Summary
Proteinsyntese er en kritisk biologisk prosess for celler. I hjernen er det nødvendig for adaptive endringer. Måling av utbredelsen av proteinsyntese i intakt hjernen krever nøye metodisk betraktninger. Her presenterer vi L-[1-14C]-leucine kvantitative autoradiographic metode for bestemmelse av regionale utbredelsen av cerebral protein syntese in vivo.
Abstract
Proteinsyntese er nødvendig for utvikling og vedlikehold av neuronal funksjon og er involvert i adaptive endringer i nervesystemet. Videre er det antatt at feilregulering av proteinsyntese i nervesystemet kan være en kjerne fenotype i noen utviklingsmessige lidelser. Nøyaktig måling av utbredelsen av cerebral proteinsyntese i dyremodeller er viktig for å forstå disse lidelsene. Metoden som vi har utviklet var designet for å brukes til studiet av våken, oppfører dyr. Det er en kvantitativ autoradiographic metode, slik at den kan gi priser i alle regioner av hjernen samtidig. Metoden er basert på bruk av en Tracer aminosyre, L-[1-14C]-leucine, og en kinetisk modell av oppførselen til L-leucine i hjernen. Vi valgte L-[1-14C]-leucine som Tracer fordi den ikke fører til overflødig merket metabolske produkter. Det er enten innlemmet i protein eller raskt metaboliseres til å gi 14co2 som er fortynnet i en stor pool av umerkede co2 i hjernen. Metoden og modellen også tillate for bidrag av umerkede leucine avledet fra vev proteinolyse til vevet forløper for proteinsyntese. Metoden har romlig oppløsning for å bestemme proteinsyntese i celle-og neuropil lag, samt hypothalamus og skallen nerve kjerner. For å oppnå pålitelige og reproduserbar kvantitative data, er det viktig å følge prosessuelle detaljer. Her presenterer vi detaljerte prosedyrer for den kvantitative autoradiographic L-[1-14C]-leucine metode for fastsettelse av regionale utbredelsen av proteinsyntese i vivo.
Introduction
Proteinsyntese er en viktig biologisk prosess som kreves for langsiktig adaptiv endring i nervesystemet1. Hemme proteinsyntese blokker lang tids minne lagring i både virvelløse dyr og virveldyr2. Proteinsyntese er viktig for vedlikehold av de sene fasene av noen former for langsiktig potensiering (LTP) og langsiktig depresjon (LTD)3, neuronal overlevelse under utbygging4, og for generell vedlikehold av Nevron og dens Synaptic tilkoblinger5. Måling av utbredelsen av hjernen proteinsyntese kan være et viktig verktøy som å studere adaptive endringer samt neurodevelopmental lidelser og lidelser knyttet til læring og hukommelse.
Vi har utviklet en metode for å kvantifisere utbredelsen av cerebral protein syntese in vivo i en våken dyr som tilbyr iboende fordeler fremfor andre teknikker som anslår priser i ex vivo eller in vitro forberedelser av hjernevevet6. Fremst er anvendelsen til målinger i intakt hjernen i et våken dyr. Dette er en viktig faktor fordi den tillater målinger med Synaptic struktur og funksjon på plass og uten bekymringer om etter obduksjon effekter. Videre, den kvantitative autoradiographic tilnærmingen som vi ansetter oppnår en høy grad av romlig lokalisering. Mens energien på 14C er slik at vi ikke kan lokalisere Tracer på subcellulære eller cellenivå, kan vi måle priser i celle lag og små hjerneområder som hypothalamus kjerner, med omtrent en 25 μm oppløsning7.
En utfordring av in vivo målinger med radiotracers er å sikre at radiolabel målt er i produktet av reaksjonen av interesse i stedet for ureagerte merket forløper eller andre overflødige merkede metabolske produkter6. Vi valgte L-[1-14C]-leucine som Tracer amino acid fordi det er enten innlemmet i protein eller raskt metaboliseres til 14co2, som er fortynnet i det store bassenget av umerkede co2 i hjernen som følge av høy hastighet på energi metabolisme8. Videre, noen 14c ikke innlemmet i protein eksisterer først og fremst som fri [14C]-leucine, som over 60 min eksperimentelle perioden, er nesten helt ryddet fra vevet6. Proteiner blir deretter festet til vev med formalin og deretter skylles med vannet fjerne eventuelle fri [14C]-leucine før autoradiografi.
En annen viktig faktor er spørsmålet om fortynning av den spesifikke aktiviteten av forløperen aminosyre pool av umerkede aminosyrer avledet fra vev proteinolyse. Vi har vist at i voksen rotte og mus, ca 40% av forløperen leucine pool for proteinsyntese i hjernen kommer fra aminosyrer avledet fra protein sammenbrudd6. Dette må inkluderes i beregningen av regionale utbredelsen av cerebral proteinsyntese (rCPS) og må bekreftes i studier der dette forholdet kan endres. Det teoretiske grunnlaget og forutsetningene for metoden har blitt presentert i detalj andre steder6. I denne utredningen fokuserer vi på de prosessuelle spørsmålene i anvendelsen av denne metodikken.
Denne metoden har vært ansatt for fastsettelse av rCPS i bakken ekorn9, sau10, rhesus Monkeys11, rotter12,13, 14,15,16 , 17 i , 18 av år , 19 andre priser , 20 priser og , 21, en mus modell av tuberous sklerose kompleks22, en mus modell av skjøre x syndrom23,24,25,26, skjøre x premutation mus27, og en musemodell av Fenylketonuri28. I dette manuskriptet presenterer vi prosedyrene for måling av rCPS med in vivo autoradiographic L-[1-14C]-leucine metode. Vi stede rCPS i hjernen regioner av en våken kontroll musen. Vi viser også at in vivo administrasjon av anisomycin, en hemmer av oversettelsen, opphever proteinsyntese i hjernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Note alle dyr prosedyrer var anerkjent av det nasjonal off av mental sunnhet dyr bekymre og bruk komité og var utført alt etter med det nasjonal Institutes av sunnhet retningslinjene opp på bekymre og bruk av dyrene.
En oversikt over protokollen er presentert i figur 1.
1. kirurgisk implantat katetre i en lår blodåre og arterie for administrasjon av Tracer og samling av tidsbestemte arteriell blodprøver, henholdsvis. Komplett kirurgi minst 22 h før administrering av Tracer. Kirurgi krever ca 1 time å fullføre.
- Samle nødvendige materialer: sterile Kirurgiske instrumenter (kirurgisk saks, mikro-saks, tang, tre kirurgiske hud kroker), utstyr for isoflurane anestesi (isoflurane fordamper, aktiv gass renovasjons, forseglet anestesi kammer, anestesi nese kjegle), steril kirurgi scene, pels Clippers, 70% etanol, Betadine, sterilt gasbind, kirurgisk bånd, kommersielle hånd varmere, kirurgisk mikroskop, steril 0,9% natriumklorid (saltvann), steril heparin 100 USP enheter/mL i 0,9% natriumklorid (heparinisert saltvann), sterile 5 20-cm strimler av 6-0 absorberbare Sutur, sterile 25 cm tråder PE-8 og PE-10 polyetylen katetre med den ene enden kuttet på 45o, sterile 1 cc sprøyter, sterile 32 gauge nåler, cauterization utstyr, sterile 15-20 cm hul rustfritt stålstang (2,5 mm innvendig diameter, 3 mm utvendig diameter), lokale anestesimidler (bupivakain og lidokain salve), og et dyr kabinett med dreibar vedheng oppsett (30 cm fjær snor med knapp, sving, dreie brakett og arm, 20 X 13 cm klar sylindrisk i beholderen).
- Forbered dyr for kirurgi.
- Sikre at riktige aseptisk og sterile teknikker brukes som kreves av institusjonen din.
- Veie dyret. Dyret må være minst 25 g for vellykket kirurgi.
- Plasser dyret inne i en forseglet plexiglass kammer og koble kammeret til isoflurane anestesi apparatet. Sett strømningshastighet til 2,5 L/min for menn og 3,0 L/min for kvinner på 1,5% isoflurane i O2. Etter omtrent 2 min, sikre musen er hensiktsmessig bedøvet av mangel på et uttak refleks med en tå knipe.
- Når bedøvet, fjerne musen fra kammeret og legge den i en liggende posisjon med ansiktet inne i anestesi nesen kjegle. Sett opp nese kjegle for å motta gass fra fordamper og for å returnere gass til gass renovasjons. Den vil fange isoflurane i et kullfilter.
- Bruk Clippers til å barbere pelsen mellom skulderbladene. Sørg for å riktig sterilisere barberte regionen, alternerende tre ganger mellom Betadine og etanol scrubs.
- Vend musen over til en liggende posisjon holde ansiktet i nesen kjegle. Tape ned venstre beinet på kirurgi scenen og bruke Clippers å barbere pels fra venstre indre lår til øvre venstre magen. Sørg for å riktig sterilisere barberte regionen, alternerende tre ganger mellom Betadine og etanol scrubs.
- Skyv en aktivert kommersielt tilgjengelig håndvarmer, innpakket i gasbind, under musa. Tape ned høyre beinet på operasjons scenen.
- Sett kateteret inn i venstre lår blodåre.
- Ved hjelp av et kirurgisk mikroskop, bruk kirurgisk saks for å lage en 1 cm snitt fra øvre midtre del av venstre lår rostrally mot midtlinjen, avslører lårarterien og vene.
- Trekk løs hud med kirurgiske hud kroker for ytterligere å utsette blemmer.
- Påfør sterilt 0,9% natriumklorid til eksponert område for å opprettholde tilstrekkelig fuktighet.
- Bruk tang til stump analysere, skille bindevev rundt en liten del av lårarterien og vene. Forsiktig, skille arterien og venen (figur 2).
- Bruk pinsett til å tre en tråd av absorberbare Sutur (strand A) under både lår venen og arterien på det mest laterale punktet i snittet. Trekk Sutur halvveis gjennom slik at endene er like.
- På et mer proksimale punkt til lysken, bruk tang til å tre en andre Sutur (strand B) under bare lår venen. Forsiktig knytte en halv knute som skal brukes til å begrense blodstrøm.
- Ved et punkt mellom strand A og strand B, bruk tang til å tre en tredje Sutur (strand C) under bare lår Bens venen. Forsiktig knytte en full knute som skal brukes til å begrense blodstrøm. Vær forsiktig så du ikke rive venen.
- Trekk forsiktig på strand B for å begrense blodstrømmen. Bruk en hemostat for å forsiktig trekke strand B for å opprettholde begrenset blodstrøm.
- Skjær et lite hull i det begrensede området av lår Bens venen med microscissors, og sett forsiktig inn den vinklede enden av PE-8-slangen (tidligere spyles med heparin saltvann) mot strand B. Når satt inn, slipper strand B ' s spenning og veilede kateteret lenger opp i venen. Stram strand B rundt venen som inneholder kateteret.
- Bruk strand C til å knytte en ekstra knute rundt kateteret. Pass på at denne knuten ikke fanger lårarterien.
- Trekk forsiktig på sprøytesylinderen til delvis å fylle slangen med blod for å sikre at kateteret har blitt implantert riktig.
- Etter samme fremgangsmåte setter du inn et PE-10-kateter i venstre lår arterie.
- Komplett kirurgisk prosedyre.
- Når både lår venen og arterie katetre er sikret, binder du strand A til en knute rundt begge katetre.
- Skjær alle overflødige sting og fjern hud kroker. Skyll arteriell kateteret med heparinisert saltvann for å forhindre blodpropp. Cauterize endene av begge katetre for å skape en forsegling.
- Plasser musen i liggende posisjon og gjøre et lite snitt i bunnen av nakken og påfør saltvann til eksponert område.
- Sett hul metallstang subdermally fra nakken snitt til lår snittet. Snake katetre gjennom hule stangen og ut av nakken snitt. Fjern hul stangen. Implanting katetre subdermally vil forhindre mus fra å skade katetre.
- Påfør bupivakain på sidene av såret. Lukk lår snittet med Sutur. Tilsett lidokain salve over lukkede, sutured sår.
- Slange katetre gjennom en 30 cm fleksibel hul Tube (fjær feste) og Sutur knappen på fjær feste under huden. Påfør bupivakain på sidene av såret. Sutur knappen på våren snor under huden. Tilsett lidokain salve over lukkede, sutured sår.
- Beveg musen i en klar sylindrisk beholder (20 cm høy, 13 cm diameter) med en dreibar brakett og arm for å huse dyret under utvinning perioden. Plasser en hånd varmere under beholderen for å holde dyret varmt.
- Skru toppen av fjær festet til en sving, og fest dreie armen til dreie delen på den sylindriske beholderen. Kontroller at musen har hele spekteret av bevegelse og katetre kan nås.
- Plasser et lokk med spor som ikke forstyrrer dreiemekanismen over dyre kabinettet. Se Figur 3 for fullt oppsett.
- Tillate musa å komme seg. Minst 22 h anbefales.
2. Forbered L-[1-14C] leucine oppløsning for injeksjon og 16% (w/v) 5-sulfosalicylic acid (SSA) dinatriumfosfatdihydrat løsning for deproteinizing plasmaprøver. I SSA løsningen, også inkluderer 0,04 mM norleucine og 1 μCi/mL [H3] leucine som interne standarder for aminosyre analyse og analyse av Tracer konsentrasjon i syre-løselig plasma fraksjoner, henholdsvis. Lagre SSA opptil to måneder ved 4 ° c.
- Kjøp kommersielt tilgjengelig L-[1-14C] leucine (50-60 mCi/mmol), som selges som en løsning i 2% etanol eller 0,1 N HCL. blås tørr en kjent aktivitet av Tracer under en skånsom strøm av nitrogen og Rekonstituer i en løsning av sterilt normalt saltvann laget konsentrasjon på 100 μCi/mL.
3. administrere L-[1-14C] leucine intravenøst og samle arteriell blodprøver.
- Samle nødvendige materialer: 18 1,5 mL mikrorør for deproteinizing plasmaprøver (tilsett 70 mL deionisert vann til hvert rør), 17 250mL glass ampuller inserts (15 innsatser for innsamling av arteriell blodprøver og 2 innsatser for innsamling av døde rom blod for å bli reinjisert. For å begrense innsamling av ekstra og unødvendig blod, små, tynne hetteglass setter inn med koniske bunner som gir mulighet for tilgjengelig pipettering av supernatanten plasma anbefales), 2 microcapillary rør (32 X 0,8 mm, for hematokrit måling), 1 heparin og litium fluor-belagt mikrosentrifugen Tube (for å forebygge blodpropp og Glykolysen, henholdsvis), hemostats (dekke tips med tygon slangen slik at klemmer ikke vil skade PE-slangen), blod glukose Monitor, blodtrykks svinger, 1 mL sterile sprøyter (for saltvann tømming), og kommersielt tilgjengelig døds-løsning (fortynnet 1:1 i deionisert vann (for mus)).
- Sørg for at dyret er i en normal fysiologisk tilstand ved begynnelsen av eksperimentet.
- Klem arterie slangen ca 2 cm fra enden og kuttet av spissen, og skaper en åpning for blod å flyte. Løsne deretter slangen og samle opp døde rom blod ((c. 30 mL) for å samle inn rester av saltvann og/eller blod fra tidligere trekninger), og i et separat rør, samle en kontroll prøve (ca. 30 μL), hematokrit prøver (omtrent halvparten av kapillærrøret volum), og en glukose eksempel (ca. 20 μL).
- Mål hematokrit ved å plugge den ene enden med tetningsmasse kitt og sentrifuger for 1 min på 4500 x g. mål forholdet mellom volumet av røde celler til det totale blod volumet. Hvis et dyr har en hematokrit under 30%, ikke fortsette studien.
- Bruk en kommersielt tilgjengelig blodsukker Monitor for å måle glukosenivået i en dråpe blod.
- Sentrifuger kontroll prøve for 2 min ved 18 000 x g til separat plasma. Deproteinize plasmaprøver som følger: tilsett 5 μL plasma til 70 μL av deionisert vann i en 1,5 mL microtube, tilsett 25 μL av 16% SSA oppløsning og Vortex. Plasser på isen i 30 minutter før frysing på tørr is.
- Returner døde rom blod til dyret gjennom venøs linje, etterfulgt av en heparinisert saltvann flush for å hindre overflødig blodtap.
- Koble arterie linjen til en blodtrykks svinger for å måle gjennomsnittlig arteriell blodtrykk.
- Etter å ha tatt prøvene være sikker på å re-klemme på arteriell linje og å skylle linjen med en liten (50 mL) volum av heparinisert saltvann.
- Administrere Tracer intravenøst og samle tidsbestemte blodprøver.
- Bruk en Y-kontakt for å feste en sprøyte med Tracer (100μCi/kg) og en sprøyte med 50 mL sterilt saltvann for å skylle venøs linje etter injeksjon av Tracer. Koble Y-kontakten til vene linjen.
- Initiere studien ved samtidig å starte en stoppeklokke og injisere Tracer. Skyll venøs linje med saltvann (c. 100 ml) umiddelbart etter injeksjon.
- Samle blodprøver 1-7 kontinuerlig gjennom de første 2 min av eksperimentet på samme måte. Etter å samle den 7. prøve, samle 30 μL Dead-Space blod før hver gjenværende prøven. Prøvene 8-14 er samlet inn på 3, 5, 10, 15, 30, 45, og 60 min, henholdsvis.
- Behandle blodprøver umiddelbart etter innsamling, som ble beskrevet for kontroll prøven. Hvis det er en forsinkelse, plassere prøvene på isen. Forsiktig reinject døde rom blod inn i arterien via arteriell kateter og skyll med heparin saltvann.
- På et tidspunkt under eksperimentet kan du behandle tre interne standarder ved å legge til 25 μL 16% SSA, 0,04 mM norleucine og 1 mCi/mL [3H] leucine til 75 μL vann, Vortex og plass på isen.
- Etter innsamling av 14nde prøven på 60 min, injisere ca 0,2 mL B-døds aktiv-D i venøs linje for å euthanize dyret. Ta opp dødstidspunktet.
- Skru av dyret fra dreiebraketten og Fjern fra dyret kabinettet. Forsiktig fjerne hjernen, sted på aluminiumsfolie, og fryse på tørr is. Ikke fryse hjernen med flytende nitrogen som hjernen kan sprekke. Oppbevar hjerne, prøver og interne standarder ved-80 ° c til den er klar for behandling. Behandlingen kan utføres når som helst etterpå.
4. analyser konsentrasjoner av leucine og L-[1-14C] leucine i plasmaprøver.
- Tin prøver og interne standarder på is, Vortex og sentrifuger 18 000 x g i 5 min ved 2 ° c. Den supernatanten fraksjonen vil inneholde gratis merket og umerkede leucine.
- Overfør 40 μL av supernatanten til et flytende scintillation hetteglass og tilsett scintillation cocktail. Kvantifisere disintegrations per min (DPM) av 3h og 14c ved hjelp av flytende scintillation telling og en slukke kurven beregnet på samtidig dobbel-avmerke (3H og 14c) opptellingen.
- For å kvantifisere konsentrasjonen av plasma leucine, bruk et HPLC-system med en Kol onne søyle i natrium og etter Kol onne derivatization med o-phthaldehyde og fluorometric deteksjon.
- Sett HPLC til følgende spesifikasjoner: fluorometer eksitasjon av 330 NM og utslipp av 465 NM. Den mobile fasen består av natrium eluant, pH 7,40, og natrium eluant + 5% sulfolane, pH 3,15. Angi buffer strømningshastighet på 0,400 mL/min og den derivatization instrument strømningshastigheten til 0,300 mL/min. Angi Kol onne temperaturen til 48 ° c og reaktor temperatur til 45 ° c.
- Kalibrer systemet med en rekke konsentrasjoner av aminosyrer (inkludert norleucine) mellom 30 og 500 pmol/10mL. Kalibreringskurven er lineær. Aminosyren konsentrasjoner av testet 10 mL injeksjon prøvene faller innenfor områdene av denne kalibrering kurven.
5. Utfør kvantitativ autoradiografi.
- Forbered hjernen seksjoner 20 μm i tykkelse for autoradiografi. § Hjernen ved hjelp av en kryostaten ved-20 ° c.
- Tin montere serielle hjernen seksjoner på gelatin-belagt lysbilder. Lufttørke.
- Vask lysbilder i fem endringer på 10% formalin i 30 min per endring, etterfulgt av en kontinuerlig strøm av deionisert vann for 1 h. dekk lysbildene løst med folie for å unngå støv og la tørke i 24 timer.
- Ordne lysbilder i en X-ray film kassett (kassetter som passer 20X25 cm mammografi filmer anbefales) sammen med et sett av [14C] methylmethacrylate standarder, som tidligere var kalibrert mot vev av kjente 14c konsentrasjoner som beskrevet29. Standarder kan være kommersielt kjøpt, men sikre at de dekker en rekke 2-300 mCi/g av vev og er kalibrert mot 20 μm vev tykkelse. Under røde safelight, plassere et stykke mammografi film, emulsjon side ned, på toppen av seksjonene.
- Forsegle kassettene og plasser i en svart stelle pose og oppbevar i et kabinett for 40-45 dager.
- Utvikle filmer i henhold til produsentens anvisninger. Merk: automatisert film utvikling anbefales ikke fordi bakgrunnen kan være ujevn og kan påvirke kvantifisering.
6. analyser bilder.
Merk: et kommersielt tilgjengelig program for bildeanalyse kombinert med et CCD-kamera og et fluorescerende lys boks med enda belysning anbefales. Den relative optiske tettheten i den opplyste filmen oppdages av CCD-kameraet.
- Konstruere en kalibrering kurve av optisk tetthet (OD) v. tissue 14C konsentrasjon basert på ODS av settet med kalibrert standarder på filmen. Tilpasse disse dataene (inkludert blank eller bakgrunn) til en polynom ligning. Enten en andre eller tredje grad polynom ligningen passer veldig godt.
- For å analysere bestemte hjerneregioner, Finn interesseområdet (ROI) i seks til åtte seksjoner ved sammenligning med en Brain Atlas. Registrere ODs av pikslene innenfor en ROI i alle seksjoner, og basert på kalibreringskurven, beregne vevet 14C konsentrasjon i hver piksel. Beregn gjennomsnittlig vev 14C konsentrasjon i avkastningen.
7. beregning av rCPS. Beregn rCPS i hver ROI ved hjelp av følgende ligning:
Der P * (t) er den veide gjennomsnittlige vevs konsentrasjonen på 14C i avkastningen, cp(t) og C*P(t) er arterie plasmakonsentrasjonen av umerkede og merket leucine på tid, t, t er tiden at dyret døde ( ca 60 min), og λ er brøkdel av leucine i vevet forløper bassenget som kommer fra plasma. Evaluering av λ utføres i et eget eksperiment 6. λ har blitt evaluert i WT, Fmr1 knockout, TSC+/-, og PKU mus 6,22,25,28. Hvis et eksperiment innebærer enten genetiske eller farmakologiske endringer som kan påvirke utbredelsen av proteinsyntese, degradering eller metabolisme av leucine, bør λ evalueres under de nye forholdene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her viser vi et representativt eksperiment som demonstrerer virkningene av tidligere administrering av en protein syntese inhibitor på rCPS. Anisomycin i normal saltvann ble administrert til en voksen C57/BL6 mannlig vill-type mus subkutant (100 mg/kg) 30 min før initiering av rCPS bestemmelse. Effekter av anisomycin behandling sammenlignet med en kjøretøy-behandlet kontroll dyr viser at rCPS er nesten undetectable i anisomycin-behandlet musen (Figur 4). Disse dataene representerer en validering at in vivo autoradiographic L-[1-14C]-leucine metode måler utbredelsen av proteinsyntese i hjernen.
Vi presenterer en figur av L-[1-14C]-leucine autoradiograms på fire nivåer i hjernen for å demonstrere oppløsningen av metoden (figur 5). Illustrert er celle lagene i olfactory pære (figur 5a og B), hippocampus (figur 5c), og lillehjernen (figur 5G). Kjerner i hypothalamus (figur 5D), den Pons (figur 5E og F), og Brain Stem (figur 5h) er også tydelig sett i autoradiograms. Vi viser også de kvantitative regionale utbredelsen av proteinsyntese i frontal cortex (5,88 nmol/g/min) (figur 6a) og rygg hippocampus (5,35 nmol/g/min) (figur 6b) av et typisk kontroll dyr.
Figur 1: skjematisk fremstilling som representerer trinnene i hele rCPS-protokollen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: bilde av eksponert lår arterie og lår blodåre. Lårarterien, som ligger parallelt med hverandre, vises over lår Bens venen. Lår Bens venen har også en dypere rød farge enn lårarterien. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: bilde av anbefalt dyre kabinett oppsett for rCPS eksperiment. Det benytter en klar sylindrisk dyr kabinett med svingbare vedheng koblet til en fjær snor. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representative bilder fra et kjøretøy behandlet dyr (a) sammenlignet med et dyr behandlet med anisomycin (100 mg/kg, subkutant) 30 min før administrering av Tracer (B). Utbredelsen av proteinsyntese er proporsjonal med nivået av mørket i bildet. Anisomycin drastisk reduserer de målte tallene for proteinsyntese indikerer spesifisitet av denne metoden. Skalaen bar øverst til høyre i A representerer 1 mm og gjelder for begge bildene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: digitalisert autoradiograms fra en våken oppfører musen på nivået av olfactory pære (A, B), hypothalamus (C, D), Pons (E, F), lillehjernen (g), og hjernestammen (g, H). De mørkere regionene har høyere rCPS. Målestokken i panel G gjelder for paneler A, C, E og G. Autoradiograms til høyre (B, D, F og H) er forstørret bilder fra de områdene som er angitt på bildene til venstre, og Skalerings linjen i panel H gjelder for paneler B , D, F og H. forkortelser er som følger: FrA, frontal foreningen cortex; OB, olfactory pære; AO, fremre olfactory kjerne; GL, glomerulær lag; EPl, ekstern plexiform lag; BLA, basolateral amygdala; py, pyramideformet celle lag; dHi, rygg hippocampus; DG, dentate gyrus; MHb, midtre habenula; RT, thalamic retikulære kjerne; VMH, ventrale midtre hypothalamus kjerne; Bue, arcuate kjerne; EW, Edinger-Westphal kjerne; R, rød kjerne; PN, Pontine nucleus; ML, molekylær lag; GL, kornet lag; PC, Purkinje celle lag; Cu, cuneate kjerne; AP, areal postrema; 10, rygg motor kjernen av vagus; 12, hypoglossus kjerne. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: digitalisert autoradiograms fra en våken oppfører kontroll musen på nivået av frontal cortex (A) og rygg hippocampus (B). Utbredelsen av cerebral proteinsyntese er fargekodet i bildene i henhold til fargen bar vist til høyre. Skalerings linjen nederst til venstre på A representerer 1 mm og gjelder for begge bildene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterer en kvantitativ metode for fastsettelse av regionale utbredelsen av cerebral protein syntese (rCPS) in vivo i forsøksdyr. Denne metoden har betydelige fordeler i forhold til eksisterende metoder: 1. målingene er gjort i våken oppfører dyret, slik at de reflekterer pågående prosesser i fungerende hjernen. 2. målinger er gjort ved hjelp av kvantitative autoradiografi som gir muligheten til å bestemme rCPS i alle regioner og regioner i hjernen samtidig. 3. kinetisk modell av metoden tar hensyn til muligheten for resirkulering av umerkede aminosyrer avledet fra vev protein degradering og dens effekt på forløperen bassenget for proteinsyntese6.
Den primære begrensningen av denne metoden er at det er tidkrevende og krevende. Mens det er fristende å ansette enklere og høyere gjennomstrømning metoder, må begrensningene av data innhentet anerkjennes.
På grunn av kompleksiteten av å måle rCPS i en intakt mus, problemer med vedlikehold av en normal fysiologisk tilstand, samle tilstrekkelige blodprøver, og unngå muligens forstyrrende forhold kan oppstå. Kirurgisk implantat av venøs og arteriell katetre er utfordrende. Som med alle kirurgiske prosedyrer, spesielt med håndtering av delikate blodkar, er det en iboende risiko for dødelighet av dyret. For oss er det sjelden (ca 1%). I løpet av den påfølgende 22 h utvinning perioden, noen ganger (ca 4%) et dyr vil trekke et kateter ut. Under målingen er det viktig at katetre er patent og at dyr er i en normal fysiologisk tilstand. I vår nylige erfaring, arteriell blod kan ikke samles i ca 2% av dyrene og om lag 1% av dyrene hadde en lav hematokrit (< 40%) eller lavt arteriell blodtrykk (< 85 mm HG), som tyder på blodtap under operasjonen og/eller utvinning.
I utarbeidelsen av hjernens seksjoner for autoradiografi, er det viktig å sikre at snitt tykkelsen er 20 μm fordi det er den delen tykkelse som [14C] methylmethacrylate standarder har blitt kalibrert. Bruk forsiktighet for å sikre god kvalitet seksjoner, dvs, uten tårer, folder, eller bobler som disse feil vil forstyrre den autoradiographic analysen. Vi utvikler autoradiographic filmer for hånd i stedet for i en automatisert film prosessor fordi vi finner at bakgrunns optisk tetthet kan være ujevn etter automatisert behandling, og dette kan påvirke kvantifisering.
I ligningen for rCPS, inkluderer vi en faktor, lambda (λ), som er brøkdelen av leucine som kommer fra arteriell plasma, resten kommer fra resirkulering av aminosyrer avledet fra vev protein degradering6. Vi har evaluert λ i separate eksperimenter i WT og Fmr1 ko (skjøre X-modell) C57Bl/6J-mus og vist at dens verdi er 0,603. Verdien av λ kan variere avhengig av art, genetisk bakgrunn, eller tilstedeværelsen av en genetisk mutasjon. Derfor, hvis du utformer protein syntese eksperimenter for andre modeller, må man vurdere λ før en nøyaktig måling kan fås.
Vårt arbeid i genetisk Mouse modeller av neurodevelopmental lidelser demonstrerer at denne metodikken avslører endringer i rCPS i disse modellene og i noen tilfeller svar på farmakologiske behandlinger22,23,25 , 26. det er også tenkelig at rCPS målingen kan også overvåke degenerative forandringer i hjernen i forhold som modeller av Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, skjøre X tremor ataksi syndrom, traumatisk hjerneskade, etc. i disse modellene, kan det være mulig å spore tidlig degenerative forandringer og muligens også svar på tidlig intervensjon. RCPS-metoden kan brukes sammen med immunhistokjemi i parallelle deler for å undersøke konkrete endringer i hjernen25. Oppsummert er den kvantitative autoradiographic L-[1-14C]-leucine-metoden ideell for nøyaktig bestemmelse av rCPS-verdier i vivo. Det gir betydelige fordeler når det gjelder nøyaktighet og anvendelighet for in vivo-forhold over eksisterende metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne Zengyan Xia for genotyperingteknologi av mus, tom Burlin for behandling av aminosyrer og filmer, og Mei Qin for å utføre noen av de rCPS eksperimenter. Denne forskningen ble støttet av intramural Research program for NIMH, ZIA MH00889. RMS ble også støttet av en Autism snakker postdoktor Fellowship 8679 og en FRAXA postdoktor Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson Laboratory | 003024 | Fmr1 knockout breeding pairs |
| Anisomycin | Tocris Bioscience | 1290 | |
| Microhematocrit Tubes | Drummond Scientific | 1-000-3200-H | capillary tubes |
| Critoseal Capillary Tube Sealant | Leica Microsystems | 39215003 | sealant putty |
| Glass vial inserts | Agilent | 5183-2089 | used to collect blood samples |
| Digi-Med Blood Pressure Analyzer | Micro-Med Inc. | BPA-400 | blood pressure analyzer |
| Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System | Bayer Breeze | 9570A | glucose meter |
| Gastight syringe | Hamilton Co. | 1710 | tuberculin glass syringe |
| HeatMax HotHands-2 Hand Warmers | HeatMax | Model HH2 | warming pads |
| Heparin Lock Flush Solution | Fresenius Kabi USA, LLC | 504505 | heparin saline |
| Clear animal container | Instech | MTANK/W | animal enclosure |
| Spring tether | Instech | PS62 | catheter tube/rodent attachment |
| Swivel | Instech | 375/25 | hooks to spring tether |
| Swivel arm and mount | Instech | SMCLA | hooks to swivel and animal enclosure |
| Tether button | Instech | VAB62BS/22 | attaches to bottom of spring tether |
| Stainless steel tube | Made in-house | N/A | used to snake catheters through mouse |
| Matrx VIP 3000 | Matrx | 91305430 | isoflurane vaporizer |
| Isoflurane | Stoelting Co. | 50207 | isoflurane/halothane adsorber |
| Clippers | Oster Finisher | Model 59 | |
| Surgical skin hooks | Made in-house (??) | N/A (??) | |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | APP Pharmaceuticals LLC | 918610 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| UNIFY silk surgical sutures | AD Surgical | #S-S618R13 | 6-0 USP, non-absorbable |
| PE-8 polyethylene tubing | SAI Infusion Technologies | PE-8-25 | |
| Syringe | Becton Dickinson and Co. | 309659 | 1cc/mL |
| PE-10 polyethylene tubing | Clay Adams | 427400 | |
| MCID Analysis | Imaging Research Inc. | Version 7.0 | optical density analysis |
| Gelatin-coated slides (75x25mm) | FD Neurotechnologies | PO101 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Super RX-N medical x-ray film | Fuji | 47410-19291 | |
| Hypercassettes (8x10 in) | Amersham Pharmacia Biotech | 11649 | |
| [1-14C]leucine | Moravek | MC404E | |
| Microcentrifuge tube | Sarstedt Aktiengesellschaft & Co. | 72.692.005 | used to deproteinize blood samples |
| Glass pasteur pipette | Wheaton | 357335 | |
| Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | |
| Nitrogen | NIH Supply Center | 6830009737285 | |
| Scintillation fluid | CytoScint | 882453 | |
| Liquid scintilllation counter | Packard Tri-Carb | 2250CA | |
| Amino acid analyzer | Pickering Laboratories | Pinnacle PCX | |
| HPLC unit | Agilent Technologies | 1260 Infinity | include 1260 Bio-Inert Pump |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg | M650 | |
| Sulfosalicylic acid | Sigma-Aldrich | MKBS1634V | 5-sulfosalicylic acid dihydrate |
| Norleucine | Sigma | N8513 | |
| 1.0 N HCl | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| [H3]leucine | Moraevk | MC672 | |
| Falcon tube | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL conical centrifuge tubes |
| Stopwatch | Heuer Microsplit | Model 1000 | 1/100 min |
| Euthanasia Solution | Vet One | H6438 | |
| Northern Light Precision Illuminator | Imaging Research Inc. | Model B95 | fluorescent light box |
| Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 | Nikon | 1442 | CDD camera |
References
- West, A. E., et al. Calcium regulation of neuronal gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).
- Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. Basic Neurochemistry. , 6th ed, Lippincott-Raven. New York. (1999).
- Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265, 1104-1107 (1994).
- Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2. Science. 286, 785-790 (1999).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).
- Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).
- Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).
- Banker, G., Cotman, C. W. Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).
- Frerichs, K. U., et al. Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).
- Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep. The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).
- Nakanishi, H., et al. Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta. The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats. Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).
- Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei. Brain Research. 494, 155-158 (1989).
- Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats. The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).
- Smith, C. B., Yu, W. H. Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment. Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).
- Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).
- Nadel, J., et al. Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis. Brain Research. 1537, 125-131 (2013).
- Sun, Y., et al. Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development. The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).
- Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool. Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).
- Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats. Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).
- Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin. Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).
- Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome. Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).
- Qin, M., et al. Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).
- Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).
- Qin, M., et al. R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034 (2015).
- Qin, M., et al. Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation. ASN Neuro. 6, (2014).
- Smith, C. B., Kang, J. Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).
- Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats. Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).
