Summary
אנו מספקים שיטה כדי לשפר את הניגודיות הקליטה רנטגן רקמת תירס מתאים סריקת טומוגרפיה microcomputed רגיל. על סמך CT תמונות, אנחנו מציגים את ערכה של זרימות עבודה של עיבוד תמונה עבור חומרים תירס שונים ביעילות לחלץ פנוטיפים מיקרוסקופיים של וסקולריים צרורות של תירס.
Abstract
זה הכרחי לכמת במדויק את מבנים אנטומיים של חומרים תירס מבוסס על טכניקות ניתוח התמונה תפוקה גבוהה. כאן, אנו מספקים "פרוטוקול הכנה מדגם" תירס חומרים (כלומר, גזע, עלים, שורש) מתאים microcomputed רגילים טומוגרפיה (מיקרו-CT) סריקה. על סמך תמונות CT ברזולוציה גבוהה של תירס גזע, עלים, שורש, אנו מתארים שני פרוטוקולים לניתוח פנוטיפי של חבילות עילאיים: (1) על סמך התמונה CT של תירס גזע, עלים, פיתחנו צינור ניתוח תמונה ספציפית באופן אוטומטי לחלץ 31 33 תכונות פנוטיפי של חבילות עילאיים; (2) מבוסס על סדרת תמונות של CT של שורש תירס, אנחנו להגדיר ערכת עיבוד תמונה עבור תלת-ממדי (3-D) חלוקת metaxylem כלי חילוץ דו-ממדית (2-D) ותכונות פנוטיפי תלת-ממדיים, כגון עוצמת, פני שטח של כלי metaxylem, וכו לעומת מדידה ידנית מסורתית של וסקולריים צרורות של חומרים תירס, הפרוטוקולים המוצע באופן משמעותי לשפר את היעילות והדיוק של כימות פנוטיפי בקנה מידה מיקרון.
Introduction
מערכת כלי הדם תירס עובר את הצמח כולו, מן השורש גזע עלים, המהווה את נתיבי תחבורה מרכזיים עבור אספקת מים, חומרים מזינים מינרלים, חומרים אורגניים1. תפקיד חשוב נוסף של מערכת כלי הדם היא לספק תמיכה מכנית של הצמח תירס. לדוגמה, מורפולוגיה, מספר, והפצה של חבילות וסקולריים השורשים, הגבעולים קשורה קשר הדוק ההתנגדות לינה של צמחי תירס2,3. בזמן הנוכחי, מחקרים על המבנה האנטומי של חבילות וסקולריים בעיקר לנצל מיקרוסקופיים וטכניקות ultramicroscopic כדי להציג את מבנה אנטומי של חלק מסויים של גזע, עלים, או שורש, ואז למדוד ואת לספור את המבנים הללו של ריבית על ידי חקירה ידנית. אין ספק, מדידה ידנית של מבנים מיקרוסקופיים שונים ב- microimages בקנה מידה גדול היא עבודה מאוד מייגע ולא יעיל, שמגביל מאד את מידת הדיוק של תכונות microphenotypic, בשל הסובייקטיביות שלה, חוסר עקביות4, 5.
תירס יש אין התפתחות משנית, וכן התוכן מורכב בעיקרו במים meristem הראשי. ללא כל רעלני, טריים דגימות של רקמות תירס ניתן ישירות לסרוק באמצעות מכשיר מיקרו-CT; עם זאת, תוצאות הסריקה הם כנראה עני ומחוספס. הסיבות העיקריות מסוכמים כדלקמן: (1) הנחתה נמוך צפיפות של רקמות הצמח, וכתוצאה מכך ניגוד נמוכה של המספר האטומי ורעש גבוה בתמונות; (2) צמח טרי חומרי נוטים הביתי של הפסיכולוג במהלך הסריקה הסביבה הרגילה, כפי שדווח על ידי Du6. הבעיות הנ ל הפכו האילוצים העיקריים עבור פיתוח, יישום של טכנולוגיה microphenotyping תירס, חיטה, אורז, monocotyledons אחרים. . כאן, אנחנו מציגים את פרוטוקול הכנה דגימה' כדי pretreat את הדגימות של תירס גזע, עלים, שורש. פרוטוקול זה מונע התייבשות של דפורמציה של הצמח חומרים במהלך ה-CT סריקה; לכן, זה מועיל להגדיל את זמן השימור דוגמאות צמחים עם nondeformation. יתר על כן, הצעד צובעת המבוסס על יוד מוצק גם משפר את החדות של הצמח חומרים; לכן, זה גורם שיפורים משמעותיים באיכות הדמיה של מיקרו-טי יתר על כן, פיתחנו תוכנות עיבוד תמונה, בשם VesselParser, כדי לעבד את התמונות CT של תירס גבעולים ועלים. תוכנה זו משלבת סט צינורות עיבוד תמונה לבצע ניתוח phenotyping תפוקה גבוהה, אוטומטי לתמונות CT דו-ממדי של רקמות שונות. חבילות עילאיים, כל חתך הרוחב של גזע תירס, עלה מזוהים, חילוץ, מזוהה באמצעות שיטת עיבוד תמונה אוטומטי. כתוצאה מכך, אנו משיגים 31 פנוטיפים מיקרוסקופיים של הגזע תירס ו ה33 פנוטיפים מיקרוסקופיים של העלה תירס. עבור הסדרה תמונת CT של השורש תירס, פיתחנו ערכת עיבוד תמונה לרכוש תכונות פנוטיפי תלת-ממדי של כלי metaxylem. ערכה זו עדיפה על היעילות של ייבוא תמונות ושיחזור לעומת שיטות מסורתיות.
תוצאות אלה מציינים כי התמונה עיבוד צינורות בהתחשב שמאפייני מיקרו רנטגן רגילים-CT הדמיה מספקות שיטה יעילה עבור phenotyping מיקרוסקופית של חבילות עילאיים; זה מאוד ומצרה את היישומים של CT טכניקות במדעי הצמח ומשפר את phenotyping אוטומטי של צמח חומרי-רזולוציה הסלולר6,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. מדגם הכנת פרוטוקול
- עבור הדגימה, לאסוף את הגזע, עלים, שורש מצמחים תירס טריים, לחלק אותם לשלושה סוגים של קבוצות המדגם (כל קבוצה עם שכפולי ארבע). לאחר מכן, לחתוך אותם לחלקים קטנים באמצעות סכין כירורגית באופן הבא: (1) לחתוך קטע באמצע גזע internode 1-1.5 ס מ אורך; (2) לחתוך קטע הרוחב המרבי של העלה 0.5 - 3 ס מ אורך לאורך הכיוון האנכי עם הווריד הראשי; (3) לחתוך קטע של השורש הכתר 0.5 ס מ אורך.
- עבור הקיבעון FAA, לטבול את מקטעי הדוגמה פתרון FAA (90:5:5 v/v/v, 70% אתנול: 100% פורמלדהיד: 100% חומצה אצטית) לפחות 3 d.
- בצע את ההליך התייבשות שישה רציפים אתנול במעברי צבע (כלומר, 30%, 50%, 70%, 85%, 95% ל- 100%) ולהגדיר את זמן העיבוד של כל צבע אתנול כ 30 דקות.
- מניחים את החומרים צמח הסלים הדגימה המתאימה מיוצרים באמצעות מדפסת תלת-ממדית; לאחר מכן, במהירות העברה הסלים מדגם לתא מדגם של2 CO נקודה קריטית מערכת ייבוש. הגדר את פרמטרי ייבוש כדלקמן:
(1) CO2 ב: מהיר מהירות. בעל מילוי: 100%.
(2) תשלום: CO2 תשלום עיכוב 120 s לתוך המחזור. להחליף מהירות: 5. מחזור מספר: 12.
(3) גז החוצה: חום, מהר. מהירות: איטי, 50%.- על פי ההבדלים מורפולוגי של שורש תירס, גזע, עלים, סלים מדגם עיצוב, הדפסה באמצעות מדפסת תלת-ממדי (למשל, איור 1).
- מקם את החומרים צמחים מיובשים (שורש תירס, גזע או עלה) שפופרת צנטרפוגה 50-mL עם דור 2 של יוד מוצק כדי לצבוע את החומרים צמח עם אדים נדיפים יוד, אז, במקום הצינורות בחדר lightproof 4-5 שעות.
2. מיקרו-CT פרוטוקול סריקה
- כדי לסרוק לתוך הנתונים הגולמיים CT, הגדרת ה-CT סריקה פרמטרים כדלקמן: µA 40 kV/250 (עבור גזע, עלים) או 34 µA kV/210 (של הבסיס). הגדר המתאימה סריקה טווחים בגדלים שונים, אמצעי האחסון של החומרים צמח בהם ולאחר להתאים את גודל פיקסל הדמיה כדלקמן: 2.0 מיקרומטר (עבור בסיס תירס) מיקרומטר 6.77 (עבור הגזע תירס), 10.0 מיקרומטר (עבור עלה תירס).
- כדי לשחזר תמונות פרוסה, להמיר CT הנתונים הגולמיים לתוך CT פרוסה תמונות ברזולוציה 2K (2,000 x 2,000 פיקסלים) באמצעות תוכנה שחזור התמונה. פרטים נוספים ניתנים במדריך למשתמש NRecon (http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf).
3. התמונה פרוטוקול ניתוח עבור תמונת CT יחיד של גזע תירס או עלה
הערה: השתמש אוטומטית תוכנות הדמיה וסקולריים חבילות לערוך ניתוח phenotyping של חבילות וסקולריים בתוך הדימויים פרוסה CT של תירס הגבעול, העלים (איור 2). השלבים השימוש בתוכנה מתוארים כדלקמן.
- למנות את סוג האיבר לאתחל את צינורות אלגוריתם שונה. לחץ על לחצן פרמטרים של פעולות שירות ובחר גזע תירס או עלה תירס בתיבה הנפתחת הראשונה.
- כדי לייבא את התמונות, לחץ על לחצן ניהול נתונים , הגדר את ספריית עבודה וייבוא אוטומטית כל פרוסה תמונות בספריה זו. בחר תמונות בודדות או פרוסה רב לתוך הצינורות התמונה.
- לקבוע את גודל פיקסל בפועל של התמונה. לחץ על לחצן פרמטרים של פעולות שירות והזן את גודל פיקסל בפועל של התמונה בתוך הפריט ערוך של גודל פיקסל.
- עבור חישוב phenotyping, לחץ על לחצן Phenotyping חישוב אוטומטי לחלץ תכונות פנוטיפי של חבילות וסקולריים לכל התמונות פרוסה שנבחרו.
- לחץ על לחצן ניתוחים סטטיסטיים פלט התוצאות כתבנית קובץ TXT או CSV.
4. התמונה פרוטוקול ניתוח עבור CT סדרת תמונות של ספריית בסיס תירס
הערה: הסדרה תמונת CT של שורשים תירס מנוצלים כדי לחלץ את מבנה תלת-ממדי של אוניות metaxylem באמצעות תוכנת עיבוד תמונה. השלבים העיקריים הם כדלהלן.
- לייבא את התמונות המשוחזרת של שורשים תירס (בתבנית קובץ BMP), לקבוע את הפרמטרים מרווח מדויק (גודל voxel [קרי, x, y, z]). השתמש בכלי גאוסיאנית רקורסיבית להחליק את התמונות האלה. כדי לשפר את איכות התמונה.
- התנהלות פילוח תלת-ממדי של כלי metaxylem על-ידי התאמת הפרמטרים הסף; זה יוצר תווית צבע אחיד עבור כל כלי metaxylem מחוברים.
- לשפר ולזהות את כלי metaxylem באופן אינטראקטיבי באמצעות מורפולוגיה, bitwise, ופעולות מבול מילוי.
- לבצע שחזור ויזואליזציה, משטח האחסון של כלי. השתמש בכלי הסטטיסטיקה מסיכה כדי לספור ולמדוד את התכונות פנוטיפי של קיבול של רמות דו-ממדיים ותלת -ממדיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול הכנה מדגם מתאים סריקה מיקרו-CT רגיל לא רק מונעת את דפורמציה של רקמות הצמח אך גם משפר את הניגוד ספיגת קרני רנטגן. צמח pretreated חומרים נסרקים באמצעות מערכת מיקרו-CT לתמונות באיכות גבוהה פרוסה, הרזולוציה הגבוהה ביותר יכול להגיע 2 מיקרומטר לפיקסל. איור 4 מציג את התמונות הסרוקות מיקרו-CT של גזע, עלים, שורש, הניגוד בתמונה יש שיפור משמעותי לעומת התוצאות שנסרקו מחומרים טריים צמח. הדימויים פרוסה CT, הבדלים משמעותיים ברמת אפור ערכים הם מקהים בין חבילות וסקולריים parenchyma תאים, כלי עצה, האפידרמיס, לרקמות אחרות.
מבוסס על תוכנה זו הדמיה עבור חבילות עילאיים, התכונות מבנה והפצה של חבילות וסקולריים בתוך חתך הרוחב של גזע שלם או עלה יכול להיות באופן אוטומטי מנותח, לכמת. קח את התמונה של גבעול תירס כדוגמה, האלגוריתם phenotyping של תוכנה מורכבת חמישה שלבים: קטע התמונה פרוסה, קטע חבילות עילאיים, לנתח את התפוצה המרחבית של חבילות עילאיים, לזהות ולשפר חבילות וסקולריים , מחשב ו פלט את התכונות פנוטיפי של חבילות עילאיים. האזור כולו האפידרמיס בתמונה, ראשית, מקוטע בהתבסס על ערכי הסף מסוימות או גמישים, וניתוח מתאר טכניקות מבוצעות כדי לחלץ את האזור האפידרמיס (איור 3A ו- 3B). בשלב הבא, מתנהלת חלוקת חבילות עילאיים. חבילות וסקולריים מוקפים האפידרמיס; לכן, האזור האפידרמיס עם העובי שהוגדר מראש מוסרת מהתמונה פרוסה. שאר התמונה מורכבת רק vascular bundles פזורים עם עוצמות פיקסלים גבוהה והתאים parenchyma עם עוצמות פיקסל חלשה. לאחר מכן, סגמנטציה המבוסס על ערך הסף קבוע מתבצע כדי לחלץ כל מועמד אזורים של חבילות עילאיים, אזורים אלה נקבעים עוד יותר כמו חבילות וסקולריים חוקי על-פי המגבלות של תכונות שטח של צורה ( איור 3C ותלת מימד).
לאחר חלוקת חבילות עילאיים, מאפייני התפוצה המרחבית של חבילות וסקולריים מחולצים. קח המרכזים גיאומטרי של חבילות וסקולריים פזורים כצמתים כדי ליצור רשתות משולש עבור כל חבילות וסקולריים בתמונה פרוסה, רשתות אלה מקובצים חמישה סוגים על פי אזורים שלהם. האזורים של חבילות וסקולריים להתבטא מגמה יורדת משמעותית מן המרכז אל קצה הגבעול תירס. משולש רשתות Voronoi לתאר את התפוצה המרחבית והקשרים טופולוגי של חבילות עילאיים, ואת כל רשת שינוי מצויר עם צבע ספציפי על פי ממצאי באשכולות חבילות וסקולריים (איור 3E - 3 H). חבילות וסקולריים העונים על האילוצים של התפוצה המרחבית (רשת אזור וצורה הם האינדקסים חשובים כדי לקבוע את הזמינות של צרור וסקולריים) הן שמורות ו השתמש כדי להפיק את התוצאות פילוח הסופי (איור 3אני).
-תכונות האחרונה, פנוטיפי של חבילות עילאיים, כגון הצורה הגיאומטרית,, הפצת מידע, יכול להיות מחושב לפי הבדיקה הנ ל, אשר תוצאות בפלט של קובץ TXT או CSV (איור 3J). מבוסס על תוכנת הדמיה עבור חבילות עילאיים, 31 תכונות פנוטיפי של הגזע ניתן באופן אוטומטי לנתח; חישוב הממוצע עבור כל תמונה CT השעה ~ 30 s. הפרמטרים פנוטיפי היחסי של הגזע מוצגים בטבלה 1. באופן דומה, ניתן לחלץ 33 תכונות פנוטיפי של העלה, הזמן חישוב הממוצע הוא ~ 50 s, וסיווגים פרמטר אלה מוצגות בטבלה מס ' 2. לקבלת רשימה של תמונות פרוסה, הצינורות ניתוח התמונה לעיל משולבים של עיבוד אצווה עבור הפעלה אוטומטית. זרימת עבודה זו יעיל כדי לנתח את התכונות פנוטיפי של כל חבילות וסקולריים בתוך תמונה כל פרוסה של גזע תירס וכן עלה. ראוי לציין, ביותר פנוטיפי התכונות של חבילות עילאיים, כגון שטח, שטח ממוצע וכן יחס שטח של חבילות עילאיים, קשים משמעותית נמדד על פי מדידות ידניות.
כי כלי metaxylem של השורשים תירס הראו שינויים מורפולוגיים ברורים לאורך לכיוון של צמיחה השורש, זה יקר יותר כדי לחלץ את המבנים התלת-ממדי של metaxylem כלי לניתוח פנוטיפי. מבוסס על סדרת תמונות של CT של שורש תירס, פילוח תלת-ממדי, שיקום השטח ואת אמצעי הדמיה מבוצעות. בהתבסס על תוצאות מקוטע, הפרמטרים מבנה תלת-ממדי של metaxylem כלי ניתן באופן אוטומטי לחשב, כולל את אמצעי האחסון, שטח, שטח חתך הרוחב (הבסיס) ואזור חתך הרוחב (דיסטלי) של כלי הכולל metaxylem וכל אחד כלי metaxylem יחיד. זרימת עבודה זו משפרת באופן משמעותי את היעילות של ניתוח תכונה פנוטיפי תלת-ממדי. התוצאות של ויזואליזציה פילוח, שחזור, אחסון ישירות יכול לבוא לידי ביטוי המבנים המרחבי של כלי metaxylem של שורש תירס, כמוצג באיור5.
איור 1 : סוגים שונים של סלים מדגם מודפס עם מדפסת תלת-ממדי. (A ו- B) סל הדגימה ספירלה עבור העלה מורכב עם גרוב אליפסה במרכז (A1) ולהנות (A2) הספירלה שמסביב. רוחב החריץ ספירלה שוכן כ 4 מ"מ כדי להכיל את העלה עם המוביל הארצי. Sidewall של החריץ ספירלה היא בורות ניקוז מרובע שנוצר עם (A5) והחלק התחתון של הסל עם חורי ניקוז עגול (B6). (C ו- D) אלה שני לוחות הצג סל הדגימה ארבע-. טוב מתאים הגזע, עם חורים מדגם (C1) בקוטר של 25 מ מ, והחלק התחתון של הסל עם (D2) שבע לנקז חורים. (E ו- F) אלה שני לוחות הצג סל הדגימה multiwell מתאים השורש, עם (E1) ארבעה חורים עגולים בקוטר של 10 מ"מ באזור מרכזי, ו (E2) 13 חורים עגולים בקוטר של 8 מ מ מסודרים ליד הקצה של הסל. החלק התחתון של הסל לדוגמה יש חורי ניקוז בקוטר של 1 מ מ כדי להבטיח כי רקמת השורש הקטן לא ידלוף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : צילומי מסך של תוכנת הדמיה אוטומטית עבור חבילות עילאיים. (א) לוח זה מראה את ניהול נתונים כדי לייבא תמונות CT כל ספריה קובץ ולבחור תמונות פרוסה CT עיבוד עוקבות. (B) לוח זה מראה את הפרמטרים שיטה כדי לזהות את סוג האיבר CT פרוסה תמונות ולהגדיר את הפרמטרים בשיטה המתאימה. (ג) לוח זה מציג חישוב phenotyping לבצע חישוב אצווה תמונות פרוסה CT ולהראות את התקדמות ביצוע. (ד) לוח זה מציג ניתוח סטטיסטי כדי לאמת את התוצאות חישובית ולהפיק פנוטיפי תכונות לכל התמונות CT. (E) לוח זה מראה את התוצאות חישובית פלט תוצאות הניתוח כקובץ TXT או CVS. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : זרימת העבודה של עיבוד תמונה, phenotyping חישוב המבוסס על תמונות פרוסה CT. (א) ייבוא תמונת CT של הגזע תירס. (B) קטע התמונה פרוסה עם ערך סף קבוע. (ג) תמצית האזור כולו של הגזע תירס. (ד) מחק האזור האפידרמיס של הגזע תירס. (E) רשתות משולש חבילות עילאיים. (F) לוח זה מציג ניתוח האשכולות על פי האזורים של חבילות עילאיים. (G) לוח זה מציג ניתוח האשכולות על פי האזורים רשתות שינוי משולש. (H) לוח זה מציג שניתוח האשכולות על פי האזורים Voronoi רשתות שינוי. (אני) לוח זה מראה את התוצאות הסופיות מקוטע של חבילות עילאיים. (J) לוח זה מראה את התפוצה המרחבית של חבילות עילאיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : Multiplanar שחזור (MPR) תמונות של תירס גזע, עלים, שורש- החלונית השמאלית מציגה תמונה MPR של חתך גזע. הלוח האמצעי מציג תמונה MPR של חתך עלה. הלוח נכון מציג תמונה MPR של חתך רוחב הבסיס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : הדמיה תלת-ממדית של שורש metaxylem כלי. הסורגים = 0.2 מ מ. (A ו- B) מראות אלה ויזואליזציה תלת-ממדי של שורש. (C - F) אלה לוחות הצג פריט חזותי תלת-ממדי של כלי metaxylem. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
טבלה 1: תכונות פנוטיפי מיקרוסקופיים של הגזע תירס.
טבלה 2: תכונות פנוטיפי מיקרוסקופיים של העלה תירס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עם יישום מוצלח של CT טכנולוגיה בתחומים של וההתערבות, הנדסת חומרים, טכנולוגיה זו בהדרגה נכנס בתחומי בוטניקה וחקלאות, קידום מחקרים בתחום מדעי החיים צמח ככלי טכני מבטיח . בשנות ה-90 המאוחרות, טכנולוגיית CT שימש קודם ללמוד את מבנה מורפולוגי והפיתוח של מערכות השורשים של הצמח. בעשור האחרון, סינכרוטרון HRCT הפך להיות כלי רב עוצמה לא הורסות לביולוגים צמח, שימש בהצלחה כדי לזהות את רקמת מבנים של מערכת כלי הדם ענבים8, מבנה רקמות של תודרנית עלה9 , 10ומבנה הזרע של אונס11. דרך סינכרוטרון HRCT, נעשתה התקדמות גדולה, המחקר של מבנה ותפקוד של חבילות וסקולריים צמחים וודי12,13,14. עם זאת, מחקר טכנולוגי HRCT תירס, חיטה, אורז של גידולים נוספים נעשה15. תירס יש אין התפתחות משנית, וכן התא מורכב בעיקרו במים meristem הראשי. אמנם ניתן לסרוק דגימות טריות על ידי מיקרו-CT ללא כל רעלני, תוצאות הסריקה קלושים מאוד. הסיבות העיקריות הן כדלקמן: (1) הנחתה נמוך צפיפות של רקמות הצמח, וכתוצאה מכך ניגוד נמוך במספר האטומי גבוה רעש בתמונות; (2) חומר טרי נוטה הביתי של הפסיכולוג במהלך תקופת סריקה, כפי שדווח על ידי Du6. הסיבות הנ ל הפכו הגורמים העיקריים להגביל היישום של טכנולוגיה זו בתירס, חיטה, אורז, monocotyledons אחרים.
כאן, אנחנו מציגים את פרוטוקול הכנה פשוטים ומעשיים הדגימה לא רק מונעת את דפורמציה של רקמות הצמח, אלא גם משפר את הניגוד ספיגת קרני רנטגן. תמונות CT באיכות גבוהה וברזולוציה של בסיס, גזע, עלים התקבלו בהתבסס על מדגם הכנת פרוטוקול מערכת מיקרו-CT הדמיה, הרזולוציה הגבוהה ביותר היה עד 2 מיקרומטר לפיקסל. לפיכך, פרוטוקול הכנה מדגם מתאים סריקה מיקרו-CT רגיל ומספקת הזדמנות גדולה עבור יישומים רחב יותר monocot, אחרים למדעי הצמח. פרוטוקול זה ניתן לשנות בקלות כדי להכיל חומרים צמח אחרים כמו התייבשות או הליך ייבוש, הגדרת הפרמטר שלה גם להיות מותאם על פי חומרים צמח מסוים לקבלת התוצאות הטובות ביותר. ראוי לציין, גישה זו מוגבל בהתאם לגודלו, נפח של המדגם הצמח. פלח המדגם עבה מדי עלולה להוביל ייבוש חלקיים או דפורמציה של המדגם. לכן, פרוטוקול הכנה מדגם זה הוא ישים חומרים צמח קטן עם עובי של פחות מ 3 ס מ ולא הרבה חומרים תירס גדול כמו אוזן תירס או קלח.
הטכנולוגיה phenotyping מיקרוסקופית של הצמח חומרים הוא אחד הנושאים חם של מחקרים פנוטיפי צמח בשנים האחרונות, זה הופך לאחת מהטכנולוגיות בסיסי תמיכה עבור גנטי פיזיולוגיה של הצמח ובעלת בהדרגה. ניתוח מסורתי מיקרוסקופיים פנוטיפי של צמחים דורש מספר רב של דוגמאות מורכבות ההכנות ותפעול ידני מייגע. זה מאוד שדורשת זמן רב כדי לספור ולמדוד את התכונות מיקרוסקופיים; התוצאות הן גם מועדת לשגיאות סובייקטיבית. לדוגמה, כדי לכמת את מאפייני פנוטיפי של חבילות עילאיים, גבעול תירס, המדגם גזע צריך להיות מוטבע פרפין חתוכים, צבעונית, ואז עם תמונה. עבור תמונת הפרוסה מוכתם, קשה לבצע תמונה אוטומטי עיבוד עקב ההגדרה רב-משמעי של תא לגבולות התא; כך, סגמנטציה וזיהוי ידני הם הכרחית16. כדי לספק את הדרישות של המידות בקנה מידה גדול עבור תכונות אנטומיות של הגזע תירס, Legland ו Heckwolf הציג את שיטות שונות של עיבוד תמונה; עם זאת, המבנים של חבילות וסקולריים בתוך הקליפה הם עדיין17,אתגר18. לפיכך, ניתוח תמונות תפוקה גבוהה, כימות מדויק של תכונות אנטומיות של רקמות תירס נחוצים. כאן, אנו מספקים תוכנת הדמיה אוטומטית עבור חבילות עילאיים, זה יכול באופן אוטומטי לחלץ 31 תכונות פנוטיפי של חבילות וסקולריים ~ 30 s עבור כל תמונה CT של הגזע תירס, תכונות פנוטיפי 33 ~ 50 s עבור כל תמונה CT של העלה תירס. התכונות מבנה והפצה של חבילות וסקולריים בתוך חתך נובעת כולה או עלים יכול להיות באופן אוטומטי מנותח, לכמת. תוכנה זו כוללת את היתרונות הבאים: (1) זה מעבד את התמונות פרוסה CT של גזע תירס, עלה באופן אוטומטי מחלץ את התכונות פנוטיפי של חבילות עילאיים; (2) יש שיעור גבוה יותר זיהוי של חבילות וסקולריים בתמונה CT, במיוחד עבור חבילות קטנות וסקולריים על הקצה; (3) שיטת ניתוח גראפי הרומן משמש כדי לחשוף את מאפייני ההפצה של חבילות עילאיים.
יתר על כן, הטכנולוגיה סריקה של מיקרו-CT רנטגן יש יתרונות ברורים תוך חיסכון של ייבוא תמונות ושיחזור לעומת שיטות שחזור מסורתי המבוסס על פרפין בסעיף תמונות19,20 ,21. מבוסס על סדרת תמונות של CT של שורש תירס, ערכת עיבוד תמונה הוא פותח על מנת לחלץ את המבנים המרחבי של כלי metaxylem ואין להשתמש בהצלחה עבור המידה תלת-ממדי של תכונות מיקרוסקופיות. המגבלה העיקרית של ערכה זו היא כי התוצאות מקוטע תלת-ממדי תלויים אינטראקציה ידנית קלה. בעתיד, אנו שואפים לפתח סט של תוכנות ניתוח תמונה תלת-ממדית אוטומטית ערכת הנתונים CT של שורשים תירס כדי לשפר את היעילות של פילוח תלת-ממדי ושיחזור.
לסיכום, סריקה מיקרו-CT רגילה מבוססת על פרוטוקול הכנה דוגמה מעשית עבור הגזע תירס, עלה, והיא הבסיס נבנה כדי להפיק תמונות CT ברזולוציה גבוהה. פרוטוקול הכנה לדוגמה שסופק כאן לא רק מונע להרכב של רקמות הצמח, אלא גם משפר את הניגוד ספיגת קרני רנטגן. פרוטוקול זה מתאים גם עבור אחרים CT סריקה יישומים חיטה, אורז, ו monocotyledons אחרים. עד כה, פיתחנו תוכנה הדמיה אוטומטיים עבור חבילות עילאיים, כי הוא מסוגל באופן אוטומטי במהירות חילוץ את התכונות פנוטיפי של חבילות וסקולריים תמונה CT אחת של תירס גזע, עלים. מבוסס על סדרת תמונות של CT של השורש תירס, ערכת עיבוד תמונה בהצלחה מוגדר כדי לחלץ את התכונות פנוטיפי תלת-ממדי של כלי metaxylem. טכניקות phenotyping מיקרוסקופית של הצמח חומרים בהתבסס על רנטגן מיקרו-CT מספקים פוטנציאלי חדש כימות מדויק ומהיר וזיהוי של תירס חבילות עילאיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי את הלאומי הטבע מדעי היסוד של סין (No.31671577), המדע, הטכנולוגיה חדשנות מיוחד בניה במימון תוכנית בייג'ינג האקדמיה של החקלאות Sciences(KJCX20180423) יערנות, המחקר תוכנית פיתוח של סין (2016YFD0300605-01), קרן מדעי הטבע בייג'ינג (5174033), בייג'ינג פוסט-דוקטורט מחקר קרן (2016 ZZ-66), ואת האקדמיה החקלאית בייג'ינג יערנות מדעי גרנט (KJCX20170404) ( JNKYT201604).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Skyscan 1172 X-ray computed tomography system | Bruker Corporation, Belgium | NA | For CT scanning |
| CO2 critical point drying system (Leica CPD300) | Leica Corporation, Germany | NA | For sample drying |
| Ethanol | Any | NA | For FAA fixation |
| Formaldehyde | Any | NA | For FAA fixation |
| Acetic acid | Any | NA | For FAA fixation |
| Surgical blade | Any | NA | For cutting the sample sgements |
| 3D printer | Makerbot replicator 2, MakerBot Industries, USA | NA | For printing the sample baskets of maize root, stem, and leaf |
| Centrifuge tube | Corning, USA | NA | Place the root, stem, or leaf materials |
| Solid iodine | Any | NA | For sample dyeing |
| SkyScan Nrecon software | SkyScan NRecon, Version: 1.6.9.4, Bruker Corporation, Belgium | NA | For image reconstruction |
| VesselParser software | VesselParser, Version: 3.0, National Engineering Research Center for Information Technology in Agriculture (NERCITA), Beijing, China | NA | Image analysis protocol for single CT image of maize stem or leaf |
| ScanIP | ScanIP, Version: 7.0; Simpleware, Exeter, UK | NA | 3D image processing software |
| Latex gloves | Any | NA | |
| Tweezers | Any | NA |
References
- Lucas, W. J., et al. The plant vascular system: evolution, development and functions. Journal of Integrative Plant Biology. 55, 294-388 (2013).
- Gou, L., et al. Effect of population density on stalk lodging resistant mechanism and agronomic characteristics of maize. Acta Agronomica Sinia. 33, 1688-1695 (2007).
- Hu, H., et al. QTL mapping of stalk bending strength in a recombinant inbred line maize population. Theoretical and Applied Genetics. 126, 2257-2266 (2013).
- Wilson, J. R., Mertens, D. R., Hatfield, R. D. Isolates of cell types from sorghum stems: Digestion, cell wall and anatomical characteristics. Journal of the Science of Food and Agriculture. 63, 407-417 (1993).
- Hatfield, R., Wilson, J., Mertens, D. Composition of cell walls isolated from cell types of grain sorghum stems. Journal of the Science of Food and Agriculture. 79, 891-899 (1999).
- Du, J., et al. Micron-scale phenotyping quantification and three-dimensional microstructure reconstruction of vascular bundles within maize stems based on micro-CT scanning. Functional Plant Biology. 44 (1), 10-22 (2016).
- Pan, X., et al. Reconstruction of Maize Roots and Quantitative Analysis of Metaxylem Vessels based on X-ray Micro-Computed Tomography. Canadian Journal of Plant Science. 98 (2), 457-466 (2018).
- McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162 (2013).
- Cloetens, P., Mache, R., Schlenker, M., Lerbs-Mache, S. Quantitative phase tomography of Arabidopsis seeds reveals intercellular void network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103, 14626-14630 (2006).
- Dorca-Fornell, C., et al. Increased leaf mesophyll porosity following transient retinoblastoma-related protein silencing is revealed by microcomputed tomography imaging and leads to a system-level physiological response to the altered cell division pattern. Plant Journal. 76 (6), 914-929 (2013).
- Verboven, P., et al. Void space inside the developing seed of Brassica napus and the modelling of its function. New Phytologist. 199, 936-947 (2013).
- Brodersen, C. R., Roark, L. C., Pittermann, J. The physiological implications of primary xylem organization in two ferns. Plant, Cell & Environment. 35, 1898-1911 (2012).
- Choat, B., Brodersen, C. R., McElrone, A. J. Synchrotron X-ray microtomography of xylem embolism in Sequoia sempervirens saplings during cycles of drought and recovery. New Phytologist. 205, 1095-1105 (2015).
- Torres-Ruiz, J. M., et al. Direct x-ray microtomography observation confirms the induction of embolism upon xylem cutting under tension. Plant Physiology. 167, 40-43 (2015).
- Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via. x-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8, 75295 (2013).
- Zhang, Y., Legay, S., Barrière, Y., Méchin, V., Legland, D. Color quantification of stained maize stem section describes lignin spatial distribution within the whole stem. Journal of the Science of Food and Agriculture. 61, 3186-3192 (2013).
- Legland, D., Devaux, M. F., Guillon, F. Statistical mapping of maize bundle intensity at the stem scale using spatial normalisation of replicated images. PLoS One. 9 (3), 90673 (2014).
- Heckwolf, S., Heckwolf, M., Kaeppler, S. M., de Leon, N., Spalding, E. P. Image analysis of anatomical traits in stem transections of maize and other grasses. Plant Methods. 11, 26 (2015).
- Wu, H., Jaeger, M., Wang, M., Li, B., Zhang, B. G. Three-dimensional distribution of vessels, passage cells and lateral roots along the root axis of winter wheat (Triticum aestivum). Annals of Botany. 107, 843-853 (2011).
- Chopin, J., Laga, H., Huang, C. Y., Heuer, S., Miklavcic, S. J. RootAnalyzer: A Cross-Section Image Analysis Tool for Automated Characterization of Root Cells and Tissues. PLoS One. 10, 0137655 (2015).
- Passot, S., et al. Characterization of pearl millet root architecture and anatomy reveals three types of lateral roots. Frontiers in Plant Science. 7, 829 (2016).
