Summary
La síntesis de proteínas es un proceso biológico crítico para las células. En el cerebro, es necesario para los cambios adaptativos. La medición de las tasas de síntesis de proteínas en el cerebro intacto requiere consideraciones metodológicas cuidadosas. Aquí presentamos el método autoradiográfico cuantitativo L-[1-14C]-leucina para la determinación de las tasas regionales de síntesis de proteínas cerebrales in vivo.
Abstract
La síntesis de proteínas es necesaria para el desarrollo y mantenimiento de la función neuronal y participa en cambios adaptativos en el sistema nervioso. Por otra parte, se cree que la desregulación de la síntesis de proteínas en el sistema nervioso puede ser un fenotipo principal en algunos trastornos del desarrollo. La medición precisa de las tasas de síntesis de proteínas cerebrales en modelos animales es importante para comprender estos trastornos. El método que hemos desarrollado fue diseñado para ser aplicado al estudio de los animales despiertos y comportándose. Es un método autoradiográfico cuantitativo, por lo que puede producir tasas en todas las regiones del cerebro simultáneamente. El método se basa en el uso de un aminoácido trazador, L-[1-14C]-leucina, y un modelo cinético del comportamiento de la L-leucina en el cerebro. Elegimos L-[1-14C]-leucina como el trazador porque no conduce a productos metabólicos etiquetados ajenos. Se incorpora a la proteína o se metaboliza rápidamente para producir 14CO2 que se diluye en un gran grupo de CO2 sin etiquetar en el cerebro. El método y el modelo también permiten la contribución de leucina sin etiquetar derivada de la proteólisis tisular a la piscina precursora de tejido para la síntesis de proteínas. El método tiene la resolución espacial para determinar las tasas de síntesis de proteínas en las capas celulares y neuropil, así como los núcleos nerviosos hipotalámicos y craneales. Para obtener datos cuantitativos fiables y reproducibles, es importante seguir los detalles de procedimiento. Aquí presentamos los procedimientos detallados del método cuantitativo autoradiográfico L-[1-14C]-leucina para la determinación de las tasas regionales de síntesis de proteínas in vivo.
Introduction
La síntesis de proteínas es un proceso biológico importante necesario para el cambio adaptativo a largo plazo en el sistema nervioso1. La inhibición de la síntesis de proteínas bloquea el almacenamiento de memoria a largo plazo tanto en invertebrados comoenvertebrados 2. La síntesis de proteínas es esencial para el mantenimiento de las fases finales de algunas formas de potenciación a largo plazo (LTP) y depresión a largo plazo (LTD)3, supervivencia neuronal durante el desarrollo4, y para el mantenimiento general de la neurona y su conexiones sinápticas5. La medición de las tasas de síntesis de proteínas cerebrales puede ser una herramienta importante con la que estudiar los cambios adaptativos, así como los trastornos y trastornos del neurodesarrollo relacionados con el aprendizaje y la memoria.
Hemos desarrollado un método para cuantificar las tasas de síntesis de proteínas cerebrales in vivo en un animaldespierto que ofrece ventajas inherentes sobre otras técnicas que estiman las tasas en preparaciones ex vivo o in vitro del tejido cerebral 6. Lo más importante es la aplicabilidad a las mediciones en el cerebro intacto en un animal despierto. Esta es una consideración clave porque permite mediciones con estructura sináptica y función en su lugar y sin preocupaciones sobre los efectos post mortem. Además, el enfoque autoradiográfico cuantitativo que empleamos logra un alto grado de localización espacial. Mientras que la energía de 14C es tal que no podemos localizar el trazador a nivel subcelular o celular, podemos medir las tasas en capas celulares y pequeñas regiones cerebrales como núcleos hipotalámicos, con aproximadamente una resolución de 25 m7.
Uno de los desafíos de las mediciones in vivo con radiosondas es garantizar que la radioetiqueta medida esté en el producto de la reacción de interés en lugar de precursores etiquetados no reaccionados u otros productos metabólicos etiquetados extraños6. Elegimos L-[1-14C]-leucina como el aminoácido trazador porque se incorpora a la proteína o se metaboliza rápidamente a 14CO2, que se diluye en la gran piscina de CO2 sin etiquetar en el cerebro resultante de la alta tasa de metabolismo energético8. Por otra parte, cualquier 14C no incorporado en la proteína existe principalmente como libre [14C]-leucina, que durante el período experimental de 60 minutos, se elimina casi en su totalidad del tejido6. Las proteínas se fijan a tejido con formalina y posteriormente se enjuagan con agua para eliminar cualquier libre [14C]-leucina antes de la autoradiografía.
Otra consideración importante es la cuestión de la dilución de la actividad específica de la piscina de aminoácidos precursores por aminoácidos sin etiquetar derivados de la proteólisis tisular. Hemos demostrado que en ratas y ratones adultos, alrededor del 40% de la piscina de leucina precursora para la síntesis de proteínas en el cerebro proviene de aminoácidos derivados de la descomposición de proteínas6. Esto debe incluirse en el cálculo de las tasas regionales de síntesis de proteínas cerebrales (rCPS) y debe confirmarse en estudios en los que esta relación puede cambiar. La base teórica y los supuestos del método sehan presentado en detalle en otros lugares 6. En este documento, nos centramos en las cuestiones de procedimiento de la aplicación de esta metodología.
Este método se ha empleado para la determinación de rCPS en ardillas molidas9, ovejas10, monos rhesus11, ratas12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21, un modelo de ratón de Complejo de Esclerosis Tuberosa22,un modelo de ratón de síndrome X frágil23,24,25,26, frágil esratones de premutación X27,y un ratón modelo de fenilcetonuria28. En este manuscrito, presentamos los procedimientos para la medición de rCPS con el método autoradiográfico in vivo L-[1-14C]-leucina. Presentamos rCPS en las regiones cerebrales de un ratón de control despierto. También demostramos que la administración in vivo de anisomicina, un inhibidor de la traducción, abolió la síntesis de proteínas en el cerebro.
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Protocol
Nota: Todos los procedimientos de los animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional de Salud Mental y se realizaron de acuerdo con las Directrices de los Institutos Nacionales de Salud sobre el Cuidado y Uso de Animales.
En la Figura 1se presenta una descripción general del protocolo.
1. Implante quirúrgico catéteres en una vena femoral y arteria para la administración del marcador y la recolección de muestras de sangre arterial cronometradas, respectivamente. Cirugía completa al menos 22 h antes de la administración del trazador. La cirugía requiere aproximadamente 1 h para completarse.
- Reunir los materiales necesarios: instrumentos quirúrgicos estériles (tijeras quirúrgicas, microtijeras, fórceps, tres ganchos quirúrgicos de la piel), equipo para la anestesia de isoflurano (vaporizador de isoflurano, carroñero de gas activo, cámara de anestesia sellada, anestesia sellada, anestesia sellada, anestesia sellada, anestesia sellada, anestesia sellada, anestesia sellada, anestesia sellada, anestesia sellada, anestesia sellada, anestesia sellada, anestesia sellada, anestesia sellada, anestesia sellada, anestesia sellada, anestesia sellada, anestesia sellada, anestesia sellada, anestesia sellada, anestesia sellada, anestesia sellada, anestesia sellada, anestesia sellada, anestesia sellada, anestesia sellada, anestesia sellada, anestesia sellada, anestesia sellada, anestesia sellada, anestesia sellada, anestesia sellada, anestesia sellada, anestesia sellada, anestesia cono nasal), etapa de cirugía estéril, cortadoras de piel, 70% etanol, betadina, gasa estéril, cinta quirúrgica, calentadores de manos comerciales, microscopio quirúrgico, cloruro de sodio estéril 0,9% (salina), heparina estéril 100 unidades USP/ml en cloruro de sodio al 0,9% (cloruro de sodio heparinizado (heparinizado) (heparinizado) salina), cinco tiras estériles de 20 cm de sutura absorbible 6-0, hebras estériles de 25 cm decatéteres de polietileno PE-8 y PE-10 con un extremo cortado a 45 o, jeringas estériles de 1 cc, agujas estériles de calibre 32, equipo de cauterización, inoxidable hueco estéril de 15-20 cm varilla de acero (2,5 mm de diámetro interior, diámetro exterior de 3 mm), anestésicos locales (pomada de bupivacaína y lidocaína) y un recinto animal con configuración de apéndice giratorio (30 cm de brida de resorte con botón, giratorio, montaje giratorio y brazo, cilíndrico claro de 20 X 13 cm contenedor).
- Preparar al animal para la cirugía.
- Asegúrese de que se utilicen técnicas asépticas y estériles adecuadas según lo requiera su institución.
- Pesa el animal. El animal debe tener al menos 25 g para una cirugía exitosa.
- Coloque al animal dentro de una cámara de plexiglás sellada y conecte la cámara al aparato de anestesia de isoflurano. Ajuste el caudal a 2,5 L/min para los machos y a 3,0 L/min para las hembras del 1,5% de isoflurano en O2. Después de aproximadamente 2 minutos, asegúrese de que el ratón esté adecuadamente sedado por falta de un reflejo de abstinencia con un pellizco del dedo del dedo del dedo del dedo del tiempo.
- Una vez sedado, retire el ratón de la cámara y colóquelo en una posición propensa con su cara dentro del cono de nariz de anestesia. Configure el cono de la nariz para recibir gas del vaporizador y para devolver el gas al carroñero de gas. El carroñero capturará isoflurano en un filtro de carbón.
- Utilice cortadoras para afeitar el pelaje entre los omóplatos. Asegúrese de esterilizar correctamente la región ave, alternando tres veces entre betadina y exfoliantes de etanol.
- Voltee el ratón en una posición supina manteniendo la cara en el cono de la nariz. Pegue la pierna izquierda hasta la etapa de cirugía y use cortadoras para afeitar el pelaje desde el muslo interno izquierdo hasta la parte superior izquierda del abdomen. Asegúrese de esterilizar correctamente la región ave, alternando tres veces entre betadina y exfoliantes de etanol.
- Deslice un calentador de manos activado disponible comercialmente, envuelto en gasa, debajo del ratón. Pegue la pierna derecha hasta la etapa de cirugía.
- Inserte el catéter en la vena femoral izquierda.
- Con la ayuda de un microscopio quirúrgico, utilice tijeras quirúrgicas para hacer una incisión de 1 cm de la parte medial superior del muslo izquierdo rostrally hacia la línea media, revelando la arteria femoral y la vena.
- Retraiga la piel suelta con ganchos quirúrgicos para la piel para exponer aún más las vesículas.
- Aplicar cloruro de sodio estéril al 0,9% en el área expuesta para mantener la humedad adecuada.
- Usa fórceps para diseccionar con telusas, separando el tejido conectivo alrededor de una pequeña sección de la arteria femoral y la vena. Cuidadosamente, separe la arteria y la vena (Figura2).
- Utilice fórceps para enhebrar una hebra de sutura absorbible (Strand A) debajo de la vena femoral y la arteria en el punto más lateral de la incisión. Tire de la sutura a mitad de camino para que los extremos estén parejos.
- En un punto más proximal a la ingle, utilice fórceps para enhebrar una segunda sutura (Strand B) bajo sólo la vena femoral. Ate suavemente un medio nudo que se utilizará para restringir el flujo sanguíneo.
- En un punto entre el Strand A y el Strand B, utilice fórceps para enhebrar una tercera sutura (Strand C) bajo sólo la vena femoral. Ate suavemente un nudo completo que se utilizará para restringir el flujo sanguíneo. Tenga cuidado de no rasgar la vena.
- Tira suavemente del strand B para restringir el flujo sanguíneo. Utilice un hemostat para tirar suavemente del hebra B para mantener el flujo sanguíneo restringido.
- Corte un pequeño agujero en el área restringida de la vena femoral con microtijeras e inserte cuidadosamente el extremo en ángulo del tubo PE-8 (previamente lavado con salina de heparina) hacia la hebra B. Una vez insertado, suelte la tensión del Strand B y guíe el catéter más arriba de la vena. Apriete el hebra B alrededor de la vena que contiene el catéter.
- Con Strand C, ate un nudo adicional alrededor del catéter. Asegúrese de que este nudo no capture la arteria femoral.
- Tire suavemente del barril de la jeringa para llenar parcialmente el tubo con sangre para asegurarse de que el catéter se ha implantado correctamente.
- Siguiendo el mismo procedimiento, inserte un catéter PE-10 en la arteria femoral izquierda.
- Procedimiento quirúrgico completo.
- Una vez que se hayan asegurado tanto la vena femoral como los catéteres arteriales, ate la hebra A en un nudo alrededor de ambos catéteres.
- Corta todo el exceso de suturas y elimina los ganchos de piel. Enjuague el catéter arterial con salina heparinizada para evitar la coagulación. Cauterizar los extremos de ambos catéteres para crear un sello.
- Coloque el ratón en la posición propensa y haga una pequeña incisión en la base del cuello y aplique salina en el área expuesta.
- Inserte la varilla metálica hueca sudérmia desde la incisión del cuello hasta la incisión femoral. Serpiente los catéteres a través de la varilla hueca y fuera de la incisión del cuello. Retire la varilla hueca. La implantación de catéteres subdermalmente evitará que los ratones dañen los catéteres.
- Aplique bupivacaína a los lados de la herida. Cierre la incisión femoral con sutura. Agregue la pomada de lidocaína sobre la herida cerrada y suturada.
- Serpiente los catéteres a través de un tubo hueco flexible de 30 cm (atadura de primavera) y sutura el botón de la correa de resorte debajo de la piel. Aplique bupivacaína a los lados de la herida. Sutura el botón de la amarre de resorte debajo de la piel. Agregue la pomada de lidocaína sobre la herida cerrada y suturada.
- Mueva el ratón a un recipiente cilíndrico transparente (20 cm de alto, 13 cm de diámetro) con un soporte giratorio y un brazo para alojar al animal durante el período de recuperación. Coloque un calentador de manos debajo del recipiente para mantener al animal caliente.
- Atornille la parte superior de la amarre del muelle a un giratorio y fije el giratorio al brazo giratorio unido al recipiente cilíndrico. Asegúrese de que el ratón tiene un rango completo de movimiento y de que se pueda acceder a los catéteres.
- Coloque una tapa ranurada que no interfiera con el mecanismo giratorio sobre el recinto del animal. Refiera al cuadro 3 para la configuración completa.
- Permita que el ratón se recupere. Se recomiendan al menos 22 h.
2. Preparar l-[1-14C]solución inyectable de leucina y 16% (p/v) solución de ácido 5-sulfosalicílico (SSA) dihidrato para desproteinizar muestras plasmáticas. En la solución SSA, también incluyen 0,04 mM de norleucina y 1 Ci/mL [H3]leucina como estándares internos para el análisis de aminoácidos y el análisis de la concentración de trazador en las fracciones plasmáticas solubles en ácido, respectivamente. Conservar la SSA hasta dos meses a 4oC.
- Comprar L-[1-14C]leucina (50-60 mCi/mmol), que se vende como solución en etanol al 2% o 0,1 N HCl. Secar una actividad conocida del trazador bajo una suave corriente de nitrógeno y reconstituir en una solución de solución salina normal estéril hecha hasta una concentración de 100 oCi/ml.
3. Administrar L-[1-14C]leucina por vía intravenosa y recoger muestras de sangre arterial.
- Reunir los materiales necesarios: 18 microtubos de 1,5 ml para desproteinizar muestras de plasma (añadir 70 ml de agua desionizada a cada tubo), 17 insertos de vial de vidrio de 250 ml (15 inserciones para la recogida de muestras de sangre arterial y 2 inserciones para la recolección de sangre de espacio muerto que deben ser Reinyectada. Para limitar la recolección de sangre extra e innecesaria, se recomiendan inserciones pequeñas y delgadas de viales de vidrio con fondos cónicos que permiten pipeteo accesible de plasma sobrenadante), 2 tubos microcapilares (32 X 0,8 mm, para medición de hematocrito), 1 heparina y tubo de microcentrífuga recubierto de fluoruro de litio (para prevenir la coagulación y la glucólisis, respectivamente), hemostats (cubrir las puntas con tubo de tygon para que las abrazaderas no dañen el tubo de PE), monitor de glucosa en sangre, transductor de presión arterial, jeringas estériles de 1 ml (para salina) y solución de eutanasia disponible comercialmente (diluido 1:1 en agua desionizada (para ratones)).
- Asegúrese de que el animal está en un estado fisiológico normal al inicio del experimento.
- Sujetar el tubo arterial a unos 2 cm del extremo y cortar la punta, creando una abertura para que la sangre fluya. A continuación, desenganche el tubo y recoja sangre de espacio muerto (c. 30 ml) para recoger cualquier salina residual y/o sangre de extracciones anteriores) y, en un tubo separado, recoja una muestra de control (aprox. 30 ol), muestras de hematocrito (aproximadamente la mitad del volumen del tubo capilar) y una glucosa muestra (aprox. 20 l).
- Mida el hematocrito enchufando un extremo con masilla y centrífuga sellantes durante 1 min a 4500 x g. Mida la relación entre el volumen de glóbulos rojos y el volumen sanguíneo total. Si un animal tiene un hematocrito por debajo del 30%, no continúe el estudio.
- Utilice un monitor de glucosa en sangre disponible comercialmente para medir el nivel de glucosa en una gota de sangre.
- Muestra de control de centrífuga durante 2 min a 18.000 x g para separar el plasma. Desproteinizar muestras plasmáticas de la siguiente manera: añadir 5 ml de plasma a 70 l de agua desionizada en un microtubo de 1,5 ml, añadir 25 ml de la solución de SSA al 16% y el vórtice. Colocar sobre hielo durante 30 minutos antes de congelarlo sobre hielo seco.
- Devolver la sangre del espacio muerto al animal a través de la línea venosa, seguido de un lavado salino heparinizado para evitar la pérdida excesiva de sangre.
- Conecte la línea arterial a un transductor de presión arterial para medir la presión arterial media.
- Después de tomar las muestras asegúrese de volver a sujetar la línea arterial y lavar la línea con un pequeño volumen (50 ml) de salina heparinizada.
- Administrar el marcador por vía intravenosa y recoger muestras de sangre arterial cronometradas.
- Utilice un conector Y para conectar una jeringa con el trazador (100oCi/kg) y una jeringa con solución salina estéril de 50 ml para lavar la línea venosa después de la inyección del trazador. Conecte el conector Y a la línea venosa.
- Inicie el estudio iniciando simultáneamente un reloj de parada e inyectando el trazador. Enjuague la línea venosa con salina (c. 100 ml) inmediatamente después de la inyección.
- Recoger muestras de sangre 1-7 continuamente a lo largo de los primeros 2 minutos del experimento de la misma manera. Después de recoger la 7a muestra, recoja sangre muerta de 30 ml antes de cada muestra restante. Las muestras 8-14 se recogen a 3, 5, 10, 15, 30, 45 y 60 min, respectivamente.
- Procesar muestras de sangre inmediatamente después de la recolección, como se describió para la muestra de control. Si hay un retraso, coloque las muestras en hielo. Reinyectar cuidadosamente sangre del espacio muerto en la arteria a través del catéter arterial y enjuague con salina de heparina.
- En algún momento durante el experimento, procese tres normas internas añadiendo 25 SSA de 16% de L, 0,04 mM de norleucina y 1 mCi/mL [3H]leucina a 75 l de agua, vórtice y colocar sobre hielo.
- Después de recoger la muestra 14 a 60 min, inyectar aproximadamente 0,2 ml de B-eutanasia-D en la línea venosa para eutanasiar al animal. Registre la hora de la muerte.
- Desenrosque el animal del soporte giratorio y retírelo del recinto del animal. Retire cuidadosamente el cerebro, colóquelo en papel de aluminio y congele sobre hielo seco. No congele cerebros con nitrógeno líquido, ya que los cerebros pueden agrietarse. Almacene el cerebro, las muestras y los estándares internos a -80 oC hasta que esté listo para el procesamiento. El procesamiento se puede realizar en cualquier momento después.
4. Analizar las concentraciones de leucina y L-[1-14C]leucina en muestras plasmáticas.
- Descongelar muestras y normas internas sobre hielo, vórtice y centrífuga 18.000 x g durante 5 min a 2oC. La fracción sobrenadante contendrá la leucina libre etiquetada y sin etiquetar.
- Transfiera 40 ml del sobrenadante a un vial de centelleo líquido y agregue un cóctel de centelleo. Cuantifique las desintegraciones por minuto (DPM) de 3H y 14C mediante recuento de centelleo líquido y una curva de enfriamiento diseñada para el recuento simultáneo de doble etiqueta (3H y 14C).
- Para cuantificar las concentraciones plasmáticas de leucina, utilice un sistema HPLC con una columna de intercambio catiónico sódico y derivación posterior a la columna con detección de o-ftaldehído y fluorométrico.
- Ajuste HPLC a las siguientes especificaciones: excitación del fluorómetro de 330 nm y emisión de 465 nm. La fase móvil consiste en eluant sódico, pH 7,40, y eluante sódico + 5% sulfolano, pH 3,15. Establezca el caudal de búfer de 0,400 ml/min y el caudal del instrumento de derivación en 0,300 ml/min. Ajuste la temperatura de la columna a 48 oC y la temperatura del reactor a 45 oC.
- Calibrar el sistema con una gama de concentraciones de aminoácidos (incluyendo norleucina) entre 30 y 500 pmol/10ml. La curva de calibración es lineal. Las concentraciones de aminoácidos de las muestras de inyección de 10 ml probadas se encuentran dentro de los rangos de esta curva de calibración.
5. Realice una autoradiografía cuantitativa.
- Preparar secciones cerebrales de 20 m de espesor para la autoradiografía. Secciona el cerebro por medio de un criostato a -20 oC.
- Secciones del cerebro serial del montaje de descongelación en diapositivas recubiertas de gelatina. Secado al aire.
- Lavar los portaobjetos en cinco cambios de 10% de formalina durante 30 minutos por cambio, seguido de un flujo continuo de agua desionizada durante 1 h. Cubra los portaobjetos libremente con papel de aluminio para evitar el polvo y deje secar durante 24 horas.
- Organizar diapositivas en un casete de película de rayos X (se recomiendan casetes que se ajusten a películas de mamografía de 20X25 cm) junto con un conjunto de normas[14C]metilmetacrilato, que fueron previamente calibradas contra tejido de concentraciones conocidas de 14C como descrito29. Las normas se pueden comprar comercialmente, pero asegurarse de que cubren un rango de 2-300 mCi/g de tejido y están calibradas contra 20 m de espesor de tejido. Bajo luz de seguridad roja, coloque un pedazo de película de mamografía, lado de emulsión hacia abajo, en la parte superior de las secciones.
- Selle los cassettes y colóquelos en una bolsa de cambio negra y guárdelos en un armario durante 40-45 días.
- Desarrolle películas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Nota: No se recomienda el desarrollo automatizado de películas porque el fondo puede ser desigual y puede afectar a la cuantificación.
6. Analizar imágenes.
Nota: Se recomienda un programa disponible comercialmente para el análisis de imágenes junto con una cámara CCD y una caja de luz fluorescente con iluminación uniforme. Las densidades ópticas relativas en la película iluminada son detectadas por la cámara CCD.
- Construir una curva de calibración de densidad óptica (OD) v. concentración de tejido 14C basada en los OD del conjunto de estándares calibrados en la película. Ajuste estos datos (incluido el espacio en blanco o el fondo) a una ecuación polinómica. Una ecuación polinómia de segundo o tercer grado encaja muy bien.
- Para analizar regiones cerebrales específicas, localice la región de interés (ROI) en seis a ocho secciones en comparación con un atlas cerebral. Registre los OD de los píxeles dentro de un ROI en todas las secciones y, en función de la curva de calibración, calcule la concentración de tejido de 14C en cada píxel. Calcular la concentración media de tejido 14C en el ROI.
7. Cálculo de rCPS. Calcular rCPS en cada ROI mediante la siguiente ecuación:
Cuando P*(T) es la concentración media ponderada de tejido de 14C en el ROI, Cp(t) y C*p(t) son las concentraciones plasmáticas arteriales de leucina sin etiquetar y etiquetadas en el momento, t, T es el momento en que el animal murió ( alrededor de 60 min), y es la fracción de leucina en la piscina precursora de tejido que proviene del plasma. La evaluación de la palabra se lleva a cabo en un experimento separado 6. Se ha evaluado en ratones WT, Fmr1 knockout, Tsc+/-y PKU 6,22,25,28. Si un experimento implica cambios genéticos o farmacológicos que podrían afectar a las tasas de síntesis de proteínas, degradación o metabolismo de la leucina, se debe evaluar en las nuevas condiciones.
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Representative Results
Aquí mostramos un experimento representativo que demuestra los efectos de la administración previa de un inhibidor de la síntesis de proteínas en el rCPS. La anisomicina en salina normal se administró a un ratón macho adulto de tipo salvaje C57/BL6 por vía subcutánea (100 mg/kg) 30 minutos antes del inicio de la determinación de rCPS. Los efectos del tratamiento con anisomicina en comparación con un animal de control tratado con vehículo muestran que el rCPS es casi indetectable en el ratón tratado con anisomicina (Figura4). Estos datos representan una validación que el método autoradiográfico in vivo L-[1-14C]-leucina mide las tasas de síntesis de proteínas en el cerebro.
Presentamos una cifra de autoradiogramas L-[1-14C]-leucina en cuatro niveles del cerebro para demostrar la resolución del método (Figura5). Se ilustran las capas celulares en la bombilla olfativa (Figura5A y B), el hipocampo (Figura5C)y el cerebelo (Figura5G). Los núcleos en el hipotálamo (Figura5D),los pons (Figura5E y F)y el tallo cerebral (Figura5H)también se ven claramente en los autoradiogramas. También mostramos las tasas regionales cuantitativas de síntesis de proteínas en la corteza frontal (5,88 nmol/g/min) (Figura6A)y el hipocampo dorsal (5,35 nmol/g/min) (Figura6B)de un animal de control típico.
Figura 1: Esquema que representa los pasos de todo el protocolo rCPS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imagen de la arteria femoral expuesta y la vena femoral. Paralelamente unas a otras, la arteria femoral se muestra por encima de la vena femoral. La vena femoral también tiene un color rojo más profundo que la arteria femoral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imagen de la configuración recomendada de la carcasa animal para el experimento rCPS. Utiliza un recinto animal cilíndrico claro con apéndice giratorio conectado a una atela de resorte. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes representativas de un animal tratado con vehículo (A) en comparación con un animal tratado con anisomicina (100 mg/kg, por vía subcutánea) 30 minutos antes de la administración del trazador (B). Las tasas de síntesis de proteínas son proporcionales al nivel de oscuridad en la imagen. La anisomicina reduce drásticamente las tasas medidas de síntesis de proteínas que indican la especificidad de este método. La barra de escala en la parte superior derecha de A representa 1 mm y se aplica a ambas imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Autoradiogramas digitalizados de un ratón de movimiento despierto a nivel de la bombilla olfativa (A, B), hipotálamo (C, D), pons (E, F), cerebelo (G) y tallo cerebral (G, H). Las regiones más oscuras tienen un rCPS más alto. La barra de escala del panel G se aplica a los paneles A, C, E y G. Autoradiogramas de la derecha (B, D, F y H) son imágenes ampliadas de las áreas designadas en las imágenes de la izquierda y la barra de escala del panel H se aplica a los paneles B , D, F y H. Las abreviaturas son las siguientes: FrA, corteza de asociación frontal; OB, bombilla olfativa; AO, núcleo olfativo anterior; Gl, capa glomerular; EPl, capa plexiforme externa; BLA, amígdala basolateral; py, capa celular piramidal; dHi, hipocampo dorsal; DG, dentado gyrus; MHb, habenula medial; Rt, núcleo reticular talámico; VMH, núcleo hipotalámico medial ventral; Arco, núcleo arcuado; EW, núcleo Edinger-Westphal; R, núcleo rojo; PN, núcleo pontino; ML, capa molecular; GL, capa granular; Pc, Capa celular de Purkinje; Cu, núcleo cuneate; AP, área postrema; 10, núcleo motor dorsal del vago; 12, núcleo hipoglossal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Autoradiogramas digitalizados de un ratón de control de movimiento despierto a nivel de la corteza frontal (A) y del hipocampo dorsal (B). Las tasas de síntesis de proteínas cerebrales se codifican por color en las imágenes de acuerdo con la barra de color que se muestra a la derecha. La barra de escala en la parte inferior izquierda de A representa 1 mm y se aplica a ambas imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Presentamos un método cuantitativo para la determinación de las tasas regionales de síntesis de proteínas cerebrales (rCPS) in vivo en animales experimentales. Este método tiene ventajas considerables sobre los métodos existentes: 1. Las mediciones se realizan en el animal que se comporta despierto, por lo que reflejan los procesos en curso en el cerebro en funcionamiento. 2. Las mediciones se realizan por medio de la autoradiografía cuantitativa que permite determinar el RCPS en todas las regiones y subregiones del cerebro simultáneamente. 3. El modelo cinético del método tiene en cuenta la posibilidad de reciclar aminoácidos no etiquetadosderivados de la degradación de proteínas tisulares y su efecto sobre la piscina precursora para la síntesis de proteínas 6.
La principal limitación de este método es que es lento y exigente. Si bien es tentador emplear métodos de rendimiento más simples y más elevados, deben reconocerse las limitaciones de los datos obtenidos.
Debido a la complejidad de medir el rCPS en un ratón intacto, se pueden encontrar problemas con el mantenimiento de un estado fisiológico normal, la recolección de muestras de sangre adecuadas y evitar posibles condiciones de interferencia. La implantación quirúrgica de los catéteres venosos y arteriales es un reto. Al igual que con cualquier procedimiento quirúrgico, especialmente con el manejo de la vasculatura delicada, existe un riesgo inherente para la mortalidad del animal. Para nosotros, es raro (alrededor del 1%). Durante el período de recuperación de 22 h, ocasionalmente (alrededor del 4%) un animal saque un catéter. Durante la medición, es importante que los catéteres sean patentes y que los animales estén en un estado fisiológico normal. En nuestra experiencia reciente, la sangre arterial no se puede recolectar en aproximadamente el 2% de los animales y alrededor del 1% de los animales tenían un hematocrito bajo (< 40%) o presión arterial baja (< 85 mm Hg), lo que sugiere pérdida de sangre durante la cirugía y/o recuperación.
En la preparación de secciones cerebrales para la autoradiografía, es importante asegurarse de que el espesor de la sección es de 20 m porque es el espesor de la sección al que se han calibrado las normas [14C]metilmetacrilato. Tenga cuidado para garantizar secciones de buena calidad, es decir, sin lágrimas, pliegues o burbujas, ya que estas imperfecciones interferirán con el análisis autoradiográfico. Desarrollamos películas autoradiográficas a mano en lugar de en un procesador de película automatizado porque encontramos que la densidad óptica de fondo puede ser desigual después del procesamiento automatizado, y esto puede afectar a la cuantificación.
En la ecuación para rCPS, incluimos un factor, lambda , es decir, la fracción de leucina que proviene del plasma arterial, el resto proviene del reciclaje de aminoácidos derivados de la degradación de la proteína tisórica6. Hemos evaluado los experimentos separados en ratones C57Bl/6J WT y Fmr1 KO (modelo X frágil) y hemos demostrado que su valor es 0,603. El valor de la palabra puede variar dependiendo de la especie, los antecedentes genéticos o la presencia de una mutación genética. Por lo tanto, si se diseñan experimentos de síntesis de proteínas para otros modelos, uno tendrá que evaluar antes de que se pueda obtener una medición precisa.
Nuestro trabajo en modelos genéticos de ratón de trastornos del neurodesarrollo demuestra que esta metodología revela cambios en el RCPS en estos modelos y en algunos casos respuestas a tratamientos farmacológicos22,23,25 , 26. También es concebible que la medición de rCPS también puede monitorear cambios degenerativos en el cerebro en condiciones tales como modelos de la enfermedad de Alzheimer, Enfermedad de Parkinson, síndrome de ataxia frágil del temblor X, lesión cerebral traumática, etc. En estos modelos, podría ser posible realizar un seguimiento de los primeros cambios degenerativos y posiblemente también respuestas a las intervenciones tempranas. El método rCPS se puede utilizar junto con la inmunohistoquímica en secciones paralelas para examinar más a fondo los cambios cerebrales específicos25. En resumen, el método cuantitativo autoradiográfico L-[1-14C]-leucina es ideal para la determinación precisa de los valores de rCPS in vivo. Ofrece considerables ventajas en términos de precisión y aplicabilidad a las condiciones in vivo sobre los métodos existentes.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Los autores quieren reconocer a Zengyan Xia por el genotipado de los ratones, Tom Burlin para el procesamiento de aminoácidos y películas, y Mei Qin por realizar algunos de los experimentos de rCPS. Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramuros del NIMH, ZIA MH00889. RMS también fue apoyado por una beca postdoctoral Autism Speaks 8679 y una beca postdoctoral FRAXA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson Laboratory | 003024 | Fmr1 knockout breeding pairs |
| Anisomycin | Tocris Bioscience | 1290 | |
| Microhematocrit Tubes | Drummond Scientific | 1-000-3200-H | capillary tubes |
| Critoseal Capillary Tube Sealant | Leica Microsystems | 39215003 | sealant putty |
| Glass vial inserts | Agilent | 5183-2089 | used to collect blood samples |
| Digi-Med Blood Pressure Analyzer | Micro-Med Inc. | BPA-400 | blood pressure analyzer |
| Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System | Bayer Breeze | 9570A | glucose meter |
| Gastight syringe | Hamilton Co. | 1710 | tuberculin glass syringe |
| HeatMax HotHands-2 Hand Warmers | HeatMax | Model HH2 | warming pads |
| Heparin Lock Flush Solution | Fresenius Kabi USA, LLC | 504505 | heparin saline |
| Clear animal container | Instech | MTANK/W | animal enclosure |
| Spring tether | Instech | PS62 | catheter tube/rodent attachment |
| Swivel | Instech | 375/25 | hooks to spring tether |
| Swivel arm and mount | Instech | SMCLA | hooks to swivel and animal enclosure |
| Tether button | Instech | VAB62BS/22 | attaches to bottom of spring tether |
| Stainless steel tube | Made in-house | N/A | used to snake catheters through mouse |
| Matrx VIP 3000 | Matrx | 91305430 | isoflurane vaporizer |
| Isoflurane | Stoelting Co. | 50207 | isoflurane/halothane adsorber |
| Clippers | Oster Finisher | Model 59 | |
| Surgical skin hooks | Made in-house (??) | N/A (??) | |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | APP Pharmaceuticals LLC | 918610 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| UNIFY silk surgical sutures | AD Surgical | #S-S618R13 | 6-0 USP, non-absorbable |
| PE-8 polyethylene tubing | SAI Infusion Technologies | PE-8-25 | |
| Syringe | Becton Dickinson and Co. | 309659 | 1cc/mL |
| PE-10 polyethylene tubing | Clay Adams | 427400 | |
| MCID Analysis | Imaging Research Inc. | Version 7.0 | optical density analysis |
| Gelatin-coated slides (75x25mm) | FD Neurotechnologies | PO101 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Super RX-N medical x-ray film | Fuji | 47410-19291 | |
| Hypercassettes (8x10 in) | Amersham Pharmacia Biotech | 11649 | |
| [1-14C]leucine | Moravek | MC404E | |
| Microcentrifuge tube | Sarstedt Aktiengesellschaft & Co. | 72.692.005 | used to deproteinize blood samples |
| Glass pasteur pipette | Wheaton | 357335 | |
| Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | |
| Nitrogen | NIH Supply Center | 6830009737285 | |
| Scintillation fluid | CytoScint | 882453 | |
| Liquid scintilllation counter | Packard Tri-Carb | 2250CA | |
| Amino acid analyzer | Pickering Laboratories | Pinnacle PCX | |
| HPLC unit | Agilent Technologies | 1260 Infinity | include 1260 Bio-Inert Pump |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg | M650 | |
| Sulfosalicylic acid | Sigma-Aldrich | MKBS1634V | 5-sulfosalicylic acid dihydrate |
| Norleucine | Sigma | N8513 | |
| 1.0 N HCl | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| [H3]leucine | Moraevk | MC672 | |
| Falcon tube | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL conical centrifuge tubes |
| Stopwatch | Heuer Microsplit | Model 1000 | 1/100 min |
| Euthanasia Solution | Vet One | H6438 | |
| Northern Light Precision Illuminator | Imaging Research Inc. | Model B95 | fluorescent light box |
| Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 | Nikon | 1442 | CDD camera |
References
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