Summary
Eiwitsynthese is een kritisch biologisch proces voor cellen. In de hersenen is het vereist voor adaptieve wijzigingen. Meting van de tarieven van de eiwitsynthese in de intacte hersenen vereist zorgvuldige methodologische overwegingen. Hier presenteren we de L-[1-14C]-Leucine kwantitatieve autoradiografische methode voor de bepaling van de regionale tarieven van cerebrale eiwitsynthese in vivo.
Abstract
Eiwitsynthese is nodig voor de ontwikkeling en het onderhoud van de neuronale functie en is betrokken bij adaptieve veranderingen in het zenuwstelsel. Bovendien wordt gedacht dat disregulatie van de eiwitsynthese in het zenuwstelsel een kern fenotype in sommige ontwikkelingsstoornissen kan zijn. Nauwkeurige meting van de tarieven van cerebrale eiwitsynthese in diermodellen is belangrijk voor het begrijpen van deze aandoeningen. De methode die we hebben ontwikkeld is ontworpen om te worden toegepast op de studie van wakker, gedragen dieren. Het is een kwantitatieve autoradiografische methode, zodat het tarieven in alle regio's van de hersenen tegelijkertijd kan opleveren. De methode is gebaseerd op het gebruik van een Tracer aminozuur, L-[1-14C]-Leucine, en een kinetische model van het gedrag van L-leucine in de hersenen. We kozen voor L-[1-14C]-Leucine als de Tracer omdat het niet leidt tot vreemd gelabelde stofwisselingsproducten. Het is ofwel opgenomen in eiwitten of snel gemetaboliseerd tot opbrengst 14co2 die wordt verdund in een grote pool van niet-gelabelde co2 in de hersenen. De methode en het model zorgen ook voor de bijdrage van niet-gelabelde Leucine afgeleid van weefsel proteolyse aan de weefsel precursor pool voor eiwitsynthese. De methode heeft de ruimtelijke resolutie om te bepalen van de eiwitsynthese percentages in cel en neuro pil lagen, evenals hypothalame en craniale zenuw kernen. Om betrouwbare en reproduceerbaar kwantitatieve gegevens te verkrijgen, is het belangrijk om te voldoen aan procedurele details. Hier presenteren we de gedetailleerde procedures van de kwantitatieve autoradiographic L-[1-14C]-Leucine methode voor de bepaling van de regionale percentages van de eiwitsynthese in vivo.
Introduction
Eiwitsynthese is een belangrijk biologisch proces dat nodig is voor lange termijn adaptieve veranderingen in het zenuwstelsel1. Remming van de eiwitsynthese blokkeert lange termijn geheugen opslag in zowel ongewervelde dieren en gewervelde dieren2. Eiwitsynthese is essentieel voor het onderhoud van de late fasen van sommige vormen van lange termijn potentiëring (LTP) en lange termijn depressie (LTD)3, neuronale overleving tijdens ontwikkeling4, en voor algemeen onderhoud van het neuron en zijn synaptische verbindingen5. Meting van de tarieven van de hersenen eiwitsynthese kan een belangrijk instrument waarmee te studeren adaptieve veranderingen evenals neuroontwikkelingsstoornissen en aandoeningen met betrekking tot leren en geheugen.
We hebben een methode ontwikkeld om de percentages van de cerebrale eiwitsynthese in vivo te kwantificeren in een wakker dier dat inherente voordelen biedt ten opzichte van andere technieken die de percentages in ex vivo of in vitro preparaten van hersenweefsel6inschatten. De belangrijkste is de toepasbaarheid op metingen in het intacte brein in een wakker dier. Dit is een belangrijke overweging, omdat het toelaat metingen met synaptische structuur en functie op zijn plaats en zonder zorgen over post mortem effecten. Bovendien bereikt de kwantitatieve autoradiografische benadering die wij hanteren een hoge mate van ruimtelijke lokalisatie. Overwegende dat de energie van 14C zodanig is dat we de Tracer niet op het subcellulaire of cellulaire niveau kunnen lokaliseren, we kunnen de tarieven in cellagen en kleine hersengebieden zoals hypothalamische kernen meten, met ongeveer een 25 μm-resolutie7.
Een uitdaging van in vivo metingen met radiotracers is om ervoor te zorgen dat radio label gemeten is in het product van de reactie van belang in plaats van ongereageerde gelabelde precursor of ander vreemd gelabelde metabole producten6. We kozen voor L-[1-14C]-Leucine als de Tracer aminozuur omdat het ofwel is opgenomen in eiwitten of snel gemetaboliseerd tot 14co2, die wordt verdund in de grote pool van niet-gelabelde co2 in de hersenen als gevolg van de hoge snelheid van energiemetabolisme8. Bovendien bestaat 14c niet opgenomen in eiwitten voornamelijk als vrij [14c]-Leucine, die gedurende de experimentele periode van 60 minuten bijna volledig uit het weefsel6wordt geklaard. Eiwitten worden vervolgens vastgemaakt aan weefsel met formaline en vervolgens gespoeld met waterom elke vrije [14C]-Leucine te verwijderen voor autoradiografie.
Een andere belangrijke overweging is de kwestie van de verdunning van de specifieke activiteit van de precursor aminozuur pool door niet-gelabelde aminozuren afgeleid van weefsel proteolyse. We hebben aangetoond dat bij volwassen rat en muis, ongeveer 40% van de precursor Leucine pool voor eiwitsynthese in de hersenen komt uit aminozuren afgeleid van eiwitafbraak6. Dit moet worden opgenomen in de berekening van de regionale tarieven van cerebrale eiwitsynthese (Rcp's) en moet worden bevestigd in studies waarin deze relatie kan veranderen. De theoretische basis en de veronderstellingen van de methode zijn in detail elders gepresenteerd6. In dit document richten we ons op de procedurele kwesties van de toepassing van deze methodologie.
Deze methode is gebruikt voor de bepaling van de rcp's in de grondeekhoorns9, schapen10, rhesus monkeys11, ratten12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21, een muismodel van het Tubereuze sclerosecomplex 22, een muismodel van fragiel x-syndroom23,24,25,26, fragiele x premutatie muizen27, en een muismodel van fenylketonurie28. In dit manuscript presenteren we de procedures voor het meten van Rcp's met de in vivo autoradiographic L-[1-14C]-Leucine-methode. We presenteren Rcp's in hersengebieden van een wakker besturings muis. We tonen ook aan dat in vivo toediening van anisomycine, een remmer van de vertaling, afschaffing van de eiwitsynthese in de hersenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: alle dier procedures zijn goedgekeurd door het Nationaal Instituut voor dierenverzorging en-gebruik en werden uitgevoerd volgens de nationale instituten voor gezondheids richtlijnen over de verzorging en het gebruik van dieren.
Een overzicht van het protocol wordt weergegeven in Figuur 1.
1. chirurgisch implantaat katheters in een femorale ader en slagader voor de toediening van de Tracer en de verzameling van getimede arteriële bloedmonsters, respectievelijk. Volledige operatie ten minste 22 h voorafgaand aan de toediening van de Tracer. Chirurgie vereist ongeveer 1 h te voltooien.
- Verzamel de benodigde materialen: steriele chirurgische instrumenten (chirurgische schaar, micro-schaar, Tang, drie chirurgische huid haken), apparatuur voor Isofluraan anesthesie (Isofluraan vaporizer, actieve gasscavenger, verzegelde anesthesie kamer, anesthesie neuskegel), steriele chirurgie fase, fur Clippers, 70% ethanol, Betadine, steriel gaas, chirurgische tape, commerciële hand warmers, chirurgische Microscoop, steriel 0,9% natriumchloride (zoutoplossing), steriele heparine 100 USP eenheden/mL in 0,9% natriumchloride (heparinized zoutoplossing), steriele 5 20-cm strips van 6-0 absorbabele hechtdraad, steriele 25-cm strengen van PE-8 en PE-10 polyethyleen katheters met één uiteinde op 45o, steriele 1 cc spuiten, steriele 32 gauge naalden, cauterie apparatuur, steriel 15-20 cm holle RVS stalen staaf (2,5 mm binnendiameter, 3 mm buitendiameter), lokale anesthetica (bupivacaine en lidocaïne zalf), en een dierlijke behuizing met draaibare aanhangsel Setup (30 cm veer Tether met knop, draaibaar, draaibare steun en arm, 20 X 13 cm helder cilindrisch container).
- Bereid het dier voor op een operatie.
- Verzeker u ervan dat de juiste aseptische en steriele technieken worden gebruikt zoals vereist door uw instelling.
- Weeg het dier af. Het dier moet ten minste 25 g zijn voor een geslaagde operatie.
- Plaats het dier in een verzegelde plexiglas kamer en verbind de kamer met het Isofluraan anesthesie apparaat. Stel de stroomsnelheid in op 2,5 L/min voor mannetjes en 3,0 L/min voor vrouwtjes van 1,5% Isofluraan in O2. Na ongeveer 2 min, zorg ervoor dat de muis is op de juiste wijze verdoofd door gebrek aan een opname reflex met een teen knijpen.
- Eenmaal verdoofd, verwijder de muis uit de kamer en leg het in een gevoelige positie met zijn gezicht in de anesthesie neuskegel. Stel de nose cone in om gas te krijgen van de vaporizer en om gas terug te geven aan de gasscavenger. De Scavenger zal Isofluraan vangen in een houtskool filter.
- Gebruik de Clippers om de vacht tussen de schouderbladen te scheren. Zorg ervoor dat u de geschoren regio goed steriliseren, drie keer afwisselend tussen Betadine en ethanol Scrubs.
- Draai de muis naar een liggende positie om het gezicht in de neuskegel te houden. Plak het linkerbeen op de operatie fase en gebruik de Clippers om de vacht van de linker binnenste dij naar de linker bovenbuik te scheren. Zorg ervoor dat u de geschoren regio goed steriliseren, drie keer afwisselend tussen Betadine en ethanol Scrubs.
- Schuif een geactiveerde in de handel verkrijgbare hand warmer, verpakt in gaas, onder de muis. Plak het rechterbeen op de operatie fase.
- Plaats de katheter in de linker femorale ader.
- Gebruik met behulp van een chirurgische Microscoop een chirurgische schaar om een incisie van 1 cm van het bovenste mediale gedeelte van het linker dijbeen naar de middellijn te brengen en de dijader en de ader te onthullen.
- Trek de losse huid aan met chirurgische huid haken om de blaasjes verder bloot te leggen.
- Breng steriel 0,9% natriumchloride aan op een blootgestelde gebied om voldoende vocht te behouden.
- Gebruik de tang om te botte dissect, scheiden van bindweefsel rond een klein deel van de dijbeen slagader en ader. Voorzichtig, scheid de slagader en ader (Figuur 2).
- Gebruik de tang om een streng absorbabel hechtmiddel (onderdeel A) te garen onder zowel de dijader als de slagader op het meest laterale punt van de incisie. Trek de hechtdraad halverwege, zodat de uiteinden zelfs zijn.
- Op een meer proximale punt naar de lies, gebruik de tang om een tweede hechtmiddel (onderdeel B) onder alleen de femorale ader te garen. Voorzichtig een halve knoop die zal worden gebruikt om de bloedtoevoer te beperken binden.
- Op een punt tussen onderdeel A en onderdeel B, gebruik de tang om een derde hechtmiddel (onderdeel C) onder alleen de femorale ader te garen. BIND voorzichtig een volledige knoop die zal worden gebruikt om de bloedtoevoer te beperken. Let op dat u de ader niet scheurt.
- Zachtjes trekken op strand B om de bloedtoevoer te beperken. Gebruik een hemostat om zachtjes te trekken van strand B om de beperkte doorbloeding te behouden.
- Snijd een klein gaatje in het beperkte gebied van de dijbeenader met micro schaar en steek voorzichtig het schuine uiteinde van de PE-8 slang (voorheen gespoeld met heparine Saline) richting onderdeel B. Eenmaal ingebracht, laat u de spanning van het onderdeel B los en leid u de katheter verder op de ader. Draai streng B rond de ader met de katheter vast.
- Met behulp van onderdeel C, binden een extra knoop rond de katheter. Zorg ervoor dat deze knoop niet de femorale slagader vastlegt.
- Trek voorzichtig terug op de spuitcilinder om de slang gedeeltelijk te vullen met bloed om ervoor te zorgen dat de katheter goed is geïmplanteerd.
- Na dezelfde procedure, steek een PE-10 katheter in de linker femorale slagader.
- Volledige chirurgische ingreep.
- Zodra zowel de femorale ader als de slagader katheters zijn vastgezet, binden strand A in een knoop rond beide katheters.
- Snijd alle overtollige hechtingen en verwijder huid haken. Spoel de arteriële katheter met gehepariniseerd zoutoplossing om stolling te voorkomen. Cauteriseren de uiteinden van beide katheters om een zegel te maken.
- Plaats de muis in de liggende positie en maak een kleine incisie aan de basis van de nek en breng een zoutoplossing aan op het blootgestelde gebied.
- Invoegen holle metalen staaf nekhuid van de hals incisie aan de femorale incisie. Slang de katheters door de holle staaf en uit de nek incisie. Verwijder de holle staaf. Implanterende katheters zal voorkomen dat muizen de katheters beschadigen.
- Breng de aan op de zijkanten van de wond. Sluit de femorale incisie met hecht. Voeg lidocaïne zalf toe over gesloten, gehecht wond.
- Slang de katheters door een 30 cm flexibele holle buis (lente Tether) en hechting van de knop van de lente Tether onder de huid. Breng de aan op de zijkanten van de wond. Hecht de knop van de veer onder de huid. Voeg lidocaïne zalf toe over gesloten, gehecht wond.
- Beweeg de muis in een doorzichtige cilindrische container (20 cm hoog, 13 cm diameter) met een draaibare houder en arm om het dier tijdens de herstelperiode te huisdieren. Plaats een hand warmer onder de container om het dier warm te houden.
- Schroef de bovenkant van de veer Tether op een wartel en bevestig de wartel aan de zwenk arm die aan de cilindrische container is bevestigd. Zorg ervoor dat de muis volledig bewegingsbereik heeft en dat de katheters toegankelijk zijn.
- Plaats een sleuf deksel dat het zwenkmechanisme over de dieren behuizing niet verstoort. Zie afbeelding 3 voor de volledige installatie.
- Laat de muis herstellen. Ten minste 22 uur wordt aanbevolen.
2. bereid L-[1-14C] Leucine oplossing voor injectie en 16% (w/v) 5-sulfosalicylzuur (SSA) dihydraat oplossing voor deproteïniserend plasma monsters. In de SSA-oplossing, omvatten ook 0,04 mM norleucine en 1 μCi/mL [H3] Leucine als interne normen voor aminozuuranalyse en analyse van de Tracer concentratie in de zuur oplosbare plasma fracties, respectievelijk. Bewaar de SSA maximaal twee maanden bij 4 °C.
- Aankoop commercieel beschikbaar L-[1-14C] Leucine (50-60 MCI/mmol), die wordt verkocht als een oplossing in 2% ethanol of 0,1 N HCl. blaas een bekende activiteit van de Tracer onder een zachte stikstofstroom en reconstitueer in een oplossing van steriele normale zout tot een concentratie van 100 μCi/mL.
3. dien L-[1-14C] Leucine intraveneus toe en verzamel arteriële bloedmonsters.
- Verzamel de benodigde materialen: 18 1,5 mL microtubes voor deproteïniserend plasma monsters (voeg 70 mL gedeïoniseerd water toe aan elke buis), 17 250mL glazen injectieflacon inserts (15 wisselplaten voor het verzamelen van arteriële bloedmonsters en 2 inserts voor het verzamelen van dode ruimte bloed opnieuw worden ingesproken. Om de verzameling van extra en onnodig bloed te beperken, worden kleine, dunne glazen injectieflacons met taps toelopende bodems die het mogelijk maken voor toegankelijke Pipetteer van supernatant plasma aanbevolen), 2 Micro-capillaire buizen (32 X 0,8 mm, voor hematocriet meting), 1 heparine en microcentrifuge buis met lithium fluoride-coating (om respectievelijk stolling en glycolyse te voorkomen), hemostatica (Bedek de uiteinden met tygon-slang zodat klemmen geen PE-slang beschadigen), bloedglucosemeter, bloeddruk omzetter, 1 mL steriele spuiten (voor zoute flushes), en in de handel verkrijgbare euthanasie oplossing (verdund 1:1 in gedeïoniseerd water (voor muizen)).
- Zorg ervoor dat het dier aan het begin van het experiment in een normale fysiologische toestand verkeert.
- Klem de arteriële slang ongeveer 2 cm van het uiteinde en snijd de punt af, waardoor een opening ontstaat voor bloed om te stromen. Vervolgens los tubing en verzamelen dode ruimte bloed ((c. 30 ml) voor het verzamelen van eventuele resterende zoutoplossing en/of bloed van vorige trekkingen), en, in een aparte buis, verzamelen van een controlemonster (ca. 30 μL), hematocriet monsters (ongeveer de helft van het capillaire volume), en een glucose monster (ca. 20 μL).
- Meet hematocriet door een uiteinde aan te sluiten met Sealant putty en Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 4500 x g. meet de verhouding van het volume van de rode cellen tot het totale bloed volume. Als een dier een hematocriet heeft van minder dan 30%, ga dan niet verder met de studie.
- Gebruik een in de handel verkrijgbare bloedglucosemeter om het glucosegehalte in een druppel bloed te meten.
- Centrifuge controlemonster voor 2 min bij 18.000 x g om plasma te scheiden. Deproteiniseert plasma monsters als volgt: Voeg 5 μL plasma toe aan 70 μL gedeïoniseerd water in een 1,5 mL micro tube, voeg 25 μL van de 16% SSA-oplossing en Vortex toe. Plaats op ijs voor 30 minuten voor het invriezen op droogijs.
- Retourneer dode ruimte bloed naar het dier door de veneuze lijn, gevolgd door een gehepariniseerd zoutoplossing flush om te voorkomen dat overtollig bloedverlies.
- Sluit de arteriële lijn aan op een bloeddruk omzetter om de gemiddelde arteriële bloeddruk te meten.
- Na het nemen van de monsters moet u de arteriële lijn opnieuw vastklemmen en de lijn spoelen met een klein (50 ml) volume gehepariniseerd zoutoplossing.
- Beheer Tracer intraveneus en verzamel getimede arteriële bloedmonsters.
- Gebruik een Y-connector om één spuit te bevestigen met de Tracer (100μCi/kg) en één spuit met 50 mL steriele zoutoplossing om de veneuze lijn na de injectie van de Tracer te spoelen. Verbind Y-connector met de veneuze lijn.
- Start de studie door gelijktijdig een stop horloge te starten en de Tracer te injecteren. Spoel de veneuze lijn met zoutoplossing (c. 100mL) onmiddellijk na de injectie.
- Verzamel bloedmonsters 1-7 continu gedurende de eerste 2 min van het experiment op dezelfde manier. Verzamel na het verzamelen van het 7e monster 30 μL dode-ruimte bloed voor elk resterend monster. Samples 8-14 worden verzameld op respectievelijk 3, 5, 10, 15, 30, 45 en 60 min.
- Proces bloedmonsters onmiddellijk na de inzameling, zoals beschreven voor de controlemonster. Als er een vertraging is, plaatst u de monsters op ijs. Zorgvuldig reject dode ruimte bloed in de slagader via de arteriële katheter en spoelen met heparine zoutoplossing.
- Op een bepaald moment tijdens het experiment, verwerken drie interne normen door toevoeging van 25 μL 16% SSA, 0,04 mM norleucine, en 1 mCi/mL [3H] leucine aan 75 μL water, Vortex en plaats op ijs.
- Injecteer na het verzamelen van het 14e monster op 60 min ongeveer 0,2 mL B-Euthanasia-D in de veneuze lijn om het dier te euthanasie. Noteer de tijd van de dood.
- Schroef het dier los van de draaibare steun en haal het uit de behuizing van het dier. Verwijder voorzichtig de hersenen, plaats op aluminiumfolie, en bevriezen op droogijs. Niet bevriezen hersenen met vloeibare stikstof als hersenen kunnen kraken. Bewaar hersenen, samples en interne normen bij-80 °C tot het klaar is voor verwerking. De verwerking kan op elk moment achteraf worden uitgevoerd.
4. Analyseer de concentraties van Leucine en L-[1-14C] Leucine in plasma monsters.
- Dooi monsters en interne normen op ijs, Vortex en centrifuge 18.000 x g gedurende 5 minuten bij 2 °C. De supernatant fractie zal het gratis gelabelde en ongegelabelde Leucine bevatten.
- Breng 40 μL van het supernatant over naar een vloeibare Scintillatie flacon en voeg Scintillatie cocktail toe. Kwantificeer desintegraties per min (DPM) van 3uur en 14c door middel van vloeibare Scintillatie telling en een dorst lessen curve ontworpen voor gelijktijdige dubbel label (3h en 14c) tellen.
- Om plasma-Leucine concentraties te kwantificeren, gebruikt u een HPLC-systeem met een natriumcation Exchange-kolom en derivatisatie na de kolom met o-ftaldehyde en fluorometrische detectie.
- Stel HPLC in op de volgende specificaties: fluorometer excitatie van 330 nm en emissie van 465 nm. De mobiele fase bestaat uit natrium eluant, pH 7,40 en natrium eluant + 5% sulfolane, pH 3,15. Stel de buffer stroom in van 0,400 ml/min en het bewerking instrument debiet tot 0,300 ml/min. Stel de kolomtemperatuur in op 48 °c en de reactor temperatuur tot 45 °c.
- Kalibreer het systeem met een reeks aminozuur concentraties (waaronder norleucine) tussen 30 en 500 pmol/10mL. De ijkcurve is lineair. De aminozuur concentraties van de geteste 10 mL injectie monsters vallen binnen de bereiken van deze kalibratiecurve.
5. Voer kwantitatieve autoradiografie uit.
- Bereid hersenen secties 20 μm in dikte voor autoradiografie. Sectie hersenen door middel van een cryostaat bij-20 °C.
- Thaw Mount seriële hersen secties op dia's met gelatine gecoate. Lucht drogen.
- Spoel dia's in vijf veranderingen van 10% formaline gedurende 30 minuten per verandering, gevolgd door een continue stroom van gedeïoniseerd water gedurende 1 uur. Bedek de dia's losjes met folie om stof te voorkomen en laat 24 uur drogen.
- Orden dia's in een X-ray film cassette (cassettes die passen bij de mammografie films van 20X25 cm worden aanbevolen) samen met een set van [14C] methylmethacrylaat-normen, die eerder waren gekalibreerd tegen weefsel van bekende 14c-concentraties als beschreven29. Normen kunnen commercieel worden gekocht, maar zorg ervoor dat ze een bereik van 2-300 mCi/g weefsel dekken en zijn gekalibreerd tegen 20 μm weefsel dikte. Onder rode safelight plaatst u een stukje mammografie film, emulsiezijde naar beneden, bovenop de secties.
- Seal de cassettes en plaats ze in een zwarte tas en bewaar ze in een kast voor 40-45 dagen.
- Ontwikkel films volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Opmerking: geautomatiseerde film ontwikkeling wordt niet aanbevolen omdat de achtergrond ongelijk kan zijn en de kwantificering kan beïnvloeden.
6. Analyseer afbeeldingen.
Opmerking: een in de handel verkrijgbaar programma voorbeeld analyse in combinatie met een CCD-camera en een fluorescerende lichtbak met gelijkmatige verlichting wordt aanbevolen. De relatieve optische dichtheden in de verlichte film worden gedetecteerd door de CCD-camera.
- Construeer een ijkcurve van optische dichtheid (OD) v. weefsel 14C concentratie op basis van de ODs van de set van gekalibreerde normen op de film. Deze gegevens (inclusief de blanco of achtergrond) aan een polynomiale vergelijking aanpassen. Ofwel een tweede of derde graad polynomiale vergelijking past zeer goed.
- Om specifieke hersengebieden te analyseren, zoekt u de regio van belang (ROI) in zes tot acht secties in vergelijking met een hersen Atlas. Noteer de ODs van de pixels binnen een ROI in alle secties en bereken, op basis van de kalibratiecurve, de weefsel concentratie van 14C in elke pixel. Bereken de gemiddelde concentratie van het weefsel 14C in de ROI.
7. berekening van de Rcp's. Bereken de Rcp's in elke ROI met behulp van de volgende vergelijking:
Waarbij P * (t) de gewogen gemiddelde weefsel concentratie van 14C in de ROI is, cp(t) en c*P(t) de arteriële plasmaconcentraties van niet-gelabelde en gelabelde Leucine op het moment, t, t is de tijd dat het dier stierf ( ongeveer 60 min), en λ is de Fractie van Leucine in de weefsel precursor pool die afkomstig is van het plasma. De evaluatie van λ wordt uitgevoerd in een afzonderlijk experiment 6. λ is geëvalueerd in WT, Fmr1 Knockout, TSC+/-en PKU muizen 6,22,25,28. Als een experiment genetische of farmacologische veranderingen inhoudt die van invloed kunnen zijn op de eiwitsynthese, afbraak of metabolisme van Leucine, moet λ onder de nieuwe voorwaarden worden geëvalueerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier tonen we een representatief experiment waaruit de effecten van voorafgaande toediening van een eiwitsynthese remmer op Rcp's blijkt. Anisomycine in normale zoutoplossing werd subcutaan toegediend aan een volwassen C57/BL6 mannelijk wild type muis (100 mg/kg) 30 min vóór aanvang van de bepaling van de Rcp's. Effecten van anisomycine behandeling in vergelijking met een met een voertuig behandeld controle dier tonen aan dat Rcp's bijna niet detecteerbaar zijn in de met anisomycine behandelde muis (Figuur 4). Deze gegevens vertegenwoordigen een validatie dat de in vivo autoradiographic L-[1-14C]-Leucine methode meet percentages van eiwitsynthese in de hersenen.
We presenteren een figuur van L-[1-14C]-Leucine autoradiogrammen op vier niveaus van de hersenen om de resolutie van de methode aan te tonen (Figuur 5). Geïllustreerd zijn de cellagen in de olfactorische bol (figuur 5a en B), de Hippocampus (figuur 5c) en het cerebellum (figuur 5g). Nuclei in de hypothalamus (figuur 5d), de Pons (Figuur 5E en F), en de hersenstam (figuur 5H) zijn ook duidelijk te zien in de autoradiogrammen. We tonen ook de kwantitatieve regionale percentages van de eiwitsynthese in de frontale cortex (5,88 nmol/g/min) (Figuur 6a) en de dorsale Hippocampus (5,35 nmol/g/min) (Figuur 6b) van een typisch controle dier.
Afbeelding 1: schematische voorstelling van de stappen van het gehele rCPS-protocol. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: beeld van blootgestelde femorale slagader en femorale ader. Parallel aan elkaar te leggen, wordt de dijbeen slagader boven de femorale ader getoond. De femorale ader heeft ook een diepere rode kleur dan de femorale slagader. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: afbeelding van aanbevolen dieren behuizing voor rCPS-experiment. Het maakt gebruik van een heldere cilindrische dierlijke behuizing met draaibare aanhangsel verbonden met een veer Tether. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: representatieve beelden van een met een voertuig behandeld dier (a) vergeleken met een met anisomycine behandeld dier (100 mg/kg, subcutaan) 30 min vóór toediening van Tracer (B). De percentages van de eiwitsynthese zijn evenredig met het niveau van duisternis in het beeld. Anisomycine vermindert drastisch de gemeten percentages van de eiwitsynthese die de specificiteit van deze methode aangeven. De schaalbalk in de rechterbovenhoek van A vertegenwoordigt 1 mm en is van toepassing op beide afbeeldingen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: gedigitaliseerde autoradiogrammen van een wakker gedragen muis op het niveau van de olfactorische gloeilamp (A, B), hypothalamus (C, D), Pons (E, F), cerebellum (g), en hersenstam (g, H). De donkerdere regio's hebben hogere Rcp's. De schaalbalk in paneel G is van toepassing op deelvensters A, C, E en G. Autoradiogrammen aan de rechterkant (B, D, F en H) zijn vergrote afbeeldingen uit de gebieden die zijn aangegeven op de afbeeldingen aan de linkerkant en de schaalbalk in paneel H is van toepassing op panelen B , D, F en H. afkortingen zijn als volgt: FrA, frontale vereniging cortex; OB, olfactorische gloeilamp; AO, anterieure olfactorische kern; Gl, glomerulaire laag; EPl, uitwendige plexiforme laag; BLA, basolaterale amygdala; py, piramidale cellaag; dHi, dorsale Hippocampus; DG, getand gyrus; MHb, mediale habenula; RT, thalamische kern; VMH, ventrale mediale hypothalame Nucleus; Arc, arcuate Nucleus; EW, Edinger-Westphal Nucleus; R, rode kern; PN, Pontine Nucleus; ML, moleculaire laag; GL, korrelige laag; PC, Purkinje Cell Layer; Cu, cuneate Nucleus; AP, gebied postrema; 10, dorsale motor kern van de vagus; 12, hypoglossale Nucleus. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: gedigitaliseerde autoradiogrammen van een wakker gedragen besturings muis op het niveau van de frontale cortex (A) en de hippocampus van de dorsale (B). Tarieven van cerebrale eiwitsynthese zijn kleur gecodeerd in de afbeeldingen volgens de kleur balk getoond aan de rechterkant. De schaalbalk linksonder van A vertegenwoordigt 1 mm en is van toepassing op beide afbeeldingen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We presenteren een kwantitatieve methode voor de bepaling van de regionale tarieven van cerebrale eiwitsynthese (Rcp's) in vivo bij proefdieren. Deze methode heeft aanzienlijke voordelen ten opzichte van bestaande methoden: 1. metingen worden gedaan in het wakker gedragen dier, dus ze weerspiegelen de lopende processen in de werkende hersenen. 2. metingen worden gedaan door middel van kwantitatieve autoradiografie die de mogelijkheid om te bepalen van de Rcp's in alle regio's en subregio's van de hersenen tegelijkertijd. 3. het kinetische model van de methode houdt rekening met de mogelijkheid van recycling van niet-gelabelde aminozuren afgeleid van weefsel eiwitafbraak en het effect ervan op de precursor pool voor eiwitsynthese6.
De primaire beperking van deze methode is dat het tijdrovend en veeleisend is. Overwegende dat het verleidelijk is om eenvoudigere en hogere doorvoer methoden te hanteren, de beperkingen van de verkregen gegevens moeten worden erkend.
Vanwege de complexiteit van het meten van Rcp's in een intacte muis, kunnen problemen met het behoud van een normale fysiologische toestand, het verzamelen van adequate bloedmonsters en het vermijden van mogelijk storende omstandigheden worden aangetroffen. Chirurgische implantatie van de veneuze en arteriële katheters is uitdagend. Zoals bij elke chirurgische ingreep, vooral bij het hanteren van delicate vasculatuur, is er een inherent risico op sterfte van het dier. Voor ons is het zeldzaam (ongeveer 1%). Tijdens de daaropvolgende 22 h herstelperiode, af en toe (ongeveer 4%) een dier zal een katheter uit te trekken. Tijdens de meting is het belangrijk dat katheters octrooi zijn en dat dieren in een normale fysiologische toestand verkeren. In onze recente ervaring kan arteriële bloed niet worden verzameld in ongeveer 2% van de dieren en ongeveer 1% van de dieren had een lage hematocriet (< 40%) of lage arteriële bloeddruk (< 85 mm Hg), suggereren bloedverlies tijdens chirurgie en/of herstel.
Bij de bereiding van hersen secties voor autoradiografie is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de sectie dikte 20 μm is, omdat dat de sectie dikte is waarop [14C] methylmethacrylaat-normen zijn gekalibreerd. Wees voorzichtig met het waarborgen van secties van goede kwaliteit, d.w.z. zonder tranen, plooien of bubbels, omdat deze onvolkomenheden de autoradiografische analyse zullen verstoren. We ontwikkelen autoradiografische films met de hand in plaats van in een geautomatiseerde film processor omdat we vinden dat de achtergrond optische dichtheid onregelmatig kan zijn na geautomatiseerde verwerking, en dit kan de kwantificering beïnvloeden.
In de vergelijking voor Rcp's, bevatten we een factor, Lambda (λ), dat is de Fractie van Leucine die afkomstig is van het arteriële plasma, de rest komt uit de recycling van aminozuren afgeleid van weefsel eiwitafbraak6. We hebben λ in afzonderlijke experimenten in WT en Fmr1 ko (fragiele X model) C57Bl/6j muizen geëvalueerd en aangetoond dat de waarde ervan 0,603 is. De waarde van λ kan variëren afhankelijk van de soort, de genetische achtergrond of de aanwezigheid van een genetische mutatie. Daarom, als het ontwerpen van eiwitsynthese experimenten voor andere modellen, zal men moeten evalueren λ voordat een nauwkeurige meting kan worden verkregen.
Ons werk in genetische Muismodellen van neuroontwikkelingsstoornissen toont aan dat deze methodologie veranderingen in de rcp's in deze modellen onthult en in sommige gevallen reacties op farmacologische behandelingen22,23,25 , 26. het is ook denkbaar dat de rcp's meting ook degeneratieve veranderingen in de hersenen kan monitoren in aandoeningen zoals modellen van de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, fragiele X tremor ataxie syndroom, traumatisch hersenletsel, enz. Deze modellen, is het mogelijk om te sporen van vroege degeneratieve veranderingen en eventueel ook reacties op vroege interventies. De rCPS-methode kan samen met immunohistochemie in parallelle secties worden gebruikt om specifieke hersenveranderingen verder te onderzoeken25. Samenvattend is de kwantitatieve autoradiografische L-[1-14C]-Leucine-methode ideaal voor het nauwkeurig bepalen van rcps-waarden in vivo. Het biedt aanzienlijke voordelen op het gebied van nauwkeurigheid en toepasbaarheid in vivo voorwaarden ten opzichte van bestaande methoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Zengyan Xia graag erkennen voor de genotypering van de muizen, Tom Burlin voor de verwerking van aminozuren en films, en mei Qin voor het uitvoeren van enkele van de rCPS experimenten. Dit onderzoek werd gesteund door het intramurale onderzoeksprogramma van het NIMH, ZIA MH00889. RMS werd ook gesteund door een Autisme spreekt Postdoctoral Fellowship 8679 en een FRAXA postdoctorale Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson Laboratory | 003024 | Fmr1 knockout breeding pairs |
| Anisomycin | Tocris Bioscience | 1290 | |
| Microhematocrit Tubes | Drummond Scientific | 1-000-3200-H | capillary tubes |
| Critoseal Capillary Tube Sealant | Leica Microsystems | 39215003 | sealant putty |
| Glass vial inserts | Agilent | 5183-2089 | used to collect blood samples |
| Digi-Med Blood Pressure Analyzer | Micro-Med Inc. | BPA-400 | blood pressure analyzer |
| Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System | Bayer Breeze | 9570A | glucose meter |
| Gastight syringe | Hamilton Co. | 1710 | tuberculin glass syringe |
| HeatMax HotHands-2 Hand Warmers | HeatMax | Model HH2 | warming pads |
| Heparin Lock Flush Solution | Fresenius Kabi USA, LLC | 504505 | heparin saline |
| Clear animal container | Instech | MTANK/W | animal enclosure |
| Spring tether | Instech | PS62 | catheter tube/rodent attachment |
| Swivel | Instech | 375/25 | hooks to spring tether |
| Swivel arm and mount | Instech | SMCLA | hooks to swivel and animal enclosure |
| Tether button | Instech | VAB62BS/22 | attaches to bottom of spring tether |
| Stainless steel tube | Made in-house | N/A | used to snake catheters through mouse |
| Matrx VIP 3000 | Matrx | 91305430 | isoflurane vaporizer |
| Isoflurane | Stoelting Co. | 50207 | isoflurane/halothane adsorber |
| Clippers | Oster Finisher | Model 59 | |
| Surgical skin hooks | Made in-house (??) | N/A (??) | |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | APP Pharmaceuticals LLC | 918610 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| UNIFY silk surgical sutures | AD Surgical | #S-S618R13 | 6-0 USP, non-absorbable |
| PE-8 polyethylene tubing | SAI Infusion Technologies | PE-8-25 | |
| Syringe | Becton Dickinson and Co. | 309659 | 1cc/mL |
| PE-10 polyethylene tubing | Clay Adams | 427400 | |
| MCID Analysis | Imaging Research Inc. | Version 7.0 | optical density analysis |
| Gelatin-coated slides (75x25mm) | FD Neurotechnologies | PO101 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Super RX-N medical x-ray film | Fuji | 47410-19291 | |
| Hypercassettes (8x10 in) | Amersham Pharmacia Biotech | 11649 | |
| [1-14C]leucine | Moravek | MC404E | |
| Microcentrifuge tube | Sarstedt Aktiengesellschaft & Co. | 72.692.005 | used to deproteinize blood samples |
| Glass pasteur pipette | Wheaton | 357335 | |
| Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | |
| Nitrogen | NIH Supply Center | 6830009737285 | |
| Scintillation fluid | CytoScint | 882453 | |
| Liquid scintilllation counter | Packard Tri-Carb | 2250CA | |
| Amino acid analyzer | Pickering Laboratories | Pinnacle PCX | |
| HPLC unit | Agilent Technologies | 1260 Infinity | include 1260 Bio-Inert Pump |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg | M650 | |
| Sulfosalicylic acid | Sigma-Aldrich | MKBS1634V | 5-sulfosalicylic acid dihydrate |
| Norleucine | Sigma | N8513 | |
| 1.0 N HCl | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| [H3]leucine | Moraevk | MC672 | |
| Falcon tube | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL conical centrifuge tubes |
| Stopwatch | Heuer Microsplit | Model 1000 | 1/100 min |
| Euthanasia Solution | Vet One | H6438 | |
| Northern Light Precision Illuminator | Imaging Research Inc. | Model B95 | fluorescent light box |
| Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 | Nikon | 1442 | CDD camera |
References
- West, A. E., et al. Calcium regulation of neuronal gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).
- Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. Basic Neurochemistry. , 6th ed, Lippincott-Raven. New York. (1999).
- Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265, 1104-1107 (1994).
- Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2. Science. 286, 785-790 (1999).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).
- Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).
- Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).
- Banker, G., Cotman, C. W. Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).
- Frerichs, K. U., et al. Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).
- Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep. The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).
- Nakanishi, H., et al. Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta. The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats. Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).
- Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei. Brain Research. 494, 155-158 (1989).
- Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats. The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).
- Smith, C. B., Yu, W. H. Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment. Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).
- Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).
- Nadel, J., et al. Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis. Brain Research. 1537, 125-131 (2013).
- Sun, Y., et al. Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development. The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).
- Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool. Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).
- Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats. Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).
- Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin. Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).
- Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome. Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).
- Qin, M., et al. Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).
- Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).
- Qin, M., et al. R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034 (2015).
- Qin, M., et al. Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation. ASN Neuro. 6, (2014).
- Smith, C. B., Kang, J. Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).
- Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats. Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).
