Summary
우리는 옥수수 조직 일반 microcomputed 단층 촬영 스캐닝 적합의 x 선 흡수 명암을 개선 하기 위해 새로운 방법을 제공 합니다. CT 이미지를 바탕으로, 우리 옥수수의 혈관 번들의 미세한 고기를 효과적으로 추출 하는 다른 옥수수 자료에 대 한 이미지 처리 워크플로 집합을 소개 합니다.
Abstract
그것은 높은 처리량 이미지 분석 기법에 따라 옥수수 자료의 해 부 구조를 정확 하 게 계량 해야 합니다. 여기, 우리는 자료에 대 한 옥수수 (즉, 줄기, 잎, 그리고 루트) 일반 microcomputed 컴퓨터 단층 촬영 (마이크로 CT) 스캔에 적합 '샘플 준비 프로토콜'을 제공 합니다. 옥수수 줄기, 잎, 그리고 뿌리의 고해상도 CT 이미지를 바탕으로, 우리는 혈관 다발의 phenotypic 분석에 대 한 두 개의 프로토콜 설명: (1) 옥수수 줄기와 잎의 CT 이미지를 바탕으로, 우리를 자동으로 추출 31 특정 이미지 분석 파이프라인 개발 그리고 혈관 번들; 33 phenotypic 특성 (2) 옥수수 루트의 CT 이미지 시리즈를 바탕으로, 우리 metaxylem 선박의 3 차원 (3 차원) 세분화에 대 한 이미지 처리 체계를 설정 2 차원 (2 차원)을 추출 하 고 볼륨, 같은 3 차원 phenotypic 특성 metaxylem 혈관의 표면적 등 옥수수 소재의 혈관 번들의 전통적인 수동 측정에 비해, 제안 된 프로토콜은 크게 효율성과 미크론 규모 phenotypic 정량화의 정확도 향상 시킵니다.
Introduction
옥수수 혈관 시스템 루트와 물, 무기물 양분 그리고 유기 물질1을 제공 하기 위한 핵심 교통 경로 형성 하는 잎을 줄기에서 전체 공장을 통해 실행 됩니다. 혈관 시스템의 또 다른 중요 한 기능 옥수수 식물에 대 한 기계적인 지원을 제공 하는 것입니다. 예를 들어 형태, 숫자, 및 뿌리와 줄기에 혈관 번들의 밀접 하 게 관련 있다 옥수수 식물2,3의 숙박 저항. 현재, 혈관 번들의 해 부 구조에 대 한 연구는 줄기, 잎, 또는 특정 부분에의 해 부 구조를 표시 하려면 현미경 및 ultramicroscopic 기술을 주로 활용 다음 측정 고의 이러한 구조 계산 수동 조사 하 여 관심입니다. 의심의 여지가, 대규모 microimages에서 다양 한 미세 구조의 수동 측정 매우 지루한 하 고 비효율적인 일 이며 심각 때문에 주관과 불일치4, microphenotypic 특성의 정밀도 제한 5.
옥수수는 아무 보조 성장 하 고 셀 내용을 근본적으로 이루어져 있다 1 차 분열 조직에 물. 어떤 전처리 없이도 신선한 옥수수 조직 샘플 검사 될 수 있습니다 직접 마이크로 CT 장치;를 사용 하 여 그러나, 검색 결과 아마 가난 하 고 거친. 주된 이유는 다음과 같이 요약 된다: 식물 조직, 원자 번호 및 높은 잡음 이미지;에 낮은 대조의 결과의 (1) 낮은 감쇠 밀도 (2) 신선한 식물 재료 뒤6에서 보고 탈수 일반 검색 환경 중 축소 하는 경향이 있다. 상기 문제 개발 및 옥수수, 밀, 쌀, 그리고 다른 monocotyledons microphenotyping 기술 응용 프로그램에 대 한 주요 제약 되 고 있습니다. 여기, 우리 '샘플 준비 프로토콜' 소개를 옥수수 줄기, 잎, 그리고 뿌리의 샘플을 pretreat. 이 프로토콜을 탈수와 CT 스캔; 동안 식물 재료의 변형 방지 따라서, nondeformation와 공장 샘플의 보존으로 유리 하다. 또한, 고체 요오드에 따라 염색 단계 또한 식물 재료;의 대비를 향상 따라서, 그것은 마이크로-중부의 이미지 품질에 상당한 개선 또한, 우리는 이미지 처리 소프트웨어를, VesselParser, 옥수수 줄기 및 잎의 CT 이미지 처리 라는 개발 했다. 이 소프트웨어는 다른 식물 조직의 2 차원 CT 이미지에 대 한 높은-처리량 및 자동 형질 분석을 수행 하는 이미지 처리 파이프라인의 집합을 통합 합니다. 옥수수 줄기와 잎의 전체 횡단면에 혈관 번들 검색, 추출, 그리고 자동 이미지 처리 방법을 사용 하 여 확인. 결과적으로, 우리 옥수수 잎의 33 미세한 고기 옥수수 줄기의 31 미세한 고기를 얻을. 옥수수 루트의 CT 이미지 시리즈, 우리는 metaxylem 혈관의 3 차원 phenotypic 특색을 취득 하는 이미지 처리 체계를 개발 했다. 이 제도 이미지 수집 및 전통적인 방법에 비해 개조의 효율성에서 우량 하다.
이러한 결과 혈관 번들;의 미세한 형질에 대 한 효과적인 방법을 제공 하는 일반 x 선 마이크로-CT의 영상 특성을 고려 하는 파이프라인을 처리 하는 이미지를 나타냅니다. 이 매우 식물 과학에 있는 CT 기술의 응용 프로그램을 확대 하 고 셀룰러 해상도6,7식물 재료의 자동 형질을 향상 시킵니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 샘플 준비 프로토콜
- 샘플링, 줄기, 잎, 수집 하 고 신선한 옥수수 식물에서 루트 샘플 그룹 (각 그룹 4 복제)의 세 가지 유형으로 나눕니다. 다음, 작은 세그먼트 외과 블레이드를 사용 하 여 다음과 같은 방식으로 그들을 잘라: (1) 컷의 중간 세그먼트 줄기 위치인 1-1.5 c m 길이; (2) 잘라 잎 0.5-주요 정 맥;와 수직 방향 따라 길이 3 cm의 최대 폭의 세그먼트 (3) 길이에서 크라운 루트 0.5 cm의 세그먼트를 잘라.
- 연방 항공국 고정을 위한 샘플 세그먼트 적어도 3 d는 FAA 솔루션 (90:5:5 v/v/v, 70% 에탄올: 100% 포름알데히드: 100% 아세트산) 담근 다.
- 6 연속 에탄올 그라디언트 (즉, 30%, 50%, 70%, 85%, 95%, 100%)에서 탈수 절차를 수행 하 고 각 에탄올 그라데이션 처리 시간 30 분으로 설정.
- 식물 재료; 3 차원 프린터를 사용 하 여 제조 하는 해당 샘플 바구니에 배치 다음, 신속 하 게 공동2 중요 한 포인트 건조 시스템의 샘플 셀에 샘플 바구니 전송. 건조 매개 변수를 다음과 같이 설정:
(1) CO2 : 빠른 속도. 홀더 필러: 100%.
(주기 2) 충전: CO2 충전 지연 120 s. 교환 속도: 5. 번호 주기: 12.
(3) 밖으로 가스: 열, 빨리. 속도: 느린, 50 %입니다.- 에 따르면 옥수수 뿌리, 줄기, 잎, 디자인과 3 차원 프린터 (예를 들어, 그림 1)를 사용 하 여 인쇄 샘플 바구니의 형태학 적 차이.
- 휘발성 요오드 증기와 식물 재료를 염색 하 고, 다음, 4-5 h에 대 한 광선이 방에 튜브 장소를 고체 요오드의 2 세대 원심 분리기 50 mL 튜브에 (옥수수 뿌리, 줄기, 또는 잎) 말린된 식물 재료를 넣습니다.
2. 마이크로-CT 스캐닝 프로토콜
- 원시 CT 데이터를 검색 하려면 다음과 같이 매개 변수를 검사 하는 CT 설정: 40 kV/250 µ A (대 한 줄기와 잎) 또는 34 kV/210 µ A (루트)에 대 한. 다양 한 크기와 사용, 식물 재료의 볼륨에 대 한 범위를 검사 하는 해당 설정 및 이미징 픽셀 크기를 다음과 같이 조정: 2.0 µ m (옥수수 루트에) 대 한, (대 한 옥수수 줄기), 6.77 µ m와 10.0 µ m (옥수수 잎)에 대 한.
- 슬라이스 이미지 재구성, 이미지 복구 소프트웨어를 사용 하 여 2k 해상도 (2000 x 2000 픽셀) CT 조각 심상으로 원시 CT 데이터를 변환. 자세한 내용은 NRecon 사용자 설명서 (http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf)에서 제공 됩니다.
3. 이미지 분석 프로토콜 옥수수 줄기 또는 잎의 단일 CT 이미지에 대 한
참고: 혈관 번들에 대 한 자동 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 옥수수 줄기와 잎 (그림 2)의 CT 슬라이스 이미지 내에서 혈관 번들의 형질 분석. 소프트웨어 사용 단계는 다음과 같이 설명 되어 있습니다.
- 다른 알고리즘 파이프라인을 초기화 하 기관 유형 임명. 메서드 매개 변수 단추를 클릭 하 고 첫 번째 드롭 다운 상자에서 옥수수 줄기 또는 옥수수 잎을 선택 합니다.
- 이미지를 가져오려면 데이터 관리 버튼을 클릭 하 고 작업 디렉터리를 설정 하 고이 디렉터리에서 자동으로 모든 조각 이미지 가져오기. 이미지 파이프라인에 단일 또는 다중 슬라이스 이미지를 선택 합니다.
- 이미지의 실제 픽셀 크기를 결정 합니다. 메서드 매개 변수 단추를 클릭 하 고 픽셀 크기의 편집 항목에서 이미지의 실제 픽셀 크기를 입력 합니다.
- 형질 계산에 대 한 모든 선택한 슬라이스 이미지에 대 한 혈관 뭉치의 phenotypic 특성을 자동으로 추출 하 형질 계산 단추를 클릭 합니다.
- TXT 나 CSV 파일 형식으로 결과 출력 하기 위해 통계 분석 단추를 클릭 합니다.
4. 이미지 분석 프로토콜 옥수수 루트의 CT 이미지 시리즈
참고: 옥수수 뿌리의 CT 이미지 시리즈를 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 metaxylem 혈관의 3 차원 구조를 추출 활용 됩니다. 주요 단계는 다음과 같습니다.
- (BMP 파일 형식)에서 옥수수 뿌리의 복원된 이미지를 가져올 고 정확한 간격 매개 변수 ([즉, x, y, z] 복의 크기)를 결정 합니다. 재귀 가우스 도구를 사용 하 여 이미지 품질을 개선 하기 위해 이러한 이미지를 매끄럽게.
- Metaxylem 혈관의 3 차원 세분화; 임계값 매개 변수를 조정 하 여 실시 이 각 연결 된 metaxylem 선박에 대 한 균일 한 색상 레이블을 생성합니다.
- 개선 하 고 대화형으로 사용 하 여 형태학, 비트, metaxylem 선박 및 홍수 채우기 작업을 식별 합니다.
- 볼륨 시각화와 표면 혈관 재건을 실시 합니다. 마스크 통계 도구를 사용 하 여 계산 하 고 측정 하는 2 차원 및 3 차원 수준에서 선박의 phenotypic 특성.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
샘플 준비 프로토콜 일반 마이크로 CT 스캔에 적합 뿐만 아니라 식물 조직의 변형을 방지 하지만 또한 x 선 흡수 대비를 향상 시킵니다. 청소용된 식물 재료는 마이크로-CT 시스템을 사용 하 여 높은-품질 조각 이미지로 스캔 하 고 높은 해상도 2 µ m/픽셀에 도달할 수 있습니다. 그림 4 는 줄기, 잎, 그리고 뿌리의 스캔된 마이크로-CT 이미지 그리고 이미지 대비는 신선한 공장 설비 재료에서 검색 결과 비해 크게 향상. 이러한 CT 슬라이스 이미지에 회색 수준 값에 중요 한 차이점은 혈관 번들, 실질 세포, xylem 혈관, 표 피, 그리고 다른 조직 사이에서 관찰.
혈관 번들에 대 한이 이미징 소프트웨어를 기반으로 전체 줄기 또는 잎의 횡단면 내 혈관 번들의 구조와 배포 기능 수 있습니다 자동으로 분석 되며 계량. 예를 들어, 옥수수 줄기의 이미지 및 소프트웨어의 형질 알고리즘 5 단계로 구성 됩니다: 슬라이스 이미지 세그먼트, 세그먼트 혈관 번들, 혈관 뭉치의 공간 분포 분석, 식별 및 혈관 번들을 개선 계산 및 출력 관 번들의 phenotypic 특성. 전체 표 피 지역 이미지에, 먼저, 특정 또는 적응형 임계값 및 등고선 분석 기법 (그림 3A 와 3B) 표 피 영역을 수행 됩니다에 따라 세그먼트. 다음으로, 혈관 번들의 세분화 실시 됩니다. 혈관 번들; 표 피에 둘러싸여 있다 따라서, 미리 정의 된 두께와 표 피 지역 슬라이스 이미지에서 제거 됩니다. 이미지의 나머지만 높은 픽셀 농도와 흩어져 vascular bundles 및 약한 픽셀 농도와 실질 세포의 구성 되어 있습니다. 다음, 고정된 임계값 값에 따라 이미지 세분화 혈관 번들의 모든 후보 영역을 추출 하 수행 하 고이 지역 지역 및 모양 기능 ( 의 한계에 따라 유효한 혈관 번들으로 추가 결정 그림 3C 및 3D).
혈관 번들의 세분화, 후 혈관 뭉치의 공간 분포 특성 추출 됩니다. 조각 이미지에서 모든 혈관 번들에 대 한 삼각형 메시를 생성 하는 노드 흩어져 혈관 번들의 기하학적 중심 고 이러한 메시 그들의 지역에 따라 5 종류로 클러스터. 혈관 번들의 지역 명단 옥수수 줄기의 가장자리에 센터에서 상당한 감소 추세. 삼각형 노이 메시 공간 배급 및 혈관 번들의 토폴로지 연결을 설명 하 고 각 메쉬 혈관 번들 (3E 그림 - 3 H)의 클러스터 된 결과 따라 특정 색으로 그려집니다. 공간 배급의 제약 조건을 충족 하는 혈관 다발 (메쉬 영역 및 모양 혈관 번들의 가능성을 확인 하는 중요 한 인덱스는) 예약 되어 있으며 (그림 3나) 최종 세분화 결과 생성 하는 데 사용.
형상, 모양, 같은 혈관 번들의 마지막, phenotypic 특성에 및 유통 정보, TXT 나 CSV 파일 (그림 3J)의 출력에서 위의 분석 계산 될 수 있다. 혈관 번들에 대 한 이미징 소프트웨어를 기반으로 줄기의 31 phenotypic 특성 분석 될 수 있다 자동으로; 각 CT 이미지에 대 한 평균 계산 시간은 ~ 30 s. 줄기의 상대 phenotypic 매개 변수는 표 1에 나와 있습니다. 마찬가지로, 잎의 33 phenotypic 특성 추출 될 수 있다, 평균 계산 시간 ~ 50 s, 및 이러한 매개 변수 분류 표 2에 나와 있습니다. 슬라이스 이미지의 목록에 대 한 위의 이미지 분석 파이프라인 일괄 자동 실행에 대 한 처리에 통합 됩니다. 이 워크플로 옥수수 줄기와 잎의 전체 슬라이스 이미지 내 모든 혈관 번들의 phenotypic 특성 분석 효율적입니다. 특히, 총 면적, 평균 지역 혈관 번들의 용적 률 등 혈관 번들의 가장 phenotypic 특성은 크게 수동 측정에 의해 측정 될 어렵다.
옥수수 뿌리의 metaxylem 배 루트 성장의 방향 따라 명백한 형태학 변화 표시, phenotypic 분석을 위한 metaxylem 혈관의 3 차원 구조를 추출 더 가치가 있다. 옥수수 뿌리의 CT 이미지 시리즈를 바탕으로, 3 차원 세분화, 표면 재건, 그리고 볼륨 시각화 수행 됩니다. 된 결과 바탕으로, metaxylem 혈관의 3 차원 구조 매개 변수 산출 될 수 있다 자동으로, 볼륨, 표면적, 단면적 (기저), 총 metaxylem 선박 및 각의 횡단면 지역 (원심) 등 단일 metaxylem 용기입니다. 이 워크플로 크게 3 차원 phenotypic 특성 분석의 효율성을 향상 시킵니다. 세분화, 재건, 그리고 볼륨 시각화 결과 직접 그림 5에서 같이 옥수수 루트의 metaxylem 혈관의 공간 구조를 나타날 수 있습니다.
그림 1 : 3 차원 프린터와 인쇄 샘플 바구니의 종류. (A 와 B) 나뭇잎의 나선형 샘플 바구니로 구성 되어 있습니다 (A1) 중앙 타원형 오목 하 고 (A2) 주변 나선형 홈. 나선형 홈의 폭 약 4 mm 주요 정 맥으로 잎에 맞게 설정 됩니다. 나선형 홈의 측 벽은 (A5)와 함께 만든된 광장 배수 구멍 (B6) 원형 드레인 구멍을 가진 바구니의 바닥. (C , D) 이 두 패널 표시 4 잘 샘플 바구니는 줄기에 적합 (C1) 샘플 구멍 직경 25 mm와 (D2)와 바구니의 바닥 7 배수 구멍. (E 와 F)이 두 패널 표시 multiwell 샘플 바구니 (E1) 중앙 지역에서 10 mm의 직경을 가진 4 개의 원형 구멍 루트에 대 한 적합 및 (E2) 배열 하는 8 밀리미터의 직경을 가진 13 원형 구멍 근처는 바구니의 가장자리. 샘플 바구니의 바닥 작은 루트 조직 밖으로 누출 되지 않습니다 보장 하기 위해 직경 1 m m의 배수 구멍을 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 혈관 번들에 대 한 자동 이미징 소프트웨어의 스크린샷을. (A)이이 패널 데이터 관리 모든 파일 디렉터리에서 CT 이미지를 가져오고 선택 후속 처리를 위해 코네티컷 슬라이스 이미지를 보여줍니다. (B)이이 패널 CT 슬라이스 이미지의 기관 유형을 식별 하 고 해당 메서드 매개 변수를 구성 하는 메서드 매개 변수를 보여 줍니다. (C)이이 패널 CT 슬라이스 이미지의 일괄 계산을 수행 하 여 실행 진행률 표시 형질 계산을 보여 줍니다. (D)이이 패널 계산 결과 확인 하 고 모든 CT 이미지 phenotypic 특성을 생성 하는 통계 분석을 보여줍니다. (E)이이 패널 TXT 또는 CVS 파일로 출력 분석 결과를 계산 결과 표시 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : CT 슬라이스 이미지를 기반으로 하는 이미지 처리 및 형질 계산의 워크플로. (A) 가져오기 옥수수 줄기의 CT 슬라이스 이미지. (B) 세그먼트 슬라이스 이미지 고정된 임계값 값입니다. (C) 추출 물 옥수수 줄기의 전체 지역. (D) 삭제 옥수수 줄기의 표 피 지역 합니다. (E) 혈관 번들의 삼각형 메시. (F)이이 패널 혈관 번들의 영역에 따라 클러스터링 분석을 보여줍니다. (G)이이 패널은 삼각형 메시의 영역에 따라 클러스터링 분석을 보여줍니다. (H)이이 패널 노이의 영역에 따라 클러스터링 분석 메시 보여줍니다. (나)이이 패널 혈관 번들의 마지막 세그먼트 결과 보여줍니다. (J)이이 패널 혈관 뭉치의 공간 분포를 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 옥수수 줄기, 잎, 그리고 뿌리의 multiplanar 재건 (MPR) 이미지. 왼쪽된 패널 줄기의 횡단면의 MPR 이미지를 보여 줍니다. 중간 패널 잎 횡단면의 MPR 이미지를 보여줍니다. 오른쪽 패널 루트 횡단면의 MPR 이미지를 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 루트 metaxylem 혈관의 3 차원 시각화. 바 = 0.2 m m. (A 와 B)이이 패널 표시 루트의 3 차원 시각화. (C - F)이이 패널 표시 metaxylem 혈관의 3 차원 시각화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
표 1: 옥수수 줄기의 미세한 phenotypic 특성.
표 2: 옥수수 잎의 미세한 phenotypic 특성.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CT 기술 의학 및 재료 과학의 분야에서의 성공적인 응용 프로그램,이 기술은 점차적으로 도입 되었습니다 식물학 및 유망 기술 도구로 식물 생명과학 연구를 추진 하는 농업 분야에 . 1990 년대 후반에, CT 기술 형태학 상 구조 및 식물 뿌리 시스템의 개발 연구에 처음 사용 되었다. 지난 10 년간, 싱크 로트 론 HRCT 식물 생물학을 위한 강력 하 고, 비파괴 도구가 되고있다 그리고 성공적으로 포도 혈관 시스템8의 조직 구조, 애기 잎9 의 조직 구조를 식별 하는 데 사용 되었습니다. , 10, 그리고 강간11의 씨 구조. 싱크 로트 론 HRCT 통해 훌륭한 진행이 했다 구조 연구와 우 디 식물12,,1314혈관 번들의 기능에. 그러나, 옥수수, 밀, 쌀 및 다른 작물에 대 한 HRCT 기술의 약간 연구15를완료 되었습니다. 옥수수는 아무 보조 성장, 그리고 셀 근본적으로 이루어져 있다 1 차 분열 조직에서 물. 비록 신선한 샘플 어떤 전처리 없이도 마이크로-CT에 의해 검색 될 수 있으며, 검색 결과 매우 가난한. 주된 이유는 다음과 같습니다: (1) 낮은 감쇠 밀도 식물 조직, 원자 번호에 낮은 대조 및 높은 잡음 이미지;에 결과의 (뒤6에서 보고 2) 신선한 소재는 탈수 검사 기간 축소 하 경향이 있다. 위에서 언급 한 이유는 옥수수, 밀, 쌀, 그리고 다른 monocotyledons에이 기술의 응용 프로그램을 제한 하는 주요 요인이 되고있다.
여기, 식물 조직의 변형을 방지 뿐만 아니라 또한 x 선 흡수 대조를 강화 하는 간단 하 고 실용적인 샘플 준비 프로토콜을 소개 합니다. 뿌리, 줄기, 잎의 높은 품질과 고해상도 CT 이미지 샘플 준비 프로토콜 및 마이크로 CT 이미징 시스템에 따라 가져온 그리고 최고 해상도 최대 2 µ m/픽셀. 따라서, 샘플 준비 프로토콜 일반 마이크로 CT 스캔에 적합 하 고 monocot 및 다른 식물 과학 분야에서 광범위 한 응용 프로그램에 대 한 좋은 기회를 제공 한다. 이 프로토콜은 탈수 또는 건조 프로시저와 같은 다른 공장 설비 재료에 맞게 쉽게 수정할 수 있습니다 그리고 그것의 매개 변수 설정 또한 최상의 결과 대 한 특정 식물 재료에 따라 조정 될 수 있다. 특히,이 접근은 크기와 공장 샘플의 볼륨에 의해 제한 됩니다. 너무 두꺼운 샘플 세그먼트 불완전 건조 하거나 샘플의 변형이 발생할 수 있습니다. 따라서이 샘플 준비 프로토콜은 두께가 3cm 미만 작은 식물 재료에 대 한 그리고 옥수수 귀 또는 개 암 나무 열매 등 훨씬 더 큰 옥수수 자료 적용 됩니다.
식물 재료의 미세한 형질 기술은 최근 몇 년 동안, 공장 phenotypic 연구의 뜨거운 주제 중 하나 그리고 그것 점차 유전자 번 식과 식물 생리학에 대 한 기본 지원 기술 중 하나. 식물의 전통적인 미세한 phenotypic 분석에는 많은 복잡 한 샘플 준비와 지루한 수동 작업이 필요합니다. 그것은 매우 노동 집약 하 고 계산 하 고 측정 현미경 특성; 소요 결과 주관적 오류 경향이 있습니다. 예를 들어 옥수수 줄기에 혈관 번들의 phenotypic 특성 척도, 줄기 샘플 필요가 수 파라핀에 포함 된 슬라이스, 스테인드, 그리고 몇 군데 있다. 얼룩진된 슬라이스 이미지에 대 한 그것은 자동화 된 이미지 때문에 셀 경계;의 모호한 정의 처리를 수행 하기 어려운 따라서, 수동 신분증 및 세분화 됩니다 필수16. 옥수수 줄기의 해 부 특성에 대 한 대규모 측정의 요구 사항을 충족, Legland 및 Heckwolf 도입 다른 이미지 처리 방법; 그러나, 껍질에 혈관 번들의 구조는 여전히 도전17,18. 따라서, 높은 처리량 이미지 분석 및 옥수수 조직의 해 부 특성의 정확한 정량화 필요 하다. 여기, 우리는 자동으로 ~ 30에 혈관 번들의 31 phenotypic 특성을 추출할 수 있는 혈관 번들에 대 한 자동 이미징 소프트웨어 제공 옥수수 줄기와 ~ 50에서 33 phenotypic 특성의 각 CT 이미지에 대 한 s 옥수수 잎의 각 CT 이미지에 대 한 s. 전체 줄기 또는 잎의 횡단면 내 혈관 번들의 구조와 배포 기능을 자동으로 분석 하 고 계량 될 수 있습니다. 이 소프트웨어는 다음과 같은 이점이 있다: (1) 그것은 자동으로 옥수수 줄기와 잎의 CT 슬라이스 이미지를 처리 하 고 혈관 번들;의 phenotypic 특성 추출 (2) 그것은 특히 가장자리;에 작은 혈관 번들에 대 한 CT 이미지에서 혈관 번들의 높은 인식률 (3)는 새로운 그래픽 분석 방법은 혈관 번들의 배포 특성을 나타내기 위해 사용 됩니다.
또한, x 선 마이크로-CT 스캐닝 기술 장점이 분명 이미지 수집 및 파라핀 섹션 이미지19,20 에 따라 전통적인 재구성 기법에 비해 개조의 효율성에 21. 옥수수 뿌리의 CT 이미지 시리즈를 바탕으로, 이미지 처리 체계 metaxylem 혈관의 공간 구조를 추출 하기 위해 개발 이며 성공적으로 현미경 특성의 3 차원 측정을 위해 사용. 이 계획의 주요 제한은 3 차원 세그먼트 결과 약간의 수동 상호 작용에 따라 달라 집니다입니다. 미래에, 우리는 3 차원 세분화 및 개조의 효율성을 개선 하기 위해 옥수수 뿌리의 CT 데이터 집합에 대 한 자동화 된 3 차원 이미지 분석 소프트웨어의 집합을 개발 하고자 합니다.
결론적으로, 옥수수 줄기, 잎에 대 한 실용적인 샘플 준비 프로토콜에 기반 한 일반 마이크로 CT 스캔 하 고 루트 고해상도 CT 이미지를 생성 하는 생성. 여기에 제공 된 샘플 준비 프로토콜 식물 조직의 변형을 방지 뿐만 아니라 또한 x 선 흡수 대비를 향상 시킵니다. 이 프로토콜은 또한 다른 CT 스캔 밀, 쌀, 그리고 다른 monocotyledons 어플리케이션에 적합 하다. 지금까지, 우리는 자동으로 그리고 급속 하 게 혈관 번들의 phenotypic 특성 옥수수 줄기와 잎의 단일 CT 이미지에서 추출 수 있는 혈관 번들에 대 한 자동 이미징 소프트웨어를 개발 했습니다. 옥수수 뿌리의 CT 이미지 시리즈를 바탕으로, 이미지 처리 체계는 성공적으로 설정 metaxylem 혈관의 3 차원 phenotypic 특성을 추출 하. X 선 마이크로-CT에 따라 식물 재료의 미세한 형질 기법 정확 하 고 급속 한 정량화 및 옥수수 혈관 번들의 식별에 대 한 새로운 가능성을 제공 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 자연 과학 재단의 중국 (No.31671577), 과학 및 기술 혁신 특별 한 건설 투자 프로그램의 베이징 아카데미의 농업 및 임업 Sciences(KJCX20180423), 연구에 의해 지원 되었다 중국 (2016YFD0300605-01)의 개발 프로그램, 베이징 자연 과학 재단 (5174033), 베이징 박사 후 연구 재단 (2016 ZZ-66), 베이징 아카데미의 농업 및 임업 과학 그랜트 (KJCX20170404) ( JNKYT201604)입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Skyscan 1172 X-ray computed tomography system | Bruker Corporation, Belgium | NA | For CT scanning |
| CO2 critical point drying system (Leica CPD300) | Leica Corporation, Germany | NA | For sample drying |
| Ethanol | Any | NA | For FAA fixation |
| Formaldehyde | Any | NA | For FAA fixation |
| Acetic acid | Any | NA | For FAA fixation |
| Surgical blade | Any | NA | For cutting the sample sgements |
| 3D printer | Makerbot replicator 2, MakerBot Industries, USA | NA | For printing the sample baskets of maize root, stem, and leaf |
| Centrifuge tube | Corning, USA | NA | Place the root, stem, or leaf materials |
| Solid iodine | Any | NA | For sample dyeing |
| SkyScan Nrecon software | SkyScan NRecon, Version: 1.6.9.4, Bruker Corporation, Belgium | NA | For image reconstruction |
| VesselParser software | VesselParser, Version: 3.0, National Engineering Research Center for Information Technology in Agriculture (NERCITA), Beijing, China | NA | Image analysis protocol for single CT image of maize stem or leaf |
| ScanIP | ScanIP, Version: 7.0; Simpleware, Exeter, UK | NA | 3D image processing software |
| Latex gloves | Any | NA | |
| Tweezers | Any | NA |
References
- Lucas, W. J., et al. The plant vascular system: evolution, development and functions. Journal of Integrative Plant Biology. 55, 294-388 (2013).
- Gou, L., et al. Effect of population density on stalk lodging resistant mechanism and agronomic characteristics of maize. Acta Agronomica Sinia. 33, 1688-1695 (2007).
- Hu, H., et al. QTL mapping of stalk bending strength in a recombinant inbred line maize population. Theoretical and Applied Genetics. 126, 2257-2266 (2013).
- Wilson, J. R., Mertens, D. R., Hatfield, R. D. Isolates of cell types from sorghum stems: Digestion, cell wall and anatomical characteristics. Journal of the Science of Food and Agriculture. 63, 407-417 (1993).
- Hatfield, R., Wilson, J., Mertens, D. Composition of cell walls isolated from cell types of grain sorghum stems. Journal of the Science of Food and Agriculture. 79, 891-899 (1999).
- Du, J., et al. Micron-scale phenotyping quantification and three-dimensional microstructure reconstruction of vascular bundles within maize stems based on micro-CT scanning. Functional Plant Biology. 44 (1), 10-22 (2016).
- Pan, X., et al. Reconstruction of Maize Roots and Quantitative Analysis of Metaxylem Vessels based on X-ray Micro-Computed Tomography. Canadian Journal of Plant Science. 98 (2), 457-466 (2018).
- McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162 (2013).
- Cloetens, P., Mache, R., Schlenker, M., Lerbs-Mache, S. Quantitative phase tomography of Arabidopsis seeds reveals intercellular void network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103, 14626-14630 (2006).
- Dorca-Fornell, C., et al. Increased leaf mesophyll porosity following transient retinoblastoma-related protein silencing is revealed by microcomputed tomography imaging and leads to a system-level physiological response to the altered cell division pattern. Plant Journal. 76 (6), 914-929 (2013).
- Verboven, P., et al. Void space inside the developing seed of Brassica napus and the modelling of its function. New Phytologist. 199, 936-947 (2013).
- Brodersen, C. R., Roark, L. C., Pittermann, J. The physiological implications of primary xylem organization in two ferns. Plant, Cell & Environment. 35, 1898-1911 (2012).
- Choat, B., Brodersen, C. R., McElrone, A. J. Synchrotron X-ray microtomography of xylem embolism in Sequoia sempervirens saplings during cycles of drought and recovery. New Phytologist. 205, 1095-1105 (2015).
- Torres-Ruiz, J. M., et al. Direct x-ray microtomography observation confirms the induction of embolism upon xylem cutting under tension. Plant Physiology. 167, 40-43 (2015).
- Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via. x-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8, 75295 (2013).
- Zhang, Y., Legay, S., Barrière, Y., Méchin, V., Legland, D. Color quantification of stained maize stem section describes lignin spatial distribution within the whole stem. Journal of the Science of Food and Agriculture. 61, 3186-3192 (2013).
- Legland, D., Devaux, M. F., Guillon, F. Statistical mapping of maize bundle intensity at the stem scale using spatial normalisation of replicated images. PLoS One. 9 (3), 90673 (2014).
- Heckwolf, S., Heckwolf, M., Kaeppler, S. M., de Leon, N., Spalding, E. P. Image analysis of anatomical traits in stem transections of maize and other grasses. Plant Methods. 11, 26 (2015).
- Wu, H., Jaeger, M., Wang, M., Li, B., Zhang, B. G. Three-dimensional distribution of vessels, passage cells and lateral roots along the root axis of winter wheat (Triticum aestivum). Annals of Botany. 107, 843-853 (2011).
- Chopin, J., Laga, H., Huang, C. Y., Heuer, S., Miklavcic, S. J. RootAnalyzer: A Cross-Section Image Analysis Tool for Automated Characterization of Root Cells and Tissues. PLoS One. 10, 0137655 (2015).
- Passot, S., et al. Characterization of pearl millet root architecture and anatomy reveals three types of lateral roots. Frontiers in Plant Science. 7, 829 (2016).
