China | NA | Image analysis protocol for single CT image of maize stem or leaf |
| ScanIP | ScanIP, Version: 7.0; Simpleware, Exeter, UK | NA | 3D image processing software |
| Latex gloves | Any | NA | |
| Tweezers | Any | NA |
References
- Lucas, W. J., et al. The plant vascular system: evolution, development and functions. Journal of Integrative Plant Biology. 55, 294-388 (2013).
- Gou, L., et al. Effect of population density on stalk lodging resistant mechanism and agronomic characteristics of maize. Acta Agronomica Sinia. 33, 1688-1695 (2007).
- Hu, H., et al. QTL mapping of stalk bending strength in a recombinant inbred line maize population. Theoretical and Applied Genetics. 126, 2257-2266 (2013).
- Wilson, J. R., Mertens, D. R., Hatfield, R. D. Isolates of cell types from sorghum stems: Digestion, cell wall and anatomical characteristics. Journal of the Science of Food and Agriculture. 63, 407-417 (1993).
- Hatfield, R., Wilson, J., Mertens, D. Composition of cell walls isolated from cell types of grain sorghum stems. Journal of the Science of Food and Agriculture. 79, 891-899 (1999).
- Du, J., et al. Micron-scale phenotyping quantification and three-dimensional microstructure reconstruction of vascular bundles within maize stems based on micro-CT scanning. Functional Plant Biology. 44 (1), 10-22 (2016).
- Pan, X., et al. Reconstruction of Maize Roots and Quantitative Analysis of Metaxylem Vessels based on X-ray Micro-Computed Tomography. Canadian Journal of Plant Science. 98 (2), 457-466 (2018).
- McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162 (2013).
- Cloetens, P., Mache, R., Schlenker, M., Lerbs-Mache, S. Quantitative phase tomography of Arabidopsis seeds reveals intercellular void network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103, 14626-14630 (2006).
- Dorca-Fornell, C., et al. Increased leaf mesophyll porosity following transient retinoblastoma-related protein silencing is revealed by microcomputed tomography imaging and leads to a system-level physiological response to the altered cell division pattern. Plant Journal. 76 (6), 914-929 (2013).
- Verboven, P., et al. Void space inside the developing seed of Brassica napus and the modelling of its function. New Phytologist. 199, 936-947 (2013).
- Brodersen, C. R., Roark, L. C., Pittermann, J. The physiological implications of primary xylem organization in two ferns. Plant, Cell & Environment. 35, 1898-1911 (2012).
- Choat, B., Brodersen, C. R., McElrone, A. J. Synchrotron X-ray microtomography of xylem embolism in Sequoia sempervirens saplings during cycles of drought and recovery. New Phytologist. 205, 1095-1105 (2015).
- Torres-Ruiz, J. M., et al. Direct x-ray microtomography observation confirms the induction of embolism upon xylem cutting under tension. Plant Physiology. 167, 40-43 (2015).
- Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via. x-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8, 75295 (2013).
- Zhang, Y., Legay, S., Barrière, Y., Méchin, V., Legland, D. Color quantification of stained maize stem section describes lignin spatial distribution within the whole stem. Journal of the Science of Food and Agriculture. 61, 3186-3192 (2013).
- Legland, D., Devaux, M. F., Guillon, F. Statistical mapping of maize bundle intensity at the stem scale using spatial normalisation of replicated images. PLoS One. 9 (3), 90673 (2014).
- Heckwolf, S., Heckwolf, M., Kaeppler, S. M., de Leon, N., Spalding, E. P. Image analysis of anatomical traits in stem transections of maize and other grasses. Plant Methods. 11, 26 (2015).
- Wu, H., Jaeger, M., Wang, M., Li, B., Zhang, B. G. Three-dimensional distribution of vessels, passage cells and lateral roots along the root axis of winter wheat (Triticum aestivum). Annals of Botany. 107, 843-853 (2011).
- Chopin, J., Laga, H., Huang, C. Y., Heuer, S., Miklavcic, S. J. RootAnalyzer: A Cross-Section Image Analysis Tool for Automated Characterization of Root Cells and Tissues. PLoS One. 10, 0137655 (2015).
- Passot, S., et al. Characterization of pearl millet root architecture and anatomy reveals three types of lateral roots. Frontiers in Plant Science. 7, 829 (2016).
