Summary
为提高适合普通 microcomputed 层析扫描的玉米组织 X 线吸收对比度提供了一种新的方法。在 CT 图像的基础上, 引入了一套不同的玉米材料图像处理工作流, 有效地提取了玉米血管束的显微表型。
Abstract
基于高通量图像分析技术, 有必要对玉米材料的解剖结构进行准确量化。在这里, 我们提供了一个 "样品准备协议" 的玉米材料 (即茎, 叶, 和根) 适合普通 microcomputed 层析成像 (微 CT) 扫描。本文以玉米茎、叶、根的高分辨率 ct 图像为基础, 描述了两种用于血管束表型分析的协议: (1) 基于玉米茎叶 ct 图像, 研制出一种特殊的图像分析管道, 自动提取3133维管束的表型特征;(2) 基于玉米根系 CT 图像序列, 建立了 metaxylem 血管三维 (3 维) 分割的图像处理方案, 提取了二维 (2 维) 和3维表型特征, 如 metaxylem 血管的体积、表面积、等与传统的人工测量玉米材料的血管束相比, 该协议大大提高了微米尺度表型量化的效率和准确性。
Introduction
玉米血管系统贯穿整个植物, 从根部到茎叶, 形成了输送水、矿物质养分和有机物质的关键运输途径1。血管系统的另一个重要功能是为玉米植株提供机械支持。例如, 根和茎中血管束的形态、数量和分布与2、3玉米植株的抗倒伏性密切相关。目前, 对血管束解剖结构的研究主要是利用显微和超微结构技术来显示茎、叶或根的某一部分的解剖结构, 然后测量和计数这些结构的通过人工调查的兴趣。毫无疑问, 大规模 microimages 中各种显微结构的手工测量是一项非常繁琐、效率低下的工作, 由于其主观性和不一致4, 严重限制了 microphenotypic 特性的精度, 5。
玉米无二次生长, 细胞含量主要由初级生分生中的水组成。未经任何预处理, 可以用微 CT 装置直接扫描玉米组织的新鲜样品;然而, 扫描结果可能是差和粗糙。主要原因如下: (1) 植物组织的衰减密度低, 导致图像中原子数和高噪声的对比度低;(2) 在正常的扫描环境中, 新鲜植物材料容易脱水和收缩, 如杜6所报告。上述问题已成为玉米、小麦、水稻等单子叶植物 microphenotyping 技术发展和应用的主要制约因素。在这里, 我们介绍了 "样品准备协议", 以预处理玉米茎, 叶和根的样品。该协议避免了在 CT 扫描过程中植物材料的脱水和变形;因此, 用 nondeformation 增加植物样品的保存时间是有益的。此外, 基于固体碘的染色步骤也提高了植物材料的对比度;从而大大提高了显微 CT 成像质量。此外, 我们还开发了名为 VesselParser 的图像处理软件来处理玉米茎叶的 CT 图像。该软件集成了一套图像处理管线, 用于对不同植物组织的2维 CT 图像进行高通量和自动分型分析。用自动图像处理方法检测、提取和识别玉米茎叶全断面的血管束。结果得到了玉米茎的31个显微表型和33个玉米叶片的显微表型。针对玉米根系的 CT 图像序列, 研制了一种图像处理方案, 以获得 metaxylem 血管的3维表型特征。与传统方法相比, 该方案具有更好的图像采集和重建效率。
结果表明, 考虑普通 X 射线显微 CT 成像特征的图像处理管线, 为血管束的显微分型提供了一种有效的方法;这极大地拓宽了 CT 技术在植物科学中的应用, 提高了细胞分辨率6、7的植物材料的自动分型。
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Protocol
1. 样品准备协议
- 对于取样, 从新鲜的玉米植株收集茎、叶和根, 并将它们分成三类样本组 (每组四个复制)。然后, 用手术刀片将其切成小段: (1) 切下中间茎节间的段, 长度为 1-1.5 厘米;(2) 用主脉沿垂直方向切开叶片最大宽度的一段, 长度为 0.5-3 厘米;(3) 将冠根的一段长度切开0.5 厘米。
- 对于联邦航空局的固定, 浸泡在 faa 解决方案 (90:5: 5 伏/v/v, 70% ethanol:100 打印张数%acetic 酸) 的样品段至少 3 d。
- 在六连续乙醇梯度 (即30%、50%、70%、85%、95% 和 100%) 中执行脱水过程, 并将每个乙醇梯度的处理时间设置为30分钟。
- 将植物材料放置在使用3维打印机制作的相应样品篮中;然后, 快速将样品篮转移到 CO2临界点干燥系统的样品单元中。设置干燥参数如下:
(1) CO2在: 快速的速度。支架填料: 100%。
(2) 充电: CO2充电延迟120s 入周期。兑换速度: 5. 循环次数:12。
(3) 气出: 热, 快。速度: 慢, 50%。- 根据玉米根、茎、叶的形态差异, 采用3维打印机 (如图 1) 设计和打印样品篮。
- 将干燥的植物材料 (玉米根、茎或叶) 放在50毫升离心管中, 用2克固体碘将植物材料染成挥发性碘蒸气, 然后将管子放在避光贮室中, 4-5 小时。
2. 微 CT 扫描协议
- 要扫描原始 ct 数据, 可将 ct 扫描参数设置为:40 kV/250 µA (茎叶) 或 34 kV/210 µA (根)。为所用植物材料的不同大小和体积设置相应的扫描范围, 并调整成像像素大小, 如下所示: 2.0 µm (用于玉米根), 6.77 µm (用于玉米茎), 10.0 µm (用于玉米叶)。
- 要重建切片图像, 请使用图像重建软件将原始 ct 数据转换为具有2K 分辨率 (2000 x 2000 像素) 的 ct 切片图像。更多详细信息在 NRecon 用户手册 (http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf) 中提供。
3. 玉米茎叶单 CT 图像分析协议
注: 使用自动成像软件进行血管束, 对玉米茎叶 CT 切片图像中的血管束进行分型分析 (图 2)。软件使用步骤如下所述。
- 指定器官类型来初始化不同的算法管线。单击 "方法参数" 按钮, 然后在第一个下拉框中选择玉米茎或玉米叶。
- 要导入图像, 请单击 "数据管理" 按钮, 设置工作目录, 并自动导入此目录中的所有切片图像。在图像管线中选择单个或多片图像。
- 确定图像的实际像素大小。单击 "方法参数" 按钮, 然后在像素大小的编辑项中输入图像的实际像素大小。
- 对于分型计算, 单击分型计算按钮, 自动提取所有选定切片图像的血管束的表型特征。
- 单击 "统计分析" 按钮以 TXT 或 CSV 文件格式输出结果。
4. 玉米根 CT 图像序列图像分析协议
注: 利用图像处理软件提取玉米根的 CT 图像序列, metaxylem 3 维结构。主要步骤如下。
- 导入玉米根的重建图像 (BMP 文件格式), 并确定准确的间距参数 (即, x, y, z 的大小)。利用递归高斯工具抚平这些图像, 提高图像质量。
- 通过调整阈值参数进行 metaxylem 的3维分割;这为每个连接的 metaxylem 容器生成一个统一的颜色标签。
- 使用形态学、按位和洪水填充操作, 以交互方式改进和识别 metaxylem 血管。
- 对船舶进行体积可视化和表面重建。使用掩码统计工具计算和测量2维和3维水平的血管的表型特征。
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Representative Results
适合于普通微 CT 扫描的样品制备方案不仅能防止植物组织的变形, 而且能提高 x 射线的吸收对比度。用微 CT 系统对预处理后的植物材料进行扫描, 得到高质量的切片图像, 最高分辨率可达2µm/像素。图 4显示了扫描的茎、叶和根的显微 CT 图像, 与从新鲜植物材料中扫描的结果相比, 图像对比度有显著的改善。在这些 CT 切片图像中, 在血管束、软组织细胞、木质部血管、表皮和其他组织中, 灰度值的显著差异是可见的。
基于这种血管束成像软件, 可以自动分析和量化整个茎叶和叶片横断面内血管束的结构和分布特征。以玉米茎秆图象为例, 软件的分型算法由五步组成: 切片图像分割, 分割血管束, 分析血管束的空间分布, 识别和改善血管束, 计算和输出血管束的表型特征。图像中的整个表皮区域首先根据特定或自适应阈值进行分段, 并执行轮廓分析技术提取表皮区域 (图 3A和3B)。其次, 对血管束进行分割。血管束被包围在表皮;因此, 从切片图像中移除具有预定义厚度的表皮区域。图像的其余部分仅由具有高像素强度的分散血管束和弱像素强度的薄壁细胞组成。然后, 基于固定阈值进行图像分割, 提取血管束的所有候选区域, 并根据区域和形状特征的限制进一步确定这些区域为有效的血管束 (图 3C和3D)。
在血管束分割后, 提取血管束的空间分布特征。以分散血管束的几何中心为节点, 为切片图像中的所有血管束生成三角形网格, 并根据它们的面积将这些网格聚集成五种类型。从中心到玉米茎的边缘, 血管束的面积明显下降。三角形和 Voronoi 网格描述了血管束的空间分布和拓扑连接, 并且根据血管束的聚集结果绘制出每个网格的特定颜色 (图 3E - 3H)。满足空间分布约束的血管束 (网格面积和形状是确定血管束可用性的重要指标) 是保留的, 用于生成最终的分割结果 (图 3)。
最后, 可以根据上述分析计算出血管束的表型特征, 如几何、形状和分布信息, 从而产生 TXT 或 CSV 文件的输出 (图 3J)。基于血管束成像软件, 可以自动分析31种茎秆的表型特征;每个 CT 图像的平均计算时间是 ~ 三十年代。表 1显示了茎秆的相对的表型参数。同样, 33 的叶片表型特征可以提取, 平均计算时间为 ~ 五十年代, 这些参数分类显示在表格 2。对于切片图像列表, 上述图像分析管线集成到批处理中以自动执行。该工作流有效地分析了玉米茎叶全切片图像中所有血管束的表型特征。值得注意的是, 血管束的大多数表型特征, 例如总面积、平均面积和血管束的面积比, 都很难用人工测量来测量。
由于玉米根系的 metaxylem 血管在根系生长方向上呈现明显的形态学变化, 因此提取 metaxylem 血管的3维结构对表型分析更有价值。基于玉米根系 CT 图像序列, 进行了3维分割、表面重建和体积可视化。根据分段结果, 可自动计算 metaxylem 容器的3维结构参数, 包括总 metaxylem 容器的体积、表面积、横截面积 (基底) 和横截面积 (远端) 及各单 metaxylem 容器。该工作流显著提高了3维表型性状分析的效率。分割、重建和体积可视化的结果可以直接体现玉米根 metaxylem 血管的空间结构, 如图 5所示。
图 1: 用3维打印机打印的不同类型的样品篮.(A和B) 叶片的螺旋样篮由 (A1) 一个中央椭圆形槽和 (A2) 周围的螺旋槽组成。螺旋槽的宽度设置在4毫米左右, 以容纳主脉叶。螺旋槽的侧壁是用 (A5) 方排水孔和篮底 (B6) 圆形排水孔产生的。(C和D)这两个面板显示一个四井样品篮适合的茎, 与 (C1) 样本孔直径25毫米, 和底部的篮子 (D2) 七排水孔。(E和F) 这两个面板显示一个多井样品篮适合的根, 与 (E1) 四圆孔直径10毫米的中心区域, 和 (E2) 13 圆孔, 直径8毫米排列在篮子边缘附近。样品篮的底部有一个直径为1毫米的排水孔, 以确保微小的根组织不会漏出。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 血管束自动成像软件的截图.(A) 本小组显示数据管理, 从任何文件目录中导入 ct 图像, 并为后续处理选择 ct 切片图像。(B) 本小组显示方法参数, 以确定 CT 切片图像的器官类型, 并配置相应的方法参数。(C) 该面板显示了分型计算, 用于对 CT 切片图像进行批量计算, 并显示执行进度。(D) 本小组显示统计分析, 以核实计算结果, 并为所有 CT 图像生成表型特征。(E) 此面板显示计算结果, 将分析结果作为 TXT 或 CVS 文件输出。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 基于 CT 切片图像的图像处理和分型计算工作流.(A) 进口玉米茎的 CT 切片图像。(B) 将切片图像分割为固定阈值。(C) 提取玉米茎的整个区域。(D) 删除玉米茎的表皮区域。(E) 血管束的三角形网格。(F) 本小组根据血管束的区域显示聚类分析。(G) 此面板根据三角形网格的区域显示了聚类分析。(H) 本小组根据 Voronoi 网格的范围, 展示了聚类分析。(I) 本小组显示血管束的最后分段结果。(J) 这个小组显示了血管束的空间分布。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 玉米茎、叶、根的平面重建 (MPR) 图像.左面板显示了一个干剖面的平面图图像。中间的面板显示了一幅叶横断面的平面图图像。右面板显示了一个根截面的平面图图像。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 3 维的根 metaxylem 血管可视化.酒吧 = 0.2 毫米 (A和B) 这些面板显示一个3维可视化的根。(C ) 这些小组显示了 metaxylem 船只的3维可视化。请单击此处查看此图的较大版本.
表 1: 玉米茎的显微形态特征。
表 2: 玉米叶片的显微形态特征。
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Discussion
随着 CT 技术在生物医学和材料科学领域的成功应用, 该技术已逐步引入植物学和农业领域, 促进了植物生命科学的研究, 成为一种有前途的技术工具。.二十世纪九十年代代末, CT 技术首次用于研究植物根系的形态结构和发育。在过去的十年中, 同步辐射已经成为植物生物学家的一种强大的、无损的工具, 已经成功地用于鉴定葡萄血管系统的组织结构8、拟南芥叶片的组织结构9,10、油菜种子结构11。通过同步辐射, 研究了12、13、14木本植物血管束的结构和功能。然而, 对玉米、小麦、水稻等作物的 HRCT 技术研究却15。玉米无二次生长, 细胞主要由初级生分生中的水组成。虽然新鲜的样品可以扫描的微 CT 没有任何预处理, 扫描结果是非常糟糕的。其主要原因如下: (1) 植物组织的衰减密度低, 导致图像中原子数和高噪声的对比度低;(2) 在扫描期间, 新鲜材料趋于脱水和收缩, 如杜6所报告。上述原因已成为制约该技术在玉米、小麦、水稻等单子叶植物中应用的主要因素。
本文介绍了一种简单实用的样品制备方案, 不仅能防止植物组织的变形, 而且能提高 x 射线的吸收对比度。以样品制备方案和显微 ct 成像系统为基础, 获得了高质量、高分辨率的根、茎、叶 ct 图像, 最高分辨率可达2µm/像素。因此, 样品制备协议适用于普通的显微 CT 扫描, 为单子叶植物和其他植物科学的广泛应用提供了广阔的契机。该协议可以很容易地修改, 以适应其他植物材料, 如脱水或干燥程序, 其参数设置也可以根据特定的植物材料调整, 以取得最佳效果。值得注意的是, 这种方法受植物样品的大小和体积的限制。太厚的样品段可能导致样品的不完全干燥或变形。因此, 本样品制备协议适用于厚度小于3厘米的小型植物材料, 而不适用于玉米穗或芯等较大的玉米原料。
植物材料显微分型技术是近年来植物表型研究的热点之一, 正逐渐成为遗传育种和植物生理学的基本支持技术之一。传统的植物显微表型分析需要大量复杂的样品准备和繁琐的手工操作。对微观特征进行计数和测量是非常耗费人力和耗费时间的;结果也容易出现主观错误。例如, 为了量化玉米茎中血管束的表型特征, 茎样需要嵌入石蜡切片, 然后切片、染色和成像。对于彩色切片图像, 由于单元边界的模糊定义, 很难进行自动图像处理;因此, 人工识别和分割是不可缺少的16。为满足大尺度测量对玉米茎秆解剖性状的要求, Legland 和 Heckwolf 引入了不同的图像处理方法;然而, 果皮中的血管束结构仍然是一个挑战17,18。因此, 高吞吐量图像分析和准确定量的玉米组织解剖特征是必要的。在这里, 我们提供自动成像软件的血管束, 可以自动抽取31表型特征的血管束在三十年代的每一个 ct 图像的玉米茎和33表型性状的每一个 ct 图像的玉米叶。可自动分析和量化整个茎叶横断面内血管束的结构和分布特征。该软件具有以下优点: (1) 自动处理玉米茎叶 CT 切片图像, 提取血管束的表型特征;(2) CT 图像中血管束的识别率较高, 尤其是边缘小血管束;(3) 采用一种新的图解分析方法, 揭示了血管束的分布特征。
此外, X 射线微 CT 扫描技术与基于石蜡切片图像19、20 的传统重建技术相比, 在图像采集和重建效率方面具有明显的优越性。,21。基于玉米根系的 CT 图像序列, 提出了一种图像处理方案, 用于提取 metaxylem 血管的空间结构, 并成功地用于显微性状的3维测量。该方案的主要局限性是, 3 维分段结果依赖于轻微的人工交互。今后, 我们的目标是开发一套用于玉米根系 CT 数据集的全自动3维图像分析软件, 以提高3维分割重建的效率。
最后, 以玉米茎、叶、根为例, 建立了一种常规的显微 ct 扫描方法, 制备出高分辨率 CT 图像。本发明提供的样品制备协议不仅能防止植物组织的变形, 而且能提高 x 射线的吸收对比度。该协议也适用于其他 CT 扫描应用在小麦, 大米, 和其他单子叶植物。到目前为止, 我们开发了血管束自动成像软件, 能够自动快速地从玉米茎叶单张 CT 图像中提取血管束的表型特征。基于玉米根系的 CT 图像序列, 成功地建立了 metaxylem 血管3维表型特征的图像处理方案。基于 X 射线显微 CT 的植物材料显微分型技术为玉米血管束的准确快速定量鉴定提供了新的前景。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了中国国家自然科学基金 (31671577)、北京农林科学院科技创新专项建设资助项目 (KJCX20180423) 的支持, 研究中国开发项目 (2016YFD0300605-01), 北京自然科学基金 (5174033), 北京博士后研究基金会 (2016 ZZ-66), 北京农林科学院 (KJCX20170404) (JNKYT201604)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Skyscan 1172 X-ray computed tomography system | Bruker Corporation, Belgium | NA | For CT scanning |
| CO2 critical point drying system (Leica CPD300) | Leica Corporation, Germany | NA | For sample drying |
| Ethanol | Any | NA | For FAA fixation |
| Formaldehyde | Any | NA | For FAA fixation |
| Acetic acid | Any | NA | For FAA fixation |
| Surgical blade | Any | NA | For cutting the sample sgements |
| 3D printer | Makerbot replicator 2, MakerBot Industries, USA | NA | For printing the sample baskets of maize root, stem, and leaf |
| Centrifuge tube | Corning, USA | NA | Place the root, stem, or leaf materials |
| Solid iodine | Any | NA | For sample dyeing |
| SkyScan Nrecon software | SkyScan NRecon, Version: 1.6.9.4, Bruker Corporation, Belgium | NA | For image reconstruction |
| VesselParser software | VesselParser, Version: 3.0, National Engineering Research Center for Information Technology in Agriculture (NERCITA), Beijing, China | NA | Image analysis protocol for single CT image of maize stem or leaf |
| ScanIP | ScanIP, Version: 7.0; Simpleware, Exeter, UK | NA | 3D image processing software |
| Latex gloves | Any | NA | |
| Tweezers | Any | NA |
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