Summary
סינתזה חלבונים היא תהליך ביולוגי קריטי עבור תאים. במוח, זה נדרש עבור שינויים גמישים. מדידת שיעורי סינתזה של חלבון במוח שלמה מחייבת שיקולים מתודולוגיים זהירים. כאן אנו מציגים את L-[1-14ג]-השיטה האוטומטית לאוצין כמותי לקביעת שיעורי הסינתזה של חלבון מוחי בvivo.
Abstract
סינתזה חלבון נדרש לפיתוח ותחזוקה של תפקוד עצבי והוא מעורב שינויים גמישים במערכת העצבים. יתר על כן, הוא חשב כי דיסתקנה של סינתזה חלבון במערכת העצבים עשוי להיות פנוטיפ ליבה בכמה הפרעות התפתחותיות. מדידה מדויקת של שיעורי סינתזה חלבון מוחין במודלים בעלי חיים חשוב להבנת הפרעות אלה. השיטה שפיתחנו תוכננה להיות מיושמת על חקר בעלי חיים מתעוררים ומתנהגים. זוהי שיטת אדיקסוגרפית כמותית, כך שהיא יכולה להניב שיעורי בכל אזורי המוח בו זמנית. השיטה מבוססת על שימוש בחומצת אמינו מנותב, L-[1-14ג]-לאוצין, ודגם קינטי של התנהגות ה-L-לאוצין במוח. בחרנו L-[1-14ג]-לאוצין כעוקב כי זה לא מוביל למוצרי חילוף חומרים חיצוניים עם תוויות. הוא משולב בחלבון או במהירות מטבוליזם כדי להניב 14CO2 אשר מדולל בבריכה גדולה של ושות בלתי מתויג2 במוח. השיטה ואת המודל גם לאפשר את התרומה של לאוצין בלתי מסומן נגזר רקמות פרוטפוליזיס של רקמת הבריכה מקודע לסינתזה חלבון. השיטה יש את הרזולוציה המרחבית כדי לקבוע את שיעורי סינתזה החלבון בתא ושכבות נוירופיל, כמו גם היפותלמי וגרעיני עצבי הגולגולת. כדי לקבל נתונים כמותיים אמין ולאחר, חשוב לדבוק בפרטים פרוצדורליים. כאן אנו מציגים את ההליכים המפורטים של השיטה האוטומטית הכמותית-[1-14ג]-שיטת לאוצין לקביעת שיעורי הסינתזה של החלבון בvivo.
Introduction
סינתזה חלבון הוא תהליך ביולוגי חשוב הנדרש עבור שינוי לטווח ארוך מסתגלת במערכת העצבים1. מעכב הסינתזה של חלבון חוסם לטווח ארוך אחסון זיכרון בשני חסרי חוליות ובעלי חוליות2. סינתזה של חלבון היא חיונית לתחזוקת השלבים המאוחרים של כמה צורות של הפוטנציאל לטווח ארוך (ltp) ודיכאון לטווח ארוך (בע מ)3, הישרדות עצבית במהלך פיתוח4, ולתחזוקה כללית של העצב וה חיבורים סינפטית5. מדידה של שיעורי סינתזה חלבון המוח עשוי להיות כלי חשוב שבו ללמוד שינויים גמישים, כמו גם הפרעות נוירותפתחותיות והפרעות הקשורות ללמידה וזיכרון.
פיתחנו שיטה לכמת שיעורי סינתזה חלבון מוחין בvivo בחיה ערה המציעה יתרונות הטבועות על פני טכניקות אחרות הערכת שיעורי vivo ex או ההכנות מחוץ לבית של רקמת המוח6. בראש ובראשונה, תחולתה למדידות במוח השלם בבעל חיים ער. זהו שיקול מפתח כי זה מאפשר מדידות עם מבנה סינפטית תפקוד במקום וללא חששות לאחר השפעות לאחר המוות. כמו-כן, הגישה האוטומטית הכמותית שאנו מעסיקים משיגה מידה גבוהה של לוקליזציה מרחבית. בעוד האנרגיה של 14ג הוא כזה שאנחנו לא יכולים להתאים את מכשיר המעקב ברמה subcellular או הסלולר, אנחנו יכולים למדוד את התעריפים בשכבות התא ואזורי מוח קטנים כגון גרעיני היפותלמי, עם בערך 25 יקרומטר רזולוציה7.
אתגר אחד של מדידות vivo עם רדיומשדרים היא להבטיח כי radiolabel נמדד הוא במוצר של תגובת הריבית ולא הגיבו מקודדד או מוצרים אחרים מטבולית המסומנים בתווית6. בחרנו L-[1-14ג]-leucine כמו חומצת אמינו מעקב כי הוא משולב בחלבון או במהירות מטבוליזם כדי 14CO2, אשר מדולל בבריכה גדולה של שיתוף בלתי מתויג2 במוח כתוצאה משיעור גבוה של חילוף חומרים אנרגיה8. יתר על כן, כל 14ג ' לא משולבים לחלבון קיים בעיקר בחינם [14ג]-leucine, אשר במשך התקופה 60 min ניסיוני, הוא כמעט לחלוטין נקי מן הרקמה6. חלבונים הם לאחר מכן מקובעים רקמה עם פורמלין ולאחר מכן שטף עם מים כדי להסיר כל חינם [14ג]-לאוצין לפני האדיגרפיה האוטומטית.
שיקול חשוב נוסף הוא הנושא של דילול הפעילות הספציפית של בריכת חומצת אמינו מקודמת על ידי חומצות אמינו ללא תווית הנגזרות רקמות פרוטפוליזיס. הצגנו כי בעכברוש מבוגר עכבר, על 40% של בריכת לאוצין מקודמן לסינתזה חלבון במוח מגיע חומצות אמינו נגזר התמוטטות חלבונים6. זה חייב להיות כלול בחישוב של שיעורי האזור של סינתזה חלבון מוחין (rCPS) ויש לאשר במחקרים שבהם קשר זה עשוי להשתנות. הבסיס התיאורטי וההנחות של השיטה הוצגו בפרוטרוט במקומות אחרים6. במאמר זה, נתמקד בסוגיות הפרוצדוראליות של יישום מתודולוגיה זו.
שיטה זו הועסק לקביעת rcps בסנאים הקרקע9, כבשים10, רזוס קופים11, חולדות12,13,14,15,16 , מיכל בן 17 , מיכל בן 18 , מיכל בן 19 , מיכל בן 20 , 21, מודל העכבר של מורכב טרשת מורכבת22, מודל עכבר של תסמונת X שביר23,24,25,26, שברירי X עכברים מוטציה27, ו מ העכבר דגם של פנילקטונוריה28. בכתב יד זה, אנו מציגים את ההליכים למדידה של Rssl עם vivo האוטומטי-[1-14ג]-שיטת הלוצין. אנו מציגים את השוכרים באזורי. המוח של עכבר שליטה ער אנו גם להדגים כי בניהול vivo של anisomycin, מעכב של תרגום, ביטול סינתזה חלבון במוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל הליכי בעלי החיים אושרו על ידי המכון הלאומי לטיפול בבעלי חיים בריאות הנפש והשתמש הוועדה ובוצעו על פי המוסדות הלאומיים של הנחיות בריאות על הטיפול והשימוש בבעלי חיים.
מבט כולל על הפרוטוקול מוצג באיור 1.
1. קטטרים השתל בניתוח בווריד הירך ובעורק לניהול מעקב ואיסוף של דגימות דם עורקים מתוזמן, בהתאמה. ניתוח מוחלט לפחות 22 שעות. לפני הניהול של המעקב . ניתוח דורש בערך 1 להשלים
- לאסוף את החומרים הדרושים: מכשירי ניתוח סטרילי (מספריים כירורגי, מיקרו מספריים, מלקחיים, שלושה ווים כירורגיים), ציוד עבור הרדמה isofלוריאן (מכשיר אידוי, גז פעיל, פח הרדמה אטום, הרדמה קונוס האף), השלב ניתוח סטרילי, קוצץ פרווה, 70% אתנול, בטדין, גזה סטרילית, סרט כירורגי, מחממי ידיים מסחרי, מיקרוסקופ כירורגי, סטרילי 0.9% נתרן כלוריד (מלוחים), סטרילי הפארין 100 USP יחידות/mL ב 0.9% נתרן כלוריד (heparinized) תמיסת מלח), מעוקר 5 20-cm רצועות של 6-0 ספיגה נספג, מעוקר 25-ס מ קווצות של PE-8 ו-PE-10 צנתרים פוליאתילן עם קצה אחד לחתוך ב 45o, סטרילי 1 cc מזרקים, סטרילי 32 למדוד מחטים, ציוד קאטרי, סטרילי 15-20 ס"מ החלול אל חלד מוט פלדה (2.5 מ"מ קוטר בפנים, 3 מ"מ קוטר בחוץ), הרדמה מקומית (bupi, ומשחה לידוקאין), ו מארז בעלי חיים עם הגדרת הנספח המסתובב (30 ס מ האביב באמצעות הכפתור, סיבוב, סיבוב הר וזרוע, 20 X 13 ס מ גליל ברור מכל).
- . הכן את בעל החיים לניתוח
- להבטיח כי השיטות הנאות וסטרילי משמשים כנדרש על ידי המוסד שלך.
- . שוקלים את החיה בעל החיים חייב להיות לפחות 25 גרם לניתוח מוצלח.
- מניחים את החיה בתוך תא פלקסיגלס אטום ומחבר את החדר למנגנון ההרדמה isofלוריאן. הגדר את קצב הזרימה ל 2.5 L/min עבור זכרים ו 3.0 L/min עבור נקבות של 1.5% isofלאנה ב O2. לאחר בערך 2 דקות, להבטיח את העכבר מסומם כראוי על ידי חוסר רפלקס הנסיגה עם צביטה בבוהן.
- פעם הרגעה, להסיר את העכבר מן התא ולהניח אותו בתנוחה נוטה עם פניו בתוך קונוס האף הרדמה. להגדיר חרוט האף כדי לקבל גז מן המאאדה ולהחזיר גז לזבל את הגז. הנבלות ייתפסו את. מסנני הפחם בפילטר
- השתמש קוצץ לגלח את הפרווה בין להבים הכתף. הקפד לעקר כראוי את האזור מגולח, לסירוגין שלוש פעמים בין הבטאדין לבין חלוק אתנול.
- להעיף את העכבר מעל לתוך מיקום פרקדן שמירה על הפנים בקונוס האף. הדבק את הרגל השמאלית לשלב הניתוח והשתמש בקוצץ כדי לגלח פרווה מהירך הפנימית השמאלית אל הבטן השמאלית העליונה. הקפד לעקר כראוי את האזור מגולח, לסירוגין שלוש פעמים בין הבטאדין לבין חלוק אתנול.
- שקופית מחמם ידיים זמין מסחרית שהופעלה, עטוף גזה, מתחת לעכבר. הקלטת את הרגל הימנית. על שלב הניתוח
- . הכנס צנתר לווריד הירך השמאלי
- בעזרת מיקרוסקופ ניתוחי, השתמש במספריים כירורגיים כדי לבצע חתך של 1 ס מ מהחלק המדיאלי העליון של הירך השמאלית לכיוון האמצע, חשיפת עורק הירך והווריד.
- למשוך עור רופף עם ווים העור כירורגי כדי לחשוף עוד יותר את שלפוחיות.
- החל סטרילי 0.9% נתרן כלוריד לשטח חשוף כדי לשמור על לחות נאותה.
- באמצעות מלקחיים כדי לנתח בוטה, הפרדת רקמת החיבור סביב חלק קטן של עורק הירך והווריד. בזהירות, הפרד את העורק והווריד (איור 2).
- השתמש מלקחיים כדי חוט מגדיל אחד של תפר נספג (סטרנד) תחת שני וריד הירך והעורק בנקודה הצדדית ביותר של החתך. , משוך את התפר בחצי הדרך. כך שקצותיו יהיו שווים
- בנקודה הטובה ביותר אל המפשעה, השתמש מלקחיים כדי חוט תפר שני (סטרנד ב) תחת רק את וריד הירך. לקשור בעדינות חצי קשר שישמש כדי להגביל את זרימת הדם.
- בנקודה בין סטרנד ו סטרנד, להשתמש מלקחיים כדי חוט תפר שלישי (סטרנד C) תחת רק וריד הירך. לקשור בעדינות קשר מלא שישמש כדי להגביל את זרימת הדם. . תיזהר לא לקרוע את הווריד
- בעדינות למשוך על סטרנד ב להגביל את זרימת הדם. השתמש בהדימום כדי למשוך בעדינות את סטרנד ב כדי לשמור על זרימת דם מוגבלת.
- חותכים חור קטן באזור המוגבל של וריד הירך עם מיקרו מספריים ובזהירות להכניס את הקצה הזוויתי של צינורות PE-8 (שרוקן בעבר עם הפלין תמיסת מלח) לכיוון סטרנד B. לאחר הכנסתו, שחרר את המתח של סטרנד ב ולהנחות את הקטטר במעלה הווריד. תהדק את סטרנד מסביב. לווריד שמכיל את הצנתר
- באמצעות סטרנד C, לקשור קשר נוסף סביב הקטטר. ודא שהקשר זה אינו תופס את עורק הירך.
- בעדינות למשוך חזרה על חבית מזרק למלא באופן חלקי אבובים עם דם כדי להבטיח את הקטטר הושתל כראוי.
- בעקבות אותו ההליך, להכניס צנתר PE-10 לעורק הירך השמאלי.
- . הליך כירורגי מלא
- ברגע שני וריד הירך ואת העורקים העורק כבר מאובטח, עניבה סטרנד לתוך קשר סביב שני קטטרים.
- חותכים את כל התפרים עודף ולהסיר ווים העור. לשטוף את קטטר העורקים עם המלח heparinized כדי למנוע קרישה. לצרוב את קצות שני הקטטרים כדי ליצור חותם.
- מניחים את העכבר בתנוחה נוטה לעשות חתך קטן בבסיס הצוואר ולהחיל תמיסת מלח על האזור חשוף.
- . מחתך הצוואר ועד לחתך הירך נחש את הקטטרים דרך המוט החלול והחוצה מחתך הצוואר. . הסר את המוט החלול השתלת קטטרים משנית תמנע מעכברים להזיק לקטטרים.
- החלת בופיטין לצידי הפצע. . תסגור את חתך הירך עם תפר תוסיף משחה לידוקאין. מעל פצע סגור
- הנחש את הקטטרים דרך שפופרת החלול 30 ס מ (האביב באמצעות) ותפר את הכפתור של הקפיץ מתחת לעור. החלת בופיטין לצידי הפצע. תפר את הכפתור של הקפיץ מתחת לעור. תוסיף משחה לידוקאין. מעל פצע סגור
- להזיז את העכבר לתוך מיכל גלילי ברור (20 ס"מ גבוה, 13 ס"מ קוטר) עם הר מסתובב וזרוע לבית החיה בתקופת ההחלמה. מניחים מחמם ידיים מתחת למיכל כדי לשמור על החיה חמה.
- לעזאזל על החלק העליון של האביב להסתובב מסתובב ולאבטח את הסיבוב אל הזרוע המסתובב מוצמד המיכל גלילי. ודא שלעכבר יש טווח תנועה מלא וניתן לגשת לקטטרים.
- מניחים מכסה משופע שאינו מפריע למנגנון המסתובב על המתחם החי. עיין באיור 3 עבור הכיוונון המלא.
- לאפשר לעכבר להתאושש. מומלץ לפחות 22 שעות.
2. להכין את L-[1-14ג] הפתרון הלוצין להזרקה 16% (w/v) 5-sulfosalicylic חומצה (SSA) מייבשים פתרון עבור דגימות פלזמה deproteinizing. בפתרון SSA, כולל גם 0.04 mM norleucine ו-1 μCi/mL [H3] leucine כתקנים פנימיים עבור ניתוח חומצת אמינו ניתוח של ריכוז מעקב בשברים פלזמה מסיסים בחומצה, בהתאמה. אחסן את ה-SSA עד חודשיים ב -4 ° c.
- רכישת מסחרית זמין L-[1-14ג] לאוצין (50-60 mCi/ממול), אשר נמכר כפתרון ב 2% אתנול או 0.1 N HCl. לפוצץ פעילות ידועה של מכשיר מעקב תחת זרם עדין של חנקן ולהוות מחדש בפתרון של תמיסת מלח רגיל סטרילי עשוי עד לריכוז של 100 μCi/mL.
3. ניהול L-[1-14ג] לאוצין באופן מידי ואיסוף דגימות דם עורקים.
- לאסוף את החומרים הדרושים: 18 1.5 mL מיקרוצינוריות עבור דגימות פלזמה מנירוסטה (להוסיף 70 mL של מים מיוהים לכל צינור), 17 250mL בקבוקון זכוכית מוסיף (15 מוסיף לאוסף של דגימות דם עורקים 2 מוסיף עבור אוסף של דם שטח מת להיות . מוזרק מחדש כדי להגביל את האוסף של דם עודף ומיותר, קטן, דק בקבוקון זכוכית מוסיף עם תחתונים מחודדות המאפשרים ליטוף נגיש של פלזמה סופרנטאנט מומלץ), 2 צינורות מיקרוקפילר (32 X 0.8 מ"מ, למדידת המטקריט), 1 הפארין ו ליתיום פלואוריד-מצופה שפופרת מיקרוצנטריפוגה (כדי למנוע קרישה וגליקולזיס, בהתאמה), הומוסטטיסטיקה (לכסות את הטיפים עם אבובים tygon כך מלחציים לא יזיק לצינורות PE), הגלוקוז דם צג, לחץ דם מתמר, 1 mL מזרקים סטרילי (עבור הריקות מלוחים), ופתרון המתת הרדמה מסחרית (מדולל 1:1 במים המליחים (עבור עכברים)).
- ודא שהחיה נמצאת במצב פיזיולוגי רגיל בתחילת הניסוי.
- קלאמפ צינורות העורקים על 2 ס מ מהסוף לחתוך את הקצה, יצירת פתיחה לדם לזרום. לאחר מכן unclamp אבובים ולאסוף דם החלל המתים ((30 מ ל) כדי לאסוף כל מלוחים שיורית ו/או דם מן הקודם מצייר), ו, בצינור נפרד, לאסוף דגימת בקרה (כ. 30 μL), דגימות המטוקריט (כמחצית הנפח שפופרת נימי), ו גלוקוז (כ-20 μL).
- מדידת המטוקריט על ידי חיבור קצה אחד עם מרק איטום וצנטריפוגה עבור 1 דקות ב 4500 x g. למדוד את היחס של עוצמת הקול של תאים אדומים לנפח הדם הכולל. אם לחיה יש המטוקריט מתחת ל -30%, אל תמשיך במחקר.
- השתמש בצג הגלוקוז בדם זמין מסחרית כדי למדוד את רמת הגלוקוז בטיפת דם.
- בקרת צנטריפוגה מדגם עבור 2 דקות ב 18,000 x g כדי להפריד פלזמה. בדיקות פלסמה deproteinize כדלקמן: להוסיף 5 μL של פלזמה כדי 70 μL של מים הממוכי ב 1.5 mL microtube, להוסיף 25 μL של 16% הפתרון SSA מערבולת. הניחו על הקרח 30 דקות לפני ההקפאה על הקרח היבש.
- החזר דם החלל המתים אל החיה דרך קו הורידים, ואחריו סומק מלוחים heparinized כדי למנוע אובדן עודף דם.
- לחבר את קו העורקים מתמר לחץ דם למדוד מתכוון לחץ דם עורקי.
- לאחר נטילת דגימות להיות בטוח מחדש להדק את הקו העורקי ולשטוף את הקו עם קטן (50 mL) נפח של תמיסת מלח heparinized.
- מעקב באופן מידי ואיסוף דגימות דם עורקים מתוזמן.
- השתמש במחבר Y כדי לצרף מזרק אחד עם מעקב (100μCi/ק"ג) ומזרק אחד עם 50 מ"ל מלוחים סטרילי כדי לרוקן את קו הורידים לאחר הזרקת מעקב. חבר את המחבר Y לקו הורידים.
- הפעל את המחקר על ידי הפעלת בו שעון עצירה והזרקת המעקב. ריקון קו הורידים עם תמיסת מלח (100mL) מיד לאחר ההזרקה.
- לאסוף דגימות דם 1-7 ברציפות במהלך 2 הדקות הראשונות של הניסוי באותו אופן. לאחר איסוף המדגם השביעי, לאסוף 30 מטרים μL החלל דם לפני כל מדגם שנותר. דגימות 8-14 נאספים ב 3, 5, 10, 15, 30, 45, ו 60 דקות, בהתאמה.
- עבד דגימות דם מיד לאחר האיסוף, כפי שתואר עבור דגימת הבקרה. , אם יש עיכוב. הניחו את הדגימות על הקרח הכנס בזהירות דם חלל מתים לתוך העורק דרך קטטר העורקים וסומק עם הפארין תמיסת מלח.
- בשלב מסוים במהלך הניסוי, תהליך שלושה סטנדרטים פנימיים על ידי הוספת 25 μL 16% SSA, 0.04 mM norleucine, ו 1 mCi/mL [3H] leucine כדי 75 μl מים, מערבולת ומקום על הקרח.
- לאחר איסוף המדגם ה -14 ב 60 דקות, הכנס כ-0.2 מ ל המתת-הרדמה-D לתוך קו הורידים כדי להרדים את החיה. . להקליט את שעת המוות
- להוציא את החיה מההר המסתובב ולהסיר ממתחם החיות. הסר בזהירות את המוח, הניחו על רדיד אלומיניום, והקפא על קרח יבש. לא להקפיא מוח עם חנקן נוזלי כמו מוח עלול לפצח. המוח בחנות, דגימות, ותקנים פנימיים ב-80 ° c עד מוכן לעיבוד. ניתן לבצע עיבוד בכל נקודה לאחר מכן.
4. ניתוח ריכוזי הלוצין והאני-[1-14ג] לאוצין בדגימות פלסמה.
- הפשרת דגימות ותקנים פנימיים על קרח, מערבולת, ו צנטריפוגה 18,000 x g עבור 5 דקות ב 2 ° c. שבר סופרנטאנט יכיל את הלוצין ללא התווית והניתן לביטול התווית.
- העבר 40 μL של הסופרנטאנט לבקבוקון בקבוקון נוזלי והוסף קוקטייל בגוון טעמים. כינור מתפורר לדקה (DPM) של 3H ו- 14ג באמצעות שלוש הטעמים הנוזליים ועקומת כיבוי המיועדת לתווית בו כפולה בו (3H ו -14ג) ספירה.
- כדי לכמת ריכוזים לאוצין פלזמה, להשתמש במערכת מערכת האבחון עם טור החליפין נתרן לאחר הטור ולאחר עמודה עם או-phthaldehyde זיהוי פלואורומטרי.
- הגדר את המפרט למפרטים הבאים: פלואורומטר עירור של 330 ננומטר ופליטה של 465 nm. השלב הנייד מורכב האלואנט נתרן, pH 7.40, ו הנתרן האלואנט + 5% sulfolane, pH 3.15. הגדר את קצב זרימת המאגר של 0.400 mL/min וקצב זרימת הכלי ללעג ל-0.300 mL/min. הגדר את טמפרטורת העמודה ל-48 ° c וטמפרטורת הכור ל45 ° c.
- כיול את המערכת עם מגוון ריכוזי חומצות אמינו (כולל נורלוצין) בין 30 ל-500 pmol/10mL. עקומת הכיול היא קווית. ריכוזי חומצות אמינו של בדיקות 10 מ"ל הזרקת הדגימות ליפול בתוך טווחים של עקומת כיול זה.
5. ביצוע האדיגרפיה אוטומטית כמותית.
- הכינו סעיפים במוח 20 יקרומטר בעובי לאדיגרפיה אוטומטית. מוח מדור באמצעות קריוסטט ב-20 ° c.
- הפשרת מקטעי מוח סדרתיים. על שקופיות מצופות ג'לטין . האוויר יבש
- לשטוף שקופיות 5 שינויים של 10% פורמלין עבור 30 דקות לשינוי, ואחריו זרימה רציפה של מים מוהים עבור 1 h. לכסות את השקופיות באופן רופף עם נייר כסף כדי למנוע אבק ולאפשר ייבוש עבור 24 h.
- מומלץ לארגן שקופיות בקלטת צילום רנטגן (קלטות המתאימות לממוגרפיה של 20x25 ס מ) יחד עם סט של [14ג] תקני מתילטיאקריל, שהוכשלו בעבר כנגד רקמת הריכוזים הידועים של 14מילים כ כמתואר29. תקנים ניתן לרכוש מסחרית, אך להבטיח כי הם מכסים מגוון של 2-300 mCi/g של רקמות מכויל כנגד 20 מיקרומטר רקמת עובי. תחת safelight אדום, המקום פיסת סרט ממוגרפיה, בצד אמולסיה למטה, על גבי סעיפים.
- חותם את הקלטות ומקום בשק שחור ולאחסן בארון במשך 40-45 ימים.
- פיתוח סרטים לפי כיווני היצרן. הערה: התפתחות הסרט האוטומטי אינה מומלצת מכיוון שהרקע עשוי להיות לא אחיד ויכול להשפיע על כימות.
6. לנתח תמונות.
הערה: תוכנית מסחרית זמין עבור ניתוח תמונה בשילוב עם מצלמת CCD ותיבת אור פלורסנט עם תאורה מומלצת אפילו. הצפיפות האופטית היחסית בסרט המואר מזוהה על ידי מצלמת CCD.
- בנו עקומת כיול של דחיסות אופטית (OD) v. רקמה 14C ריכוז המבוסס על הדים של הקבוצה של התקנים מכויל על הסרט. התאם נתונים אלה (כולל הריק או הרקע) למשוואה פולינומיאלית. משוואה פולינומיאלית בדרגה שנייה או שלישית מתאימה מאוד.
- כדי לנתח אזורי מוח ספציפיים, לאתר את אזור הריבית (ROI) בשישה עד שמונה סעיפים על ידי השוואה עם אטלס המוח. הקלט את ה-ODs של הפיקסלים בתוך ROI בכל המקטעים, ובהתבסס על עקומת הכיול, חשב את הריכוז של הרקמה 14C בכל פיקסל. לחשב את הרקמה הממוצעת 14C ריכוז ב-ROI.
7. חישוב של rCPS מחשב rCPS כל ROI באמצעות המשוואה הבאה:
כאשר P * (t) הוא ריכוז הרקמה הממוצעת משוקלל של 14ג ב ROI, cp(t) ו-C*P(t) הם ריכוזי פלזמה העורקים של לאוצין ומתויג בזמן, t, t הוא הזמן שהחיה מתה ( כ 60 דקות), ו λ הוא שבריר של לאוצין בבריכה קודמן הרקמה שמגיעה מן הפלזמה. הערכה של λ מבוצעת בניסוי נפרד 6. λ כבר הוערך ב WT, Fmr1 נוק, tsc+/-, ו pku עכברים 6,22,25,28. אם הניסוי כולל שינויים גנטיים או תרופתי שעשויים להשפיע על שיעורי סינתזה חלבונים, השפלה, או חילוף החומרים של leucine, λ יש להעריך תחת התנאים החדשים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן אנו מראים ניסוי מייצג הממחיש את ההשפעות של הממשל הקודם של חלבון סינתזה מעכבי על rCPS. Anisomycin בתמיסת מלח רגיל היה מנוהל מבוגר C57/BL6 זכר פראי-סוג העכבר תת-עורי (100 mg/ק"ג) 30 דקות לפני החניכה של הנחישות rCPS. ההשפעות של הטיפול anisomycin לעומת הרכב מטופלים בקרת בעל חיים להראות כי rCPS הוא כמעט בלתי ניתן לגילוי בעכבר anisomycin מטופלים (איור 4). נתונים אלה מייצגים אימות כי vivo האוטומטי-[1-14ג]-שיטת לאוצין מודד שיעורי סינתזה של חלבון במוח.
אנו מציגים דמות של L-[1-14ג]-לאוצין אוטומטי בארבע רמות של המוח כדי להדגים את הרזולוציה של השיטה (איור 5). מאוירים הם שכבות התא בנורת הריח (איור 5A ו- B), ההיפוקמפוס (איור 5a), ואת המוח החצי (איור 5a). גרעינים בהיפותלמוס (איור 5d), את פונס (איור 5E ו- F), ואת גזע המוח (איור 5d) הם גם רואים בבירור באדיאוגרמות האוטומטית. אנו מציגים גם את שיעורי האזורים הכמותיים של סינתזה החלבון בקליפת המוח (5.88 nmol/g/min) (איור 6A) והיפוקמפוס (5.35 nmol/g/min) (איור 6a) של בעל חיים אופייני לשליטה.
איור 1: סכימטי המייצג את השלבים של פרוטוקול rcps כולו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: התמונה של עורק הירך ואת וריד הירך. עורק הירך מוצג. מעל וריד הירך לווריד הירך יש גם צבע אדום. עמוק יותר מעורק הירך אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תמונה של מארז החיות המומלץ המוגדר לניסוי rcps היא משתמשת במתחם בעלי חיים גליליים ברורים עם הנספח המסתובב מחובר לקשר הקפיץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תמונות מייצגות של בעל חיים המטופל ברכב (א) לעומת בעל חיים שטופלו באניסומצין (100 מ"ג/ק"ג, תת-עורי) 30 דקות לפני המינהל של מעקב (ב). שיעורי סינתזה החלבון הם יחסיים לרמת החושך בתמונה. Anisomycin מפחית באופן דרסטי את שיעורי סינתזה של חלבון המציין את הספציפיות של שיטה זו. סרגל קנה המידה בפינה הימנית העליונה של A מייצג 1 מ"מ ומוחל על שתי התמונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: שגיאה אוטומטית האנלוגית מעכבר מתנהג ער ברמה של הנורה הריח (A, B), ההיפותלמוס (C, D), פונס (E, F), המוח (g), גזע המוח (g, H). באזורים הכהים יותר יש rCPS r גבוה יותר. סרגל קנה המידה בלוח G חל על לוחות A, C, E, ו-G. משמאל לימין (B, D, F, ו-H) תמונות מוגדלות מהאזורים המוגדרים על התמונות בצד שמאל ואת סרגל קנה המידה בלוח H חל על לוחות B , D, F ו-H קיצורים הם כדלקמן: פרה, קליפת ההתאגדות הפרונטלית; אבוב, נורת ריח; AO, גרעין הריח הקדמי; Gl, שכבת פקיום; EPl, שכבת plexiform חיצונית; בלה, באסאואין צלעות האמיגדלה; py, שכבת התאים של הדגם; dHi, היפוקמפוס; . די. ג'י, גירוס מאוד . מ-Hb, האמצעי האמצעי Rt, הגרעין התלמי; VMH, הגרעין ההיפותלמי המדיאלי; קשת, קושת הגרעין; א. י., הגרעין של אדנגר-וסטפאל; R, גרעין אדום; PN, גרעין פונטין; ML, שכבה מולקולרית; GL, שכבה גרעינית; מחשב, שכבת תא Purkinje; Cu, מונאט הגרעין; AP, אזור postrema; 10, הגרעין המוטורי המוטוריים של vagus; . שתים עשרה, גרעין ההיפוגלואל אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: שגיאה אוטומטית האנלוגית מעכבר שליטה מתנהג ער ברמת הקליפה הקדמית (A) ו היפוקמפוס (ב). שיעורי סינתזה של חלבון מוחי הם צבע מקודד בתמונות לפי סרגל הצבע המוצג בצד ימין. סרגל קנה המידה בחלק השמאלי התחתון של A מייצג 1 מ"מ ומוחל על שתי התמונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מציגים שיטה כמותית לקביעת שיעורי האזור של סינתזה חלבון מוחין (rCPS) בvivo בבעלי חיים ניסיוניים. לשיטה זו יתרונות ניכרים בשיטות הקיימות: 1. מדידות מועצמות בחיה המתתעוררת, ולכן הן משקפות תהליכים מתמשכים במוח התפקודי. 2. מדידות מושמעות באמצעות כמותי אוטומטי מאפשר את היכולת לקבוע rCPS בכל האזורים ואזורי המשנה של המוח בו זמנית. 3. המודל הקינטי של השיטה לוקח בחשבון את האפשרות של מיחזור של חומצות אמינו ללא תווית שנגזר השפלה חלבון הרקמה ואת השפעתו על הבריכה קודמן עבור סינתזה חלבון6.
המגבלה העיקרית של שיטה זו היא שהיא גוזלת זמן ותובענית. הואיל ומפתה להעסיק שיטות תפוקה פשוטות וגבוהות יותר, יש להכיר במגבלות הנתונים שהתקבלו.
בגלל המורכבות של מדידת rCPS בעכבר שלם, בעיות עם תחזוקה של מדינה פיזיולוגית נורמלית, איסוף דגימות דם נאותה, והימנעות תנאים מפריעים אולי נתקל. השרשה כירורגית של הורידים והקטטרים העורקים מאתגרת. כמו בכל הליך כירורגי, במיוחד בטיפול בvascuלטורה עדינה, קיים סיכון מטמון לתמותה של בעל החיים. בשבילנו, זה נדיר (בערך 1%). במהלך ההתאוששות במשך 22 שעות, מדי פעם (כ 4%) . בעל חיים ימשוך צנתר החוצה במהלך המדידה, חשוב כי קטטרים הם פטנט ושבעלי חיים הם במצב פיזיולוגי נורמלי. בניסיון האחרון שלנו, דם עורקי לא ניתן לאסוף ב 2% של בעלי חיים ו-1% של בעלי חיים היו המטוקריט נמוך (< 40%) או לחץ דם עורקי נמוך (< 85 מ"מ Hg), מציע אובדן דם במהלך ניתוח ו/או התאוששות.
בהכנת מקטעי מוח לאדיגרפיה אוטומטית, חשוב לוודא שעובי המקטע הוא 20 יקרומטר מכיוון שזהו עובי המקטע שאליו מכוילים התקנים מתילתיאקריל [14ג]. השתמש בטיפול כדי להבטיח מקטעים באיכות טובה, כלומר, ללא דמעות, קפלי, או בועות כמו אלה פגמים יפריעו בניתוח האדיקסוגרפי האוטומטי. אנו מפתחים בעבודת יד באמצעות הקרנת סרטים בלתי מעודכנים משום שאנו מוצאים כי צפיפות הרקע האופטית יכולה להיות לא אחידה בעקבות העיבוד האוטומטי, והדבר עלול להשפיע על הכמת.
במשוואה עבור rcps אנו כוללים גורם, למדא (λ), כי הוא שבריר של לאוצין הנובע פלזמה העורקים, השארית מגיע מיחזור של חומצות אמינו נגזר השפלה חלבון רקמות6. יש לנו הערכה λ בניסויים נפרדים ב WT ו Fmr1 KO (שברירי X מודל) C57Bl/6j עכברים והראו כי הערך שלה הוא 0.603. הערך של λ עשוי להשתנות בהתאם למינים, לרקע גנטי, או לנוכחות של מוטציה גנטית. לכן, אם עיצוב הסינתזה של החלבון ניסויים עבור דגמים אחרים, אחד יצטרך להעריך λ לפני מדידה מדויקת ניתן לקבל.
עבודתנו במודלים של עכבר גנטי של הפרעות נוירוולוגית ממחיש כי מתודולוגיה זו מגלה שינויים rcps במודלים אלה ובמקרים מסוימים התגובות תרופות תרופתי22,23,25 , 26. זה גם אפשרי כי מדידה rcps יכול גם לפקח על שינויים ניווניות במוח בתנאים כגון מודלים של מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, תסמונת אטקסיה שברירית X רעד, פציעה מוחית טראומטית, וכו '. מודלים אלה, יכול להיות אפשרי לעקוב אחר שינויים ניווניות מוקדם ואולי גם תגובות התערבויות מוקדם. ניתן להשתמש בשיטת rCPS יחד עם אימונוהיסטוכימיה בסעיפים מקבילים כדי לבחון מראש את שינויי המוח הספציפיים25. לסיכום, השיטה האוטומטית המותית-[1-14ג]-שיטת לאוצין היא אידיאלית לקביעת ערכים מדויקים בvivo. הוא מציע יתרונות ניכרים במונחים של דיוק וישימות בתנאים vivo על שיטות קיימות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.
Acknowledgments
המחברים רוצים להכיר Zengyan Xia עבור הגנוזה של העכברים, טום בורלין לעיבוד של חומצות אמינו וסרטים, מיי צ'ין לביצוע כמה ניסויים rCPS. מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מחקר תוך-ציור של NIMH, ZIA MH00889. RMS גם נתמך על ידי אוטיזם מדבר המענק 8679 ו המענק FRAXA פוסט דוקטורט.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson Laboratory | 003024 | Fmr1 knockout breeding pairs |
| Anisomycin | Tocris Bioscience | 1290 | |
| Microhematocrit Tubes | Drummond Scientific | 1-000-3200-H | capillary tubes |
| Critoseal Capillary Tube Sealant | Leica Microsystems | 39215003 | sealant putty |
| Glass vial inserts | Agilent | 5183-2089 | used to collect blood samples |
| Digi-Med Blood Pressure Analyzer | Micro-Med Inc. | BPA-400 | blood pressure analyzer |
| Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System | Bayer Breeze | 9570A | glucose meter |
| Gastight syringe | Hamilton Co. | 1710 | tuberculin glass syringe |
| HeatMax HotHands-2 Hand Warmers | HeatMax | Model HH2 | warming pads |
| Heparin Lock Flush Solution | Fresenius Kabi USA, LLC | 504505 | heparin saline |
| Clear animal container | Instech | MTANK/W | animal enclosure |
| Spring tether | Instech | PS62 | catheter tube/rodent attachment |
| Swivel | Instech | 375/25 | hooks to spring tether |
| Swivel arm and mount | Instech | SMCLA | hooks to swivel and animal enclosure |
| Tether button | Instech | VAB62BS/22 | attaches to bottom of spring tether |
| Stainless steel tube | Made in-house | N/A | used to snake catheters through mouse |
| Matrx VIP 3000 | Matrx | 91305430 | isoflurane vaporizer |
| Isoflurane | Stoelting Co. | 50207 | isoflurane/halothane adsorber |
| Clippers | Oster Finisher | Model 59 | |
| Surgical skin hooks | Made in-house (??) | N/A (??) | |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | APP Pharmaceuticals LLC | 918610 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| UNIFY silk surgical sutures | AD Surgical | #S-S618R13 | 6-0 USP, non-absorbable |
| PE-8 polyethylene tubing | SAI Infusion Technologies | PE-8-25 | |
| Syringe | Becton Dickinson and Co. | 309659 | 1cc/mL |
| PE-10 polyethylene tubing | Clay Adams | 427400 | |
| MCID Analysis | Imaging Research Inc. | Version 7.0 | optical density analysis |
| Gelatin-coated slides (75x25mm) | FD Neurotechnologies | PO101 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Super RX-N medical x-ray film | Fuji | 47410-19291 | |
| Hypercassettes (8x10 in) | Amersham Pharmacia Biotech | 11649 | |
| [1-14C]leucine | Moravek | MC404E | |
| Microcentrifuge tube | Sarstedt Aktiengesellschaft & Co. | 72.692.005 | used to deproteinize blood samples |
| Glass pasteur pipette | Wheaton | 357335 | |
| Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | |
| Nitrogen | NIH Supply Center | 6830009737285 | |
| Scintillation fluid | CytoScint | 882453 | |
| Liquid scintilllation counter | Packard Tri-Carb | 2250CA | |
| Amino acid analyzer | Pickering Laboratories | Pinnacle PCX | |
| HPLC unit | Agilent Technologies | 1260 Infinity | include 1260 Bio-Inert Pump |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg | M650 | |
| Sulfosalicylic acid | Sigma-Aldrich | MKBS1634V | 5-sulfosalicylic acid dihydrate |
| Norleucine | Sigma | N8513 | |
| 1.0 N HCl | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| [H3]leucine | Moraevk | MC672 | |
| Falcon tube | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL conical centrifuge tubes |
| Stopwatch | Heuer Microsplit | Model 1000 | 1/100 min |
| Euthanasia Solution | Vet One | H6438 | |
| Northern Light Precision Illuminator | Imaging Research Inc. | Model B95 | fluorescent light box |
| Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 | Nikon | 1442 | CDD camera |
References
- West, A. E., et al. Calcium regulation of neuronal gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).
- Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. Basic Neurochemistry. , 6th ed, Lippincott-Raven. New York. (1999).
- Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265, 1104-1107 (1994).
- Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2. Science. 286, 785-790 (1999).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).
- Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).
- Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).
- Banker, G., Cotman, C. W. Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).
- Frerichs, K. U., et al. Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).
- Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep. The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).
- Nakanishi, H., et al. Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta. The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats. Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).
- Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei. Brain Research. 494, 155-158 (1989).
- Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats. The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).
- Smith, C. B., Yu, W. H. Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment. Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).
- Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).
- Nadel, J., et al. Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis. Brain Research. 1537, 125-131 (2013).
- Sun, Y., et al. Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development. The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).
- Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool. Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).
- Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats. Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).
- Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin. Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).
- Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome. Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).
- Qin, M., et al. Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).
- Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).
- Qin, M., et al. R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034 (2015).
- Qin, M., et al. Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation. ASN Neuro. 6, (2014).
- Smith, C. B., Kang, J. Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).
- Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats. Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).
