Summary
Wij bieden een nieuwe methode om het contrast X-ray absorptie van maïs weefsel geschikt voor het scannen van gewone microcomputed-tomografie. Op basis van CT-beelden, introduceren we een set van beeldverwerking workflows voor verschillende maïs materialen effectief uitpakken microscopische fenotypes van vaatbundels van maïs.
Abstract
Het is noodzakelijk de anatomische structuren van maïs materialen op basis van hoge-doorvoer afbeelding analysetechnieken nauwkeurig te kwantificeren. Hier, bieden wij een "monster voorbereiding protocol" voor maïs materialen (dat wil zeggen, stengel, blad en wortel) geschikt voor gewone microcomputed tomografie (micro-CT) scannen. Op basis van hoge resolutie CT-beelden van maïs stengel, blad en wortel, beschrijven we twee protocollen voor de fenotypische analyse van vaatbundels: (1) op basis van het beeld van de CT van maïs stengel en blad, ontwikkelden we een bepaalde afbeelding analyse pijpleiding als u wilt automatisch uitpakken 31 en nog 33 fenotypische eigenschappen van vaatbundels; (2) gebaseerd op de CT afbeelding serie van maïs root, we zetten een beeld verwerking ten behoeve van de driedimensionale (3-D) segmentatie van metaxylem schepen, en geëxtraheerd van tweedimensionale (2D) en 3D-fenotypische eigenschappen, zoals volume, oppervlak van metaxylem schepen, enz. Vergeleken met traditionele handmatige meting van vaatbundels van maïs materialen, verbeteren de voorgestelde protocollen aanzienlijk de efficiëntie en nauwkeurigheid van de fenotypische kwantificering micron-schaal.
Introduction
De maïs vasculaire systeem loopt door de gehele installatie, van de wortel en stam naar de bladeren, dat de belangrijkste vervoer paden vormt voor het leveren van water, minerale voedingsstoffen en organische stoffen1. Een andere belangrijke functie van het vaatstelsel is mechanische ondersteuning te bieden voor de maïs plant. Bijvoorbeeld, zijn de morfologie, het aantal en de verdeling van de vaatbundels in wortels en stengels nauw verwant aan de accommodatie weerstand van maïs planten2,3. Op dit moment studie over de anatomische structuur van vaatbundels voornamelijk gebruik maken van microscopische en ultramicroscopic technieken om de anatomische structuren van een bepaald deel van de stengel, blad of wortel, weer te geven en vervolgens meten en tellen deze structuren van belang door handmatige onderzoek. Ongetwijfeld, handmatige meting van verschillende microscopische structuren in grootschalige microimages is een zeer vervelend en inefficiënt werken en ernstig beperkt de precisie van microphenotypic eigenschappen, vanwege haar subjectiviteit en inconsistentie4, 5.
Maïs heeft geen secundaire groei, en de inhoud van de cel bestaat hoofdzakelijk uit water in de primaire meristeem. Zonder enige voorbehandeling, kunnen verse monsters van maïs weefsels worden rechtstreeks gescand met behulp van een micro-CT-apparaat; de scannen resultaten zijn echter waarschijnlijk slechte en ruw. De belangrijkste redenen zijn samengevat als volgt: (1) lage demping dichtheden van plantaardige weefsels, wat resulteert in een laag contrast van atoomnummer en een hoog geluidsniveau in beelden; (2) verse plantaardige materialen zijn gevoelig voor uitdrogen en krimpen tijdens de normale scannen omgeving, zoals gerapporteerd door Du6. De bovengenoemde problemen zijn de belangrijkste beperkingen voor de ontwikkeling en toepassing van microphenotyping technologie voor maïs, tarwe, rijst en andere eenzaadlobbigen geworden. Hier introduceren wij de 'sample voorbereiding protocol' aan de voorbehandeling van de monsters van maïs stengel, blad en wortel. Dit protocol vermijdt de uitdroging en vervorming van plantaardig materiaal tijdens de CT scan; het is dus gunstig voor Verhoog de tijd van bewaring van plant monsters met nondeformation. Bovendien, de verven stap gebaseerd op solide jodium ook verbetert het contrast van plantaardig materiaal; Dus, het maakt aanzienlijke verbeteringen in de grafische kwaliteit van micro-CT. Daarnaast ontwikkelden we beeld processing software, genaamd VesselParser, voor het verwerken van de CT-beelden van maïs stengels en bladeren. Deze software integreert een aantal van de beeldverwerking pijpleidingen naar high-throughput en automatische fenotypering analyses uit te voeren voor 2D-CT afbeeldingen van verschillende plantaardige weefsels. Vaatbundels in de hele doorsnede van de maïs stengel en blad worden gedetecteerd, uitgepakt en geïdentificeerd met behulp van een automatische beeldverwerking methode. Daardoor krijgen we 31 microscopische fenotypes van de maïs stengel en 33 microscopische fenotypes van de maïs blad. Voor de CT afbeelding serie van de maïs root ontwikkelden we een beeld-verwerkende regeling te verwerven van 3D-fenotypische eigenschappen van metaxylem schepen. Deze regeling is superieur in efficiëntie van Beeldacquisitie en wederopbouw in vergelijking met traditionele methoden.
Deze resultaten wijzen erop dat de beeldverwerking pijpleidingen overweegt dat de imaging kenmerken van gewone röntgenfoto micro-CT bieden een effectieve methode voor de microscopische fenotypering van vaatbundels; Dit uiterst verruimt de toepassingen van CT technieken in plantkunde en verbetert de automatische fenotypering van plantaardig materiaal op cellulaire resolutie6,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. steekproef voorbereiding Protocol
- Voor de bemonstering, de stengel, blad, verzamelen en wortel uit verse maïs planten en verdeel ze in drie soorten monster groepen (elke groep met vier replicaties). Vervolgens, snij ze in kleine segmenten met behulp van een chirurgisch mes op de volgende manier: (1) knippen een segment van het midden voort stengellid 1-1,5 cm in lengte; (2) snijd een segment van de maximale breedte van het blad 0,5 - 3 cm in de lengte langs de verticale richting met de belangrijkste ader; (3) Snij een segment van de kroon wortel 0.5 cm in lengte.
- Voor de fixatie van de FAA, geniet u de segmenten van het monster in een FAA-oplossing (90:5:5 v/v/v, 70% ethanol: 100% formaldehyde: 100% azijnzuur) voor ten minste 3 d.
- Voer de procedure uit uitdroging in zes opeenvolgende ethanol verlopen (dat wil zeggen, 30%, 50%, 70%, 85%, 95% en 100%) en stel de verwerkingstijd van het verloop van elke ethanol als 30 min.
- Plaats de plant materialen in de overeenkomstige monster manden vervaardigd met behulp van een 3D-printer; vervolgens Breng snel het monster manden naar de monster-cel van een CO2 kritische-punts drogen systeem. Het drogen parameters als volgt instellen:
(1) CO2 in: snelle snelheid. Houder vulstoffen: 100%.
(2) gratis: CO2 gratis vertraging 120 s in de kringloop. Wisselen van snelheid: 5. cyclus nummer: 12.
(3) gas uit: warmte, snel. Snelheid: traag, 50%.- Volgens de morfologische verschillen van maïs wortel, stam, en blad, design en drukproef manden met behulp van een 3D-printer (bijvoorbeeld, Figuur 1).
- Plaats de gedroogde plant materialen (maïs wortel, stam of blad) in een centrifugebuis van 50 mL met 2 g voor solide iodine kleurstof het plantaardig materiaal met damp van de vluchtige jodium en dan het plaatsen van de buizen in een Svetonepronitsaemyi kamer voor 4-5 h.
2. micro-CT scan Protocol
- Als u wilt scannen in de onbewerkte gegevens van CT, stel de CT Scanparameters als volgt: 40 kV/250 µA (voor stengel en blad) of 34 kV/210 µA (voor root). Stel de corresponderende scannen marges voor de verschillende maten en hoeveelheden van de gebruikte materialen voor de plant en de beeldvorming pixelgrootte als volgt aanpassen: 2,0 µm (voor de maïs root), 6.77 µm (voor de maïs stam) en 10.0 µm (voor de maïs blad).
- Als u wilt reconstrueren segment beelden, de ruwe gegevens van de CT in CT segment beelden met een 2K resolutie (2000 x 2000 pixels) met behulp van een afbeelding wederopbouw software te converteren. Meer details vindt u in de gebruikershandleiding van de NRecon (http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf).
3. image analyse Protocol voor een Single CT-beeld van een maïs stengel of blad
Opmerking: Gebruik automatische denkbaar software voor vaatbundels de fenotypering analyse van vaatbundels binnen de CT segment beelden van de maïs stengel en blad (Figuur 2). De software gebruik stappen zijn als volgt omschreven.
- Het orgel-type voor het initialiseren van verschillende algoritme pijpleidingen te benoemen. Klik op de knop van de parameters van de methode en selecteer maïs stam of maïs blad in de eerste drop-down box.
- Naar de afbeeldingen importeren en klik op Gegevensbeheer , stel de werk map automatisch alle segment afbeeldingen in deze map importeren. Selecteer één of meerdere segment afbeeldingen in de afbeelding pijpleidingen.
- Het bepalen van de werkelijke pixelgrootte van het beeld. Klik op de knop van de parameters van de methode en voer de werkelijke pixelgrootte van het beeld in de punt van het bewerken van de pixelgrootte.
- Voor de berekening van de fenotypering, klikt de fenotypering berekening automatisch uitpakken fenotypische kenmerken van de vaatbundels voor alle geselecteerde segment afbeeldingen.
- Klik op de knop van de statistische analyse om de output van de resultaten als een TXT- of CSV-dossierformaat.
4. afbeelding analyse Protocol voor CT-serie van de afbeelding van een maïs Root
Opmerking: De CT afbeelding serie van maïs wortels worden gebruikt om uit te pakken van de 3D-structuren van metaxylem schepen met behulp van beeld-verwerkende software. De belangrijkste stappen zijn als volgt.
- De gereconstrueerde beelden van maïs wortels (in BMP-bestandsindeling) importeren en bepalen van de nauwkeurige spatiëring parameters (de grootte van een voxel [d.w.z., x, y, z]). De recursieve Gaussian hulpprogramma gebruiken om vlakken van deze beelden om de beeldkwaliteit te verbeteren.
- 3D-segmentatie van metaxylem schepen voeren door het aanpassen van de parameters van de drempel; Dit genereert een uniforme kleurlabel voor elk vaartuig van de aangesloten metaxylem.
- Verbeteren en de metaxylem vaartuigen interactief met behulp van morfologie, bitsgewijze, en de flood-fill operaties te identificeren.
- Volume visualisatie en oppervlak-reconstructie van de schepen voeren. Gebruik het gereedschap Masker statistieken te tellen en meten van de fenotypische kenmerken van een schip in de 2D en 3D-niveaus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het monster voorbereiding protocol geschikt voor gewone micro-CT scanning niet alleen de vervorming van plantaardige weefsels voorkomt maar ook verbetert het contrast van de absorptie X-ray. Voorbehandeld plantaardig materiaal worden gescand met behulp van een micro-CT-systeem in kwalitatief hoogwaardige segment beelden, en de hoogste resolutie kan bereiken 2 µm/pixel. Figuur 4 toont de gescande micro-CT-beelden van de stengel, blad en wortel, en het afbeeldingscontrast heeft een aanzienlijke verbetering vergeleken met de resultaten die zijn gescand uit de verse plantaardige materialen. In deze CT segment beelden zijn aanzienlijke verschillen in grijs-niveau waarden waarneembare onder vaatbundels, parenchym cellen xylem vaartuigen, opperhuid en andere weefsels.
Op basis van deze imaging software voor vaatbundels, kunnen de structuur en distributie kenmerken van vaatbundels binnen de doorsnede van de hele stam of blad worden automatisch geanalyseerd en gekwantificeerd. Het beeld van een maïs stam als voorbeeld nemen, en de fenotypering algoritme van de software bestaat uit vijf stappen: segment van het segment beeld, segment de vaatbundels, analyseren van de ruimtelijke spreiding van de vaatbundels, identificeren en verbeteren van de vaatbundels , en berekenen en output van de fenotypische kenmerken van de vaatbundels. De opperhuid van de hele regio in de afbeelding is, ten eerste, gesegmenteerd op basis van specifieke of adaptieve drempelwaarden en contour analyse technieken worden uitgevoerd om uit te pakken van de opperhuid regio (figuur 3A en 3B). Vervolgens verloopt de segmentatie van de vaatbundels. Vaatbundels zijn omgeven in de epidermis; Dus, de opperhuid regio met de vooraf gedefinieerde dikte wordt verwijderd uit het segment beeld. De rest van de afbeelding bestaat alleen uit verspreide vascular bundles met hoge pixeldichtheid intensiteiten en parenchym cellen met zwakke pixel intensiteiten. Vervolgens de beeldsegmentatie op basis van de vaste drempelwaarde wordt uitgevoerd om uit te pakken van alle kandidaat-regio's van de vaatbundels en deze regio's zijn verder bepaald als geldige vaatbundels volgens de beperkingen van ruimte en vorm functies ( Figuur 3 c en 3D).
Na de segmentatie van de vaatbundels, zijn kenmerken van de ruimtelijke spreiding van de vaatbundels geëxtraheerd. Het geometrische middelpunt van verspreide vaatbundels als knooppunten voor het genereren van Driehoek mazen voor alle vaatbundels in het segment beeld, en deze mazen zijn geclusterd in vijf typen volgens hun gebieden. De gebieden van de vaatbundels manifesteren een significant dalende trend vanuit het midden naar de rand van de maïs stengel. De driehoekige Voronoi mazen beschrijven de ruimtelijke verdeling en topologische Connecties van vaatbundels en elk net wordt getekend met een specifieke kleur volgens de geclusterde resultaten van vaatbundels (3E figuur - 3 H). Vaatbundels die voldoen aan de beperkingen van ruimtelijke verdeling (mesh gebied en vorm zijn de belangrijke indexen om te bepalen van de beschikbaarheid van vascular bundel) zijn gereserveerd en gebruikt voor het genereren van de segmentering van de definitieve resultaten (Figuur 3ik).
Bij laatste, fenotypische eigenschappen van vaatbundels, zoals geometrische, vorm, en verdeling informatie, kan worden berekend volgens de bovenstaande analyse, wat resulteert in de uitvoer van een TXT- of CSV-bestand (Figuur 3J). Gebaseerd op de imaging software voor vaatbundels, kunnen 31 fenotypische eigenschappen van de stengel worden automatisch geanalyseerd; de gemiddelde rekentijd voor elke afbeelding CT is ~ 30 s. De relatieve fenotypische parameters van de stengel zijn vermeld in tabel 1. Evenzo 33 fenotypische kenmerken van het blad kunnen worden gewonnen, de gemiddelde rekentijd is ~ 50 s, en deze parameter classificaties zijn weergegeven in tabel 2. Voor een lijst met afbeeldingen van het segment, zijn de bovenstaande afbeelding analyse pijpleidingen geïntegreerd in een batch-verwerking voor automatische uitvoering. Deze workflow is efficiënt voor het analyseren van de fenotypische kenmerken van alle de vaatbundels binnen een afbeelding van de hele segment van een maïs stengel en blad. Met name zijn meest fenotypische eigenschappen van vaatbundels, zoals de totale oppervlakte, gemiddelde oppervlakte en gebied ratio van vaatbundels, aanzienlijk moeilijk te meten door handmatige metingen.
Omdat de metaxylem schepen van maïs wortels duidelijke morfologische veranderingen in de richting van de wortelgroei tonen, is het waardevoller om uit te pakken van de 3D-structuren van metaxylem schepen voor fenotypische analyse. Gebaseerd op de CT afbeelding serie van maïs root, worden volume visualisatie, 3D-segmentatie en oppervlakte wederopbouw uitgevoerd. Op basis van de gesegmenteerde resultaten, kunnen de 3D-structurele parameters van metaxylem schepen worden automatisch berekend, met inbegrip van het volume, oppervlakte, oppervlakte van de dwarsdoorsnede (basale) en oppervlakte van de dwarsdoorsnede (distale) van de totale metaxylem-schepen en elk enkele metaxylem schip. Deze werkstroom wordt de efficiëntie van 3D-fenotypische trait analyse aanzienlijk verbeterd. De resultaten van segmentatie, wederopbouw en volume visualisatie kunnen rechtstreeks manifesteren de ruimtelijke structuren van metaxylem schepen van maïs root, zoals afgebeeld in Figuur 5.
Figuur 1 : Verschillende soorten manden van de steekproef met een 3D-printer afgedrukt. (A en B) de spiraal monster mand voor het blad is samengesteld met (A1) een centrale ovaal groove en (A2) de omliggende spiraal groove. De breedte van de spiraal groef is ingesteld op ongeveer 4 mm op het blad met de belangrijkste ader. De zijwand van de spiraal groef is gemaakt met (A5) vierkante drainagegaten en de onderkant van de mand met (B6) circulaire afvoer gaten. (C en D) Deze twee panelen tonen een vier-well monster mand geschikt voor de stam, met een diameter van 25 mm, en de onderkant van de mand met (D2) rijggat (C1) monster uit zeven gaten afvoer. (E en F) deze twee panelen een multiwell monster mand geschikt voor de wortel, met (E1) vier ronde gaten met een diameter van 10 mm in de wijk, Toon en (E2) 13 ronde gaten met een diameter van 8 mm gerangschikt in de buurt van de rand van de mand. De onderkant van de mand monster heeft afvoer gaten met een diameter van 1 mm om ervoor te zorgen dat de kleine wortel weefsel niet doet uitlekken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Screenshots van automatische denkbaar software voor vaatbundels. (A) dit paneel toont de gegevensbeheer CT afbeeldingen importeren uit een bestand map en selecteer CT segment afbeeldingen voor de verdere verwerking. (B) dit paneel toont de methodeparameters aangeven welk type orgel CT segment beelden en configureren van de corresponderende methodeparameters. (C) dit paneel toont de fenotypering berekening uit te voeren van de batch berekening van CT segment beelden en weergave van de voortgang van de uitvoering. (D) dit paneel toont de statistische analyse om te controleren de computationele resultaten en fenotypische eigenschappen voor alle CT afbeeldingen genereren. (E) dit paneel toont de computationele resultaten naar uitvoer de analyse resultaten als een TXT- of CVS-bestand. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Workflow van beeldverwerking en fenotypering berekening op basis van CT segment beelden. (A) importeren het imago van de slice CT van de maïs stengel. (B) Segment de afbeelding segment met een vaste drempelwaarde. (C) Extract de hele regio van de maïs stengel. (D) Verwijder de regio van de opperhuid van de maïs stengel. (E) driehoekige netten van vaatbundels. (F) dit paneel toont een clustering analyse volgens de gebieden van de vaatbundels. (G) dit paneel toont een clustering analyse volgens de gebieden van de driehoekige netten. (H) dit paneel toont dat een clustering analyse volgens de gebieden van Voronoi mazen. (ik) dit paneel toont de gesegmenteerde eindresultaten van de vaatbundels. (J) dit paneel toont de ruimtelijke spreiding van de vaatbundels. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Multiplanar wederopbouw (MPR) beelden van de maïs stengel, blad en root. Het linkerpaneel bevat een MPR-afbeelding van een dwarsdoorsnede van de stam. Het middelste deelvenster bevat een afbeelding van de MPR de dwarsdoorsnede van een blad. Het rechterpaneel bevat een afbeelding van de MPR de dwarsdoorsnede van een wortel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : 3D-visualisatie van de wortel metaxylem schepen. De balken = 0,2 mm. (A en B) deze panelen tonen een 3-D visualisatie van een wortel. (C - F) deze panelen tonen een 3-D visualisatie van metaxylem schepen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Tabel 1: Microscopische fenotypische eigenschappen van de maïs stengel.
Tabel 2: Microscopische fenotypische kenmerken van het maïs blad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met de succesvolle toepassing van CT technologie op het gebied van biogeneeskunde en materiaalkunde, is deze technologie geleidelijk ingevoerd in de velden in de botanie en landbouw, bevordering van onderzoek in de biowetenschappen plant als een veelbelovende technisch instrument . In de late jaren 1990, was CT technologie voor het eerst gebruikt om te studeren de morfologische structuren en de ontwikkeling van het wortelstelsel van de planten. In het afgelopen decennium, synchrotron HRCT is een krachtige, niet-destructieve hulpmiddel geworden voor biologen van de plant en is met succes gebruikt voor het identificeren van de weefsel structuren van druif vasculaire systeem8, weefsel structuur van Arabidopsis blad9 , 10en zaad structuur van verkrachting11. Via de synchrotron HRCT, is grote vooruitgang geboekt in de studie van de structuur en functie van de vaatbundels in houtachtige planten12,13,14. Er echter weinig van HRCT technologie voor maïs, tarwe, rijst en andere gewassen is onderzoek gedaan15. Maïs heeft geen secundaire groei, en de cel bestaat hoofdzakelijk uit water in de primaire meristeem. Hoewel vers monsters kunnen worden gescand door micro-CT zonder enige voorbehandeling, zijn de scannen resultaten zeer slecht. De belangrijkste redenen zijn als volgt: (1) lage demping dichtheden van plantaardige weefsels, wat resulteert in een laag contrast in atoomnummer en hoge ruis in beelden; (2) vers materiaal vaak uitdrogen en krimpen tijdens het scannen, zoals gerapporteerd door Du6. De bovengenoemde redenen zijn de belangrijkste factoren beperken de toepassing van deze technologie in maïs, tarwe, rijst en andere eenzaadlobbigen geworden.
Hier introduceren we een eenvoudige en praktische monster voorbereiding protocol dat de vervorming van plantaardige weefsels voorkomt niet alleen maar ook verbetert het contrast van de absorptie X-ray. Hoge kwaliteit en met hoge resolutie CT-beelden van wortel, stengel en blad zijn verkregen op basis van het protocol van de voorbereiding van de steekproef en de micro-CT imaging systeem, en de hoogste resolutie was maximaal 2 µm/pixel. Dus, het monster voorbereiding protocol is geschikt voor gewone micro-CT-scannen en biedt een grote kans voor bredere toepassingen in monocot en andere Plantenwetenschappen. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast zodat andere plantaardig materiaal zoals uitdroging of drogen procedure, en de instelling van de parameter kan ook worden aangepast volgens de specifieke plantaardige materialen voor de beste resultaten. Deze aanpak is met name beperkt door de grootte en de hoeveelheid van het monster van de plant. Een te dik monster segment kan leiden tot onvolledige drogen of vervorming van het monster. Daarom is dit monster voorbereiding protocol van toepassing voor kleine plantaardig materiaal met een dikte van minder dan 3 cm en niet voor veel grotere maïs materialen zoals maïs oor of cob.
De technologie microscopische fenotypering van plantaardig materiaal is één van de hot topics van plant fenotypische studies in de afgelopen jaren, en het wordt stilaan een van de technologieën van de basisondersteuning voor genetische fokken en plantenfysiologie. Traditionele microscopische fenotypische analyse van planten vereist een groot aantal complexe staalvoorbereiding en vervelend handmatige bewerkingen. Het is zeer arbeidsintensief en tijdrovend om te rekenen en meten van de microscopische kenmerken; de resultaten zijn ook subjectieve foutgevoelig. Bijvoorbeeld om te kwantificeren van de fenotypische kenmerken van vaatbundels in een maïs stengel, moet het monster van de stam worden ingesloten in paraffine en vervolgens gesneden, gekleurd, en beeld. Voor een beeld van het gekleurde segment is het moeilijk om uit te voeren een geautomatiseerd beeld processing als gevolg van de onduidelijke definitie van celbegrenzing; handmatige identificatie en segmentatie zijn dus onmisbaar16. Om te voldoen aan de eisen van grootschalige metingen voor anatomische eigenschappen van de maïs stengel, Legland en Heckwolf ingevoerd verschillende beeldverwerking methoden; de structuren van de vaatbundels in de schil zijn echter nog steeds een uitdaging17,18. Vandaar, high-throughput beeldanalyse en nauwkeurige kwantificering van anatomische eigenschappen van maïs weefsels zijn noodzakelijk. Hier, wij voorzien in automatische imagingsoftware vaatbundels, welk annuleerteken automatisch uittreksel 31 fenotypische eigenschappen van vaatbundels in ~ 30 s voor elke afbeelding CT van de maïs stengel en 33 fenotypische kenmerken in ~ 50 s voor elke afbeelding CT van de maïs blad. De kenmerken van het structuur- en distributie van vaatbundels binnen de doorsnede van de hele stengels of bladeren kunnen automatisch worden geanalyseerd en gekwantificeerd. Deze software heeft de volgende voordelen: (1) het automatisch de beelden van de slice CT van de maïs stengel en blad verwerkt en extracten van de fenotypische kenmerken van vaatbundels; (2) het heeft een hoger percentage van de erkenning van de vaatbundels in de CT-beeld, met name voor kleine vaatbundels aan de rand; (3) een nieuwe grafische analyse-methode wordt gebruikt om te onthullen van de kenmerken van de distributie van de vaatbundels.
Verder, de X-ray micro-CT scanning technologie heeft duidelijke voordelen in de efficiëntie van Beeldacquisitie en wederopbouw in vergelijking met traditionele wederopbouw technieken op basis van paraffine sectie beelden19,20 ,21. Gebaseerd op de CT afbeelding serie van maïs root, is een spiegelbeeld-verwerking-regeling ontwikkeld om de ruimtelijke structuur van metaxylem schepen en met succes gebruikt voor de 3D-meting van microscopische kenmerken. De belangrijkste beperking van deze regeling is dat de 3D-gesegmenteerde resultaten afhankelijk is van lichte handmatige interactie. In de toekomst, streven wij naar het ontwikkelen van een set van software van de analyse van de geautomatiseerde 3D-beeld voor de CT-dataset van maïs wortels ter verbetering van de efficiëntie van 3D-segmentatie en wederopbouw.
Kortom, een gewone micro-CT-scanner gebaseerd op een praktische monster voorbereiding protocol voor de maïs stengel, blad, en wortel is gebouwd met een hoge resolutie CT-beelden produceren. Het monster voorbereiding protocol geboden hier voorkomt niet alleen de vervorming van plantaardige weefsels maar ook verbetert het contrast van de absorptie X-ray. Dit protocol is ook geschikt voor andere CT scannen toepassingen in tarwe, rijst en andere eenzaadlobbigen. Tot nu toe hebben we automatische denkbaar software voor vaatbundels, dat kan snel en automatisch de fenotypische kenmerken van vaatbundels wilt uitpakken vanaf een enkel CT-beeld van de maïs stengel en blad. Gebaseerd op de serie afbeelding CT van de maïs root, is een spiegelbeeld-verwerking-regeling met succes ingesteld om uit te pakken van de 3D-fenotypische eigenschappen van metaxylem schepen. Microscopische fenotypering technieken van plantaardig materiaal gebaseerd op de X-ray micro-CT bieden een nieuw perspectief voor de nauwkeurige en snelle kwantificering en identificatie van maïs vaatbundels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door de nationale aard Science Foundation van China (No.31671577), de wetenschap en technologie innovatie speciale bouw gefinancierd programma van Beijing Academie van landbouw en bosbouw Sciences(KJCX20180423), het onderzoek Ontwikkelingsprogramma van China (2016YFD0300605-01), de Beijing Natural Science Foundation (5174033), het Beijing Postdoc Research Foundation (2016 ZZ-66), en de Peking Academie van landbouw en bosbouw wetenschappen Grant (KJCX20170404),) JNKYT201604).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Skyscan 1172 X-ray computed tomography system | Bruker Corporation, Belgium | NA | For CT scanning |
| CO2 critical point drying system (Leica CPD300) | Leica Corporation, Germany | NA | For sample drying |
| Ethanol | Any | NA | For FAA fixation |
| Formaldehyde | Any | NA | For FAA fixation |
| Acetic acid | Any | NA | For FAA fixation |
| Surgical blade | Any | NA | For cutting the sample sgements |
| 3D printer | Makerbot replicator 2, MakerBot Industries, USA | NA | For printing the sample baskets of maize root, stem, and leaf |
| Centrifuge tube | Corning, USA | NA | Place the root, stem, or leaf materials |
| Solid iodine | Any | NA | For sample dyeing |
| SkyScan Nrecon software | SkyScan NRecon, Version: 1.6.9.4, Bruker Corporation, Belgium | NA | For image reconstruction |
| VesselParser software | VesselParser, Version: 3.0, National Engineering Research Center for Information Technology in Agriculture (NERCITA), Beijing, China | NA | Image analysis protocol for single CT image of maize stem or leaf |
| ScanIP | ScanIP, Version: 7.0; Simpleware, Exeter, UK | NA | 3D image processing software |
| Latex gloves | Any | NA | |
| Tweezers | Any | NA |
References
- Lucas, W. J., et al. The plant vascular system: evolution, development and functions. Journal of Integrative Plant Biology. 55, 294-388 (2013).
- Gou, L., et al. Effect of population density on stalk lodging resistant mechanism and agronomic characteristics of maize. Acta Agronomica Sinia. 33, 1688-1695 (2007).
- Hu, H., et al. QTL mapping of stalk bending strength in a recombinant inbred line maize population. Theoretical and Applied Genetics. 126, 2257-2266 (2013).
- Wilson, J. R., Mertens, D. R., Hatfield, R. D. Isolates of cell types from sorghum stems: Digestion, cell wall and anatomical characteristics. Journal of the Science of Food and Agriculture. 63, 407-417 (1993).
- Hatfield, R., Wilson, J., Mertens, D. Composition of cell walls isolated from cell types of grain sorghum stems. Journal of the Science of Food and Agriculture. 79, 891-899 (1999).
- Du, J., et al. Micron-scale phenotyping quantification and three-dimensional microstructure reconstruction of vascular bundles within maize stems based on micro-CT scanning. Functional Plant Biology. 44 (1), 10-22 (2016).
- Pan, X., et al. Reconstruction of Maize Roots and Quantitative Analysis of Metaxylem Vessels based on X-ray Micro-Computed Tomography. Canadian Journal of Plant Science. 98 (2), 457-466 (2018).
- McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162 (2013).
- Cloetens, P., Mache, R., Schlenker, M., Lerbs-Mache, S. Quantitative phase tomography of Arabidopsis seeds reveals intercellular void network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103, 14626-14630 (2006).
- Dorca-Fornell, C., et al. Increased leaf mesophyll porosity following transient retinoblastoma-related protein silencing is revealed by microcomputed tomography imaging and leads to a system-level physiological response to the altered cell division pattern. Plant Journal. 76 (6), 914-929 (2013).
- Verboven, P., et al. Void space inside the developing seed of Brassica napus and the modelling of its function. New Phytologist. 199, 936-947 (2013).
- Brodersen, C. R., Roark, L. C., Pittermann, J. The physiological implications of primary xylem organization in two ferns. Plant, Cell & Environment. 35, 1898-1911 (2012).
- Choat, B., Brodersen, C. R., McElrone, A. J. Synchrotron X-ray microtomography of xylem embolism in Sequoia sempervirens saplings during cycles of drought and recovery. New Phytologist. 205, 1095-1105 (2015).
- Torres-Ruiz, J. M., et al. Direct x-ray microtomography observation confirms the induction of embolism upon xylem cutting under tension. Plant Physiology. 167, 40-43 (2015).
- Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via. x-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8, 75295 (2013).
- Zhang, Y., Legay, S., Barrière, Y., Méchin, V., Legland, D. Color quantification of stained maize stem section describes lignin spatial distribution within the whole stem. Journal of the Science of Food and Agriculture. 61, 3186-3192 (2013).
- Legland, D., Devaux, M. F., Guillon, F. Statistical mapping of maize bundle intensity at the stem scale using spatial normalisation of replicated images. PLoS One. 9 (3), 90673 (2014).
- Heckwolf, S., Heckwolf, M., Kaeppler, S. M., de Leon, N., Spalding, E. P. Image analysis of anatomical traits in stem transections of maize and other grasses. Plant Methods. 11, 26 (2015).
- Wu, H., Jaeger, M., Wang, M., Li, B., Zhang, B. G. Three-dimensional distribution of vessels, passage cells and lateral roots along the root axis of winter wheat (Triticum aestivum). Annals of Botany. 107, 843-853 (2011).
- Chopin, J., Laga, H., Huang, C. Y., Heuer, S., Miklavcic, S. J. RootAnalyzer: A Cross-Section Image Analysis Tool for Automated Characterization of Root Cells and Tissues. PLoS One. 10, 0137655 (2015).
- Passot, S., et al. Characterization of pearl millet root architecture and anatomy reveals three types of lateral roots. Frontiers in Plant Science. 7, 829 (2016).
