Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

विवो में सेरेब्रल प्रोटीन संश्लेषण की क्षेत्रीय दरों के निर्धारण के लिए मात्रात्मक ऑटोरेडियोग्राफिक विधि

Published: June 28, 2019 doi: 10.3791/58503
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Section on Neuroadaptation and Protein Metabolism, National Institute of Mental Health, National Institutes of Health

Summary

प्रोटीन संश्लेषण कोशिकाओं के लिए एक महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रिया है। मस्तिष्क में, यह अनुकूली परिवर्तन के लिए आवश्यक है. बरकरार मस्तिष्क में प्रोटीन संश्लेषण की दरों के मापन सावधान methodological विचारकी आवश्यकता है. यहाँ हम विवो में सेरेब्रल प्रोटीन संश्लेषण की क्षेत्रीय दरों के निर्धारण के लिए एल-[1-14सी]-ल्यूसिन मात्रात्मक ऑटोरेडियोग्राफिक विधि प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

प्रोटीन संश्लेषण के विकास और न्यूरॉन समारोह के रखरखाव के लिए आवश्यक है और तंत्रिका तंत्र में अनुकूली परिवर्तन में शामिल है. इसके अलावा, यह सोचा है कि तंत्रिका तंत्र में प्रोटीन संश्लेषण के disविनियमन कुछ विकासात्मक विकारों में एक कोर phenotype हो सकता है. पशु मॉडल में मस्तिष्क प्रोटीन संश्लेषण की दरों की सटीक माप इन विकारों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. जिस विधि को हमने विकसित किया है, उसे जागने, जानवरों के व्यवहार के अध्ययन के लिए लागू करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। यह एक मात्रात्मक ऑटोरेडियोग्राफिक विधि है, इसलिए यह मस्तिष्क के सभी क्षेत्रों में एक साथ दरों को प्राप्त कर सकता है। विधि एक अनुरेखक एमिनो एसिड के उपयोग पर आधारित है, एल-[1-14सी]-leucine, और मस्तिष्क में एल-ल्यूसिन के व्यवहार की एक गतिज मॉडल. हमने एल-[1-14C]-leucine को अनुरेखक के रूप में चुना क्योंकि इससे बाह्य लेबल वाले चयापचय उत्पाद नहीं होते हैं। यह या तो प्रोटीन में शामिल है या तेजी से उपज के लिए metabolized 14सीओ2 जो मस्तिष्क में unlabeled सीओ2 के एक बड़े पूल में पतला है. विधि और मॉडल भी प्रोटीन संश्लेषण के लिए ऊतक अग्रदूत पूल करने के लिए ऊतक प्रोटीओलिसिस से व्युत्पन्न unlabeled ल्यूकोइन के योगदान के लिए अनुमति देते हैं। विधि सेल और neuropil परतों में प्रोटीन संश्लेषण दर निर्धारित करने के लिए स्थानिक संकल्प है, साथ ही hypothalamic और कपाल तंत्रिका नाभिक. विश्वसनीय और पुन: उत्पादनीय मात्रात्मक आंकड़े प्राप्त करने के लिए प्रक्रियात्मक विवरणों का पालन करना महत्वपूर्ण है। यहाँ हम विवो में प्रोटीन संश्लेषण की क्षेत्रीय दरों के निर्धारण के लिए मात्रात्मक ऑटोरेडियोग्राफिक एल-[1-14सी]-ल्यूसिन विधि की विस्तृत प्रक्रियाप्रस्तुत करते हैं।

Introduction

प्रोटीन संश्लेषण तंत्रिका तंत्र1में दीर्घकालिक अनुकूली परिवर्तन के लिए आवश्यक एक महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रिया है। प्रोटीन संश्लेषण को रोकना अकशेरुकी और कशेरुकियों दोनों में दीर्घकालिक स्मृति भंडारण को अवरुद्ध करताहै2। प्रोटीन संश्लेषण दीर्घकालिक potentiation के कुछ रूपों के देर से चरणों के रखरखाव के लिए आवश्यक है (LTP) और दीर्घकालिक अवसाद (LTD)3, विकास के दौरान न्यूरॉन अस्तित्व4, और न्यूरॉन के सामान्य रखरखाव के लिए और इसके synaptic कनेक्शन5| मस्तिष्क प्रोटीन संश्लेषण की दरों का मापन एक महत्वपूर्ण उपकरण हो सकता है जिसके साथ अनुकूली परिवर्तनों के साथ-साथ neurodevelopmental विकारों और सीखने और स्मृति से संबंधित विकारों का अध्ययन करने के लिए हो सकता है।

हमने विवो में सेरेब्रल प्रोटीन संश्लेषण की दरों को एक जागते हुए जानवर में निर्धारित करने के लिए एकविधि विकसित की है जो अन्य तकनीकों पर अंतर्निहित लाभ प्रदान करती है जो पूर्व विवो में या मस्तिष्क के ऊतकों की विट्रो तैयारियों में दरों का अनुमान करती है . सबसे पहले एक जाग जानवर में बरकरार मस्तिष्क में माप के लिए प्रयोज्यता है. यह एक महत्वपूर्ण विचार है क्योंकि यह synaptic संरचना और जगह में समारोह के साथ और पोस्टमार्टम प्रभाव के बारे में चिंताओं के बिना माप की अनुमति देता है. इसके अलावा, मात्रात्मक autoradiographic दृष्टिकोण है कि हम रोजगार स्थानिक स्थानीयकरण के एक उच्च डिग्री प्राप्त करता है. जबकि 14ब् की ऊर्जा ऐसी है कि हम अनुकोशिकीय अथवा कोशिकीय स्तर पर अनुरेखक को स्थानीयकृत नहीं कर सकते हैं, हम कोशिका परतों और छोटे मस्तिष्क क्षेत्रों जैसे हाइपोथैलेमिक नाभिक में दरों को माप सकते हैं, जिसमें लगभग 25 डिग्री मी संकल्प7होते हैं।

रेडियोट्रेसर्स के साथ विवो माप में की एक चुनौती यह सुनिश्चित करना है कि रेडियोलेबल मापा गया ब्याज की प्रतिक्रियाके उत्पाद में है न कि बिना प्रतिक्रिया वाले लेबल वाले अग्रदूत या अन्य बाहरी लेबल वाले चयापचय उत्पाद6 . हमने लु-[1-14सी]-ल्यूसिन को अनुरेखक एमिनो एसिड के रूप में चुना क्योंकि इसे या तो प्रोटीन में शामिल किया जाता है या 14 सीओ 2 को तेजी से चयापचय किया जाता है, जो मस्तिष्क में बिना लेबल वाले सीओ2 के बड़े पूल में पतला होता है जिसके परिणामस्वरूप उच्च दर होती है ऊर्जा चयापचय8| इसके अलावा, प्रोटीन में शामिल नहीं किसी भी 14सी मुख्य रूप से मुक्त के रूप में मौजूद है [14C]-leucine, जो 60 मिनट से अधिक प्रयोगात्मक अवधि, लगभग पूरी तरह से ऊतक से मंजूरी दे दी है6. प्रोटीन तो formalin के साथ ऊतक के लिए तय कर रहे हैं और बाद में पानी के साथ कुल्ला करने के लिए किसी भी मुक्त हटाने के लिए [14C]-leucine autoradiography से पहले.

एक अन्य महत्वपूर्ण विचार ऊतक प्रोटीओलिसिस से व्युत्पन्न unlabeled एमिनो एसिड द्वारा अग्रदूत एमिनो एसिड पूल की विशिष्ट गतिविधि के कमजोर पड़ने का मुद्दा है. हमने दिखाया है कि वयस्क चूहे और माउस में, मस्तिष्क में प्रोटीन संश्लेषण के लिए अग्रदूत ल्यूसिन पूल का लगभग 40% प्रोटीन टूटने से प्राप्त अमीनो एसिड से आता है6. यह मस्तिष्क प्रोटीन संश्लेषण (rCPS) के क्षेत्रीय दरों की गणना में शामिल किया जाना चाहिए और अध्ययन में जो इस रिश्ते को बदल सकते हैं में पुष्टि की जानी चाहिए. सैद्धांतिक आधार और विधि की मान्यताओं को कहींऔर 6 में विस्तार से प्रस्तुत किया गया है . इस पत्र में, हम इस पद्धति के आवेदन की प्रक्रियात्मक मुद्दों पर ध्यान केंद्रित.

इस विधि को जमीन गिलहरी9, भेड़10, रीसस बंदर11, चूहों12,13,14,15,16 में आर सीपीएस के निर्धारण के लिए नियोजित किया गया है , 17 , 18 , 19 , 20 , 21, ट्यूबरस स्केलेरोसिस परिसर22के एक माउस मॉडल , नाजुक एक्स सिंड्रोम23,24,25,26, नाजुक एक्स premutation चूहों27, और एक के एक माउस मॉडल फेनिलकेटोनूरिया का माउस मॉडल28| इस पांडुलिपि में, हम इन विवो ऑटोरेडियोग्राफिक एल के साथ आरसीपीएस की माप के लिए प्रक्रियाओं को प्रस्तुत करते हैं-[1-14सी]-ल्यूसिन विधि। हम एक जाग नियंत्रण माउस के मस्तिष्क क्षेत्रों में rCPS प्रस्तुत करते हैं. हम यह भी प्रदर्शित करते हैं कि anisomycin के vivo प्रशासन में, अनुवाद के एक अवरोधक, मस्तिष्क में प्रोटीन संश्लेषण समाप्त.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नोट: सभी पशु प्रक्रियाओं मानसिक स्वास्थ्य पशु देखभाल और उपयोग समिति के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा अनुमोदित किया गया और जानवरों की देखभाल और उपयोग पर स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया.

प्रोटोकॉल का अवलोकन चित्र 1में प्रस्तुत किया गया है।

1. शल्य चिकित्सा अनुरेखक के प्रशासन और समय पर धमनी रक्त के नमूनों के संग्रह के लिए एक ऊरु नस और धमनी में शल्य चिकित्सा प्रत्यारोपण कैथेटर, क्रमशः. ट्रेसर के प्रशासन से पहले कम से कम 22 एच सर्जरी पूरी करें। सर्जरी को पूरा करने के लिए लगभग 1 एच की आवश्यकता होती है।

  1. आवश्यक सामग्री इकट्ठा: बाँझ शल्य चिकित्सा उपकरणों (सर्जिकल कैंची, माइक्रो-कैंची, संदंश, तीन शल्य त्वचा हुक), isoflurane संज्ञाहरण के लिए उपकरण (isoflurane vaporizer, सक्रिय गैस scavenger, सील संज्ञाहरण कक्ष, संज्ञाहरण नाक शंकु), बाँझ सर्जरी चरण, फर क्लिपर, 70% इथेनॉल, betadine, बाँझ धुंध, शल्य टेप, वाणिज्यिक हाथ warmers, शल्य माइक्रोस्कोप, बाँझ 0.9% सोडियम क्लोराइड (सैलिन), बाँझ heparin 100 यूएसपी इकाइयों / नमकीन), बाँझ 5 20 सेमी 6-0 अवशोषणीय सीवन के स्ट्रिप्स, पीई-8 और पीई-10 पॉलीथीन कैथेटर के बाँझ 25 सेमी किस्में 45ओपर एक छोर कटौती के साथ, बाँझ 1 सीसी सिरिंज, बाँझ 32 गेज सुइयों, कॉटरी उपकरण, बाँझ 15-20 सेमी खोखले दाग स्टील रॉड (2.5 मिमी व्यास के अंदर, 3 मिमी व्यास के बाहर), स्थानीय एनेस्थेटिक्स (bupivacaine और lidocaine मरहम), और कुंडा उपांग सेटअप के साथ एक पशु बाड़े (30 सेमी स्प्रिंग टेदर बटन के साथ, कुंडा, कुंडा माउंट और हाथ, 20 एक्स 13 सेमी स्पष्ट बेलनाकार कहूँ तोक)
  2. सर्जरी के लिए पशु तैयार करें।
  3. आश्वासन है कि उचित aseptic और बाँझ तकनीक के रूप में अपनी संस्था के लिए आवश्यक उपयोग किया जाता है.
    1. जानवर का वजन करें। सफल सर्जरी के लिए जानवर कम से कम 25 ग्राम होना चाहिए।
    2. जानवर को सीलबंद प्लेक्सीग्लास चैम्बर के अंदर रखें और कक्ष को आइसोफ्लुरेन संज्ञाहरण उपकरण से जोड़ दें। पुरुषों के लिए 2.5 L/min के लिए प्रवाह दर निर्धारित करें और ओ2में 1.5% isoflurane की महिलाओं के लिए 3.0 L/ मोटे तौर पर 2 मिनट के बाद, सुनिश्चित करें कि माउस उचित रूप से एक अंगुली चुटकी के साथ एक वापसी पलटा की कमी से बेहोश है.
    3. एक बार बेहोश हो जाने पर, कक्ष से माउस को हटा दें और संज्ञाहरण नाक शंकु के अंदर अपने चेहरे के साथ एक प्रवण स्थिति में रखें। वाष्पित्र से गैस प्राप्त करने के लिए और गैस scavenger को गैस लौटने के लिए नाक शंकु सेट करें। सफाई कर्मचारी एक लकड़ी का कोयला फिल्टर में isoflurane पर कब्जा होगा.
    4. कंधे ब्लेड के बीच फर दाढ़ी के लिए क्लिपर का प्रयोग करें। ठीक से मुंडा क्षेत्र बाँझ करने के लिए सुनिश्चित करें, betadine और इथेनॉल scrubs के बीच तीन बार बारी.
    5. माउस को नाक शंकु में चेहरे को रखने के लिए एक सुपाच्य स्थिति में पलटें। सर्जरी के चरण पर बाएं पैर को पतला करें और बाएं भीतरी जांघ से ऊपरी बाएं पेट तक फर दाढ़ी करने के लिए क्लिपर का उपयोग करें। ठीक से मुंडा क्षेत्र बाँझ करने के लिए सुनिश्चित करें, betadine और इथेनॉल scrubs के बीच तीन बार बारी.
    6. माउस के नीचे, धुंध में लिपटे एक सक्रिय व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैंडवार्मर स्लाइड करें। सर्जरी के चरण पर दाहिने पैर नीचे टेप।
  4. बाएं ऊरु शिरा में कैथेटर डालें।
    1. सर्जिकल माइक्रोस्कोप की सहायता से, बाईं जांघ के ऊपरी मध्य भाग से मिडलाइन की ओर 1 सेमी चीरा बनाने के लिए सर्जिकल कैंची का उपयोग करें, जो ऊरु धमनी और नस को प्रकट करता है।
    2. आगे vesicles बेनकाब करने के लिए शल्य त्वचा हुक के साथ ढीली त्वचा को वापस लें।
    3. पर्याप्त नमी बनाए रखने के लिए उजागर क्षेत्र में बाँझ 0.9% सोडियम क्लोराइड लागू करें।
    4. ऊरु धमनी और नस के एक छोटे से खंड के आसपास संयोजी ऊतक को अलग करने, विच्छेदन कुंद करने के लिए संदंश का प्रयोग करें। धमनी और शिरा को सावधानी से अलग करें (चित्र 2)।
    5. चीरा के सबसे पार्श्व बिंदु पर दोनों ऊरु नस और धमनी के तहत अवशोषित सीवन (स्ट्रैंड ए) के एक किनारा धागा करने के लिए संदंश का प्रयोग करें। सीवन आधे रास्ते के माध्यम से खींचतो समाप्त होता है भी कर रहे हैं.
    6. कमर के लिए एक अधिक समीपस्थ बिंदु पर, केवल ऊरु नस के तहत एक दूसरे सीवन (स्ट्रैंड बी) धागा करने के लिए forceps का उपयोग करें। धीरे से एक आधा गाँठ है कि रक्त के प्रवाह को प्रतिबंधित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा टाई.
    7. स्ट्रैंड ए और स्ट्रैंड बी के बीच एक बिंदु पर, केवल ऊरु नस के तहत एक तिहाई सीवन (स्ट्रैंड सी) धागा करने के लिए संदंश का उपयोग करें। धीरे से एक पूरी गाँठ है कि रक्त के प्रवाह को प्रतिबंधित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा टाई. नस फाड़ ने सावधान रहें।
    8. रक्त प्रवाह को प्रतिबंधित करने के लिए स्ट्रैंड बी पर धीरे से टग करें। प्रतिबंधित रक्त प्रवाह को बनाए रखने के लिए धीरे से स्ट्रैंड बी खींचने के लिए एक हेमोस्टका टयूब का उपयोग करें।
    9. माइक्रोसिकर्स के साथ ऊरु नस के प्रतिबंधित क्षेत्र में एक छोटा सा छेद काटें और ध्यान से पीई-8 ट्यूबिंग के कोण वाले अंत को सम्मिलित करें (पहले हेपरिन नमकीन के साथ फ्लश किया गया था) स्ट्रैंड बी की ओर। एक बार डाला, Strand बी तनाव जारी है और कैथेटर आगे नस गाइड. कैथेटर युक्त नस के चारों ओर स्ट्रैंड बी को कसें।
    10. स्ट्रैंड सी का उपयोग करना, कैथेटर के चारों ओर एक अतिरिक्त गाँठ टाई. सुनिश्चित करें कि इस गाँठ ऊरु धमनी पर कब्जा नहीं करता है.
    11. धीरे से सिरिंज बैरल पर वापस खींचने के लिए आंशिक रूप से रक्त के साथ ट्यूबिंग भरने के लिए सुनिश्चित करें कि कैथेटर ठीक से प्रत्यारोपित किया गया है.
  5. एक ही प्रक्रिया के बाद, बाएं ऊरु धमनी में एक पीई-10 कैथेटर डालें।
  6. शल्य चिकित्सा प्रक्रिया को पूरा करें।
    1. एक बार दोनों ऊरु शिरा और धमनी कैथेटर सुरक्षित किया गया है, दोनों कैथेटर के आसपास एक गाँठ में Strand ए टाई.
    2. सभी अतिरिक्त टांके काटें और त्वचा के हुक हटा दें। धमनी कैथेटर को थक्के को रोकने के लिए हेपरिनीकृत लवण के साथ फ्लश करें। एक मुहर बनाने के लिए दोनों कैथेटर के सिरों Cauterize.
    3. प्रवण स्थिति में माउस प्लेस और गर्दन के आधार पर एक छोटा सा चीरा बनाने के लिए और उजागर क्षेत्र के लिए नमकीन लागू होते हैं।
    4. गर्दन चीरा से ऊरु चीरा करने के लिए खोखले धातु की छड़ subdermally डालें. खोखले रॉड के माध्यम से कैथेटर साँप और गर्दन चीरा से बाहर. खोखले रॉड निकालें. कैथेटर को सबडरली लगाने से चूहों को कैथेटरों को नुकसान नहीं पहुंचा है।
    5. घाव के किनारों पर बुनिवाकेन लगाएं। सीवन के साथ ऊरु चीरा बंद करो. बंद, सीवन घाव पर लिडकेन मरहम जोड़ें।
    6. एक 30 सेमी लचीला खोखले ट्यूब के माध्यम से कैथेटर साँप (स्प्रिंग टेदर) और त्वचा के नीचे वसंत तार के बटन सीवन. घाव के किनारों पर बुनिवाकेन लगाएं। त्वचा के नीचे वसंत टेदर के बटन सीवन. बंद, सीवन घाव पर लिडकेन मरहम जोड़ें।
    7. वसूली की अवधि के दौरान जानवर घर के लिए एक कुंडा माउंट और हाथ के साथ एक स्पष्ट बेलनाकार कंटेनर (20 सेमी उच्च, 13 सेमी व्यास) में माउस ले जाएँ। जानवर को गर्म रखने के लिए कंटेनर के नीचे एक हाथ गर्म रखें।
    8. एक कुंडा के लिए वसंत तार के शीर्ष पेंच और कुंडा बेलनाकार कंटेनर से जुड़ी कुंडा हाथ को सुरक्षित. सुनिश्चित करें कि माउस गति की पूरी रेंज है और कैथेटर पहुँचा जा सकता है.
    9. एक स्लॉटेड ढक्कन रखें जो पशु बाड़े पर कुंडा तंत्र के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है। पूर्ण सेटअप के लिए चित्र 3 देखें.
    10. माउस को पुनर्प्राप्त करने की अनुमति दें. कम से कम 22 एच की सिफारिश की है.

2. इंजेक्शन के लिए एल-[1-14सी]ल्यूसिन समाधान और 16% (w/v) 5-सल्फोसैलिसिलिक एसिड (एसएसए) प्लाज्मा नमूनों को विप्रोटीनीकृत करने के लिए डाइहाइड्रेट समाधान तैयार करें। सर्व शिक्षा उपायों के समाधान में 0ण्04 एम एम नॉर्ल्यूसिन तथा 1 डिग्री सी आई/एमएल -एच3एम एल एम आई अम्ल विश्लेषण के लिए आंतरिक मानकों के रूप में तथा अम्ल-विलेय प्लाज्मा भिन्नों में अनुरेखक सांद्रता का विश्लेषण भी शामिल है। एसएसए को दो महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

  1. खरीद व्यावसायिक रूप से उपलब्ध L-[1-14C]leucine (50-60 mCi/mmol), जो 2% इथेनॉल या 0.1 एन एचसीएल में एक समाधान के रूप में बेचा जाता है। नाइट्रोजन की एक कोमल धारा के तहत अनुरेखक की एक ज्ञात गतिविधि को उड़ाएं और बाँझ सामान्य लवण के समाधान में पुनर्गठन करें। 100 डिग्री सेल्सियस की एकाग्रता तक।

3. प्रशासन L-[1-14C]leucine नसों में और धमनी रक्त के नमूने एकत्र.

  1. आवश्यक सामग्री इकट्ठा: 18 1.5 एमएल microtubes deproteinizing प्लाज्मा नमूने के लिए (प्रत्येक ट्यूब के लिए deionized पानी के 70 एमएल जोड़ें), 17 250mL कांच शीशी आवेषण (15 धमनी रक्त के नमूने के संग्रह के लिए सम्मिलित करता है और मृत अंतरिक्ष रक्त के संग्रह के लिए 2 आवेषण किया जा करने के लिए फिर से इंजेक्शन. अतिरिक्त और अनावश्यक रक्त के संग्रह को सीमित करने के लिए, छोटे, पतले कांच शीशी पतला नीचे है कि supernatant प्लाज्मा के सुलभ pipeting के लिए अनुमति के साथ आवेषण की सिफारिश की है, 2 microcapillary ट्यूबों (32 एक्स 0.8 मिमी, hematocrit माप के लिए), 1 heparin और लिथियम फ्लोराइड लेपित microcentrifuge ट्यूब (के थक्के और ग्लाइकोलिसिस को रोकने के लिए, क्रमशः), hemostats (टिगॉन ट्यूबिंग के साथ सुझावों को कवर इतना है कि clamps पीई ट्यूबिंग नुकसान नहीं होगा), रक्त ग्लूकोज की निगरानी, रक्तचाप ट्रांसड्यूसर, 1 एमएल बाँझ सिरिंजों (के लिए नमकीन flushes), और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इच्छामृत्यु समाधान (deionized पानी में 1:1 पतला (मस्से के लिए)।
  2. सुनिश्चित करें कि प्रयोग के शुरू में जानवर एक सामान्य शारीरिक स्थिति में है।
    1. अंत से 2 सेमी के बारे में धमनी ट्यूबिंग दबाना और टिप काट, रक्त के लिए एक खोलने के प्रवाह के लिए बनाने. फिर ट्यूबिंग को अनक्लिम्प करें और मृत अंतरिक्ष रक्त ((c. 30 एमएल) को इकट्ठा करने के लिए पिछले ड्रॉ से किसी भी अवशिष्ट नमकीन और/या रक्त एकत्र करने के लिए), और, एक अलग ट्यूब में, एक नियंत्रण नमूना इकट्ठा (लगभग 30 डिग्री सेल्सियस), हेमेटोक्रिट नमूने (केशिका ट्यूब की मात्रा के लगभग आधे), और एक ग्लूकोज नमूना (लगभग 20 डिग्री सेल्सियस)।
    2. सीलेंट पोटली और अपकेंद्रित्र के साथ एक छोर को 4500 x ग्राम पर 1 मिनट के लिए प्लग करके हेमेटोक्रिट को मापें। कुल रक्त मात्रा में लाल कोशिकाओं की मात्रा के अनुपात को मापें। यदि किसी जानवर में 30% से कम हेमाटोक्रिट है, तो अध्ययन जारी न रखें।
    3. रक्त की एक बूंद में ग्लूकोज के स्तर को मापने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रक्त ग्लूकोज मॉनिटर का उपयोग करें।
    4. प्लाज्मा अलग करने के लिए 18,000 x ग्राम पर 2 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज नियंत्रण नमूना। प्लाज्मा नमूनों को निम्नानुसार विप्रोटीनीकृत करें: 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में 70 डिग्री सेल्सियस जल में प्लाज्मा के 5 डिग्री एल जोड़ें, 16% एसएसए समाधान और भ्रमिल के 25 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। सूखी बर्फ पर ठंड से पहले 30 मिनट के लिए बर्फ पर रखें.
    5. शिरापरक लाइन के माध्यम से पशु को मृत अंतरिक्ष रक्त वापस, अतिरिक्त रक्त हानि को रोकने के लिए एक heparinized नमकीन फ्लश द्वारा पीछा किया।
    6. धमनी रक्तचाप को मापने के लिए एक रक्तचाप ट्रांसड्यूसर करने के लिए धमनी लाइन कनेक्ट करें।
    7. नमूने लेने के बाद धमनी लाइन फिर से दबाना करने के लिए और heparinized नमकीन की एक छोटी (50 एमएल) मात्रा के साथ लाइन फ्लश करने के लिए सुनिश्चित हो।
  3. अंतःशिरा ट्रेसर प्रशासन और समय पर धमनी रक्त के नमूने इकट्ठा।
    1. ट्रेसर के साथ एक सिरिंज संलग्न करने के लिए एक वाई-कनेक्टर का उपयोग करें (100 डिग्री सेल्सियस/किलोग्राम) और ट्रेसर के इंजेक्शन के बाद शिरापरक लाइन को फ्लश करने के लिए 50 एमएल बाँझ नमकीन के साथ एक सिरिंज। वेशिरा लाइन के लिए Y-कनेक्टर कनेक्ट करें।
    2. एक साथ एक स्टॉप वॉच शुरू करने और ट्रेसर इंजेक्शन द्वारा अध्ययन शुरू करें। इंजेक्शन के तुरंत बाद नमकीन (c. 100mL) के साथ शिरापरक लाइन फ्लश करें।
    3. एक ही तरीके से प्रयोग के पहले 2 मिनट भर में लगातार रक्त के नमूने 1-7 ले लीजिए। 7 वीं नमूना इकट्ठा करने के बाद, प्रत्येक शेष नमूने से पहले 30 डिग्री सेल्सियस मृत अंतरिक्ष रक्त इकट्ठा. नमूने 8-14 क्रमशः 3, 5, 10, 15, 30, 45, और 60 मिनट पर एकत्र कर रहे हैं।
    4. संग्रह के तुरंत बाद रक्त के नमूनों की प्रक्रिया, के रूप में नियंत्रण नमूने के लिए वर्णित किया गया था. यदि कोई विलंब होता है, तो नमूने बर्फ पर रखें। ध्यान से धमनी कैथेटर के माध्यम से धमनी में मृत अंतरिक्ष रक्त को फिर से शामिल करें और हेपरिन लवण के साथ फ्लश करें।
    5. प्रयोग के दौरान कुछ बिंदु पर, 25 डिग्री एल 16% एसएसए, 0.04 एम एम norleucine, और 1 mCi/mL ]3H]leucine को 75 डिग्री सेल्सियस पानी, भंवर और बर्फ पर जगह जोड़कर तीन आंतरिक मानकों को संसाधित करें।
    6. 60 मिनट पर 14 वीं नमूना इकट्ठा करने के बाद, जानवर euthanize करने के लिए शिरापरक लाइन में बी-यूथेनिया-डी के लगभग 0.2 एमएल इंजेक्ट करें। मृत्यु का समय रिकॉर्ड करें।
    7. कुंडा माउंट से जानवर खोलना और पशु बाड़े से हटा दें। ध्यान से मस्तिष्क को हटाने, एल्यूमीनियम पन्नी पर जगह है, और सूखी बर्फ पर फ्रीज. तरल नाइट्रोजन के साथ दिमाग फ्रीज न करें क्योंकि दिमाग दरार कर सकता है। प्रसंस्करण के लिए तैयार जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर मस्तिष्क, नमूने, और आंतरिक मानकों को स्टोर। प्रसंस्करण के बाद किसी भी बिंदु पर किया जा सकता है.

4. प्लाज्मा नमूनों में ल्यूकोइन और एल-[1-14सी]ल्यूसिन की सांद्रता का विश्लेषण करें।

  1. Thaw नमूने और बर्फ पर आंतरिक मानकों, भंवर, और अपकेंद्रित्र 18,000 x ग्राम के लिए 5 मिनट पर 2 डिग्री सेल्सियस. supernatant अंश मुक्त लेबल और unlabeled ल्यूकोइन शामिल होंगे.
  2. एक तरल scintillation शीशी के लिए supernatant के 40 $L स्थानांतरण और scintillation कॉकटेल जोड़ें. तरल प्रस्फुरण गणना के माध्यम से 3एच और 14सी के प्रति मिनट (डीपीएम) और एक साथ डबल लेबल (3 एच और 14सी) गिनती के लिए डिज़ाइन किया गया एक शमन वक्र के प्रति विघटन की मात्रा।
  3. प्लाज्मा ल्यूकोइन सांद्रता की मात्रा निर्धारित करने के लिए, एक सोडियम धन विनिमय कॉलम और ओ-फ्थैल्डिहाइड और फ्लोरोमेट्रिक डिटेक्शन के साथ पोस्ट-कॉलम डेरीवाटन के साथ एचपीएलसी सिस्टम का उपयोग करें।
    1. निम्नलिखित विनिर्देशों के लिए HPLC सेट: 330 एनएम के fluorometer उत्तेजना और 465 एनएम के उत्सर्जन. मोबाइल चरण में सोडियम एलुआंट, पीएच 7.40 और सोडियम एलुआंट + 5% सल्फोलेन, पीएच 3.15 होते हैं। 0.400 एमएल/मिनट की बफर प्रवाह दर और डेरीगेटाइजेशन उपकरण प्रवाह दर को 0.300 एमएल/मिनट पर सेट करें। कॉलम तापमान को 48 डिग्री सेल्सियस और रिएक्टर तापमान को 45 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
    2. एमिनो एसिड सांद्रता की एक श्रृंखला के साथ प्रणाली अंशांक (norleucine सहित) के बीच 30 और 500 pmol/ अंशांकन वक्र रैखिक है। परीक्षण के एमिनो एसिड सांद्रता 10 एमएल इंजेक्शन नमूने इस अंशांकन वक्र की श्रेणियों के भीतर गिर जाते हैं.

5. मात्रात्मक autoradiography प्रदर्शन करते हैं।

  1. ऑटोरेडियोग्राफी के लिए मोटाई में मस्तिष्क वर्गों 20 डिग्री मीटर तैयार करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर एक क्रायोस्टैट के माध्यम से धारा मस्तिष्क।
  2. Thaw जिलेटिन लेपित स्लाइड पर सीरियल मस्तिष्क वर्गों माउंट. हवा सूखी.
  3. परिवर्तन प्रति 30 मिनट के लिए 10% फॉर्मेलिन के पांच परिवर्तनों में स्लाइड्स को धोएं, इसके बाद 1 एच के लिए deionized पानी का निरंतर प्रवाह होता है। स्लाइड को धूल से बचने के लिए पन्नी के साथ खुले तौर पर कवर करें और 24 ज के लिए सूखने की अनुमति दें।
  4. एक एक्स-रे फिल्म कैसेट में स्लाइड की व्यवस्था (कैसेट कि फिट 20X25 सेमी मैमोग्राफी फिल्मों की सिफारिश कर रहे हैं) के एक सेट के साथ साथ[14C]methylmethacrylate मानकों, जो पहले ज्ञात 14सी सांद्रता के ऊतकों के खिलाफ calibrated थे के रूप में 29वर्णित | मानक व्यावसायिक रूप से खरीदे जा सकते हैं लेकिन यह सुनिश्चित करें कि वे 2-300 mCi/g ऊतक की एक सीमा को कवर और 20 डिग्री ऊतक मोटाई के खिलाफ calibrated हैं. लाल सेफलाइट के तहत, मैमोग्राफी फिल्म का एक टुकड़ा, पायस साइड नीचे, वर्गों के शीर्ष पर रखें।
  5. कैसेट सील और एक काले बदलते बैग में जगह है और 40-45 दिनों के लिए एक कैबिनेट में दुकान.
  6. निर्माता के निर्देशों के अनुसार फिल्मों का विकास करना। नोट: स्वचालित फिल्म विकास की सिफारिश नहीं है क्योंकि पृष्ठभूमि असमान हो सकता है और परिमाणीकरण को प्रभावित कर सकते हैं.

6. छवियों का विश्लेषण करें।

नोट: छवि विश्लेषण के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कार्यक्रम एक सीसीडी कैमरा और भी रोशनी के साथ एक फ्लोरोसेंट प्रकाश बॉक्स के साथ युग्मित की सिफारिश की है. प्रबुद्ध फिल्म में रिश्तेदार ऑप्टिकल घनत्व सीसीडी कैमरे द्वारा पता चला रहे हैं.

  1. फिल्म पर calibrated मानकों के सेट के ओडी के आधार पर ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) v. ऊतक 14सी एकाग्रता के एक अंशांकन वक्र का निर्माण। एक बहुपद समीकरण के लिए इन डेटा (रिक्त या पृष्ठभूमि सहित) फ़िट करें। या तो एक दूसरे या तीसरे डिग्री बहुपद समीकरण बहुत अच्छी तरह से फिट बैठता है.
  2. विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों का विश्लेषण करने के लिए, एक मस्तिष्क एटलस के साथ तुलना करके छह से आठ वर्गों में ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) का पता लगाने. सभी अनुभागों में एक ROI के भीतर पिक्सेल के ओडी रिकॉर्ड करें और, अंशांकन वक्र के आधार पर, प्रत्येक पिक्सेल में ऊतक 14C एकाग्रता की गणना करें। ROI में औसत ऊतक 14C सांद्रता की गणना करें।

7. आरसीपीएस की गणना। निम्न समीकरण के माध्यम से प्रत्येक ROI में rCPS की गणना करें:

Equation

जहां पी * (टी) ROI में 14सी की भारित औसत ऊतक एकाग्रता है, सीपी(टी) और सी*पी(टी) समय पर unlabeled और लेबल ल्यूकोइन की धमनी प्लाज्मा सांद्रता रहे हैं, टी, टी समय है कि जानवर मर गया ( के बारे में 60 मिनट), और $ ऊतक अग्रदूत पूल है कि प्लाज्मा से आता है में ल्यूकोइन का अंश है. एक पृथक प्रयोग 6में प्रमूल्यांकन किया जाता है। डट, Fmr1 नॉकआउट, Tsc+/-, और PKU चूहों 6,22,25,28में मूल्यांकन किया गया है। यदि किसी प्रयोग में आनुवंशिक या औषधीय परिवर्तन शामिल हैं जो प्रोटीन संश्लेषण, निम्नीकरण, या ल्यूकोइन के चयापचय की दरों को प्रभावित कर सकते हैं, तो नई परिस्थितियों के तहत मूल्यांकन किया जाना चाहिए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

यहाँ हम एक प्रतिनिधि प्रयोग rCPS पर एक प्रोटीन संश्लेषण अवरोध करनेवाला के पूर्व प्रशासन के प्रभाव का प्रदर्शन दिखा. सामान्य नमकीन में Anisomycin एक वयस्क C57/BL6 पुरुष जंगली प्रकार माउस subcutaneously (100 mg/kg) 30 मिनट rCPS दृढ़ संकल्प की दीक्षा से पहले करने के लिए प्रशासित किया गया था. एक वाहन उपचार नियंत्रण पशु की तुलना में anisomycin उपचार के प्रभाव से पता चलता है कि rCPS लगभग anisomycin इलाज माउस में undetectable है (चित्र 4). ये डेटा एक मान्यता का प्रतिनिधित्व करते हैं कि विवो ऑटोरेडियोग्राफिक एल-[1-14सी]-ल्यूसिन विधि मस्तिष्क में प्रोटीन संश्लेषण की दरों को मापता है।

हम विधि के संकल्प को प्रदर्शित करने के लिए मस्तिष्क के चार स्तरों पर ल-[1-14C]-ल्यूसिन ऑटोरेडियोग्राम का एक आंकड़ा प्रस्तुत करते हैं (चित्र 5)। इलस्ट्रेटेड घ्राण बल्ब में कोशिका स्तर (चित्र 5क और बी), हिप्पोकैम्पस (चित्र 5 ब्) और सेरिबैलम ( चित्र5जी) हैं . हाइपोथैलेमस में न्यूक्लिय (चित्र 5D), पोन्स (चित्र 5ई और एफ) और मस्तिष्क तना (चित्र 5भ्) भी ऑटोरेडियोग्राम में स्पष्ट रूप से देखा जाता है. हम यह भी ललाट प्रांतस्था में प्रोटीन संश्लेषण की मात्रात्मक क्षेत्रीय दरों (5.88 nmol/g/min) (चित्र 6A) और पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस (5ण्35 nmol/g/min) (चित्र 6B) एक विशिष्ट नियंत्रण जानवर की.

Figure 1
चित्र 1: संपूर्ण rCPS प्रोटोकॉल के चरणों का प्रतिनिधित्व करने वाले Schematic. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: उजागर ऊरु धमनी और ऊरु शिरा की छवि. एक दूसरे के समानांतर बिछाने, ऊरु धमनी ऊरु नस के ऊपर दिखाया गया है। ऊरु शिरा भी ऊरु धमनी की तुलना में एक गहरा लाल रंग है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: rCPS प्रयोग के लिए अनुशंसित पशु संलग्नक सेट-अप की छवि. यह एक वसंत तार से जुड़े कुंडा उपांग के साथ एक स्पष्ट बेलनाकार पशु बाड़े का इस्तेमाल करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: एक वाहन का इलाज जानवर से प्रतिनिधि छवियों (ए) ए anisomycin के साथ इलाज किया एक जानवर के साथ तुलना में (100 mg/kg, subcutaneously) 30 मि.मी. प्रोटीन संश्लेषण की दरें छवि में अंधेरे के स्तर के समानुपाती होती हैं। Anisomycin काफी इस विधि की विशिष्टता का संकेत प्रोटीन संश्लेषण की मापा दरों को कम कर देता है. A के ऊपरी दाएँ भाग में स्केल बार 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है और दोनों छवियों पर लागू होता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: घ्राण बल्ब (ए, बी), हाइपोथैलेमस (सी, डी), पोन्स (ई, एफ), सेरिबैलम (जी), और मस्तिष्क स्टेम (जी, एच) के स्तर पर एक जाग व्यवहार माउस से डिजीटल autoradiograms। गहरे क्षेत्रों में उच्च rCPS है. पैनल जी में स्केल बार पैनल ए, सी, ई, और जी Autoradiograms पर दाईं ओर लागू होता है (बी, डी, एफ, और एच) बाईं ओर छवियों पर नामित क्षेत्रों से बढ़े हुए चित्र हैं और पैनल में स्केल बार H पैनल बी पर लागू होता है , डी, एफ, और एच संक्षिप्तरूप इस प्रकार हैं: FrA, ललाट संघ प्रांतस्था; ओबी, घ्राण बल्ब; ए.ओ., अग्रकाल घ्राण नाभिक; Gl, ग्लोमेरूलर परत; EPl, बाहरी plexiform परत; BLA, basolateral amygdala; पाय, पिरामिडी कोशिका परत; dHi, पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस; डीजी, दंतेतर जाइरस; MHb, मध्यस्थ habenula; Rt, थैलेमिक रेटिक्युलर नाभिक; VMH, अधर मध्य हाइपोथैलेमिक नाभिक; आर्क, आर्कुएट नाभिक; ईडब्ल्यू, एडिंगर-वेस्टफेल नाभिक; आर, लाल नाभिक; पी.एन., पोंटीन नाभिक; एमएल, आणविक परत; जीएल, दानेदार परत; पीसी, पुर्कीज सेल परत; क्यू, cuneate नाभिक; एपी, क्षेत्र postrema; 10, वेगस की पृष्ठीय मोटर नाभिक; 12, हाइपोग्लोसल नाभिक। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: ललाट प्रांतस्था (ए) और पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस (बी) के स्तर पर नियंत्रण माउस व्यवहार एक जाग से डिजीटल autoradiograms. मस्तिष्क प्रोटीन संश्लेषण की दरें सही पर दिखाया रंग पट्टी के अनुसार छवियों में कोडित रंग हैं. A के निचले बाएँ में स्केल बार 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है और दोनों छवियों पर लागू होता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

हम प्रयोगात्मक पशुओं में विवो में सेरेब्रल प्रोटीन संश्लेषण (आरसीपीएस) की क्षेत्रीय दरों के निर्धारण के लिए एक मात्रात्मक विधि प्रस्तुत करते हैं। इस विधि मौजूदा तरीकों पर काफी लाभ है: 1. माप जाग व्यवहार जानवर में बना रहे हैं, तो वे कार्य मस्तिष्क में चल रही प्रक्रियाओं को प्रतिबिंबित. 2. माप मात्रात्मक autoradiography के माध्यम से किया जाता है सभी क्षेत्रों और मस्तिष्क के उपक्षेत्रों में एक साथ rCPS निर्धारित करने की क्षमता affording. 3. विधि की गतिज मॉडल ऊतक प्रोटीन गिरावट से व्युत्पन्न unlabeled एमिनो एसिड के रीसाइक्लिंग और प्रोटीन संश्लेषण के लिए अग्रदूत पूल पर इसके प्रभाव को ध्यान में रखताहै 6.

इस विधि की प्राथमिक सीमा यह है कि यह समय लेने वाली और मांग है. जबकि यह सरल और उच्च थ्रूपुट तरीकों को रोजगार देने के लिए आकर्षक है, प्राप्त आंकड़ों की सीमाओं को स्वीकार किया जाना चाहिए।

एक बरकरार माउस में rCPS को मापने की जटिलता की वजह से, एक सामान्य शारीरिक राज्य के रखरखाव के साथ समस्याओं, पर्याप्त रक्त के नमूने इकट्ठा करने, और संभवतः हस्तक्षेप की स्थिति से बचने का सामना किया जा सकता है. शिरापरक और धमनी कैथेटर के सर्जिकल प्रत्यारोपण चुनौतीपूर्ण है। किसी भी शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के साथ के रूप में, विशेष रूप से नाजुक vascuculature से निपटने के साथ, वहाँ पशु की मृत्यु के लिए एक अंतर्निहित जोखिम है. हमारे लिए, यह दुर्लभ है (के बारे में 1%). आगामी 22 एच वसूली अवधि के दौरान, कभी कभी (के बारे में 4%) एक जानवर एक कैथेटर बाहर खींच लेंगे. माप के दौरान, यह महत्वपूर्ण है कि कैथेटर पेटेंट हैं और जानवरों को एक सामान्य शारीरिक स्थिति में हैं. हमारे हाल के अनुभव में, धमनी रक्त जानवरों के बारे में 2% में एकत्र नहीं किया जा सकता है और जानवरों के बारे में 1% एक कम hematocrit था (और lt; 40%) या कम धमनी रक्तचाप (और 85 मिमी एचजी), सर्जरी के दौरान रक्त की हानि का सुझाव और /

ऑटोरेडियोग्राफी के लिए मस्तिष्क वर्गों की तैयारी में, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि अनुभागमोटाई 20 डिग्री है क्योंकि वह खंड मोटाई है जिसके लिए 14 सी]मेथिलमेथाक्रिलेट मानकों को अंशांकित किया गया है। अच्छी गुणवत्ता वर्गों, यानी, आँसू, परतों, या बुलबुले के बिना सुनिश्चित करने के लिए देखभाल का उपयोग करें क्योंकि इन खामियों autoradiographic विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप करेगा. हम हाथ से autoradiographic फिल्मों के विकास के बजाय एक स्वचालित फिल्म प्रोसेसर में से क्योंकि हम पाते हैं कि पृष्ठभूमि ऑप्टिकल घनत्व असमान स्वचालित प्रसंस्करण के बाद किया जा सकता है, और यह परिमाणीकरण को प्रभावित कर सकते हैं.

rCPS के लिए समीकरण में, हम एक कारक शामिल हैं, लैम्ब्डा (जेड), कि ल्यूकोइन का अंश है कि धमनी प्लाज्मा से आता है, शेष ऊतक प्रोटीन गिरावट6से व्युत्पन्न एमिनो एसिड के रीसाइक्लिंग से आता है. हम WT और Fmr1 KO (fragile X मॉडल) C57Bl/6J चूहों में अलग-अलग प्रयोगों में $ का मूल्यांकन किया है और पता चला है कि इसके मूल्य 0.603 है। प्रजातियों, आनुवंशिक पृष्ठभूमि, या आनुवंशिक उत्परिवर्तन की उपस्थिति के आधार पर $ का मान भिन्न हो सकता है। इसलिए, यदि अन्य मॉडलों के लिए प्रोटीन संश्लेषण प्रयोगों को डिजाइन किया जाता है, तो सटीक माप प्राप्त करने से पहले एक का मूल्यांकन करने की आवश्यकता होगी।

neurodevelopmental विकारों के आनुवंशिक माउस मॉडल में हमारा काम दर्शाता है कि इस पद्धति इन मॉडलों में rCPS में परिवर्तन का पता चलता है और कुछ मामलों में औषधीय उपचार के लिए प्रतिक्रियाओं22,23,25 , 26.यह भी अनुमान है कि आरसीपीएस माप अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग, नाजुक एक्स कंपन ataxia सिंड्रोम, दर्दनाक मस्तिष्क की चोट, आदि के मॉडल के रूप में स्थितियों में मस्तिष्क में अपक्षयी परिवर्तन की निगरानी कर सकते हैं इन मॉडलों, यह जल्दी अपक्षयी परिवर्तन और संभवतः भी जल्दी हस्तक्षेप करने के लिए प्रतिक्रियाओं को ट्रैक करने के लिए संभव हो सकता है. आरसीपीएस विधि का उपयोग इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ समानांतर खंडों में किया जा सकता है ताकि विशिष्ट मस्तिष्क परिवर्तनों की आगे जांच की जासके. संक्षेप में, मात्रात्मक स्वविकिरणी L-[1-14C]-leucine विधि विवो में आरसीपीएस मूल्यों के सटीक निर्धारण के लिए आदर्श है। यह सटीकता और मौजूदा तरीकों से अधिक vivo शर्तों में प्रयोज्यता के मामले में काफी लाभ प्रदान करता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के हित का कोई संघर्ष नहीं है खुलासा करने के लिए.

Acknowledgments

लेखक चूहों के जीनोटाइपिंग के लिए ज़ेंगयान ज़िया को स्वीकार करना चाहते हैं, एमिनो एसिड और फिल्मों के प्रसंस्करण के लिए टॉम बर्लिन, और कुछ rCPS प्रयोगों के प्रदर्शन के लिए मेई क्यून। इस शोध NIMH के Intramural अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था, जिया MH00889. RMS भी एक Autism बोलती Postdoctoral फैलोशिप 8679 और एक FRAXA Postdoctoral फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice The Jackson Laboratory 003024 Fmr1 knockout breeding pairs
Anisomycin Tocris Bioscience 1290
Microhematocrit Tubes Drummond Scientific 1-000-3200-H capillary tubes
Critoseal Capillary Tube Sealant Leica Microsystems 39215003 sealant putty
Glass vial inserts Agilent 5183-2089 used to collect blood samples
Digi-Med Blood Pressure Analyzer Micro-Med Inc. BPA-400 blood pressure analyzer
Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System Bayer Breeze 9570A glucose meter
Gastight syringe Hamilton Co. 1710 tuberculin glass syringe
HeatMax HotHands-2 Hand Warmers HeatMax Model HH2 warming pads
Heparin Lock Flush Solution Fresenius Kabi USA, LLC 504505 heparin saline
Clear animal container Instech MTANK/W animal enclosure
Spring tether Instech PS62 catheter tube/rodent attachment
Swivel Instech 375/25 hooks to spring tether
Swivel arm and mount Instech SMCLA hooks to swivel and animal enclosure
Tether button Instech VAB62BS/22 attaches to bottom of spring tether
Stainless steel tube Made in-house N/A used to snake catheters through mouse
Matrx VIP 3000 Matrx 91305430 isoflurane vaporizer
Isoflurane Stoelting Co. 50207 isoflurane/halothane adsorber
Clippers Oster Finisher Model 59
Surgical skin hooks Made in-house (??) N/A (??)
0.9% Sodium Chloride Saline APP Pharmaceuticals LLC 918610
Forceps Fine Science Tools 11274-20
Surgical scissors Fine Science Tools 14058-11
Microscissors Fine Science Tools 15000-00
UNIFY silk surgical sutures AD Surgical #S-S618R13 6-0 USP, non-absorbable
PE-8 polyethylene tubing SAI Infusion Technologies PE-8-25
Syringe Becton Dickinson and Co. 309659 1cc/mL
PE-10 polyethylene tubing Clay Adams 427400
MCID Analysis Imaging Research Inc. Version 7.0 optical density analysis
Gelatin-coated slides (75x25mm) FD Neurotechnologies PO101
Cryostat Leica CM1850
Super RX-N medical x-ray film Fuji 47410-19291
Hypercassettes (8x10 in) Amersham Pharmacia Biotech 11649
[1-14C]leucine Moravek MC404E
Microcentrifuge tube Sarstedt Aktiengesellschaft & Co. 72.692.005 used to deproteinize blood samples
Glass pasteur pipette Wheaton 357335
Glass wool Sigma-Aldrich 18421
Nitrogen NIH Supply Center 6830009737285
Scintillation fluid CytoScint 882453
Liquid scintilllation counter Packard Tri-Carb 2250CA
Amino acid analyzer Pickering Laboratories Pinnacle PCX
HPLC unit Agilent Technologies 1260 Infinity include 1260 Bio-Inert Pump
Surgical microscope Wild Heerbrugg M650
Sulfosalicylic acid Sigma-Aldrich MKBS1634V 5-sulfosalicylic acid dihydrate
Norleucine Sigma N8513
1.0 N HCl Sigma-Aldrich H9892
[H3]leucine Moraevk MC672
Falcon tube Thermo Scientific 339652 50 mL conical centrifuge tubes
Stopwatch Heuer Microsplit Model 1000 1/100 min
Euthanasia Solution Vet One H6438
Northern Light Precision Illuminator Imaging Research Inc. Model B95 fluorescent light box
Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 Nikon 1442 CDD camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. West, A. E., et al. Calcium regulation of neuronal gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).
  2. Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. Basic Neurochemistry. , 6th ed, Lippincott-Raven. New York. (1999).
  3. Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265, 1104-1107 (1994).
  4. Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2. Science. 286, 785-790 (1999).
  5. Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).
  6. Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).
  7. Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).
  8. Banker, G., Cotman, C. W. Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).
  9. Frerichs, K. U., et al. Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).
  10. Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep. The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).
  11. Nakanishi, H., et al. Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta. The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).
  12. Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats. Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).
  13. Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei. Brain Research. 494, 155-158 (1989).
  14. Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats. The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).
  15. Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).
  16. Smith, C. B., Yu, W. H. Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment. Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).
  17. Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).
  18. Nadel, J., et al. Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis. Brain Research. 1537, 125-131 (2013).
  19. Sun, Y., et al. Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development. The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).
  20. Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool. Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).
  21. Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats. Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).
  22. Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin. Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).
  23. Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome. Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).
  24. Qin, M., et al. Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).
  25. Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).
  26. Qin, M., et al. R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034 (2015).
  27. Qin, M., et al. Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation. ASN Neuro. 6, (2014).
  28. Smith, C. B., Kang, J. Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).
  29. Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats. Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 148 प्रोटीन संश्लेषण मस्तिष्क प्रोटीन गिरावट autoradiography अनुवाद एमिनो एसिड anisomycin
विवो में सेरेब्रल प्रोटीन संश्लेषण की क्षेत्रीय दरों के निर्धारण के लिए मात्रात्मक ऑटोरेडियोग्राफिक विधि
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saré, R. M., Torossian, A.,… More

Saré, R. M., Torossian, A., Rosenheck, M., Huang, T., Beebe Smith, C. Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo. J. Vis. Exp. (148), e58503, doi:10.3791/58503 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter