Summary
Nós fornecemos um método inovador para melhorar o contraste de absorção de raio-x do milho tecido apropriado para digitalização de tomografia computadorizada de microcomputed comum. Com base em imagens de CT, apresentamos um conjunto de fluxos de trabalho de processamento de imagem para diferentes materiais de milho que efetivamente extrair fenótipos microscópicos de feixes vasculares de milho.
Abstract
É necessário quantificar com precisão as estruturas anatômicas do milho materiais baseados em técnicas de análise de imagem de alta produtividade. Aqui, nós fornecemos um 'protocolo de preparação de amostra' para materiais milho (ou seja, caule, folha e raiz) apropriados para tomografia computadorizada normal microcomputed (micro-CT) digitalização. Com base em imagens de alta resolução do CT de milho caule, folha e raiz, descrevemos dois protocolos para a análise fenotípica de feixes vasculares: (1) com base na imagem CT do milho caule e folha, desenvolvemos um pipeline de análise de imagem específica para extrair automaticamente 31 e 33 características fenotípicas de feixes vasculares; (2) baseado na série de imagem CT da raiz do milho, montamos um esquema de processamento de imagem para a segmentação de tridimensional (3D) dos vasos metaxylem e extraído bidimensional (2D) e a área dos navios de metaxylem, de superfície 3D características fenotípicas, tais como o volume, etc. Os protocolos propostos comparado com medição manual tradicional de feixes vasculares de milho materiais, melhorar significativamente a eficiência e a precisão de quantificação fenotípica mícron-escala.
Introduction
O sistema vascular milho atravessa toda a planta, da raiz e caule para as folhas, que forma os caminhos de transporte chave para o fornecimento de água, nutrientes minerais e substâncias orgânicas1. Outra função importante do sistema vascular é fornecer suporte mecânico para a planta de milho. Por exemplo, a morfologia, número e distribuição dos feixes vasculares em raízes e caules estão intimamente relacionadas à resistência de alojamento de plantas de milho2,3. Actualmente, estudos sobre a estrutura anatômica dos feixes vasculares principalmente utilizam técnicas microscópicas e Ultramicroscópicos para exibir as estruturas anatômicas de uma determinada parte do caule, folha ou raiz e em seguida medem e contam essas estruturas de interesse pela investigação manual. Sem dúvida, medição manual de várias estruturas microscópicas em microimages em grande escala é um trabalho muito tedioso e ineficiente e limita severamente a precisão dos traços microphenotypic, devido a sua subjetividade e inconsistência4, 5.
O milho não tem nenhum crescimento secundário, e o conteúdo da célula consiste essencialmente de água no meristema primário. Sem qualquer tratamento prévio, frescas amostras de tecidos de milho podem ser diretamente digitalizadas usando um dispositivo micro-CT; no entanto, os resultados da verificação são provavelmente pobre e difícil. As principais razões são resumidas como segue: densidades (1) baixa atenuação dos tecidos da planta, resultando em um baixo contraste de número atômico e alto ruído em imagens; (2) materiais vegetais frescos são propensas a desidratar e encolher durante o varredura ambiente normal, conforme relatado por Du6. Os problemas acima referidos tornaram-se as principais restrições para o desenvolvimento e a aplicação da tecnologia de microphenotyping de milho, trigo, arroz e outras monocotiledôneas. Aqui, apresentamos o 'protocolo de preparação de amostra' para o pré-tratamento das amostras de milho caule, folha e raiz. Este protocolo evita a desidratação e deformação de materiais vegetais durante o CT varredura; assim, é benéfico aumentar o tempo de preservação de amostras de plantas com nondeformation. Além disso, a etapa de tingimento com base em iodo sólido também aumenta o contraste dos materiais de planta; assim, faz-se melhorias significativas na qualidade de imagem do micro-CT. Além disso, desenvolvemos o software de processamento de imagem, chamado VesselParser, para processar as imagens de CT de milho caules e folhas. Este software integra um conjunto de condutas de processamento de imagem para executar análise de fenotipagem do elevado-throughput e automático para imagens de CT 2-D de tecidos vegetais diferentes. Feixes vasculares na toda seção transversal do caule de milho e folha são detectados, extraídos e identificado usando um método automático de processamento de imagem. Como resultado, obtemos 31 fenótipos microscópicos da haste milho e 33 fenótipos microscópicos da folha do milho. Para a série de imagem CT da raiz do milho, desenvolvemos um esquema de processamento de imagem para adquirir características fenotípicas 3D dos vasos metaxylem. Este esquema é superior em eficiência de aquisição de imagem e reconstrução em comparação com métodos tradicionais.
Estes resultados indicam que a imagem processamento de dutos, Considerando que as características da imagem latente de micro-CT ordinário do raio-x fornecem um método eficaz para o microscópico fenotipagem de feixes vasculares; isso extremamente amplia as aplicações das técnicas de CT na ciência de planta e melhora a fenotipagem automática de materiais vegetais no celular resolução6,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. protocolo de preparação de amostra
- Para a amostragem, coletar o caule, folha e raiz de plantas de milho frescas e dividi-los em três tipos de grupos de amostra (cada grupo com quatro repetições). Em seguida, cortá-los em pequenos segmentos, usando uma lâmina cirúrgica da seguinte maneira: (1) corte um segmento do meio da haste entrenó 1-1,5 cm de comprimento; (2) cortar um segmento da largura máxima da folha 0.5 - 3 cm de comprimento ao longo da direção vertical com a veia principal; (3) corte um segmento da raiz coroa 0,5 cm de comprimento.
- Para a fixação da FAA, mergulhe os segmentos da amostra em uma solução de FAA (90:5:5 v/v/v, 70% etanol: 100% formaldeído: 100% ácido acético) pelo menos 3 d.
- Execute o procedimento de desidratação em seis gradientes de etanol sequencial (ou seja, 30%, 50%, 70%, 85%, 95% e 100%) e definir o tempo de processamento de cada gradiente de etanol como 30 min.
- Guarde o material de planta nas cestas de amostra correspondente, fabricadas usando uma impressora 3-d; em seguida, rapidamente transferi as cestas de amostra para a célula de amostra de um CO2 ponto crítico sistema de secagem. Defina os parâmetros de secagem da seguinte forma:
(1) CO2 em: velocidade rápida. Enchimentos de titular: 100%.
(2) charge: CO2 carga demora 120 s no ciclo. Troca de velocidade: 5. ciclo número: 12.
(3) gás fora: aquecer, rápido. Velocidade: lento, 50%.- De acordo com as diferenças morfológicas de milho raiz, caule e folha, design e cestas de amostra imprimir usando uma impressora 3D (por exemplo, Figura 1).
- Coloque os materiais de planta seca (milho raiz, caule ou folha) num tubo de centrífuga de 50 mL com 2 g de iodo sólido para tingir os materiais de planta com vapor de iodo voláteis e, em seguida, coloque os tubos num quarto opacos para 4-5 h.
2. micro-CT varredura protocolo
- Para digitalizar para os dados brutos do CT, definir o CT parâmetros de digitalização da seguinte forma: 40 kV/250 µA (para o tronco e folha) ou 34 kV/210 µA (para o root). Definir o correspondente digitalização varia para os diferentes tamanhos e volumes de materiais vegetais utilizados e ajustar o tamanho do pixel da imagem latente da seguinte maneira: 2,0 µm (para a raiz do milho), 6,77 µm (para a haste de milho) e 10,0 µm (para a folha de milho).
- Para reconstruir imagens de fatia, converta os dados de CT brutos em imagens de fatia CT com uma resolução de 2K (2.000 x 2.000 pixels) usando um software de reconstrução de imagem. Mais detalhes são fornecidos no Manual do usuário NRecon (http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf).
3. imagem protocolo de análise para um único CT imagem de um caule de milho ou folha
Nota: Use o software de imagem automático para feixes vasculares para realizar a análise de fenotipagem de feixes vasculares dentro as imagens de fatia CT do milho caule e folha (Figura 2). As etapas de uso de software são descritas como segue.
- Nomear o tipo de órgão para inicializar o algoritmo diferente pipelines. Clique no botão parâmetros de método e selecione haste de milho ou folha de milho na primeira caixa suspensa.
- Para importar as imagens, clique em Gerenciamento de dados , definir o diretório de trabalho e importar automaticamente todas as imagens de fatia neste diretório. Selecione imagens simples ou multi-slice em pipelines a imagem.
- Determine o tamanho real do pixel da imagem. Clique no botão parâmetros de método e digite o tamanho real do pixel da imagem no item de editar o tamanho de pixel.
- Para o cálculo de fenotipagem, clique no botão de cálculo de fenotipagem para extrair automaticamente características fenotípicas dos feixes vasculares para todas as imagens de fatia selecionada.
- Clique no botão de análise estatística para gerar os resultados como um formato de arquivo TXT ou CSV.
4. imagem protocolo de análise para a série de imagem CT de uma raiz de milho
Nota: A série de imagem CT de raízes de milho é utilizada para extrair as estruturas 3-d dos vasos metaxylem, usando o software de processamento de imagem. As etapas principais são as seguintes.
- Importar as imagens reconstruídas de raízes de milho (no formato de arquivo BMP) e determinar os parâmetros exatos de espaçamento (do tamanho de um voxel [ou seja,x, y, z]). Use a ferramenta de Gaussian recursiva para suavizar as imagens para melhorar a qualidade de imagem.
- Conduta em 3D segmentação dos vasos metaxylem, ajustando os parâmetros do limiar; Isso gera uma etiqueta de cor uniforme para cada navio metaxylem conectados.
- Melhorar e identificar os vasos metaxylem interativamente usando morfologia, bit a bit e operações de inundação-preenchimento.
- Realizar a reconstrução de superfície e visualização volume dos vasos. Use a ferramenta de estatísticas de máscara para contar e medir as características fenotípicas de um navio nos níveis de 2-D e 3-d.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O protocolo de preparação de amostra adequado para a digitalização de micro-CT normal não só impede a deformação dos tecidos vegetais, mas também aumenta o contraste de absorção de raios-x. Materiais vegetais pré-tratados são verificados usando um sistema de micro-CT em imagens de alta qualidade fatia, e a maior resolução pode chegar a 2 µm/pixel. A Figura 4 mostra as imagens digitalizadas de micro-CT de caule, folha e raiz, e o contraste da imagem tem uma melhora significativa em comparação com os resultados verificados dos materiais de planta frescos. Nestas imagens de fatia CT, diferenças significativas nos valores de nível de cinza são observáveis entre os feixes vasculares, células do parênquima, vasos de xilema, epiderme e outros tecidos.
Baseia-se este software de imagem para feixes vasculares, as características de estrutura e distribuição dos feixes vasculares, dentro da seção transversal da haste inteira ou folha podem ser automaticamente analisadas e quantificadas. Pegue a imagem de uma haste de milho como um exemplo, e o algoritmo de fenotipagem de software consiste em cinco passos: a imagem da fatia do segmento, os feixes vasculares do segmento, analisar a distribuição espacial dos feixes vasculares, identificar e melhorar os feixes vasculares e calcular e saída as características fenotípicas dos feixes vasculares. A região toda epiderme da imagem é, em primeiro lugar, segmentada com base em valores de limiar adaptativo ou específico e contorno análise técnicas são executadas para extrair a região da epiderme (Figura 3A e 3B). Em seguida, segmentação dos feixes vasculares é conduzida. Feixes vasculares são cercados na epiderme; Portanto, região da epiderme com a espessura predefinida é removida da imagem da fatia. O resto da imagem só consiste vascular bundles dispersas com intensidades pixel alta e células de parênquima com intensidades pixel fraco. Então, a segmentação de imagens baseada no valor limite fixo é executada para extrair todas as regiões de candidato dos feixes vasculares, e estas regiões são ainda mais determinadas como válidos feixes vasculares de acordo com as limitações de recursos da área e forma ( Figura 3 e 3D).
Após a segmentação dos feixes vasculares, características de distribuição espacial dos feixes vasculares são extraídas. Os centros geométricos de dispersas feixes vasculares como nós para gerar malhas de triângulo para todos os feixes vasculares na imagem fatia, e estas malhas são agrupadas em cinco tipos, de acordo com suas áreas. As áreas dos feixes vasculares manifestam uma tendência decrescente significativa do centro para a borda da haste milho. O triangular e malhas de Voronoi descrevem a distribuição espacial e conexões topológicas dos feixes vasculares, e cada malha é desenhada com uma cor específica de acordo com os resultados agrupados de feixes vasculares (Figura 3E - 3 H). Feixes vasculares que atendem as restrições de distribuição espacial (área de malha e forma são os índices importantes para determinar a disponibilidade de feixe vascular) são reservados e usado para gerar os resultados de segmentação final (Figura 3eu).
No passado, fenotípicas características dos feixes vasculares, tais como forma geométrica, e informações de distribuição, pode ser calculado de acordo com a análise acima, o que resulta na saída de um arquivo TXT ou CSV (Figura 3-J). Baseado no software da imagem latente para feixes vasculares, 31 características fenotípicas da haste podem ser automaticamente analisadas; o tempo de computação de médio para cada imagem de CT é ~ 30 s. Os parâmetros fenotípicos relativos da haste são mostrados na tabela 1. Da mesma forma, 33 características fenotípicas da folha podem ser extraídas, o tempo de computação média é 50 ~ s e estas classificações de parâmetro são mostrados na tabela 2. Para obter uma lista de imagens de fatia, os pipelines de análise de imagem acima são integrados em um processamento em lote para execução automática. Este fluxo de trabalho é eficiente para analisar as características fenotípicas de todos os feixes vasculares dentro de uma imagem de fatia inteira de uma haste de milho e folha. Notavelmente, mais fenotípicas características dos feixes vasculares, tais como a área total, área média e proporção de área de feixes vasculares, são significativamente difícil de ser medido por medição manual.
Porque os vasos metaxylem de raízes de milho mostram mudanças morfológicas óbvias na direção do crescimento da raiz, é mais valioso para extrair as estruturas 3-d dos navios de metaxylem para análise fenotípica. Baseado na série de imagem de CT de raiz de milho, segmentação em 3D, reconstrução de superfície e volume de visualização são executadas. Baseado nos resultados segmentados, os parâmetros estruturais 3D dos navios de metaxylem podem ser calculados automaticamente, incluindo volume, superfície, área da seção transversal (basal) e área de seção transversal (distal) dos navios metaxylem total e cada um vaso de metaxylem único. Este fluxo de trabalho melhora significativamente a eficiência de análise 3D característica fenotípica. Os resultados da segmentação, reconstrução e volume de visualização diretamente podem manifestar as estruturas espaciais dos vasos metaxylem de raiz de milho, como mostrado na Figura 5.
Figura 1 : Diferentes tipos de cestas de amostra impresso com uma impressora 3-d. (A e B) a cesta de amostra em espiral para a folha é composta com groove de um oval central (A1) e (A2) a espiral ao redor do sulco. A largura do sulco espiral situa-se em cerca de 4 mm para acomodar a folha com a veia principal. A parede lateral do sulco espiral é orifícios de drenagem quadrado criado com (A5) e o fundo da cesta com furos de dreno circular (B6). (C e D) Estes dois painéis mostram uma cesta de amostra de quatro-bem adequado para o tronco, com buracos de amostra (C1) com um diâmetro de 25 mm e a parte inferior da cesta com (D2), sete drenar buracos. (E e F) esses dois painéis mostram uma cesta de amostra do multiwell apropriado para a raiz, com (E1) quatro orifícios circulares com um diâmetro de 10 mm na área central e (E2) 13 orifícios circulares com um diâmetro de 8 mm arranjado perto da borda da cesta. O fundo do cesto de amostra tem orifícios de descarga com diâmetro de 1 mm para garantir que o tecido de raiz pequena não vazar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Screenshots do software de imagem automático para feixes vasculares. (A), este painel mostra a gestão de dados para importar imagens de CT de qualquer diretório do arquivo e selecionar imagens de fatia CT para o processamento subsequente. (B), este painel mostra os parâmetros de método para identificar o tipo de órgão de imagens de fatia CT e configurar os parâmetros do método correspondente. (C), este painel mostra a computação de fenotipagem para realizar o cálculo do lote de imagens de fatia CT e mostrar o progresso da execução. (D), este painel mostra a análise estatística para verificar os resultados computacionais e gerar características fenotípicas para todas as imagens de CT. (E) este painel mostra os resultados computacionais para a análise de resultados de saída como um arquivo TXT ou CVS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Fluxo de trabalho de processamento de imagem e fenotipagem de computação baseado em imagens de fatia CT. (A) importação a imagem de fatia CT do milho caule. (B) segmento a imagem da fatia com um valor de limite fixo. (C) extrato de toda a região do caule do milho. (D) excluir a região da epiderme do caule milho. (E) malhas Triangular de feixes vasculares. (F), este painel mostra uma análise de cluster, de acordo com as áreas dos feixes vasculares. (G), este painel mostra uma análise de cluster, de acordo com as áreas das malhas triangulares. (H) este painel mostra que uma análise de cluster de acordo com as áreas de Voronoi malhas. (eu) este painel mostra os resultados finais segmentados dos feixes vasculares. (J), este painel mostra a distribuição espacial dos feixes vasculares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Imagens de reconstrução multiplanar (MPR), do milho caule, folha e raiz. O painel esquerdo mostra uma imagem MPR de uma secção do tronco. O painel do meio mostra uma imagem MPR de uma secção de folha. O painel direito mostra uma imagem MPR de uma secção de raiz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Visualização 3D dos navios de raiz metaxylem. As barras = 0,2 mm. (A e B) estes painéis mostram uma visualização em 3D de uma raiz. (C - F) estes painéis mostram uma visualização em 3D dos vasos metaxylem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Microscópicas características fenotípicas da haste milho.
Tabela 2: Microscópicas características fenotípicas de folha do milho.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Com o sucesso da aplicação da tecnologia de CT nos domínios da biomedicina e ciência dos materiais, esta tecnologia foi gradualmente introduzida nos campos da botânica e agricultura, promover pesquisas nas ciências da vida de planta como uma ferramenta técnica promissora . Na década de 1990, a tecnologia de CT foi usada primeiramente para estudar as estruturas morfológicas e desenvolvimento de sistemas de raiz da planta. Na década passada, síncrotron HRCT tornou-se uma ferramenta poderosa, não destrutiva para os biólogos da planta e tem sido usada com sucesso para identificar as estruturas do tecido do sistema vascular uva8, estrutura de tecido de Arabidopsis folha9 , 10e estrutura de sementes de estupro11. Através do síncrotron HRCT, grandes progressos no estudo da estrutura e função dos feixes vasculares em plantas lenhosas12,13,14. No entanto, pesquisa de tecnologia HRCT para milho, trigo, arroz e outras culturas se fez15. O milho não tem nenhum crescimento secundário, e a célula consiste essencialmente de água no meristema primário. Embora amostras frescas podem ser verificadas por micro-CT sem qualquer tratamento prévio, os resultados da verificação são muito pobres. Os principais motivos são os seguintes: densidades (1) baixa atenuação dos tecidos da planta, resultando em um baixo contraste de número atômico e alto ruído em imagens; (2) material fresco tende a desidratar e diminuir durante o período de varredura, conforme relatado por Du6. Pelas razões acima mencionadas tornaram-se os principais fatores que limitam a aplicação desta tecnologia em milho, trigo, arroz e outras monocotiledôneas.
Aqui, apresentamos um protocolo de preparação de amostra simples e prático que não só impede a deformação dos tecidos vegetais, mas também aumenta o contraste de absorção de raios-x. Imagens de CT de alta resolução e alta qualidade de raiz, caule e folhas foram obtidas com base no protocolo de preparação de amostra e sistema de imagens de micro-CT, e a mais alta resolução foi até 2 µm/pixel. Assim, o protocolo de preparação de amostra é adequado para a digitalização de micro-CT normal e oferece uma grande oportunidade para aplicações mais amplas em botânica e outras ciências de planta. Este protocolo pode ser facilmente modificado para acomodar outros materiais vegetais tais como o procedimento de secagem ou desidratação, e sua configuração de parâmetro também pode ser ajustada de acordo com os materiais de planta específica para os melhores resultados. Notavelmente, esta abordagem é limitada pelo tamanho e volume da amostra da planta. Um segmento de amostra muito grosso pode levar a secagem incompleta ou deformação da amostra. Portanto, este protocolo de preparação de amostra é aplicável para materiais de planta pequena com uma espessura inferior a 3 cm e não muito maiores materiais de milho como orelha de milho ou cob.
A tecnologia microscópica fenotipagem de materiais vegetais é um dos tópicos quentes dos estudos fenotípicos de planta nos últimos anos, e aos poucos está se tornando uma das tecnologias de suporte básico para fisiologia genética da criação de animais e plantas. Tradicional análise fenotípica microscópica das plantas requer um grande número de preparações de exemplo complexo e tediosas operações manuais. É muito trabalhosa e demorada de contar e medir as características microscópicas; os resultados também são propensos a erros subjetivos. Por exemplo, para quantificar as características fenotípicas dos feixes vasculares em uma haste de milho, a haste de amostra precisa ser incorporado em parafina e em seguida fatiado, manchado e fotografada. Para uma imagem manchada fatia, é difícil realizar uma imagem automatizada de processamento devido a definição ambígua dos limites da célula; assim, segmentação e identificação manual são indispensáveis16. Para satisfazer os requisitos de medições em grande escala para características anatômicas do milho caule, Legland e Heckwolf introduziram diferentes métodos de processamento de imagem; no entanto, as estruturas dos feixes vasculares na casca ainda são um desafio17,18. Portanto, análise de imagem de alto rendimento e quantificação exacta das características anatômicas dos tecidos de milho são necessários. Aqui, nós fornecemos o software de imagem automático para feixes vasculares, que pode extrair automaticamente 31 características fenotípicas dos feixes vasculares em ~ 30 s para cada imagem de CT da haste de milho e 33 características fenotípicas em ~ 50 s para cada imagem de CT da folha do milho. Os recursos de estrutura e distribuição dos feixes vasculares dentro a secção de todo caules ou folhas podem ser automaticamente analisados e quantificados. Este software tem as seguintes vantagens: (1) automaticamente processa as imagens de fatia CT do milho caule e folha e extrai as características fenotípicas dos feixes vasculares; (2) tem uma maior taxa de reconhecimento de feixes vasculares na imagem CT, especialmente para pequenos feixes vasculares na borda; (3) um método de análise gráfica romance é usado para revelar as características de distribuição de feixes vasculares.
Além disso, a tecnologia de varredura de raio-x micro-CT tem vantagens óbvias nas eficiências de aquisição de imagem e reconstrução em comparação com as técnicas de reconstrução tradicional baseadas em parafina seção fotos19,20 ,21. Baseado na série de imagem de CT de raiz de milho, um esquema de processamento de imagem é desenvolvido para extrair as estruturas espaciais dos vasos metaxylem e utilizado com sucesso para a medição 3D de traços microscópicos. A principal limitação deste regime é que os resultados segmentados em 3D dependem ligeira interação manual. No futuro, pretendemos desenvolver um conjunto de software de análise automatizada de imagem 3-d para o dataset do CT de raízes de milho para melhorar a eficiência da segmentação em 3D e reconstrução.
Em conclusão, uma digitalização de micro-CT normal baseado em um protocolo de preparação de amostra prático para o milho caule, folha, e raiz é construído para produzir imagens de alta resolução do CT. O protocolo de preparação de amostra fornecido aqui não só impede a deformação dos tecidos vegetais, mas também aumenta o contraste de absorção de raios-x. Este protocolo é também adequado para outro CT varredura aplicações em trigo, arroz e outras monocotiledôneas. Até agora, nós desenvolvemos o software de imagem automático para feixes vasculares, que é capaz de automaticamente e rapidamente extrair os traços fenotípicos de feixes vasculares de uma única imagem de CT do milho caule e folha. Baseado na série de imagem de CT da raiz do milho, um esquema de processamento de imagem é com êxito criado para extrair os traços fenotípicos em 3D dos vasos metaxylem. Técnicas microscópicas fenotipagem de materiais vegetais, com base no raio-x micro-CT fornecem uma nova perspectiva para a quantificação exata e rápida e identificação de milho feixes vasculares.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo nacional natureza Science Foundation da China (No.31671577), a ciência e tecnologia inovação especial construção financiados pelo programa de Pequim Academia da agricultura e silvicultura Sciences(KJCX20180423), a pesquisa Programa de desenvolvimento da China (2016YFD0300605-01), a Fundação de ciência Natural de Beijing (5174033), o Beijing pós-doutorado pesquisa Foundation (2016 ZZ-66) e a Academia de Pequim de agrícola e Grant de Ciências Florestais (KJCX20170404) ( JNKYT201604).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Skyscan 1172 X-ray computed tomography system | Bruker Corporation, Belgium | NA | For CT scanning |
| CO2 critical point drying system (Leica CPD300) | Leica Corporation, Germany | NA | For sample drying |
| Ethanol | Any | NA | For FAA fixation |
| Formaldehyde | Any | NA | For FAA fixation |
| Acetic acid | Any | NA | For FAA fixation |
| Surgical blade | Any | NA | For cutting the sample sgements |
| 3D printer | Makerbot replicator 2, MakerBot Industries, USA | NA | For printing the sample baskets of maize root, stem, and leaf |
| Centrifuge tube | Corning, USA | NA | Place the root, stem, or leaf materials |
| Solid iodine | Any | NA | For sample dyeing |
| SkyScan Nrecon software | SkyScan NRecon, Version: 1.6.9.4, Bruker Corporation, Belgium | NA | For image reconstruction |
| VesselParser software | VesselParser, Version: 3.0, National Engineering Research Center for Information Technology in Agriculture (NERCITA), Beijing, China | NA | Image analysis protocol for single CT image of maize stem or leaf |
| ScanIP | ScanIP, Version: 7.0; Simpleware, Exeter, UK | NA | 3D image processing software |
| Latex gloves | Any | NA | |
| Tweezers | Any | NA |
References
- Lucas, W. J., et al. The plant vascular system: evolution, development and functions. Journal of Integrative Plant Biology. 55, 294-388 (2013).
- Gou, L., et al. Effect of population density on stalk lodging resistant mechanism and agronomic characteristics of maize. Acta Agronomica Sinia. 33, 1688-1695 (2007).
- Hu, H., et al. QTL mapping of stalk bending strength in a recombinant inbred line maize population. Theoretical and Applied Genetics. 126, 2257-2266 (2013).
- Wilson, J. R., Mertens, D. R., Hatfield, R. D. Isolates of cell types from sorghum stems: Digestion, cell wall and anatomical characteristics. Journal of the Science of Food and Agriculture. 63, 407-417 (1993).
- Hatfield, R., Wilson, J., Mertens, D. Composition of cell walls isolated from cell types of grain sorghum stems. Journal of the Science of Food and Agriculture. 79, 891-899 (1999).
- Du, J., et al. Micron-scale phenotyping quantification and three-dimensional microstructure reconstruction of vascular bundles within maize stems based on micro-CT scanning. Functional Plant Biology. 44 (1), 10-22 (2016).
- Pan, X., et al. Reconstruction of Maize Roots and Quantitative Analysis of Metaxylem Vessels based on X-ray Micro-Computed Tomography. Canadian Journal of Plant Science. 98 (2), 457-466 (2018).
- McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162 (2013).
- Cloetens, P., Mache, R., Schlenker, M., Lerbs-Mache, S. Quantitative phase tomography of Arabidopsis seeds reveals intercellular void network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103, 14626-14630 (2006).
- Dorca-Fornell, C., et al. Increased leaf mesophyll porosity following transient retinoblastoma-related protein silencing is revealed by microcomputed tomography imaging and leads to a system-level physiological response to the altered cell division pattern. Plant Journal. 76 (6), 914-929 (2013).
- Verboven, P., et al. Void space inside the developing seed of Brassica napus and the modelling of its function. New Phytologist. 199, 936-947 (2013).
- Brodersen, C. R., Roark, L. C., Pittermann, J. The physiological implications of primary xylem organization in two ferns. Plant, Cell & Environment. 35, 1898-1911 (2012).
- Choat, B., Brodersen, C. R., McElrone, A. J. Synchrotron X-ray microtomography of xylem embolism in Sequoia sempervirens saplings during cycles of drought and recovery. New Phytologist. 205, 1095-1105 (2015).
- Torres-Ruiz, J. M., et al. Direct x-ray microtomography observation confirms the induction of embolism upon xylem cutting under tension. Plant Physiology. 167, 40-43 (2015).
- Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via. x-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8, 75295 (2013).
- Zhang, Y., Legay, S., Barrière, Y., Méchin, V., Legland, D. Color quantification of stained maize stem section describes lignin spatial distribution within the whole stem. Journal of the Science of Food and Agriculture. 61, 3186-3192 (2013).
- Legland, D., Devaux, M. F., Guillon, F. Statistical mapping of maize bundle intensity at the stem scale using spatial normalisation of replicated images. PLoS One. 9 (3), 90673 (2014).
- Heckwolf, S., Heckwolf, M., Kaeppler, S. M., de Leon, N., Spalding, E. P. Image analysis of anatomical traits in stem transections of maize and other grasses. Plant Methods. 11, 26 (2015).
- Wu, H., Jaeger, M., Wang, M., Li, B., Zhang, B. G. Three-dimensional distribution of vessels, passage cells and lateral roots along the root axis of winter wheat (Triticum aestivum). Annals of Botany. 107, 843-853 (2011).
- Chopin, J., Laga, H., Huang, C. Y., Heuer, S., Miklavcic, S. J. RootAnalyzer: A Cross-Section Image Analysis Tool for Automated Characterization of Root Cells and Tissues. PLoS One. 10, 0137655 (2015).
- Passot, S., et al. Characterization of pearl millet root architecture and anatomy reveals three types of lateral roots. Frontiers in Plant Science. 7, 829 (2016).
