Summary
Wir bieten eine neuartige Methode zur Verbesserung der Resorption Röntgenkontrast Mais Gewebe geeignet für gewöhnliche Microcomputed Tomographie scannen. Basierend auf CT-Bilder, stellen wir eine Reihe von Bildverarbeitungs-Workflows für verschiedene Mais Materialien effektiv mikroskopische Phänotypen der Leitbündel von Mais zu extrahieren.
Abstract
Es ist notwendig, die anatomischen Strukturen des Mais Materialien auf Basis von Hochdurchsatz-Bild-Analyse-Techniken genau zu quantifizieren. Hier bieten wir ein "Probe-Vorbereitung-Protokoll" für Mais (d.h., Stamm, Blatt und Wurzel) geeigneten Materialien für gewöhnliche Microcomputed Tomographie (Mikro-CT) scannen. Basierend auf hochauflösenden CT-Aufnahmen des Mais Stamm, Blatt und Wurzel, beschreiben wir zwei Protokolle für die phänotypische Analyse der Leitbündel: (1) basierend auf dem CT-Bild von Mais Stiel und Blatt, entwickelten wir eine bestimmtes Bild Analyse Pipeline um 31 automatisch extrahieren und 33 phänotypische Merkmale der Leitbündel; (2) basierend auf der CT-Bild-Serie von Mais Root, wir richten Sie ein Bild-Verarbeitung-Schema für die dreidimensionale (3D) Segmentierung der Messungen Schiffe und extrahiert zweidimensional (2D) und 3-d-phänotypische Merkmale, wie Volumen, Fläche Messungen Schiffe, etc. Verglichen mit traditionellen manuellen Messung der Leitbündel Mais Materialien, verbessern die vorgeschlagenen Protokolle erheblich die Effizienz und Genauigkeit der phänotypischen Quantifizierung Mikron-Skala.
Introduction
Der Maize Gefäßsystem durchzieht die gesamte Anlage, von der Wurzel und Stengel, Blätter, bildet die wichtigsten Transport-Wege für die Bereitstellung von Wasser, Mineralstoffen und organischen Substanzen1. Eine weitere wichtige Funktion des Gefäßsystems soll der Maispflanze mechanische unterstützen. Beispielsweise sind die Morphologie, die Anzahl und die Verteilung der Leitbündel in Wurzeln und Stängeln, die Standfestigkeit von Maispflanzen2,3eng. Zur Zeit Studien über die anatomische Struktur der Leitbündel hauptsächlich nutzen mikroskopische und ultramikroskopischer Techniken um die anatomischen Strukturen eines bestimmten Teils der Stamm, Blatt oder Wurzel, anzuzeigen und dann Messen und zählen diese Strukturen der Interesse durch die manuelle Untersuchung. Zweifellos, manuelle Messung von verschiedenen mikroskopischen Strukturen in groß angelegten Microimages ist eine sehr mühsame und ineffiziente Arbeit und schränkt die Präzision der Microphenotypic Merkmale, aufgrund seiner Subjektivität und Inkonsistenz4, 5.
Mais hat keine sekundäre Wachstum, und Inhalt der Zelle besteht im Wesentlichen aus Wasser in den primären Meristem. Ohne jede Vorbehandlung können frische Proben von Mais Gewebe direkt mit einem Mikro-CT-Gerät gescannt werden; die Scan-Ergebnisse sind jedoch wahrscheinlich schlechte und rau. Die Hauptgründe sind wie folgt zusammenfassen: (1) niedrige Dämpfung dichten von Pflanzengewebe, was einen geringen Kontrast von Ordnungszahl und hohe Rauschen in Bildern; (2) frisches Pflanzenmaterial sind anfällig für austrocknen und schrumpfen während der normalen Scan-Umgebung, wie Du6berichtet. Die oben genannten Probleme sind die Haupthindernisse für die Entwicklung und Anwendung der Microphenotyping-Technologie für Mais, Weizen, Reis und anderen monocotylen geworden. Hier stellen wir das "Probe-Vorbereitung-Protokoll", die Proben von Mais Stamm, Blatt und Wurzel Vorbehandeln. Dieses Protokoll verhindert die Austrocknung und Verformung des pflanzlichen Rohstoffen bei der CT Scan; Daher ist es vorteilhaft, die Aufbewahrungszeit von Pflanzenproben mit Nondeformation zu erhöhen. Darüber hinaus erhöht der Färbe Schritt basierend auf soliden Jod auch den Kontrast von Pflanzenmaterial; So macht es signifikante Verbesserungen in der Bildqualität von Mikro-CT Darüber hinaus entwickelten wir Bildverarbeitungs-Software, namens VesselParser, die CT-Bilder von Mais Stengel und Blätter zu verarbeiten. Diese Software integriert eine Reihe von Bildverarbeitungs-Pipelines zu hohem Durchsatz und automatische Phänotypisierung Analysen für 2-D-CT-Aufnahmen von verschiedenen Pflanzengeweben. Leitbündel in den gesamten Querschnitt des Mais Stiel und Blatt werden erkannt, extrahiert und durch eine automatische Bildverarbeitung Methode identifiziert. Dadurch erhalten wir 31 mikroskopische Phänotypen des Mais Stammes und 33 mikroskopische Phänotypen des Mais Blattes. Für die CT-Bild-Serie der Mais Wurzel entwickelten wir ein Bildverarbeitungs-System, 3-d-phänotypische Merkmale der Messungen Schiffe zu erwerben. Dieses Schema ist in der Effizienz der Bildaufnahme und Wiederaufbau im Vergleich zu traditionellen Methoden überlegen.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Bildverarbeitung Rohrleitungen, wenn man bedenkt, dass die Abbildungseigenschaften von normalen x-ray Micro-CT bieten eine effektive Methode für die mikroskopische Phänotypisierung von leitbündeln; Das extrem weitet sich die Anwendungen von CT Techniken in Pflanzenkunde und verbessert die automatische Phänotypisierung von Pflanzenmaterial im zellulären Auflösung6,7.
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Protocol
1. Probe Vorbereitung Protokoll
- Für die Probenahme sammeln die Stengel, Blatt, Wurzel aus frischen Mais Pflanzen und teilen sie in drei Arten von Beispielgruppen (jede Gruppe mit vier Wiederholungen). Dann schneiden sie in kleine Segmente mit einer chirurgischen Klinge auf folgende Weise: (1) Schnitt ein Segment der mittleren Stamm Internodium 1-1,5 cm Länge; (2) schneiden Sie ein Segment für die maximale Breite des Blattes 0,5 - 3 cm in der Länge entlang der vertikalen Richtung mit der Hauptader; (3) geschnitten Sie ein Segment der eigentlichen Krone 0,5 cm in der Länge.
- Einweichen Sie für die FAA-Fixierung der Probe-Segmente in eine FAA-Lösung (90:5:5 V/V/V, 70 % Ethanol: 100 % Formaldehyd: 100 % Essigsäure) für mindestens 3 d.
- Führen Sie die Dehydrierung in sechs sequenziellen Ethanol-Gradienten (d.h.30 %, 50 %, 70 %, 85 %, 95 % und 100 %) und die Bearbeitungszeit von jeder Ethanol Verlauf als 30 min festgelegt.
- Legen Sie das Pflanzenmaterial in die entsprechende Probe-Körbe hergestellt, mit einem 3-d-Drucker; übertragen Sie anschließend die Probe Körbe schnell auf die Sample-Zelle von einer CO2 kritische Punkt Trocknungsanlage. Legen Sie die Trocknungsparameter wie folgt:
(1) CO2 in: Eilgang. Inhaber Füllstoffe: 100 %.
(2) kostenlos: CO2 kostenlos Verzögerung 120 s in den Kreislauf. Austausch von Geschwindigkeit: 5. Zyklus Anzahl: 12.
(3) Gas heraus: Wärme, schnell. Geschwindigkeit: langsam, 50 %.- Nach der morphologischen Unterschiede von Mais Wurzel, Stamm und Blatt, Design und print Sample Körbe mit einem 3-d-Drucker (z. B. Abbildung 1).
- Legen Sie die getrockneten pflanzlichen Rohstoffen (Mais Wurzel, Stängel oder Blatt) in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen mit 2 g solide Jod färben das Pflanzenmaterial mit flüchtigen Jod Dampf und platzieren Sie dann die Rohre in einem lichtdichten Raum für 4-5 h.
2. Micro-CT-Scan-Protokoll
- Um in den Rohdaten CT scan, der CT Scan-Parameter wie folgt eingestellt: 40 kV/250 µA (für Stamm und Blatt) oder 34 kV/210 µA (für Root). Die entsprechenden Bereiche für die verschiedenen Größen und Volumina der verwendeten pflanzlichen Materialien zu scannen, und passen Sie die bildgebenden Pixelgrößen wie folgt: 2,0 µm (für den Mais Stamm), 6.77 µm (für den Mais Stamm) und 10,0 µm (nach dem Mais Blatt).
- Um Schnittbilder zu rekonstruieren, konvertieren Sie die CT Rohdaten in CT-Slice-Bilder mit einer Auflösung von 2K (2.000 x 2.000 Pixel) mit einem Bild-Wiederaufbau-Software. Weitere Details sind in der NRecon Bedienungsanleitung (http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf) zur Verfügung gestellt.
3. Image Analyse Protokoll für eine Single-CT-Bild eines Mais Stamm oder Blatt
Hinweis: Verwenden Sie automatische imaging-Software für Leitbündel, die Phänotypisierung Analyse der Leitbündel in CT-Schnittbildern des Mais Stiel und Blatt (Abbildung 2). Die Software-Nutzung-Schritte werden im folgenden beschrieben.
- Benennen des Orgel-Typs zum anderen Algorithmus Rohrleitungen zu initialisieren. Klicken Sie auf Methodenparameter und wählen Sie Mais Stamm oder Mais Blatt im ersten Dropdown-Feld aus.
- Um die Bilder zu importieren, klicken Sie auf die Schaltfläche " Datenverwaltung ", legen Sie das Arbeitsverzeichnis und importieren Sie automatisch alle Schnittbilder in diesem Verzeichnis. Wählen Sie Einzel- oder Multi-Slice-Bilder in der Bild-Pipelines.
- Ermitteln Sie die tatsächliche Pixelgröße des Bildes. Klicken Sie auf Methodenparameter und geben Sie die tatsächliche Pixelgröße des Bildes in das Element bearbeiten von der Pixelgröße.
- Klicken Sie für die Phänotypisierung Berechnung, um automatisch extrahieren phänotypische Merkmale der Leitbündel für alle ausgewählten Schnittbilder Phänotypisierung Berechnung .
- Klicken Sie auf statistische Analyse , um die Ergebnisse als eine TXT oder CSV-Datei-Format ausgegeben.
4. Bild Analyse Protokoll für CT-Bild-Serie der Mais Wurzel
Hinweis: Die CT-Bild-Serie von Maiswurzeln werden genutzt, um die 3-d-Strukturen der Messungen Schiffe mit Bildbearbeitungs-Software zu extrahieren. Die wichtigsten Schritte sind wie folgt.
- Importieren Sie die rekonstruierten Bilder von Maiswurzeln (im BMP-Datei-Format) und bestimmen Sie die genaue Abstände Parameter (die Größe des ein Voxel [d.h., X, y, Z]). Verwenden Sie das rekursive "glockenförmig" Werkzeug um zu glätten diese Bilder um die Bildqualität zu verbessern.
- Durchführung von 3-d-Segmentierung der Messungen Schiffe durch Anpassung der Parameter Schwelle; Dies erzeugt eine einheitliche Farbe Bezeichnung für jedes angeschlossene Messungen Schiff.
- Zu verbessern Sie und die Messungen Schiffe interaktiv mit Morphologie, bitweise, und Füllung Operationen.
- Führen Sie Volume Visualisierung und Oberfläche Rekonstruktion der Gefäße. Verwenden Sie die Maske-Statistik-Tool zu zählen und messen die phänotypische Merkmale eines Schiffes in den 2-D und 3-d-Niveaus.
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Representative Results
Die Probe Vorbereitung Protokoll geeignet für normale Mikro-CT-Scan nicht nur verhindert die Verformung der Pflanzengewebe aber auch verstärkt den x-ray Absorption Kontrast. Vorbehandelte pflanzlichen Stoffen werden gescannt, mit einem Mikro-CT-System in qualitativ hochwertige Schnittbilder, und die höchste Auflösung erreichen 2 µm/Pixel. Abbildung 4 zeigt die gescannten Mikro-CT-Bilder der Stamm, Blatt und Wurzel und den Kontrast des Bildes hat eine deutliche Verbesserung im Vergleich mit den Ergebnissen aus der frischen Pflanzenmaterialien gescannt. In dieser CT-Schnittbildern sind signifikante Unterschiede in grau-Ebene Werte unter Leitbündel, parenchymzellen, xylemgefäße, Haut und anderen Geweben zu beobachten.
Basierend auf diesem imaging-Software für Leitbündel, können die Struktur und Verteilung Merkmale der Leitbündel in den Querschnitt des ganzen Stamm oder Blatt automatisch analysiert und quantifiziert werden. Das Bild eines Mais Stammes als Vorbild zu nehmen, und die Phänotypisierung Algorithmus der Software besteht aus fünf Schritten: segmentieren die Slice-Bild, segment der Leitbündel, analysieren die räumliche Verteilung der Leitbündel, identifizieren und verbessern die Leitbündel , berechnen und ausgeben der phänotypischen Merkmale der Leitbündel. Die gesamte Epidermis-Region im Bild ist, erstens segmentiert anhand spezifischer oder adaptive Schwellenwerte und konturanalyse Techniken durchgeführt werden, um die Oberhaut Region (Abbildung 3A und 3 b) zu extrahieren. Als nächstes erfolgt die Segmentierung der Leitbündel. Leitbündel sind in der Epidermis umgeben; Daher ist die Epidermis-Region mit der vordefinierten Dicke aus dem Slice Bild entfernt. Der Rest des Bildes besteht nur aus zerstreuten Vascular bundles mit hoher Pixeldichte Intensitäten und parenchymzellen mit schwachen Pixelintensität. Dann die Bild Segmentierung basierend auf den festen Grenzwert wird durchgeführt, um allen Kandidaten Regionen der Leitbündel zu extrahieren, und diese Regionen werden weiter als gültige Leitbündel nach die Grenzen von Raum und Form-Funktionen ( bestimmt Abbildung 3 und 3D).
Nach der Segmentierung der Leitbündel sind räumliche Verteilung Eigenschaften der Leitbündel extrahiert. Die geometrischen Zentren der zerstreute Leitbündel als Knoten Dreieck Netze für alle Leitbündel in der Slice-Bild zu generieren und diese Maschen sind gruppiert in fünf Typen nach ihren Anwendungsgebieten. Die Bereichen der Leitbündel manifestieren erhebliche rückläufig vom Zentrum an den Rand des Mais Stammes. Die dreieckigen Voronoi-Netze zu beschreiben, die räumliche Verteilung und topologischen Verbindungen der Leitbündel und jedes Gitter wird mit einer bestimmten Farbe nach den gruppierten Ergebnissen der Leitbündel (Abbildung 3E - 3 H) gezeichnet. Leitbündel, die die Zwängen der räumlichen Verteilung zu erfüllen (Netz-Bereich und die Form sind die wichtigen Indizes zu bestimmen, die Verfügbarkeit der Vascular Bundle) verwendet, um die endgültige Segmentierung Ergebnisse (Abbildung 3ich) zu generieren und reserviert sind.
Am letzten, phänotypische Merkmale der Leitbündel, wie geometrische, Form und Verteilungsinformationen gemäß der vorstehenden Analyse, die Ergebnisse in der Ausgabe einer TXT oder CSV-Datei (Abbildung 3J) berechnet werden kann. Basierend auf der imaging-Software für Leitbündel, können 31 phänotypische Merkmale des Stammes automatisch analysiert werden; die durchschnittliche Rechenzeit für jedes CT-Bild ist ~ 30 s. Die relative phänotypischen Parameter des Stammes sind in Tabelle 1dargestellt. In ähnlicher Weise 33 phänotypische Merkmale des Blattes extrahiert werden können, die durchschnittliche Rechenzeit ist ~ 50 s, und diese Parameter Klassifizierungen sind in Tabelle 2dargestellt. Für eine Liste der Schnittbilder sind die oben genannten Bild Analyse Pipelines in eine Batch-Verarbeitung für die automatische Ausführung integriert. Dieser Workflow ist effizient zu analysieren, die phänotypische Merkmale der Leitbündel in einem kompletten Slice Bild eines Mais Stiel und Blatt. Insbesondere sind die meisten phänotypischen Merkmale der Leitbündel wie die Gesamtfläche, durchschnittliche Fläche und Flächenverhältnis der Leitbündel, deutlich schwieriger durch manuelle Messungen gemessen werden.
Da die Messungen Schiffe von Maiswurzeln offensichtliche morphologische Veränderungen entlang der Richtung des Wurzelwachstums zeigen, ist es noch wertvoller für die 3-d-Strukturen der Messungen Schiffe für die phänotypische Analyse extrahieren. Basierend auf der CT-Bild-Serie von Mais Wurzel, sind 3-d-Segmentierung, Flächenrückführung und Volumen Visualisierung durchgeführt. Auf der Grundlage der segmentierten Ergebnisse können die 3-d-Strukturparameter von Messungen Schiffe automatisch berechnet werden einschließlich Volumen, Fläche, Querschnittsfläche (basal) und Querschnittsfläche (distal) der gesamten Messungen Schiffe und jeder, Einzelne Messungen Schiff. Dieser Workflow verbessert deutlich die Effizienz der 3-d-phänotypische Merkmal Analyse. Die Ergebnisse der Segmentierung, Wiederaufbau und Volumen Visualisierung manifestieren können direkt die räumlichen Strukturen der Messungen Schiffe der Mais Wurzel, wie in Abbildung 5dargestellt.
Abbildung 1 : Verschiedene Arten von Probe Körbe mit einem 3-d-Drucker gedruckt. (A und B) besteht der Spirale Probe Korb für das Blatt mit (A1) eine zentrale Oval groove und (A2) der umliegenden Spiral groove. Die Breite der spiralförmige Rille liegt bei ca. 4 mm, das Blatt mit der Hauptader unterzubringen. Die Seitenwand der spiralförmige Rille ist erstellt mit (A5) quadratische Entwässerungsbohrungen und der Boden des Korbes mit kreisförmigen Ablauflöcher (B6). (C und D) Diese beiden Platten zeigen einen vier-gut Probe-Korb für den Stamm drain mit (C1) Probe Löcher mit einem Durchmesser von 25 mm, und der Boden des Korbes mit (D2) sieben Löcher. (E und F) zeigen diese beiden Platten Blumenkorb multiwell Probe für die Wurzel mit (E1) vier Runde Löcher mit einem Durchmesser von 10 mm in den zentralen Bereich geeignet und (E2) 13 Runde Löcher mit einem Durchmesser von 8 mm angeordnet, in der Nähe von dem Rand des Korbes. Der Boden des Korbes Probe hat Löcher mit einem Durchmesser von 1 mm um sicherzustellen, dass das kleine Wurzel Gewebe nicht austreten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Screenshots von automatischen imaging-Software für Leitbündel. (A) dieses Panel zeigt das Datenmanagement zu CT-Bilder aus einem beliebigen Dateiverzeichnis zu importieren, und wählen CT-Schnittbildern zur Weiterverarbeitung. (B) dieses Panel zeigt die Methodenparameter zu identifizieren die Orgel Art der CT-Schnittbildern und konfigurieren Sie die entsprechende Methodenparameter. (C) dieses Panel zeigt die Phänotypisierung Berechnung, führen Sie die Batch-Berechnung der CT-Schnittbildern und zeigen den Fortschritt der Ausführung. (D) dieses Panel zeigt die statistische Auswertung der Rechenergebnisse überprüft und phänotypischen Merkmale für die CT-Bilder zu erzeugen. (E) dieses Panel zeigt die Berechnungsergebnisse zur Ausgabe der Analyse-Ergebnisse als TXT oder CVS-Datei. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Workflow Bildverarbeitungs- und Phänotypisierung Berechnung basierend auf CT-Schnittbildern. (A) Import der CT-Slice-Bild des Mais Stammes. (B) Segment der Slice-Bild mit einem festen Schwellwert. (C) Auszug der gesamten Region des Mais Stammes. (D) Löschen der Epidermis Region des Mais Stammes. (E) dreieckigen Maschen der Leitbündel. (F) dieses Panel zeigt eine Cluster-Analyse nach den Bereichen der Leitbündel. (G) dieses Panel zeigt eine Cluster-Analyse nach den Bereichen von der dreieckigen Gittern. (H) zeigt dieses Fenster eine Cluster-Analyse nach den Bereichen von Voronoi Maschen. (ich) zeigt dieses Fenster die segmentierten Endergebnisse der Leitbündel. (J) dieses Panel zeigt die räumliche Verteilung der Leitbündel. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Multiplanar Rekonstruktion (MPR) Bilder von der Mais Stamm, Blatt und Wurzel. Die linke Tafel zeigt ein MPR-Bild von einem Stamm Querschnitt. Der mittleren Spalte zeigt ein MPR-Bild von einem Blatt Querschnitt. Im Rechte Bereich zeigt einen Querschnitt der Wurzel MPR. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : 3-d Visualisierung der Wurzel Messungen Schiffe. Die Balken = 0,2 mm. (A und B) Diese Tafeln zeigen eine 3-d-Visualisierung einer Wurzel. (C - F) Diese Tafeln zeigen eine 3-d-Visualisierung der Messungen Schiffe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Tabelle 1: Mikroskopische phänotypische Merkmale des Mais Stammes.
Tabelle 2: Mikroskopische phänotypische Merkmale des Mais Blattes.
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Discussion
Mit den erfolgreichen Einsatz der CT-Technologie in den Bereichen Biomedizin und Materialwissenschaften wurde diese Technologie nach und nach in den Bereichen Botanik und Landwirtschaft, Förderung der Forschungen in den Lebenswissenschaften Werk als ein viel versprechendes Instrument der technischen eingeführt . In den späten 1990er Jahren war CT Technologie erstmals zur Untersuchung der morphologischen Strukturen und Entwicklung der Pflanze-Wurzel-Systeme eingesetzt. In den letzten zehn Jahren Synchrotron HRCT ist ein leistungsstarkes, zerstörungsfreien Tool für Pflanze Biologen geworden und wurde erfolgreich verwendet, um ermitteln die Gewebestrukturen der Traube Gefäßsystem8, Gewebestruktur von Arabidopsis Blatt9 , 10, und Samen Struktur der Vergewaltigung11. Durch das Synchrotron HRCT wurden in die Untersuchung der Struktur und Funktion der Leitbündel in Gehölzen12,13,14große Fortschritte erzielt. Jedoch wurde wenig Forschung der HRCT-Technik für Mais, Weizen, Reis und andere Getreide15durchgeführt. Mais hat keine sekundäre Wachstum, und die Zelle besteht im Wesentlichen aus Wasser in den primären Meristem. Obwohl frische Proben von Mikro-CT ohne jede Vorbehandlung gescannt werden können, sind die Scanergebnisse sehr arm. Die Hauptgründe sind wie folgt: (1) niedrige Dämpfung dichten von Pflanzengewebe, wodurch ein geringer Kontrast in Ordnungszahl und hohe Rauschen in Bildern; (2) frisches Material neigt dazu, Austrocknen und schrumpfen während der Scan Zeit, wie Du6berichtet. Die oben genannten Gründen sind die wichtigsten Faktoren begrenzen die Anwendung dieser Technologie in Mais, Weizen, Reis und anderen monocotylen geworden.
Hier stellen wir eine einfache und praktische Probe-Vorbereitung-Protokoll, die nicht nur die Verformung der Pflanzengewebe verhindert, sondern auch die x-ray Absorption Kontrast verbessert. Qualitativ hochwertige und hochauflösende CT-Aufnahmen von Wurzel, Stamm und Blatt wurden anhand der Probe Vorbereitung Protokoll und Mikro-CT imaging-System, und die höchste Auflösung war bis zu 2 µm/Pixel. So, das Probe-Vorbereitung-Protokoll eignet sich für normale Mikro-CT-Scan und bietet eine großartige Gelegenheit für größere Anwendungen in Monocot und anderen Pflanzenwissenschaften. Dieses Protokoll kann leicht geändert werden, um anderen pflanzlichen Materialien wie z. B. Austrocknung oder Trocknungsvorgangs unterzubringen, und seine Parametereinstellung kann auch nach bestimmten pflanzlichen Rohstoffen für die besten Ergebnisse angepasst werden. Vor allem wird dieser Ansatz durch die Größe und das Volumen der Anlage Probe begrenzt. Ein Segment zu dick Probe kann zu unvollständiger Trocknung oder Verformung der Probe führen. Daher gilt dieses Beispiel Vorbereitung Protokoll für kleine Pflanze-Materialien mit einer Dicke von weniger als 3 cm und nicht viel größeren Mais Materialien wie Mais Ohr oder Maiskolben.
Die mikroskopische Phänotypisierung Technologie von Pflanzenmaterial ist eines der Trendthemen der Pflanze phänotypische Untersuchungen in den letzten Jahren, und es wird allmählich eine der basic-Support Technologien für genetische Züchtung und Werk Physiologie. Traditionelle mikroskopische phänotypische Analyse von Pflanzen erfordert eine große Anzahl von komplexen Beispiel Zubereitungen und mühsame manuelle Eingriffe. Es ist sehr arbeitsintensiv und zeitaufwändig zu zählen und messen die mikroskopischen Eigenschaften; die Ergebnisse sind auch anfällig für subjektive Fehler. Zum Beispiel muss zur Quantifizierung der phänotypischen Eigenschaften der Leitbündel in einem Mais Stiel Stiel Probe werden in Paraffin eingebettet und dann in Scheiben geschnitten, gefärbt und abgebildet. Für einen verschmutzten Scheibe Bild ist es schwierig, eine automatisierte Bildverarbeitung aufgrund der mehrdeutigen Definition von Zellgrenzen durchführen; So sind manuelle Identifikation und Segmentierung unverzichtbar16. Um den Anforderungen der großflächige Messungen für anatomische Merkmale des Mais Stammes Legland und Heckwolf verschiedene Methoden der Bildverarbeitung eingeführt; die Strukturen der Leitbündel in der Schale sind jedoch nach wie vor eine Herausforderung17,18. Hochdurchsatz-Bildanalyse und genaue Quantifizierung der anatomischen Eigenschaften der Mais Gewebe sind daher notwendig. Wir bieten hier automatische imaging-Software für Leitbündel, das automatisch, 31 phänotypische Merkmale der Leitbündel in ~ 30 extrahieren können s für jedes CT-Bild aus dem Mais Stamm und 33 phänotypische Merkmale bei ~ 50 s für jedes CT-Bild des Mais Blattes. Die Struktur und Verteilung Merkmale der Leitbündel innerhalb der Querschnitt der gesamten stengel oder Blätter können automatisch analysiert und quantifiziert werden. Diese Software hat folgende Vorteile: (1) es automatisch verarbeitet die CT-Schnittbildern Mais Stiel und Blatt und extrahiert die phänotypische Merkmale der Leitbündel; (2) Es hat eine höhere Erkennungsrate der Leitbündel in der CT-Bild, vor allem für kleine Leitbündel am Rande; (3) eine neuartige grafische Analyse-Methode dient zur Verteilung Eigenschaften der Leitbündel zu offenbaren.
Darüber hinaus hat die x-ray Micro-CT-Scan-Technologie offensichtliche Vorteile in der Effizienz der Bildaufnahme und Wiederaufbau im Vergleich zu traditionellen Rekonstruktionstechniken basierend auf Paraffin Abschnitt Bilder19,20 ,21. Basierend auf der CT-Bild-Serie von Mais Wurzel, ist ein Bildverarbeitungs-System entwickelt, um die räumlichen Strukturen der Messungen Schiffe zu extrahieren und erfolgreich für die 3-d-Messung der mikroskopischen Eigenschaften verwendet. Die wichtigste Einschränkung dieser Regelung ist, dass die 3-d-segmentierte Ergebnis leichte manuelle Interaktion abhängt. In Zukunft wollen wir eine Reihe von automatisierten 3-d-Bildanalyse-Software für den CT-Datensatz von Maiswurzeln zur Verbesserung der Effizienz der 3-d-Segmentierung und des Wiederaufbaus zu entwickeln.
Zusammenfassend, eine normale Mikro-CT-Scan basierend auf ein praktisches Beispiel Vorbereitung Protokoll für den Mais Stamm, Blatt, und Wurzel ist konstruiert, um hochauflösende CT-Bilder zu erzeugen. Das Probe-Vorbereitung-Protokoll hier zur Verfügung gestellten die Verformung der Pflanzengewebe verhindert nicht nur, sondern verbessert auch die x-ray Absorption Kontrast. Dieses Protokoll eignet sich auch für andere CT scanning-Anwendungen in Weizen, Reis und anderen monocotylen. Bisher haben wir automatische imaging-Software für Leitbündel, entwickelt, das in der Lage schnell und automatisch extrahieren die phänotypische Merkmale der Leitbündel von einem einzelnen CT-Bild von der Mais Stiel und Blatt. Basierend auf der CT-Bild-Serie der Mais Wurzel, ist eine Bildverarbeitungs-System erfolgreich eingerichtet, die 3-d-phänotypische Merkmale der Messungen Schiffe zu extrahieren. Mikroskopische Phänotypisierung Techniken der pflanzlichen Rohstoffen basierend auf x-ray Micro-CT bieten eine neue Perspektive für die genaue und schnelle Quantifizierung und Identifizierung von Mais Leitbündel.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde unterstützt durch die National Natur Science Foundation of China (No.31671577), die Wissenschaft und Technologie Innovation besondere Bau finanzierte Programm von Peking Akademie für Land- und Forstwirtschaft Sciences(KJCX20180423), die Forschung Entwicklungsprogramm von China (2016YFD0300605-01), der Beijing Natural Science Foundation (5174033), der Beijing Postdoc Research Foundation (2016 ZZ-66), und die Peking-Akademie der Landwirtschaft und Forstwirtschaft Wissenschaften Grant (KJCX20170404) ( JNKYT201604).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Skyscan 1172 X-ray computed tomography system | Bruker Corporation, Belgium | NA | For CT scanning |
| CO2 critical point drying system (Leica CPD300) | Leica Corporation, Germany | NA | For sample drying |
| Ethanol | Any | NA | For FAA fixation |
| Formaldehyde | Any | NA | For FAA fixation |
| Acetic acid | Any | NA | For FAA fixation |
| Surgical blade | Any | NA | For cutting the sample sgements |
| 3D printer | Makerbot replicator 2, MakerBot Industries, USA | NA | For printing the sample baskets of maize root, stem, and leaf |
| Centrifuge tube | Corning, USA | NA | Place the root, stem, or leaf materials |
| Solid iodine | Any | NA | For sample dyeing |
| SkyScan Nrecon software | SkyScan NRecon, Version: 1.6.9.4, Bruker Corporation, Belgium | NA | For image reconstruction |
| VesselParser software | VesselParser, Version: 3.0, National Engineering Research Center for Information Technology in Agriculture (NERCITA), Beijing, China | NA | Image analysis protocol for single CT image of maize stem or leaf |
| ScanIP | ScanIP, Version: 7.0; Simpleware, Exeter, UK | NA | 3D image processing software |
| Latex gloves | Any | NA | |
| Tweezers | Any | NA |
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