Summary
Die Proteinsynthese ist ein kritischer biologischer Prozess für Zellen. Im Gehirn ist es für adaptive Veränderungen erforderlich. Die Messung der Raten der Proteinsynthese im intakten Gehirn erfordert sorgfältige methodische Überlegungen. Hier stellen wir die l-[1-14C]-eucinquantitative autoradiographische Methode zur Bestimmung der regionalen Raten der zerebralen Proteinsynthese in vivo vor.
Abstract
Proteinsynthese ist für die Entwicklung und Aufrechterhaltung der neuronalen Funktion erforderlich und ist an adaptiven Veränderungen im Nervensystem beteiligt. Darüber hinaus wird angenommen, dass dysregulation der Proteinsynthese im Nervensystem ein Kernphäpnotyp bei einigen Entwicklungsstörungen sein kann. Eine genaue Messung der Raten der zerebralen Proteinsynthese in Tiermodellen ist wichtig, um diese Störungen zu verstehen. Die Methode, die wir entwickelt haben, wurde entwickelt, um auf das Studium von wachen, sich verhaltenden Tieren angewendet zu werden. Es ist eine quantitative autoradiografische Methode, so dass es Raten in allen Regionen des Gehirns gleichzeitig liefern kann. Die Methode basiert auf der Verwendung einer Tracer-Aminosäure, L-[1-14C]-Leucin, und einem kinetischen Modell des Verhaltens von L-Leucin im Gehirn. Wir haben uns für L-[1-14C]-Leucin als Tracer entschieden, da es nicht zu fremd gekennzeichneten Stoffwechselprodukten führt. Es wird entweder in Protein eingliedert oder schnell metabolisiert, um 14CO2 zu ergeben, das in einem großen Pool von unbeschriftetem CO2 im Gehirn verdünnt wird. Die Methode und das Modell ermöglichen auch den Beitrag von unbeschrifteten Leucin aus Gewebeproteolyse in den Gewebevorläuferpool für die Proteinsynthese. Die Methode hat die räumliche Auflösung, um Proteinsyntheseraten in Zell- und Neuropilschichten sowie hypothalamische und schädelige Nervenkerne zu bestimmen. Um zuverlässige und reproduzierbare quantitative Daten zu erhalten, ist es wichtig, sich an Verfahrensdetails zu halten. Hier stellen wir die detaillierten Verfahren der quantitativen autoradiographischen L-[1-14C]-Leucin-Methode zur Bestimmung der regionalen Raten der Proteinsynthese in vivo vor.
Introduction
Die Proteinsynthese ist ein wichtiger biologischer Prozess, der für eine langfristige adaptive Veränderung des Nervensystems erforderlich ist1. Hemmende Proteinsynthese blockiert die Langzeitspeicherspeicherung bei Wirbellosen und Wirbeltieren2. Proteinsynthese ist wichtig für die Aufrechterhaltung der späten Phasen einiger Formen der Langzeitpotenzierung (LTP) und Langzeitdepression (LTD)3, neuronale Überleben während der Entwicklung4, und für die allgemeine Wartung des Neurons und seiner synaptische Verbindungen5. Die Messung der Raten der Proteinsynthese des Gehirns kann ein wichtiges Werkzeug sein, um adaptive Veränderungen sowie neuroentwicklungsbedingte Störungen und Störungen im Zusammenhang mit Lernen und Gedächtnis zu studieren.
Wir haben eine Methode entwickelt, um die Raten der zerebralen Proteinsynthese in vivo in einem wachen Tier zu quantifizieren, das inhärente Vorteile gegenüber anderen Techniken bietet, die Raten in ex vivo oder In-vitro-Präparaten von Hirngewebe schätzen6. Vor allem die Anwendbarkeit auf Messungen im intakten Gehirn eines wachen Tieres. Dies ist eine wichtige Überlegung, weil es Messungen mit synaptischen Struktur und Funktion an Ort und Stelle und ohne Bedenken über post-mortem Effekte ermöglicht. Darüber hinaus erreicht der von uns einsetzende quantitative autoradiografische Ansatz einen hohen Grad an räumlicher Lokalisierung. Während die Energie von 14C so ist, dass wir den Tracer nicht auf subzellulärer oder zellulärer Ebene lokalisieren können, könnenwir Raten in Zellschichten und kleinen Hirnregionen wie hypothalamischen Kernen mit einer Auflösung von etwa 25 m 7 messen.
Eine Herausforderung bei In-vivo-Messungen mit Radiotracern besteht darin, sicherzustellen, dass das gemessene Radiolabel im Produkt der Reaktion von Interesse liegt und nicht unreagierte gekennzeichnete Vorläufer oder andere fremdmarkierte Stoffwechselprodukte6. Wir haben L-[1-14C]-Leucin als Tracer-Aminosäure gewählt, weil es entweder in Protein eingliedert oder schnell zu 14CO2 metabolisiert wird, das in dem großen Pool von unbeschriftetem CO2 im Gehirn verdünnt wird, das aus der hohen Rate von Energiestoffwechsel8. Darüber hinaus existiert jedes 14C, das nicht in Proteine eingearbeitet ist, in erster Linie als freies [14C]-Leucin, das während der 60-min-Versuchsphase fast vollständig aus dem Gewebe6. Proteine werden dann mit Formalin am Gewebe fixiert und anschließend mit Wasser abspült, um freies[14C]-Leucin vor der Autoradiographie zu entfernen.
Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Frage der Verdünnung der spezifischen Aktivität des Vorläufer-Aminosäurepools durch unbeschriftete Aminosäuren aus Gewebeproteolyse. Wir haben gezeigt, dass bei erwachsenen Ratten und Mäusen etwa 40% des Vorläufer-Leucin-Pools für die Proteinsynthese im Gehirn aus Aminosäuren stammt, die aus dem Proteinabbau6gewonnen wurden. Dies muss in die Berechnung der regionalen Raten der zerebralen Proteinsynthese (rCPS) einbezogen werden und muss in Studien bestätigt werden, in denen sich diese Beziehung ändern kann. Die theoretische Grundlage und die Annahmen der Methode wurden an anderer Stelle ausführlich dargestellt6. In diesem Papier konzentrieren wir uns auf die Verfahrensfragen bei der Anwendung dieser Methode.
Diese Methode wurde für die Bestimmung von rCPS in Bodenhörnchen9, Schafe10, Rhesusaffen11, Ratten12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21, ein Mausmodell des Tuberöse-Sklerose-Komplexes22, ein Mausmodell des fragilen X-Syndroms23,24,25,26, fragile X-Prämutationsmäuse27und ein Mausmodell von Phenylketonuria28. In diesem Manuskript stellen wir die Verfahren zur Messung von rCPS mit der in vivo autoradiographischen L-[1-14C]-Leucin-Methode vor. Wir präsentieren rCPS in Hirnregionen einer wachen Kontrollmaus. Wir zeigen auch, dass die In-vivo-Verabreichung von Anisomycin, einem Inhibitor der Translation, die Proteinsynthese im Gehirn abschafft.
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Protocol
Hinweis: Alle tierischen Verfahren wurden vom National Institute of Mental Health Animal Care and Use Committee genehmigt und gemäß den National Institutes of Health Guidelines on the Care and Use of Animals durchgeführt.
Eine Übersicht über das Protokoll ist in Abbildung 1dargestellt.
1. Chirurgische Implantatkatheter in einer Femoralvene und Arterie für die Verabreichung des Tracers bzw. die Entnahme von zeitzeitlichen arteriellen Blutproben. Vollständige Operation mindestens 22 h vor der Verabreichung des Tracers. Die Operation dauert ca. 1 h.
- Sammeln Sie notwendige Materialien: sterile chirurgische Instrumente (chirurgische Schere, Mikroschere, Zange, drei chirurgische Hauthaken), Ausrüstung für Isoflurananästhesie (Isofluran-Verdampfer, aktiver Gasfänger, versiegelte Anästhesiekammer, Anästhesie Nasenkegel), steriles Operationsstadium, Pelzknipser, 70% Ethanol, Betadine, sterile Gaze, chirurgisches Klebeband, kommerzielle Handwärmer, chirurgisches Mikroskop, steriles 0,9% Natriumchlorid (Saline), steriles Heparin 100 USP-Einheiten/ml in 0,9% Natriumchlorid (heparinisiert Kernmittel), sterile fünf 20-cm-Streifen mit 6-0 resorbierbarer Naht, sterile 25-cm-Stränge pe-8 und PE-10 Polyethylenkatheter mit einem Endschnitt bei 45o,sterile 1 cc Spritzen, sterile 32-Spurnadeln, Kautergeräte, steril e15-20 cm Hohlhohlraum Stahlstange (2,5 mm Innendurchmesser, 3 mm Außendurchmesser), Lokalanästhetika (Bupivacain und Lidocain Salbe) und ein Tiergehege mit Schwenkanhand-Setup (30 cm Federtether mit Knopf, Schwenk, Schwenkhalterung und Arm, 20 X 13 cm klar zylindrisch Behälter).
- Bereiten Sie das Tier auf eine Operation vor.
- Stellen Sie sicher, dass die richtigen aseptischen und sterilen Techniken verwendet werden, wie von Ihrer Institution gefordert.
- Wiegen Sie das Tier. Das Tier muss mindestens 25 g für eine erfolgreiche Operation sein.
- Legen Sie das Tier in eine versiegelte Plexiglaskammer und verbinden Sie die Kammer mit dem Isofluran-Anästhesieapparat. Satzrate auf 2,5 l/min für Männer und 3,0 L/min für Frauen von 1,5% Isofluran in O2einstellen. Nach ca. 2 min stellen Sie sicher, dass die Maus durch das Fehlen eines Entzugsreflexes mit einer Zehenprise entsprechend sediert wird.
- Einmal sediert, entfernen Sie die Maus aus der Kammer und legen Sie sie in eine anfällige Position mit ihrem Gesicht in der Anästhesie Nasenkegel. Stellen Sie Nasenkegel auf, um Gas vom Verdampfer zu empfangen und Gas an den Gasfänger zurückzugeben. Der Abräumer fängt Isofluran in einem Holzkohlefilter ein.
- Verwenden Sie Clipper, um Fell zwischen den Schulterblättern zu rasieren. Achten Sie darauf, den rasierten Bereich richtig zu sterilisieren, abwechselnd dreimal zwischen Betadin und Ethanol Peelings.
- Drehen Sie die Maus in eine Supine-Position, die das Gesicht im Nasenkegel hält. Tape das linke Bein auf die Operationsphase und verwenden Clippers, um Fell vom linken inneren Oberschenkel bis zum oberen linken Bauch zu rasieren. Achten Sie darauf, den rasierten Bereich richtig zu sterilisieren, abwechselnd dreimal zwischen Betadin und Ethanol Peelings.
- Schieben Sie einen aktivierten handelsüblichen Handwärmer, in Gaze gewickelt, unter die Maus. Tape das rechte Bein auf die Operationsphase.
- Fügen Sie Katheter in die linke Femoralvene ein.
- Verwenden Sie mit Hilfe eines chirurgischen Mikroskops eine chirurgische Schere, um einen 1 cm langen Schnitt vom oberen medialen Teil des linken Oberschenkels rostral zur Mittellinie zu machen, wodurch die Oberschenkelarterie und Vene enthüllt werden.
- Lösende Haut mit chirurgischen Hauthaken zurücknehmen, um die Vesikel weiter freizulegen.
- Tragen Sie steriles 0,9% Natriumchlorid auf exponierte Fläche auf, um ausreichend Feuchtigkeit zu erhalten.
- Verwenden Sie Zangen, um sezieren, Trennen von Bindegewebe um einen kleinen Abschnitt der Oberschenkelarterie und Vene. Trennen Sie die Arterie und die Vene sorgfältig (Abbildung 2).
- Verwenden Sie Zangen, um einen Strang der resorbierbaren Naht (Strang A) unter der Femoralvene und arteriellsten am seitlichsten Punkt des Einschnitts zu fädeln. Ziehen Sie die Naht auf halbem Weg, so dass die Enden gleichmäßig sind.
- Verwenden Sie an einem proximalen Punkt zur Leistengegend Zange, um eine zweite Naht (Strang B) nur unter die femorale Vene zu fädeln. Binden Sie vorsichtig einen halben Knoten, der verwendet wird, um den Blutfluss zu begrenzen.
- Verwenden Sie an einem Punkt zwischen Strand A und Strand B Zangen, um eine dritte Naht (Strand C) nur unter die femorale Vene einzufädeln. Binden Sie vorsichtig einen vollen Knoten, der verwendet wird, um den Blutfluss zu begrenzen. Achten Sie darauf, die Vene nicht zu zerreißen.
- Ziehen Sie vorsichtig an Strang B, um den Blutfluss zu begrenzen. Verwenden Sie ein Hämostat, um Strand B sanft zu ziehen, um den eingeschränkten Blutfluss aufrechtzuerhalten.
- Schneiden Sie ein kleines Loch im eingeschränkten Bereich der Femoralvene mit Mikroschere und legen Sie vorsichtig das abgewinkelte Ende des PE-8-Schlauches (zuvor mit Heparin-Kochsaline gespült) in Richtung Strang B ein. Nach dem Einsetzen die Spannung von Strang B loslassen und den Katheter weiter nach oben führen. Ziehen Sie Strand B um die Vene mit dem Katheter an.
- Mit Strang C, binden Sie einen zusätzlichen Knoten um den Katheter. Stellen Sie sicher, dass dieser Knoten die Femoralarterie nicht erfasst.
- Ziehen Sie vorsichtig auf den Spritzenlauf zurück, um die Schläuche teilweise mit Blut zu füllen, um sicherzustellen, dass der Katheter richtig implantiert wurde.
- Nach dem gleichen Verfahren, legen Sie einen PE-10 Katheter in die linke Oberschenkelarterie.
- Vollständige chirurgische Eingriffe.
- Sobald sowohl Femoralven als auch Arterienkatheter gesichert sind, binden Sie Strand A in einen Knoten um beide Katheter.
- Schneiden Sie alle überschüssigen Nähte und entfernen Sie Hauthaken. Spülen Sie den arteriellen Katheter mit heparinisierter Saline, um Gerinnung zu verhindern. Kauterisieren Sie die Enden beider Katheter, um eine Dichtung zu erzeugen.
- Legen Sie die Maus in die anfällige Position und machen Sie einen kleinen Schnitt an der Basis des Halses und tragen Sie Diestrandlinie auf den exponierten Bereich auf.
- Fügen Sie hohle Metallstange subdermally vom Halsschnitt zum Oberschenkelschnitt ein. Schlangen Sie die Katheter durch die Hohlstange und aus dem Halsschnitt heraus. Entfernen Sie die Hohlstange. Die subdermalen Implantation von Kathetern verhindert, dass Mäuse die Katheter schädigen.
- Tragen Sie Bupivacaine auf die Seiten der Wunde auf. Schließen Sie den Oberschenkelschnitt mit Naht. Lidocainsalbe über geschlossener, genähter Wunde hinzufügen.
- Schnzen Sie die Katheter durch ein 30 cm flexibles Hohlrohr (Federtether) und vernästen Sie den Knopf des Federtethers unter der Haut. Tragen Sie Bupivacaine auf die Seiten der Wunde auf. Nahn den Knopf der Feder Tether unter der Haut. Lidocainsalbe über geschlossener, genähter Wunde hinzufügen.
- Bewegen Sie die Maus in einen klaren zylindrischen Behälter (20 cm hoch, 13 cm Durchmesser) mit schwenkbarer Halterung und Arm, um das Tier während der Erholungsphase unterzubringen. Legen Sie einen Handwärmer unter den Behälter, um das Tier warm zu halten.
- Schrauben Sie die Oberseite des Federtethers an einen Schwenk und sichern Sie den Schwenk an dem Schwenkarm, der am zylindrischen Behälter befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass die Maus alle Bewegungsmöglichkeiten hat und auf die Katheter zugegriffen werden kann.
- Platzieren Sie einen Geschlitzdeckel, der den Schwenkmechanismus nicht über dem Tiergehege stört. Die vollständige Einrichtung finden Sie in Abbildung 3.
- Lassen Sie die Maus wiederherstellen. Es wird mindestens 22 h empfohlen.
2. Bereiten Sie L-[1-14C]Leucin-Injektionslösung und 16% (w/v) 5-Sulfosaliicylsäure (SSA) Dihydratlösung zur Deproteinisierung von Plasmaproben vor. In der SSA-Lösung enthalten auch 0,04 mM Norleucin und 1 Ci/ml [H3]Leucin als interne Standards für die Aminosäureanalyse bzw. Analyse der Tracerkonzentration in den säurelöslichen Plasmafraktionen. Bewahren Sie die SSA bis zu zwei Monate bei 4 °C auf.
- Kauf kommerziell erhältliches L-[1-14C]Leucin (50-60 mCi/mmol), das als Lösung in 2% Ethanol oder 0,1 N HCl verkauft wird. Eine bekannte Aktivität des Tracers unter einem schonenden Stickstoffstrom trocknen und in einer Lösung steriler Normalsaline rekonstituieren bis zu einer Konzentration von 100 °C/ml.
3. L-[1-14C]leucin intravenös verabreichen und arterielle Blutproben sammeln.
- Sammeln Sie notwendige Materialien: 18 1,5 ml Mikroröhren zur Entproteinisierung von Plasmaproben (hinzufügen 70 ml entionisiertes Wasser zu jeder Röhre), 17 250 ml Glasfläschcheneinsätze (15 Einsätze für die Sammlung von arteriellen Blutproben und 2 Einsätze für die Sammlung von Totraumblut erneut injiziert. Um die Sammlung von zusätzlichem und unnötigem Blut zu begrenzen, werden kleine, dünne Glasfläschcheneinsätze mit verjüngten Böden empfohlen, die eine zugängliche Pipettierung von Überstandplasma ermöglichen), 2 Mikrokapillarröhren (32 X 0,8 mm, für Hämatokritmessungen), 1 Heparin und Lithiumfluoridbeschichtetes Mikrozentrifugenrohr (zur Vermeidung von Gerinnung bzw. Glykolyse), Hämostate (Abdeckung der Spitzen mit Tygonschläuchen, damit Klemmen PE-Schläuche nicht beschädigen), Blutzuckermessgerät, Blutdruckwandler, 1 ml sterile Spritzen (für Salzspülungen) und handelsübliche Euthanasielösung (verdünnt 1:1 in entionisiertem Wasser (für Mäuse)).
- Stellen Sie sicher, dass sich das Tier zu Beginn des Experiments in einem normalen physiologischen Zustand befindet.
- Klemmen Sie die arteriellen Schläuche ca. 2 cm vom Ende entfernt und schneiden Sie die Spitze ab, wodurch eine Öffnung für das Fließen des Blutes entsteht. Dann ausklemmen Schläuche und sammeln Totraumblut ((ca. 30 ml) um Reste der Strandlinie und /oder Blut aus früheren Ziehungen zu sammeln), und in einem separaten Rohr, sammeln Sie eine Kontrollprobe (ca. 30 l), Hämatokritproben (ca. die Hälfte des Kapillarrohrvolumens) und eine Glukose Probe (ca. 20 l).
- Messen Sie Hämatokrit, indem Sie ein Ende mit Dichtmittel-Putte und Zentrifuge für 1 min bei 4500 x g verstopfen. Messen Sie das Verhältnis des Volumens der roten Zellen zum gesamten Blutvolumen. Wenn ein Tier einen Hämatokrit unter 30% hat, setzen Sie die Studie nicht fort.
- Verwenden Sie einen handelsüblichen Blutzuckermessgerät, um den Glukosespiegel in einem Tropfen Blut zu messen.
- Zentrifugenkontrollprobe für 2 min bei 18.000 x g, um Plasma zu trennen. Plasmaproben wie folgt deproteinisieren: Fügen Sie 5 l Plasma zu 70 l entionisiertem Wasser in ein 1,5 ml Mikrorohr, 25 l der 16%-SSA-Lösung und wirbeln. 30 min auf Eis legen, bevor sie auf Trockeneis gefrieren.
- Geben Sie totes Weltraumblut durch die venöse Linie an das Tier zurück, gefolgt von einer heparinisierten Salinespülung, um übermäßigen Blutverlust zu verhindern.
- Verbinden Sie die arterielle Linie mit einem Blutdruckwandler, um den mittleren arteriellen Blutdruck zu messen.
- Achten Sie nach der Entnahme der Proben darauf, die arterielle Linie wieder zu klemmen und die Linie mit einem kleinen (50 ml) Volumen der heparinisierten Saline zu spülen.
- Verabreichen Sie Tracer intravenös und sammeln Sie zeitzeitliche arterielle Blutproben.
- Verwenden Sie einen Y-Stecker, um eine Spritze mit dem Tracer (100 c/kg) und eine Spritze mit 50 ml steriler Saline zu befestigen, um die venöse Linie nach der Injektion des Tracers zu spülen. Verbinden Sie den Y-Anschluss mit der venösen Leitung.
- Initiieren Sie die Studie, indem Sie gleichzeitig eine Stoppuhr starten und den Tracer injizieren. Spülen Sie die venöse Linie unmittelbar nach der Injektion mit Einer Saline (ca. 100ml).
- Sammeln Sie Blutproben 1-7 kontinuierlich während der ersten 2 min des Experiments in der gleichen Weise. Nach dem Sammeln der 7. Probe, sammeln Sie 30 L Totraumblut vor jeder verbleibenden Probe. Die Proben 8-14 werden in 3, 5, 10, 15, 30, 45 und 60 min gesammelt.
- Verarbeiten Sie Blutproben unmittelbar nach der Entnahme, wie für die Kontrollprobe beschrieben. Wenn es zu einer Verzögerung kommt, legen Sie die Proben auf Eis. Über den arteriellen Katheter vorsichtig totes Weltraumblut in die Arterie reinininininund mit Heparin-Saline bündig.
- Zu einem bestimmten Zeitpunkt während des Experiments werden drei interne Standards verarbeitet, indem man 25 l 16% SSA, 0,04 mM Norleucin und 1 mCi/ml [3H]leucin bis 75 l Wasser, Wirbel und Eis aufEis hinzufügt.
- Nach dem Sammeln der 14. Probe in 60 min, injizieren Sie etwa 0,2 ml B-Euthanasie-D in die venöse Linie, um das Tier einzuschläfern. Zeichnen Sie die Todeszeit auf.
- Lösen Sie das Tier vom Schwenkberg und entfernen Sie es aus dem Tiergehege. Entfernen Sie vorsichtig das Gehirn, legen Sie auf Aluminiumfolie, und einfrieren auf Trockeneis. Einfrieren Sie Gehirne nicht mit flüssigem Stickstoff, da Gehirne knacken können. Speichern Sie Gehirn-, Proben- und interne Standards bei -80 °C, bis sie für die Verarbeitung bereit sind. Die Verarbeitung kann an jedem punktweiter Punkt danach durchgeführt werden.
4. Analysieren Sie die Konzentrationen von Leucin und L-[1-14C]Leucin in Plasmaproben.
- Tauproben und interne Standards auf Eis, Wirbel und Zentrifuge 18.000 x g für 5 min bei 2 °C auftauen. Die Überstandfraktion enthält das frei beschriftete und unbeschriftete Leucin.
- Übertragen Sie 40 l des Überstandes in eine flüssige Szintillationsflasche und fügen Sie einen Szintillationscocktail hinzu. Quantifizieren Sie Disintegrationen pro Min (DPM) von 3H und 14C mittels Flüssigszintillationszählung und einer Quench-Kurve, die für die gleichzeitige Doppelbeschriftung (3 H und 14C) für die Zählung ausgelegt ist.
- Um die Plasmaleucinkonzentrationen zu quantifizieren, verwenden Sie ein HPLC-System mit einer Natriumkationenaustauschsäule und einer postkolonnischen Derivatisierung mit O-Phthaldehyd und fluorometrischem Nachweis.
- Stellen Sie HPLC auf die folgenden Spezifikationen ein: Fluortonitregung von 330 nm und Emission von 465 nm. Die mobile Phase besteht aus Natriumeluant, pH 7,40 und Natriumeluant + 5% Sulfolane, pH 3,15. Stellen Sie den Pufferdurchfluss von 0,400 mlL/min und den Abfluss des Derivatisierungsinstruments auf 0,300 mL/min ein. Stellen Sie die Säulentemperatur auf 48 °C und die Reaktortemperatur auf 45 °C ein.
- Kalibrieren Sie das System mit einer Reihe von Aminosäurekonzentrationen (einschließlich Norleucin) zwischen 30 und 500 pmol/10ml. Die Kalibrierkurve ist linear. Die Aminosäurekonzentrationen der getesteten 10 ml Injektionsproben liegen im Bereich dieser Kalibrierkurve.
5. Führen Sie quantitative Autoradiographie durch.
- Bereiten Sie Hirnabschnitte mit einer Dicke von 20 m für die Autoradiographie vor. Schnittgehirn mittels Kryostat bei -20 °C.
- Tauen montieren serielle Gehirnabschnitte auf Gelatine-beschichteten Dias. Lufttrocken.
- Waschen Sie die Schlitten in fünf Wechseln von 10% formalin für 30 min pro Wechsel, gefolgt von einem kontinuierlichen Fluss von entionisiertem Wasser für 1 h. Bedecken Sie die Dias lose mit Folie, um Staub zu vermeiden und 24 h trocknen zu lassen.
- Ordnen Sie Dias in einer Röntgenfilmkassette (Kassetten, die 20X25 cm Mammographiefolien passen, werden empfohlen) zusammen mit einer Reihe von[14C]Methylmethacrylat-Standards, die zuvor gegen Gewebe bekannter 14C-Konzentrationen kalibriert wurden, wie beschrieben29. Standards können kommerziell erworben werden, stellen aber sicher, dass sie einen Bereich von 2-300 mCi/g Gewebe abdecken und gegen eine Gewebedicke von 20 m kalibriert sind. Unter rotem Sicherheitslicht legen Sie ein Stück Mammographiefilm, Emulsionsseite nach unten, auf die Abschnitte.
- Versiegeln Sie die Kassetten und legen Sie sie in eine schwarze Wickeltasche und lagern Sie sie 40-45 Tage lang in einem Schrank.
- Entwickeln Sie Folien nach den Anweisungen des Herstellers. Hinweis: Die automatisierte Filmentwicklung wird nicht empfohlen, da der Hintergrund ungleichmäßig sein kann und die Quantifizierung beeinflussen kann.
6. Analysieren Sie Bilder.
Hinweis: Es wird ein handelsübliches Programm zur Bildanalyse in Verbindung mit einer CCD-Kamera und einem Leuchtstofflampenkasten mit gleichmäßiger Beleuchtung empfohlen. Die relativen optischen Dichten im beleuchteten Film werden von der CCD-Kamera erfasst.
- Konstruieren Sie eine Kalibrierkurve der optischen Dichte (OD) v. Gewebe 14C Konzentration auf der Grundlage der ODs der Reihe der kalibrierten Standards auf dem Film. Passen Sie diese Daten (einschließlich des Rohlings oder des Hintergrunds) an eine Polynomgleichung an. Entweder eine Polynomgleichung zweiten oder dritten Grades passt sehr gut.
- Um bestimmte Hirnregionen zu analysieren, lokalisieren Sie die Region von Interesse (ROI) in sechs bis acht Abschnitten im Vergleich zu einem Hirnatlas. Zeichnen Sie die ODs der Pixel innerhalb eines ROI in allen Abschnitten auf und berechnen Sie basierend auf der Kalibrierkurve die Gewebekonzentration 14C in jedem Pixel. Berechnen Sie die durchschnittliche Gewebekonzentration 14C im ROI.
7. Berechnung von rCPS. Berechnen Sie rCPS in jedem ROI anhand der folgenden Gleichung:
Wenn P*(T) die gewichtete durchschnittliche Gewebekonzentration von 14C im ROI ist, sind Cp(t) und C*p(t) die arteriellen Plasmakonzentrationen von nicht beschrifteten und markierten Leucin zu diesem Zeitpunkt, t, T ist die Zeit, in der das Tier starb ( ca. 60 min) und ist der Anteil von Leucin im Gewebevorläuferpool, der aus dem Plasma stammt. Die Auswertung des Wertes erfolgt in einem separaten Experiment 6. • wurde in WT, Fmr1 Knockout, Tsc+/-und PKU Mäuse 6,22,25,28ausgewertet. Wenn ein Experiment entweder genetische oder pharmakologische Veränderungen beinhaltet, die die Raten der Proteinsynthese, des Abbaus oder des Leucinstoffwechsels beeinflussen könnten, sollte dies unter den neuen Bedingungen bewertet werden.
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Representative Results
Hier zeigen wir ein repräsentatives Experiment, das die Auswirkungen der vorherigen Verabreichung eines Proteinsyntheseinhibitors auf rCPS demonstriert. Anisomycin in normaler Saline wurde einer erwachsenen C57/BL6 männlichen Wildmaus subkutan (100 mg/kg) 30 min verabreicht, bevor die rCPS-Bestimmung eingeleitet wurde. Die Auswirkungen der Anisomycin-Behandlung im Vergleich zu einem mit fahrzeugen behandelten Kontrolltier zeigen, dass rCPS bei der mit Anisomycin behandelten Maus fast nicht nachweisbar ist (Abbildung 4). Diese Daten stellen eine Validierung dar, dass die in vivo autoradiographische L-[1-14C]-Leucine-Methode die Raten der Proteinsynthese im Gehirn misst.
Wir stellen eine Figur von L-[1-14C]-Leucin-Autoradiogrammen auf vier Ebenen des Gehirns vor, um die Auflösung der Methode zu demonstrieren (Abbildung 5). Illustriert sind die Zellschichten in der Riechbirne (Abbildung 5A und B), der Hippocampus (Abbildung 5C) und das Kleinhirn (Abbildung 5G). Kerne im Hypothalamus (Abbildung 5D), die Pons (Abbildung 5E und F), und der Hirnstamm (Abbildung 5H) sind auch deutlich in den Autoradiogrammen zu sehen. Wir zeigen auch die quantitativen regionalen Raten der Proteinsynthese im frontalen Kortex (5,88 nmol/g/min) (Abbildung 6A) und dorsalem Hippocampus (5,35 nmol/g/min) (Abbildung 6B) eines typischen Kontrolltiers.
Abbildung 1: Schema, das die Schritte des gesamten rCPS-Protokolls darstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Bild der exponierten Femoralarterie und Femoralvene. Parallel zueinander liegend, wird die Femoralarterie über der Femoralvene dargestellt. Die femorale Vene hat auch eine tiefere rote Farbe als die Oberschenkelarterie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Abbildung des empfohlenen Tiergeheges für rCPS-Experimente. Es nutzt ein klares zylindrisches Tiergehege mit schwenkbarem Anhängskopf, der mit einem Federtether verbunden ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative Bilder eines mit fahrzeugen behandelten Tieres (A) im Vergleich zu einem mit Anisomycin (100 mg/kg, subkutan) 30 min vor der Verabreichung von Tracer (B) behandelten Tier. Die Raten der Proteinsynthese sind proportional zum Dunkelgrad im Bild. Anisomycin reduziert drastisch die gemessenen Raten der Proteinsynthese, was auf die Spezifität dieser Methode hinweist. Die Skalenleiste oben rechts von A stellt 1 mm dar und gilt für beide Bilder. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Digitalisierte Autoradiogramme einer wachen Benehmender Maus auf Der Ebene der Riechbirne (A, B), Hypothalamus (C, D), Pons (E, F), Kleinhirn (G) und Hirnstamm (G, H). Die dunkleren Regionen weisen höhere rCPS auf. Die Skalenleiste im Panel G gilt für die Bereiche A, C, E und G. Autoradiogramme rechts (B, D, F und H) sind vergrößerte Bilder aus den Auflagen auf den Bildern auf der linken Seite und die Skalenleiste in Panel H für die Bedienfelder B , D, F und H Abkürzungen sind wie folgt: FrA, frontaler Assoziationskortex; OB, Olfaktor-Glühbirne; AO, vorderer olfaktorischer Kern; Gl, glomeruläre Schicht; EPl, externe Plexiformschicht; BLA, basolaterale Amygdala; py, pyramidale Zellschicht; dHi, dorsalhippocampus; DG, dentate gyrus; MHb, mediale Hatula; Rt, thalamischer retikulärer Kern; VMH, ventraler medialer hypothalamischer Kern; Bogen, arkuatischer Kern; EW, Edinger-Westphal-Kern; R, roter Kern; PN, Pontinkern; ML, molekulare Schicht; GL, körnige Schicht; Pc, Purkinje Zellschicht; Cu, Cuneate-Kern; AP, Bereich postrema; 10, dorsaler Motorkern des Vagus; 12, hypoglossaler Kern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Digitalisierte Autoradiogramme einer wachen Kontrollmaus auf Höhe des frontalen Kortex (A) und des dorsalen Hippocampus (B). Die Raten der zerebralen Proteinsynthese werden in den Bildern entsprechend dem auf der rechten Seite dargestellten Farbbalken farbkodiert. Die Skalenleiste unten links von A stellt 1 mm dar und gilt für beide Bilder. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Wir stellen eine quantitative Methode zur Bestimmung der regionalen Raten der zerebralen Proteinsynthese (rCPS) in vivo bei Versuchstieren vor. Diese Methode hat erhebliche Vorteile gegenüber bestehenden Methoden: 1. Messungen werden im wach laufenden Verhalten des Tieres durchgeführt, so dass sie laufende Prozesse im funktionierenden Gehirn widerspiegeln. 2. Messungen werden mittels quantitativer Autoradiographie durchgeführt, die die Möglichkeit bietet, rCPS in allen Regionen und Subregionen des Gehirns gleichzeitig zu bestimmen. 3. Das kinetische Modell der Methode berücksichtigt die Möglichkeit des Recyclings von nicht gekennzeichneten Aminosäuren, die aus dem Abbau von Gewebeproteinen gewonnen werden, und seine Wirkung auf den Vorläuferpool für die Proteinsynthese6.
Die primäre Einschränkung dieser Methode ist, dass sie zeitaufwändig und anspruchsvoll ist. Während es verlockend ist, einfachere und höhere Durchsatzmethoden anzuwenden, müssen die Grenzen der erhaltenen Daten anerkannt werden.
Aufgrund der Komplexität der Messung von rCPS in einer intakten Maus können Probleme mit der Aufrechterhaltung eines normalen physiologischen Zustandes, dem Sammeln ausreichender Blutproben und der Vermeidung möglicherweise störender Bedingungen auftreten. Die chirurgische Implantation der venösen und arteriellen Katheter ist eine Herausforderung. Wie bei jedem chirurgischen Eingriff, insbesondere beim Umgang mit empfindlichen Gefäßen, besteht ein inhärentes Risiko für die Sterblichkeit des Tieres. Für uns ist es selten (ca. 1%). Während der folgenden 22 h Erholungsphase, gelegentlich (ca. 4%) ein Tier zieht einen Katheter heraus. Während der Messung ist es wichtig, dass Katheter Patent eitern und dass sich die Tiere in einem normalen physiologischen Zustand befinden. Nach unserer jüngsten Erfahrung kann arterielles Blut bei etwa 2% der Tiere nicht entnommen werden und etwa 1% der Tiere hatten einen niedrigen Hämatokrit (< 40%) oder niedriger arterieller Blutdruck (< 85 mm Hg), was auf einen Blutverlust während der Operation und/oder Genesung hindeutet.
Bei der Vorbereitung von Hirnabschnitten für die Autoradiographie ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Schnittdicke 20 m beträgt, da dies die Schnittdicke ist, auf die[14C]methylmethacrylat-Standards kalibriert wurden. Achten Sie darauf, dass Abschnitte von guter Qualität, d. h. ohne Risse, Falten oder Blasen, sichergestellt werden, da diese Unvollkommenheiten die autoradiografische Analyse beeinträchtigen. Wir entwickeln autoradiografische Filme von Hand und nicht in einem automatisierten Filmprozessor, weil wir feststellen, dass die optische Hintergrunddichte nach automatisierter Verarbeitung ungleichmäßig sein kann, was die Quantifizierung beeinflussen kann.
In die Gleichung für rCPS schließen wir einen Faktor ein, Lambda (), d. h. den Anteil von Leucin, der aus dem arteriellen Plasma stammt, der Rest stammt aus dem Recycling von Aminosäuren, die aus dem Abbau von Gewebeproteinen abgeleitet wurden6. Wir haben in separaten Experimenten an WT- und Fmr1 KO-Mäusen (fragilex-Modell) C57Bl/6J-Mäusen den Wert von 0,603 bewertet und gezeigt. Der Wert des Wertes kann je nach Art, genetischem Hintergrund oder dem Vorhandensein einer genetischen Mutation variieren. Daher muss man bei der Entwicklung von Proteinsyntheseexperimenten für andere Modelle die Bewertung des Wertes bewerten, bevor eine genaue Messung durchgeführt werden kann.
Unsere Arbeit in genetischen Mausmodellen von neuroentwicklungsbedingten Störungen zeigt, dass diese Methode Veränderungen in rCPS in diesen Modellen und in einigen Fällen Reaktionen auf pharmakologische Behandlungen zeigt22,23,25 , 26. Es ist auch denkbar, dass die rCPS-Messung auch degenerative Veränderungen im Gehirn unter Erkrankungen wie Alzheimer-Modellen, Parkinson-Krankheit, fragilem X-Zitter-Ataxie-Syndrom, traumatischen Hirnverletzungen usw. überwachen kann. diese Modelle, könnte es möglich sein, frühe degenerative Veränderungen und möglicherweise auch Reaktionen auf frühe Interventionen zu verfolgen. Die rCPS-Methode kann zusammen mit der Immunhistochemie in parallelen Abschnitten verwendet werden, um spezifische Hirnveränderungen weiter zu untersuchen25. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die quantitative autoradiologische L-[1-14C]-Leucine-Methode ideal für die genaue Bestimmung der rCPS-Werte in vivo ist. Es bietet erhebliche Vorteile in Bezug auf Genauigkeit und Anwendbarkeit auf In-vivo-Bedingungen gegenüber bestehenden Methoden.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Die Autoren möchten Zengyan Xia für die Genotypisierung der Mäuse, Tom Burlin für die Verarbeitung von Aminosäuren und Filmen und Mei Qin für die Durchführung einiger rCPS-Experimente würdigen. Diese Forschung wurde durch das Intramural Research Program des NIMH, ZIA MH00889, unterstützt. RMS wurde auch von einem Autism Speaks Postdoctoral Fellowship 8679 und einem FRAXA Postdoctoral Fellowship unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson Laboratory | 003024 | Fmr1 knockout breeding pairs |
| Anisomycin | Tocris Bioscience | 1290 | |
| Microhematocrit Tubes | Drummond Scientific | 1-000-3200-H | capillary tubes |
| Critoseal Capillary Tube Sealant | Leica Microsystems | 39215003 | sealant putty |
| Glass vial inserts | Agilent | 5183-2089 | used to collect blood samples |
| Digi-Med Blood Pressure Analyzer | Micro-Med Inc. | BPA-400 | blood pressure analyzer |
| Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System | Bayer Breeze | 9570A | glucose meter |
| Gastight syringe | Hamilton Co. | 1710 | tuberculin glass syringe |
| HeatMax HotHands-2 Hand Warmers | HeatMax | Model HH2 | warming pads |
| Heparin Lock Flush Solution | Fresenius Kabi USA, LLC | 504505 | heparin saline |
| Clear animal container | Instech | MTANK/W | animal enclosure |
| Spring tether | Instech | PS62 | catheter tube/rodent attachment |
| Swivel | Instech | 375/25 | hooks to spring tether |
| Swivel arm and mount | Instech | SMCLA | hooks to swivel and animal enclosure |
| Tether button | Instech | VAB62BS/22 | attaches to bottom of spring tether |
| Stainless steel tube | Made in-house | N/A | used to snake catheters through mouse |
| Matrx VIP 3000 | Matrx | 91305430 | isoflurane vaporizer |
| Isoflurane | Stoelting Co. | 50207 | isoflurane/halothane adsorber |
| Clippers | Oster Finisher | Model 59 | |
| Surgical skin hooks | Made in-house (??) | N/A (??) | |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | APP Pharmaceuticals LLC | 918610 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| UNIFY silk surgical sutures | AD Surgical | #S-S618R13 | 6-0 USP, non-absorbable |
| PE-8 polyethylene tubing | SAI Infusion Technologies | PE-8-25 | |
| Syringe | Becton Dickinson and Co. | 309659 | 1cc/mL |
| PE-10 polyethylene tubing | Clay Adams | 427400 | |
| MCID Analysis | Imaging Research Inc. | Version 7.0 | optical density analysis |
| Gelatin-coated slides (75x25mm) | FD Neurotechnologies | PO101 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Super RX-N medical x-ray film | Fuji | 47410-19291 | |
| Hypercassettes (8x10 in) | Amersham Pharmacia Biotech | 11649 | |
| [1-14C]leucine | Moravek | MC404E | |
| Microcentrifuge tube | Sarstedt Aktiengesellschaft & Co. | 72.692.005 | used to deproteinize blood samples |
| Glass pasteur pipette | Wheaton | 357335 | |
| Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | |
| Nitrogen | NIH Supply Center | 6830009737285 | |
| Scintillation fluid | CytoScint | 882453 | |
| Liquid scintilllation counter | Packard Tri-Carb | 2250CA | |
| Amino acid analyzer | Pickering Laboratories | Pinnacle PCX | |
| HPLC unit | Agilent Technologies | 1260 Infinity | include 1260 Bio-Inert Pump |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg | M650 | |
| Sulfosalicylic acid | Sigma-Aldrich | MKBS1634V | 5-sulfosalicylic acid dihydrate |
| Norleucine | Sigma | N8513 | |
| 1.0 N HCl | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| [H3]leucine | Moraevk | MC672 | |
| Falcon tube | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL conical centrifuge tubes |
| Stopwatch | Heuer Microsplit | Model 1000 | 1/100 min |
| Euthanasia Solution | Vet One | H6438 | |
| Northern Light Precision Illuminator | Imaging Research Inc. | Model B95 | fluorescent light box |
| Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 | Nikon | 1442 | CDD camera |
References
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