Summary
普通マイクロ断層レントゲン写真撮影スキャンに適したトウモロコシ組織の x 線吸収コントラストを改善する新たな方法を提供します。CT 画像を用いた異材トウモロコシ トウモロコシの維管束の微細な表現を効果的に抽出するための画像処理ワークフローのセットを紹介します。
Abstract
高速画像解析手法に基づくトウモロコシ材料の解剖学的構造を正確に定量化する必要は。ここでは、普通のマイクロ マイクロ CT 検査のスキャンに適したトウモロコシ材料 (すなわち幹、葉および根) の 'サンプル準備のプロトコル' を提供します。トウモロコシの茎、葉および根の高解像度の CT 画像を基に、維管束の表現型解析のための 2 つのプロトコルについて述べる: (1) 31 を自動的に抽出する特定のイメージ解析パイプライン開発したトウモロコシの茎と葉の CT 画像を用いた、・維管束の分化形質を 33(グリシンリッチプロテイン、ボリュームなどの 3-D 形質表面積とグリシンリッチプロテイン、三次元 (3 D) のセグメンテーションのための画像処理手法を設定し、2 次元 (2 D) を抽出 2) トウモロコシ根の CT 画像のシリーズに基づいて、などトウモロコシ材料の維管束の伝統的な手動測定と比べると、提案プロトコルでは効率とミクロン スケール表現型定量の精度大幅向上します。
Introduction
トウモロコシの維管束系を通るルートと水と無機成分と有機物1を提供するため主要な輸送経路を形成する葉を茎から、全体の植物。血管系のもう一つの重要な機能は、トウモロコシの葉の機械サポートを提供することです。たとえば、形態、数、根や茎の維管束の分布はトウモロコシ2,3の耐倒伏性に密接に関連します。現時点では、維管束の解剖学的構造の研究主に茎、葉、またはルートの特定の部分の解剖学的構造を表示する微視的・極微の技術を活用し測定し、カウントのこれらの構造手動調査の関心。確かに、大規模な microimages の様々 な微細構造の手動測定が非常に面倒で非効率的な作業とその主観と矛盾4のための microphenotypic 特性の精度が大幅に制限 5。
トウモロコシに二次成長がなく、セルの内容は基本的に一次分裂組織の水ので構成されています。任意の前処理なしトウモロコシ組織の新鮮なサンプル直接マイクロ CT 装置を使用してスキャンすることができます。ただし、スキャンの結果は、おそらく貧しいとラフです。主な理由は次のとおり: (1) 低減衰原子番号とイメージで高いノイズの低コントラストをもたらす植物組織の密度(2) 新鮮な植物材料は、Du6によって報告されたが脱水し、通常のスキャン環境中に縮小傾向があります。上記問題開発とトウモロコシ、ムギ、米および他の単子葉植物の microphenotyping 技術のアプリケーションの主な制約となっています。'サンプル準備のプロトコル' を紹介ここでは、トウモロコシの茎、葉および根のサンプルを前処理します。このプロトコルは脱水と CT スキャンの中に植物材料の変形を回避できます。したがって、nondeformation による植物試料の保存時間を増やすに有益です。さらに、固体ヨウ素に基づく染色の手順はまた植物材料のコントラストを強調します。従って、それはマイクロ ct 画像の品質で大幅な改善を作るさらに、という名前の VesselParser、トウモロコシの茎や葉の CT 画像を処理する画像処理ソフトウェアを開発しました。このソフトウェアは、異なる植物組織の CT 画像を 2 D の高スループットと自動フェノタイピング分析を実行する画像処理パイプラインのセットを統合します。トウモロコシの茎や葉の全体の断面における維管束が検出され、抽出、画像処理手法を使用して識別されます。その結果、我々 はトウモロコシの茎における微視的表現型 31 とトウモロコシの葉の微細な表現型 33 を取得します。トウモロコシの根の CT 画像シリーズ、グリシンリッチプロテインの 3次元の形質を獲得する画像処理方式を開発しました。この方式は、画像の取得と従来の方法と比較して復興の効率に優れています。
これらの結果は普通 x 線マイクロ CT の撮像特性を維管束の微細な表現の有効な手段を考慮したパイプラインの処理イメージを示すこれは非常に植物科学 CT 技術の応用を広げ、細胞分解能6,7で植物材料の自動の表現を向上します。
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Protocol
1. サンプル準備のプロトコル
- サンプリング、幹、葉、収集し新鮮なトウモロコシからルートし、サンプル グループ (各 4) の 3 種類に分けます。その後、外科ブレードを使用して次のように小さなセグメントにそれらをカット: (1) カット、中間のセグメントの茎の節間 1 〜 1.5 cm の長さ;(2) 葉 0.5 - 主な静脈; を縦方向に長さ 3 cm 最大幅のセグメントをカットします。(3) 長さ 0.5 cm の根のセグメントにカットします。
- FAA 固定のため少なくとも 3 d のため、FAA のソリューション (90:5:5 v/v/v、70% エタノール: 100% ホルムアルデヒド: 100% 酢酸) でセグメントのサンプルを浸します。
- 6 連続エタノール グラデーション (すなわち30%、50%、70%、85%、95%、100%) の退避手順を実行し、30 分として各エタノール グラデーションの処理時間を設定します。
- 3 D プリンターを使用して製造された対応するサンプル バスケットの植物素材を配置します。その後、CO2臨界点乾燥システムのサンプル セルにサンプル バスケットをすばやく転送します。乾燥パラメーターを次のように設定します。
(CO 1)2 : 速い速度。ホルダー フィラー: 100%。
(2) 担当: CO2料金遅延 120 のサイクルに。交換速度: 5 します。 サイクル番号: 12。
(ガス 3): 高速熱します。速度: 遅い 50%。- トウモロコシ根の形態の違いによると、茎し、葉、(例えば図 1) 3次元プリンターを使用してデザインと印刷のサンプル バスケット。
- 揮発性ヨウ素蒸気の植物材料を染めるし、その後、遮光ルーム 4-5 h 用チューブを配置する固体ヨウ素の 2 g を 50 mL の遠心管に乾燥植物材料 (トウモロコシ根や茎、葉) を配置します。
2. マイクロ CT スキャン プロトコル
- 生の CT データをスキャンする設定パラメーターを次のように走査型 CT: (茎、葉) 40 kV/250 μ A または (ルート) のための 34 の kV/210 μ A。対応範囲のサイズが異なると使用される植物材料のボリュームをスキャンして設定し、次のように画像のピクセル サイズを調整する: (トウモロコシの根) の 2.0 μ m、(トウモロコシ茎) の 6.77 μ m、(トウモロコシの葉) の 10.0 μ m。
- スライス画像を再構成するには、画像再構築ソフトウェアを使用して 2 K の解像度 (2,000 × 2,000 ピクセル) の CT スライス画像に raw CT データを変換します。詳細については、NRecon ユーザー マニュアル (http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf) で提供されます。
トウモロコシの茎や葉のシングル CT 画像の画像の分析のプロトコル
注: は、トウモロコシの茎や葉は (図 2) の ct スライス内の維管束の表現分析を実施するのに維管束の自動イメージング ソフトウェアを使用します。ソフトウェアの使用手順は次のとおりです。
- 異なるアルゴリズムのパイプラインを初期化するオルガン型を任命します。メソッドのパラメーター ] ボタンをクリックし、最初のドロップ ダウン ボックスでトウモロコシ茎やトウモロコシの葉を選択します。
- 画像をインポートするには、データ管理ボタンをクリックして作業ディレクトリを設定し、自動的にこのディレクトリ内のすべてのスライス画像をインポートします。画像のパイプラインにシングルまたはマルチ スライス画像を選択します。
- 画像の実際のピクセルのサイズを決定します。メソッドのパラメーターをクリックし、ピクセル サイズの編集項目の画像の実際のピクセル サイズを入力します。
- 表現型解析の計算ですべての選択したスライス画像の維管束の分化形質を自動的に抽出する表現型解析計算ボタンをクリックします。
- Txt ファイルや CSV ファイル形式として結果を出力する統計量の分析ボタンをクリックします。
4 トウモロコシ根の CT 画像シリーズ イメージ分析のプロトコル
注: トウモロコシ根の CT 画像のシリーズ グリシンリッチプロテイン画像処理ソフトウェアを使用しての 3次元構造の抽出に利用されています。主な手順は次のとおりです。
- トウモロコシの根 (BMP ファイル形式) に再建されたイメージをインポートし、正確な間隔パラメーター ([すなわちx、y、z] ボクセルの大きさ) を決定します。再帰的なガウス ツールを使用して、画像の品質を改善するためにこれらの画像を滑らかにします。
- しきい値パラメーターを調整することによってグリシンリッチプロテインの 3次元領域の分割を行うこれは各接続の metaxylem 容器の均一色ラベルを生成します。
- 改善し、対話をビットごと、形態、使用してグリシンリッチプロテインと洪水塗りつぶし操作を識別します。
- 血管ボリューム可視化と表面再構成を行います。マスクの統計ツールを使用して、2 D と 3 D のレベルで容器の形質を測る。
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Representative Results
普通マイクロ CT スキャンに適したサンプル準備のプロトコルは、植物組織の変形を防ぐだけでなく、また x 線吸収コントラストを高めます。高品質スライス画像にマイクロ CT を用いた前処理プラント材料がスキャンされ、最高の解像度は、2 μ m/ピクセルを達することができます。図 4は、幹、葉、根、スキャンしたマイクロ CT 画像を示しています、画像のコントラストが新鮮な植物材料からスキャン結果と比較して有意な改善。これらの CT スライス画像の濃淡値に有意差は維管束、柔細胞、導管、表皮、および他の組織の中で注目すべきです。
維管束のこのイメージング ソフトウェアに基づいて、全体の茎や葉の断面内の維管束の分布と構造機能自動的に解析でき定量化します。例として、トウモロコシの茎のイメージを取るし、ソフトウェアの表現型解析アルゴリズムは、5 つのステップで構成されています: スライス画像をセグメント、セグメントの維管束、維管束の分布を分析、識別、維管束を改善、と計算し、維管束の分化形質を出力します。イメージで全体の表皮は地域は、まず、特定または適応しきい値の値、および表皮地域 (図 3 a 3 b) を抽出する行われて輪郭線解析に基づくセグメント化されました。次に、維管束のセグメンテーションを実施します。維管束に囲まれている表皮;したがって、定義済みの厚さと表皮の地域は、スライス画像から削除されます。画像の残りの部分のみ高輝度と散乱 vascular bundles と弱いピクセル強度の柔細胞で構成されます。維管束のすべての候補領域を抽出する固定しきい値に基づく画像の領域分割を実行し、これらの地域は、さらに面積や形状の機能 (の制限によると有効な維管束として決定されます。図 3と3 D)。
維管束のセグメンテーション後、維管束の分布特性が抽出されます。スライス画像のすべての維管束の三角形メッシュを生成するノードとして散乱の維管束の幾何学的な中心を取るし、これらのメッシュは、分野に応じて 5 種類にクラスター化します。維管束のエリアは、トウモロコシの茎の端に中心から有意な減少傾向をマニフェストします。三角ボロノイ メッシュ分布と維管束のトポロジー接続を記述し、各メッシュは維管束 (図 3E - 3 H) のクラスター化された結果によると特定の色で描画されます。空間分布の制約を満たす維管束 (メッシュ面積と形状が維管束の可用性を判断する重要な指標) が予約され (図 3私) 最終的な結果を生成するために使用します。
幾何学図形などの維管束の最後に、表現型の形質でと分布については、することができます (図 3J) txt ファイルや CSV ファイルの出力の結果上記の分析によると計算します。維管束のイメージング ソフトウェアに基づいて、茎の 31 形質自動的に分析できます。各 CT 画像の平均計算時間は ~ 30 s。茎の相対表現型パラメーターは表 1のとおりです。同様に、葉の 33 の形質を抽出できる、平均計算時間 〜 50 s、およびこれらのパラメーターの分類を表 2に示します。スライス画像の一覧は、バッチ処理の自動実行のために上記の画像解析パイプラインが統合されます。このワークフローは、トウモロコシの茎や葉の全体のスライス イメージ内のすべての維管束の分化形質を分析する効率的です。特に、総面積、平均面積、維管束の面積比などの維管束の最も形質が手動測定によって測定することが著しく困難。
トウモロコシの根グリシンリッチプロテイン根の伸長方向に沿って明白な形態学的変化を示す、グリシンリッチプロテイン表現型解析のための 3次元構造を抽出するより価値のあります。トウモロコシ根の CT 画像のシリーズに基づいて、3-D 分割、表面再構成とボリューム可視化が実行されます。分割の結果に基づいて、グリシンリッチプロテインの 3次元構造パラメーター自動的に計算できるボリューム、表面積、断面積 (基底)、合計グリシンリッチプロテインとそれぞれの断面積 (遠位) など単一 metaxylem 容器。このワークフローは、3次元の表現形質解析の効率を大幅アップします。セグメンテーション、再構成、およびボリューム可視化の結果は、図 5に示すように、トウモロコシの根のグリシンリッチプロテインの空間構造を直接マニフェストができます。
図 1: 3次元プリンターで印刷サンプル バスケットの種類。葉のスパイラル サンプル バスケットが (AとB) で構成されています (A1) 中央の楕円形の溝し、(A2) 周辺のスパイラル溝します。スパイラル溝の幅は、主脈と葉を合わせて約 4 mm に設定されます。スパイラル溝の側壁 (A5) で作成した正方形の排水の穴 (B6) 循環水抜き穴が付いているバスケットの下部です。(CとD)これらの 2 つのパネル表示 4 よくサンプル バスケット、幹に適した 25 mm の直径と (D2) が付いているバスケットの下部 (C1) サンプル穴 7 水抜き穴。これらの 2 つのパネルは中央部に 10 mm の直径を持つ (E1) 4 つの円孔をもつルートに適した multiwell サンプル バスケットを表示 (EおよびF) と (E2) 13 孔配置 8 mm の直径のバスケットの端の近きます。サンプル バスケットの底には、小さな根の組織が漏れないことを確認直径 1 mm の水抜き穴があります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 維管束の自動イメージング ソフトウェアのスクリーン ショットします。(A) このパネルは任意のファイル ディレクトリから CT 画像をインポートし、後続の処理のための CT スライス像を選択データ管理を示します。(B) このパネルは、CT スライス画像の臓器のタイプを識別し、対応するメソッドのパラメーターを構成するメソッドのパラメーターを示しています。(C) このパネルは、CT スライス画像のバッチ処理を実行し、実行の進行状況を示す表現型解析計算を示しています。(D) このパネルでは、計算結果を確認し、すべての CT 画像からの形質を生成する統計的分析を示しています。(E) このパネルには、TXT または CVS ファイルとして出力分析結果に計算結果が表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: CT スライス画像に基づいた画像処理・表現型解析計算のワークフロー 。(A) 輸入トウモロコシの幹の CT スライス像。(B) セグメント固定しきい値とスライス画像。(C) トウモロコシの茎の全体の地域を抽出します。(D) トウモロコシの幹の表皮の領域を削除します。(E) 維管束の三角形メッシュ。(F) このパネルでは、維管束部によるとクラスタ リング解析を示しています。(G) このパネルは、三角形メッシュの面積に従ってクラスタ リング解析を示しています。(H) このパネルは、ボロノイ領域に従ってクラスタ リング解析メッシュを示しています。(私) このパネルは、維管束の最終的なセグメント化された結果を示します。(J) このパネルでは、維管束の分布を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: トウモロコシの茎、葉および根の多断面再構成 (MPR) 画像。左のパネルには、茎の断面の MPR 画像が表示されます。中央のパネルには、葉の断面の MPR 画像が表示されます。右側のパネルは、ルート断面の MPR 画像を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: ルート グリシンリッチプロテインの三次元視覚化します。バー = 0.2 mm. (AとB) これらのパネル表示、ルートの 3次元可視化。(C ・ F) これらのパネル表示グリシンリッチプロテインの 3次元可視化。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
トウモロコシの茎の表 1: 微視的形質。
トウモロコシの葉の表 2: 微視的形質。
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Discussion
この技術生物医学、材料科学の分野で CT 技術の成功のアプリケーション、植物や有望な技術ツールとして植物生命科学研究を推進して、農業の分野に徐々 に導入されています。.1990 年代後半の CT の技術は形態学的構造と植物根系発達の勉強を初めて使われました。過去 10 年間でシンクロトロン HRCT 植物生物学の強力な非破壊のツールとなっている、ブドウの血管システム8の組織構造、シロイヌナズナ葉9の組織構造を識別するために使用されています,10、およびレイプ11の種子構造。シンクロトロン HRCT による構造の研究と維管束植物12,13,14の機能の大きな進歩をしました。ただし、トウモロコシ、小麦、米および他の穀物の HRCT 技術の少し研究は15を行われています。トウモロコシは二次成長を持たず、セルは基本的に一次分裂組織の水ので構成されています。新鮮なサンプルは、任意の前処理なしのマイクロ CT によるスキャンできます、スキャンの結果が非常に悪いです。主な理由は次のとおりです: (1) 低減衰原子番号の低いコントラストとイメージで高いノイズの結果、植物組織の密度(2) 新鮮な材料デュ6によって報告されたが脱水し、スキャンの期間中に縮小傾向にあります。上記の理由からトウモロコシ、小麦、米、その他の単子葉植物におけるこの技術の応用を制限する主な要因となっています。
植物組織の変形を防ぐだけでなく、また x 線吸収コントラストを高める、シンプルで実用的なサンプル準備のプロトコルを紹介します。根、茎、葉の高品質と高解像度の CT 画像がサンプル準備のプロトコルとマイクロ CT イメージング システム、に基づいて得られた、最高の解像度は最大 2 μ m/ピクセル。したがって、サンプル準備のプロトコルは普通マイクロ CT スキャンに適して、単子葉および他の植物科学の広範なアプリケーションのための絶好の機会を提供します。このプロトコルは、脱水や乾燥プロシージャなど他の植物材料に合わせて簡単に変更できる、最高の結果を得るのための特定の植物材料によるとそのパラメーターの設定を調整できます。特に、このアプローチは、サイズと植物サンプルの量によって制限されます。あまりにも厚いサンプル セグメントは、不完全乾燥またはサンプルの変形をもたらすかもしれない。したがって、このサンプル準備のプロトコルは、トウモロコシの耳やコブなど多くの大きいトウモロコシの材料ではなく、厚さが 3 cm 未満の小さな植物材料に適用されます。
植物材料の微視的表現型解析技術は、近年、植物の表現型研究のホットなトピックの 1 つ、それがしだいに遺伝育種、植物生理学の基本的なサポート テクノロジの 1 つになっています。伝統的な顕微鏡による植物の表現型解析には、多数の複雑なサンプル準備と面倒な手動操作が必要です。これは非常に労働集約的な顕微鏡の特徴を測るに時間がかかります結果、主観的なエラーになりやすい。たとえば、トウモロコシの茎の維管束の形質の特徴を定量化する幹サンプルをパラフィンに埋め込まれていると、スライス、ステンド グラス、し、イメージを作成必要があります。ステンド グラスのスライス画像の自動イメージ セルの境界のあいまいな定義のために処理を行うことは困難です。したがって、手動同定とセグメンテーションは、不可欠な16です。トウモロコシの茎の解剖学的特性の大規模な測定の要件を満たすためには、Legland と Heckwolf を導入さまざまな画像処理方法;ただし、皮の維管束の構造がチャレンジ17,18 です。したがって、高速画像解析とトウモロコシの組織の解剖学的特徴の定量の正確さは必要です。ここで、維管束 ~ 30 で維管束の 31 の形質を自動的に抽出することができます、自動イメージング ソフトウェアを提供 s 33 〜 50 特性とトウモロコシの茎の各 CT イメージのトウモロコシの葉の各 CT イメージの s。全体の茎や葉の断面内の維管束の構造と分布の特徴を自動的に分析、定量化することができます。このソフトウェアは、次の利点を持っている: (1) は自動的にトウモロコシの茎や葉の CT スライス像を処理し、維管束の分化形質を抽出(2) は、CT 画像、特にエッジによる小維管束維管束の高い認識率(3) グラフィック解析手法は、維管束の分布特性を明らかにするためです。
さらに、x 線マイクロ CT スキャン技術は、画像集録や復興パラフィン セクション画像19,20 に基づく伝統的な再建法と比較して効率の明白な利点は、21。トウモロコシ根の CT 画像のシリーズに基づいて、画像処理方式はグリシンリッチプロテインの空間構造を抽出するために開発、微視的特性の 3次元計測向け使用です。この方式の主な制限は、3-D の分割結果が若干手作業に依存します。将来は、3次元領域の分割と再構築の効率を改善するためにトウモロコシの根の CT データセットの自動 3次元画像解析ソフトウェアの開発を目指しています。
結論としては、普通のマイクロ CT スキャンのトウモロコシの茎、葉、実用的なサンプル準備のプロトコルに基づいて、高解像度の CT 画像を生成するルートを構築します。ここで提供されるサンプル準備のプロトコルは植物組織の変形を防ぐだけでなく、また x 線吸収コントラストを高めます。このプロトコルは他の CT の小麦、米および他の単子葉植物でアプリケーションに適しても。これまでのところ、維管束の自動的にかつ迅速には、トウモロコシの茎や葉のシングル CT 画像から維管束の分化形質を抽出可能なイメージング ソフトウェアの自動を開発しました。トウモロコシの根の CT 画像のシリーズに基づいて、画像処理方式が正常にセットアップ グリシンリッチプロテイン 3-D の形質を抽出します。X 線マイクロ CT による植物材料の微視的表現型解析技術は、正確かつ迅速な定量化及びトウモロコシの維管束の同定のため新しい見通しを提供します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この研究は、国家自然科学基金、中国の (No.31671577)、科学と技術革新特別建設資金を供給されたプログラムの北京アカデミーの農業と林業 Sciences(KJCX20180423)、研究によって支えられました。ポスドクの北京、北京自然科学基金 (5174033) 中国 (2016YFD0300605-01) の開発プログラム研究財団 (2016 ZZ-66) と北京アカデミー農業と林業科学研究補助金 (KJCX20170404) (JNKYT201604)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Skyscan 1172 X-ray computed tomography system | Bruker Corporation, Belgium | NA | For CT scanning |
| CO2 critical point drying system (Leica CPD300) | Leica Corporation, Germany | NA | For sample drying |
| Ethanol | Any | NA | For FAA fixation |
| Formaldehyde | Any | NA | For FAA fixation |
| Acetic acid | Any | NA | For FAA fixation |
| Surgical blade | Any | NA | For cutting the sample sgements |
| 3D printer | Makerbot replicator 2, MakerBot Industries, USA | NA | For printing the sample baskets of maize root, stem, and leaf |
| Centrifuge tube | Corning, USA | NA | Place the root, stem, or leaf materials |
| Solid iodine | Any | NA | For sample dyeing |
| SkyScan Nrecon software | SkyScan NRecon, Version: 1.6.9.4, Bruker Corporation, Belgium | NA | For image reconstruction |
| VesselParser software | VesselParser, Version: 3.0, National Engineering Research Center for Information Technology in Agriculture (NERCITA), Beijing, China | NA | Image analysis protocol for single CT image of maize stem or leaf |
| ScanIP | ScanIP, Version: 7.0; Simpleware, Exeter, UK | NA | 3D image processing software |
| Latex gloves | Any | NA | |
| Tweezers | Any | NA |
References
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