Summary
Protein sentezini hücreler için kritik bir biyolojik süreçtir. Beyinde, adaptif değişiklikler için gereklidir. Sağlam beyinde protein sentezinin oranlarının ölçülmesi dikkatli metodolojik hususlar gerektirir. Burada L-[1-14C]-leucine nicel autoradiographic yöntemi, serebral protein sentezinin bölgesel oranlarının in vivo olarak belirlenmesi için sunuyoruz.
Abstract
Protein sentezi, nöronal fonksiyonun geliştirilmesi ve bakımı için gereklidir ve sinir sistemindeki adaptif değişikliklerle ilgilidir. Ayrıca, sinir sisteminde protein sentezi disregülasyon bazı gelişimsel bozukluklarda bir çekirdek fenotipi olabilir düşünülmektedir. Hayvan modellerinde serebral protein sentezi oranlarının doğru ölçümü Bu bozuklukları anlamak için önemlidir. Geliştirdiğimiz Yöntem, uyanık, hayvanlar gibi davranan çalışmaya uygulanacak şekilde tasarlandı. Bu bir niceliksel autoradiographic yöntemi, bu yüzden aynı anda beynin tüm bölgelerinde oranları elde edebilirsiniz. Yöntem bir izleyici amino asit kullanımı dayanmaktadır, L-[1-14C]-leucine, ve beyin L-leucine davranışının kinetik modeli. Biz seçti L-[1-14C]-leucine Tracer olarak çünkü yabancı etiketli metabolik ürünlere yol açmaz. Ya protein içine dahil veya hızlı bir şekilde etiketlenmemiş CO2 beyinde büyük bir havuzda seyreltilir 14Co2 verim metabolize edilir. Yöntem ve model aynı zamanda doku proteolden doku öncül havuzu protein sentezi için türetilen etiketli olmayan lösin katkısı için izin verir. Yöntem, hücre ve nörofobik katmanlarda protein sentezi oranlarının yanı sıra hipotalamik ve kranial sinir çekirdekleri belirlemek için uzamsal çözünürlüğe sahiptir. Güvenilir ve tekrarlanabilir nicel veriler elde etmek için, yordamsal ayrıntılara uymak önemlidir. Burada, nicel autoradiographic L-[1-14C]-leucine yöntemi ile bölgesel protein sentezi oranlarının belirlenmesi için ayrıntılı prosedürler sunuyoruz.
Introduction
Protein sentezi, sinir sistemindeki uzun süreli adaptif değişim için gerekli olan önemli bir biyolojik süreçtir1. Hem omurgasızlar hem de omurgalı protein sentezi blokları uzun süreli bellek depolama inhibe2. Protein sentezi, uzun vadeli potansiyelleşme (LTP) ve uzun vadeli depresyon (LTD)3, geliştirme sırasında nöronal hayatta kalma bazı formların geç aşamalarının bakımı için gereklidir4, ve nöron genel bakım ve onun sinaptik bağlantılar5. Beyin proteini sentezinin oranlarının ölçülmesi, uyarlanabilir değişikliklerin yanı sıra öğrenme ve hafızaya ilişkin nörogelişimsel bozukluklar ve bozuklukların incelenmesi için önemli bir araç olabilir.
Biz bir yöntem geliştirdik serebral protein sentezi oranlarını ölçmek için bir uyanık hayvan bu ex vivo veya in vitro preparatlar içinde oran tahmin diğer teknikler üzerinde doğal avantajları sunan beyin dokusu6. En önemlisi uyanık bir hayvan içinde bozulmamış beyin ölçümleri için uygulanabilirlik. Bu önemli bir dikkate çünkü sinaptik yapısı ve yerinde fonksiyon ve post mortem etkileri hakkında endişeleri olmadan ölçümleri sağlar. Dahası, kullandığımız nicel autoradiographic yaklaşımı yüksek derecede uzamsal lokalizasyonu elde eder. Oysa 14C enerji biz alt hücresel veya hücresel düzeyde izleyici yerelleştirmek olamaz gibi, biz hücre katmanları ve hipotalamik çekirdekler gibi küçük beyin bölgelerinde oranları ölçmek, yaklaşık 25 μm çözünürlük7.
Radiotracers ile in vivo ölçümlerin bir meydan okuma radiolabel ölçülmesi değil tepki ürünüdür emin olmak için faiz yerine tepki etiketlenmemiş etiketli öncüsü veya diğer yabancı etiketli metabolik ürünler6. Biz seçti L-[1-14C]-leucine Tracer amino asit olarak ya protein içine dahil ya da hızla 14Co2, hangi etiketlenmemiş Co2 büyük havuzda seyreltilmiş olduğu için yüksek oranda kaynaklanan beyin enerji metabolizması8. Dahası, herhangi bir 14c protein içine Incorporated öncelikle ücretsiz olarak var [14c]-leucine, hangi 60 min deneysel dönemde, neredeyse tamamen doku temizlenmiş6. Proteinler daha sonra formalin ile dokuya sabitlenir ve daha sonra su ile durulanır, herhangi bir ücretsiz [14C]-leucine autoradiography önce kaldırılır.
Başka bir önemli dikkate doku proteolizi türetilen etiketlenmemiş amino asitler tarafından preürosi amino asit havuzunun spesifik aktivite seyreltme konudur. Biz yetişkin sıçan ve fare göstermiştir, yaklaşık 40% beyin protein sentezi için preürosi lösin havuzun% protein arıza türetilen amino asitler gelir6. Bu, serebral protein sentezi (rCPS) bölgesel oranlar hesaplaması dahil edilmelidir ve bu ilişkinin değişeceği çalışmalarda onaylanmalıdır. Yöntemin teorik temeli ve varsayımları başka bir yerde6' da ayrıntılı olarak sunulmuştur. Bu yazıda, Bu metodoloji uygulamasının yordamsal konularına odaklanıyoruz.
Bu yöntem yer sincaplarda RCPS belirlenmesi için istihdam edilmiştir9, koyun10, Rhesus Monkeys11, fareler12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 tane , 21, Tüberöz skleroz kompleksi22bir fare modeli, kırılgan x sendromu bir fare modeli23,24,25,26, kırılgan x premutasyon fareler27, ve bir fenilketoniinin fare modeli28. Bu yazıda, rCPS ölçüm prosedürlerini In vivo autoradiographic L-[1-14C]-leucine yöntemiyle sunuyoruz. Biz uyanık bir kontrol fare beyin bölgelerinde rCPS mevcut. Ayrıca, bir tercüme inhibitörü olan anisomisin in vivo yönetiminde beynin protein sentezini ortadan kaldırmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: tüm hayvan prosedürleri, Ulusal ruh sağlığı hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır ve hayvanların bakımı ve kullanımı konusunda ulusal sağlık kurumları yönetmeliklere göre yapılmıştır.
İletişim kuralına genel bakış Şekil 1' de sunulmuştur.
1. bir femoral ven ve arter izleme ve zamanlanmış arteriyel kan numunelerinin toplanması, sırasıyla uygulanması için cerrahi implant kateterler. Tam cerrahi en az 22 saat önce Tracer yönetimi. Cerrahi tamamlamak için yaklaşık 1 h gerektirir.
- Gerekli malzemeleri toplayın: Steril Cerrahi aletler (cerrahi makas, mikro-makas, forseps, üç cerrahi Cilt kancası), isofluran anestezisi için ekipmanlar (izofluran buharlaştırıcı, aktif gaz tutucu, mühürlü anestezi odası, anestezi burun koni), steril cerrahi aşama, kürk kesiciler, 70% etanol, Betadine, steril gazlı bez, cerrahi bant, ticari el ısıtıcılar, cerrahi mikroskop, steril 0,9% sodyum klorür (tuz), steril heparin 100 USP birimleri/mL% 0,9 sodyum klorür (heparinized tuz), steril 5 20-cm şeritler 6-0 emilebilir sütür, steril 25 cm iplik PE-8 ve pe-10 polietilen kateter bir uç kesme ile 45o, steril 1 cc şırıngalar, steril 32 Gauge iğneler, koter ekipman, steril 15-20 cm Hollow Paslanmaz çelik çubuk (2,5 mm iç çapı, 3 mm dış çapı), lokal anestezikler (Bupivacaine ve lidokain merhem), ve döner eklentiyle bir hayvan muhafaza (düğme ile 30 cm yay Tether, döner, döner montaj ve kol, 20 X 13 cm şeffaf silindirik Konteyner).
- Hayvan ameliyatı için hazırlayın.
- Kurumunuzun gerektirdiği doğru aseptik ve steril tekniklerin kullanıldığından emin olun.
- Hayvanı tartın. Hayvan başarılı ameliyat için en az 25 g olmalıdır.
- Hayvanı mühürlü bir Pleksiglas odasına yerleştirin ve odası izofluran anestezi aygıtına bağlayın. Erkek için 2,5 L/dak ve O2' de% 1,5 ' lık isofluran dişi Için 3,0 l/dk debisi ayarlayın. Kabaca 2 dakika sonra, fare uygun bir parmak tutam ile bir çekilme refleks eksikliği tarafından yatıştırıcı olduğundan emin olun.
- Bir kez Sedated, Oda fare çıkarın ve anestezi burun koni içinde yüzü ile meyilli bir konumda yatıyordu. Buharlaştırıcı gaz almak ve gaz çöpçü gaz dönmek için burun koni ayarlayın. Çöpçü bir kömür filtresinde Isoflurane yakalayacaktır.
- Omuz bıçakları arasında kürk tıraş için Clippers kullanın. Düzgün tıraş bölge sterilize emin olun, Betadine ve etanol Scrubs arasında üç kez alternatif.
- Fare, burun koni yüz tutmak bir sırtüstü konumuna çevirin. Sol bacağa ameliyat aşamasına kadar bant yerleştirin ve sol iç uyluk üst sol karın için kürk tıraş için Clippers kullanın. Düzgün tıraş bölge sterilize emin olun, Betadine ve etanol Scrubs arasında üç kez alternatif.
- Farenizin altında, gazlı bezle sarılmış, piyasada kullanılabilen bir el ısıtıcıyı kaydırın. Sağ bacağa ameliyat aşamasında bant yerleştirin.
- Sol femoral ven içine kateter yerleştirin.
- Cerrahi mikroskop yardımıyla, sol uyluk üst medial kısmı orta çizgi doğru rostrally bir 1 cm kesi yapmak için cerrahi makas kullanın, femoral arter ve ven açığa.
- Daha fazla veziküller açığa çıkarmak için cerrahi Cilt kanca ile gevşek cilt geri çekin.
- Yeterli nemi korumak için steril 0,9% sodyum klorür maruz alana uygulayın.
- Femoral arter ve ven küçük bir bölümü etrafında bağ dokusu ayıran, künt dissect için forseps kullanın. Dikkatle, arter ve ven ayırın (Şekil 2).
- Kesi en lateral noktasında hem femoral ven ve arter altında emici sütür (Strand A) bir iplikleri iplik için forseps kullanın. Dikişi yarı yarıya çekin, böylece uçları bile.
- Kasık daha proksimal bir noktada, ikinci bir dikiş iplik için forseps kullanın (Strand B) sadece femoral ven altında. Yavaşça kan akışını kısıtlamak için kullanılacak bir yarım düğüm kravat.
- Strand A ve Strand B arasındaki bir noktada, üçüncü bir sütür (Strand C) sadece femoral ven altında iplik için forseps kullanın. Yavaşça kan akışını kısıtlamak için kullanılacak bir tam düğüm kravat. Damarını yırtmamaya dikkat et.
- Hassas bir şekilde kan akışını kısıtlamak için Strand B üzerine römorkör. Kısıtlı kan akışını korumak için Strand B 'ye hafifçe çekmek için bir hemostat kullanın.
- Femoral ven kısıtlı alanda mikromakas ile küçük bir delik kesmek ve dikkatle PE-8 boru açılı ucunu takın (daha önce heparin tuz ile temizlendi) Strand B doğru. Eklendikten sonra Strand B 'nin gerginliğini serbest bırakın ve kateteri ven kadar ileriye yönlendirin. Kateter içeren ven etrafında Strand B sıkın.
- Strand C kullanarak kateter etrafında ek bir düğüm bağlayın. Bu düğüm femoral arter yakalamak değil emin olun.
- Kateterin düzgün bir şekilde implante edilmesini sağlamak için hortumu kan ile kısmen doldurmak için şırınga varil üzerine yavaşça geri çekin.
- Aynı prosedürü takiben, sol femoral arter içine bir PE-10 kateter takın.
- Tam bir cerrahi prosedür.
- Hem femoral ven ve arter kateterleri güvenli olduktan sonra, her iki kateter etrafında bir düğüm içine Strand A kravat.
- Tüm aşırı sütürler kesip cilt kancaları kaldırın. Pıhtılaşma önlemek için arteriyel kateter heparinize tuz ile Flush. Bir mühür oluşturmak için her iki kateter uçları cauterize.
- Fare meyilli konumuna yerleştirin ve boyun tabanında küçük bir kesi yapmak ve maruz alan için tuz uygulayın.
- Boyun kesi femoral kesi için subdermally boş metal çubuk takın. Kateterleri boş çubuk ve boyun kesi üzerinden yılan. Boş çubuğu çıkarın. İmplantasyon kateterler subdermally farelerin kateterler zarar vermesini önleyecek.
- Yaranın tarafına bupivakain uygulayın. Femoral kesi ile sütür kapatın. Kapalı, dikişli yara üzerine lidokain merhem ekleyin.
- 30 cm esnek Hollow tüp (Bahar Tether) ile kateterler yılan ve cilt altında bahar Tether düğmesini sütür. Yaranın tarafına bupivakain uygulayın. Cilt altında bahar Tether düğmesini sütür. Kapalı, dikişli yara üzerine lidokain merhem ekleyin.
- Kurtarma döneminde hayvan ev için döner montaj ve kol ile açık bir silindirik konteyner (20 cm yüksek, 13 cm çap) içine fareyi hareket ettirin. Hayvan sıcak tutmak için konteyner altında bir el sıcak yerleştirin.
- Bir döner için yay Tether üst vida ve silindirik konteyner bağlı döner kol döner güvenli. Mouse 'un tam hareket aralığına sahip olduğundan ve kateterlerinin erişilebildiğinden emin olun.
- Hayvan muhafazasının üzerinde döner mekanizmaya müdahale etmeyen bir oluklu kapak yerleştirin. Tam kurulum için Şekil 3 ' e bakın.
- Fare kurtarmak için izin verin. En az 22 h önerilir.
2. hazırlamak L-[1-14C] enjeksiyon için leucine çözeltisi ve 16% (w/v) 5-Sülfosalisilik asit (SSA) plazma örnekleri deproteinizing için dihidrat solüsyonu. SSA çözeltisi de dahil 0,04 mM norleucine ve 1 Μcı/mL [H3] lösin amino asit analizi için iç standartlar olarak ve asit-çözünür plazma fraksiyonlarında izleyici konsantrasyonu analizi, sırasıyla. SSA 'ya 4 °C ' de iki aya kadar saklayın.
- Satın ticari olarak kullanılabilir L-[1-14C] leucine (50-60 MCI/mmol), hangi bir çözüm olarak satılır 2% etanol veya 0,1 N HCL. steril normal tuzlu yapılan bir çözelti azot yumuşak bir akış altında izleyicinin bilinen bir aktivite kuru darbe ve yeniden teşkil 100 Μcı/mL konsantrasyonuna kadar.
3. yönetmek L-[1-14C] lösin intravenöz ve arteriyel kan örnekleri toplamak.
- Gerekli malzemeleri toplayın: 18 1,5 mL mikrotüpler deproteinizing plazma örnekleri için (eklemek 70 her tüp için deiyonize su mL), 17 250mL cam şişe ekler (arter kan numuneleri toplama için 15 ekler ve ölü alan kan toplanması için 2 ekler reinjected. Ekstra ve gereksiz kan koleksiyonunu sınırlamak için, küçük, ince cam şişe ekler ile erişilebilir pipetleme süpernatant plazma için izin konik altları tavsiye edilir), 2 mikrokapiller tüpler (32 X 0.8 mm, hematokrit ölçümü için), 1 heparin ve Lityum fluorid kaplı mikrosantrifüjlü tüp (sırasıyla pıhtılaşma ve glikoliz önlemek için), hemostats (böylece kelepçeler PE boru zarar vermez Tygon boru ile ipuçları kapak), kan şekeri monitörü, kan basıncı dönüştürücü, 1 mL steril şırınga (için ) ve ticari olarak kullanılabilir ötenazi solüsyonu (deiyonize suda seyreltilmiş 1:1 (fareler için)).
- Hayvanın deney başında normal bir fizyolojik durumda olduğundan emin olun.
- Sondan yaklaşık 2 cm arteriyel Boru Kelepçe ve ucu kesilmiş, akan kan için bir açılış oluşturma. Daha sonra boru gevşetilmeli ve ölü alan kan toplamak ((c. 30 ml) herhangi bir kalıntı tuz ve/veya önceki berabere kan toplamak için), ve, ayrı bir tüp, bir kontrol örneği toplamak (yaklaşık 30 μL), hematokrit örnekleri (kapiller tüp hacminin yaklaşık yarısı), ve bir glikoz örnek (yaklaşık 20 μL).
- 4500 x g 'de 1 dakika boyunca sızdırmazlık macunu ve Santrifüjü ile bir ucunu takarak hematokrit ölçümü yapın. kırmızı hücrelerin hacminin toplam kan hacmine oranını ölçün. Bir hayvan% 30 altında bir hematokrit varsa, çalışmaya devam etmeyin.
- Bir damla kan glikoz seviyesini ölçmek için ticari olarak kullanılabilir kan şekeri monitörü kullanın.
- Santrifüjün kontrol numunesi 2 dk. 18.000 x g 'de ayrı plazma. Aşağıdaki gibi deproteinize plazma örnekleri: 1,5 mL mikrotüpte 70 μL deiyonize su için 5 μL plazma ekleyin,% 16 SSA çözeltisi ve Vortex 25 μL ekleyin. Kuru buzda dondurmadan önce 30 dakika buz üzerine yerleştirin.
- Venöz hat yoluyla hayvan ölü uzay kanı dönün, aşırı kan kaybını önlemek için bir heparinize tuz Flush izledi.
- Ortalama arter kan basıncını ölçmek için arter hattını bir kan basıncı dönüştürücüsünü bağlayın.
- Numuneleri aldıktan sonra, arteriyel çizgiyi yeniden kelepçenin ve küçük bir (50 ml) heparinize tuz hacmine sahip çizgiyi boşalttığınızdan emin olun.
- Tracer intravenöz yönetmek ve zamanlanmış arter kan örnekleri toplamak.
- Tracer enjeksiyonu sonrasında venöz çizgiyi temizlemek için Tracer (100Μcı/kg) ile bir şırınga ve 50 mL steril tuz ile bir şırınga takmak için bir Y-konektörü kullanın. Y-konektörünü venöz hattan bağlayın.
- Aynı anda bir durdurma saati başlatmak ve izleyici enjekte ederek çalışma başlatın. Venöz çizgiyi hemen enjeksiyonu takiben tuz (c. 100mL) ile temizleyin.
- Aynı şekilde deney ilk 2 dakika boyunca sürekli 1-7 kan örnekleri toplayın. 7. numuneyi topladıktan sonra, kalan her örnekten önce 30 μL ölü alan kanı toplayın. Örnekler 8-14 sırasıyla 3, 5, 10, 15, 30, 45 ve 60 dk 'da toplanır.
- İşleme kan örnekleri hemen sonra toplama, kontrol örneği için tanımlanmıştır. Eğer bir gecikme varsa, örnekleri buza yerleştirin. Dikkatli bir şekilde arter kateter ve heparin tuzlu ile Flush yoluyla arteri ölü uzay kanı reenere.
- Deneme sırasında bir noktada, 25 μL 16% SSA, 0,04 mM norleucine ve 1 MCI/mL [3H] leucine 75 μL su, girdap ve buz üzerinde yer ekleyerek üç iç standartları işlemek.
- 14. numuneyi 60 dakikada topladıktan sonra, yaklaşık 0,2 mL B-ötenazi-D ' i k i venöz çizgiye enjekte ederek hayvanı ötenize edersiniz. Ölüm saatini kaydedin.
- Döner montajdan hayvanı sökün ve hayvan muhafazadan çıkarın. Dikkatle beyin kaldırmak, alüminyum folyo üzerine yer, ve kuru buz dondurmak. Beyin çatlak olabilir gibi sıvı azot ile beyin dondurmayın. İşleme için hazır olana kadar-80 °C ' de beyin, numune ve iç standartları saklayın. İşleme, daha sonra herhangi bir noktada gerçekleştirilebilir.
4. lösin ve L-[1-14C] lösin plazma örneklerinde konsantrasyonları analiz edin.
- Numune ve iç standartları buz, girdap ve santrifüjde çözüyor 18.000 x g, 2 °C ' de 5 dak. Süpernatant fraksiyonu ücretsiz etiketli ve etiketlenmemiş leucine içerecektir.
- Transfer 40 μL süpernatant bir sıvı scintbrilasyon şişe ve eklemek scintilasyon kokteyl. Sıvı scintıtasyon sayımı ve eşzamanlı çift etiketli (3saat ve 14c) sayma için tasarlanmış bir sönme eğrisi sayesinde, 3h ve 14c 'nin min (DPM) başına disintegrasyonları ölçün.
- Plazma lösin konsantrasyonlarını ölçmek için, bir HPLC sistemi ile bir sodyum akort değişimi sütunu ve o-ftaldehit ve Fluorometrik algılama ile sütun sonrası derivatizasyon kullanın.
- HPLC 'yi aşağıdaki belirtimlere ayarlayın: 330 nm ve 465 nm emisyonu Fluorometre uyarma. Mobil faz sodyum eluant oluşur, pH 7,40, ve sodyum eluant + 5% sülfolan, pH 3,15. 0,400 mL/dak tampon akış hızını ve derivatizasyon aleti debisi 0,300 mL/dak olarak ayarlayın. sütun sıcaklığını 48 °C ' ye ve reaktör sıcaklığına 45 °C ' ye ayarlayın.
- Sistemi, 30 ve 500 pmol/10mL arasında bir dizi amino asit konsantrasyonu (norleucine dahil) ile kalibre edin. Kalibrasyon eğrisi doğrusal. Test edilen 10 mL enjeksiyon numunelerinin amino asit konsantrasyonları bu kalibrasyon eğrisi aralığında düşer.
5. nicel autoradiography gerçekleştirin.
- Autoradiography için beyin bölümlerini 20 μm kalınlıkta hazırlayın. -20 °C ' de kriyostat vasıtasıyla bölüm beyni.
- Jelatin kaplı slaytlar üzerinde çözme Mount seri beyin bölümleri. Hava kuru.
- % 10 formalin beş değişiklikte, değişim başına 30 dakika boyunca yıkanır, 1 saat boyunca sürekli deiyonize su akışını takip eder. toz önlemek ve 24 h için kurumaya izin folyo ile gevşek slaytlar kapak.
- Slaytları bir X-ışını film kasetinde düzenleyin (20X25 cm mamografi filmlerine uyan kasetler tavsiye edilir), daha önce bilinen 14c konsantrasyonlarının dokusuna karşı kalibre edilmiş [14c] Metilmetakrilgeç standartları ile birlikte 29' ı tarif etmiştir. Standartlar ticari olarak satın alınabilir ancak 2-300 MCI/g doku aralığını kapsamalı ve 20 μm doku kalınlığına göre kalibre edilir. Kırmızı Safelight altında, bölümlerin üstüne, bir parça mamografi filmi, emülsiyon tarafı aşağı yerleştirin.
- Kasetleri mühürleyin ve siyah değişen çantaya yerleştirin ve 40-45 gün boyunca bir kabinede saklayın.
- Üretici yönergelere göre filmler geliştirin. Not: arka plan düzensiz olabilir ve ölçmeyi etkileyebilir çünkü otomatik film geliştirme önerilmez.
6. görüntüleri analiz edin.
Not: bir CCD kamera ve hatta aydınlatma ile floresan ışık kutusu ile birleştiğinde görüntü analizi için ticari olarak kullanılabilen bir program önerilir. Işıklı filmde göreli optik yoğunlukları CCD kamera tarafından tespit edilir.
- Optik yoğunluklu bir kalibrasyon eğrisi oluşturun (OD) v. doku 14C konsantrasyon film kalibre standartlar kümesinin ODs dayanmaktadır. Bu verileri (boş veya arka plan dahil) polinom denklemine sığdırın. Ya ikinci ya da üçüncü derece polinomial denklem çok iyi uyuyor.
- Belirli beyin bölgelerini çözümlemek için, bir beyin Atlası ile karşılaştırıldığında altı ila sekiz bölümden ilgi bölgesini (YG) bulun. Tüm bölümlerde YG içindeki piksellerin ODs 'sini kaydedin ve kalibrasyon eğrisine göre her bir pikseldeki doku 14C konsantrasyonunu hesaplayın. YG 'de ortalama doku 14C konsantrasyonunu hesaplayın.
7. rCPS hesaplaması. Aşağıdaki denklem yoluyla her YG 'de rCPS COMPUTE:
Burada P * (t) YG, cP(t) ve c*p(t) 14c ağırlıklı ortalama doku konsantrasyonu olduğu zaman, t, t etiketlenmemiş ve etiketli lösin arteriyel plazma konsantrasyonları olan zaman hayvan öldü ( yaklaşık 60 dk), ve λ plazmadan gelen doku habercisi havuzunda lösin kesir. Λ 'nin değerlendirilmesi ayrı bir deney 6' da gerçekleştirilir. λ WT, Fmr1 Knockout, TSC+/-ve PKU Mice 6,22,25,28' de değerlendirildi. Bir deney, protein sentezi, bozulma veya lösin metabolizması oranlarını etkileyebilecek genetik veya farmakolojik değişiklikler içeriyorsa, yeni koşullar altında λ değerlendirilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada rCPS üzerinde bir protein sentezi inhibitörü önceki yönetim etkilerini gösteren bir temsilci deneme göstermektedir. Normal tuz içinde anisomisin bir yetişkin C57/BL6 erkek Wild-tip fare subkutan (100 mg/kg) 30 dakika önce rCPS belirlenmesi başlaması için uygulandı. Anisomisin tedavisinin etkileri, bir araç tarafından tedavi edilen kontrol hayvan gösterisine kıyasla rCPS 'in anomisin tedavi edilen fareyle neredeyse algılanamayan olduğunu göstermektedir (Şekil 4). Bu veriler, In vivo autoradiographic L-[1-14C]-leucine yöntemi beynin protein sentezi oranlarını ölçer bir doğrulama temsil eder.
Yöntemin çözünürlüğünü göstermek için beyin dört düzeyde L-[1-14C]-leucine autoradiograms bir rakam sunuyoruz (Şekil 5). Resimde, koku ampul (Şekil 5A ve B), hipokampus (Şekil 5c) ve serebellum (Şekil 5g) hücre katmanları vardır. Hipotalamus içinde çekirdekler (Şekil 5D), Pons (Şekil 5E ve F), ve beyin kökü (Şekil 5h) de açıkça autoradiograms görülür. Ayrıca, ön korteks (5,88 nmol/g/dak) (Şekil 6a) ve dorsal hipokampus (5,35 nmol/g/dak) (Şekil 6B) tipik bir kontrol hayvanında protein sentezinin nicel bölgesel oranlarını gösteriyoruz.
Şekil 1: tüm rCPS protokolünün adımlarını temsil eden şematik. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: maruz kalan femoral arter ve femoral ven görüntüsü. Birbirlerine paralel döşeme, femoral arter femoral ven üzerinde gösterilir. Femoral ven de femoral arter daha derin bir kırmızı renk vardır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: rCPS deneyi için önerilen hayvan Muhafazası seti görüntüsü. Bir yay Tether bağlı döner uzantıyla açık bir silindirik hayvan muhafaza kullanır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: araç tarafından işlenmiş bir hayvandan (a) anomisin (100 mg/kg, subkutan) ile tedavi edilen bir hayvana göre, Tracer (B) uygulamadan 30 dakika önce temsili görüntüler. Protein sentezi oranları görüntüde karanlık düzeyine orantılı. Anisomisin bu yöntemin özgüllüğünü gösteren protein sentezinin ölçülen oranlarını büyük ölçüde azaltır. A 'nın sağ üst köşesindeki ölçek çubuğu 1 mm temsil eder ve her iki görüntü için de geçerlidir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: yaşlılık ampulünün (A, B), hipotalamus (C, D), Pons (E, F), serebellum (g) ve beyin kökü (g, H) seviyesinde uyanık davranan fareyle Digitized autoradiograms. Koyu bölgelerde daha yüksek rCPS vardır. Panel G 'deki ölçek çubuğu, sağ tarafta A, C, E ve G. Autoradiograms (B, D, F ve H) panolarına uygulanır, soldaki görüntülerde belirlenen alanlardan ve H panelinde ölçek çubuğunun B panellerine uygulanacağı genişlik görüntüler , D, F ve H. kısaltmalar aşağıdaki gibidir: FrA, frontal dernek korteks; OB, koku ampul; Ao, anterior koku çekirdeği; GL, glomerüler tabaka; EPL, Harici pleksiform tabakası; BLA, bazolateral amigdala; Pi, piramit hücre tabakası; dHi, dorsal Hippocampus; DG, dentat gyrus; MHb, medial habenula; RT, talamik retiküler çekirdeği; VMH, ventral medial hipotalamik çekirdeği; Yay, arcuat çekirdeği; EW, Edinger-Westphal çekirdeği; R, kırmızı çekirdek; PN, Pontine çekirdeği; ML, Moleküler tabaka; GL, granüler katman; PC, purkinje hücre katmanı; Cu, kama çekirdeği; AP, alan postrema; 10, vagus dorsal motor çekirdeği; 12, hipoglossal çekirdeği. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 6: frontal korteks (A) ve dorsal hipokampus (B) seviyesinde uyanık davranan kontrol faresindeki Digitized autoradiograms. Serebral protein sentezi oranları sağ üzerinde gösterilen renk çubuğuna göre görüntülerde renk kodlu. A 'nın sol alt köşesindeki ölçek çubuğu 1 mm temsil eder ve her iki görüntü için de geçerlidir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deneysel hayvanlarda serebral protein sentezinin (rCPS) bölgesel oranlarının belirlenmesi için nicel bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, varolan yöntemleri üzerinde önemli avantajları vardır: 1. ölçümler uyanık davranan hayvan yapılır, bu nedenle işleyen beyin devam eden süreçleri yansıtacak. 2. ölçümler, beynin tüm bölgelerinde ve alt bölgeyi aynı anda RCPS belirleme yeteneğini sağlayan nicel otoradyografi tekniklerinde yoluyla yapılır. 3. yöntemin kinetik modeli, doku proteini bozulması ve protein sentezi6için habercisi havuzu üzerindeki etkisi türetilen etiketli olmayan amino asitler geri dönüşüm olasılığını dikkate alır.
Bu yöntemin birincil sınırlama zaman alıcı ve zorlu olmasıdır. Daha basit ve daha yüksek verimlilik yöntemleri istihdam etmek cazip olsa da, elde edilen verilerin sınırlamaları kabul edilmelidir.
Sağlam bir fare içinde rCPS ölçme karmaşıklığı nedeniyle, normal bir fizyolojik durumun Bakımı ile ilgili sorunlar, yeterli kan örnekleri toplama, ve muhtemelen müdahale koşulları kaçınarak karşılaşılan olabilir. Venöz ve arter kateterinin cerrahi implantasyonu zordur. Herhangi bir cerrahi prosedür gibi, özellikle hassas damar işleme ile, hayvan mortalite için doğal bir risk vardır. Bizim için (yaklaşık% 1) nadirdir. Takip eden 22 h iyileşme döneminde, bazen (yaklaşık% 4) bir hayvan bir kateter dışarı çekecek. Ölçüm sırasında, kateterler patent ve hayvanların normal bir fizyolojik durumda olduğu önemlidir. Bizim son deneyimimizde, arteriyel kan hayvanların yaklaşık% 2 ve hayvanların yaklaşık% 1 ' i düşük hematokrit (<% 40) vardı toplanamaz veya düşük arter kan basıncı (< 85 mm Hg), cerrahi ve/veya iyileşme sırasında kan kaybını düşündürmektedir.
Autoradiography için beyin kısımlarının hazırlanması, Bölüm kalınlığının 20 μm olduğundan emin olmak önemlidir, çünkü bu kesit kalınlığı [14C] Metilmethacrylate standartları kalibre edilmiştir. Bu kusurları autoradiographic analiz müdahale edecek gibi, gözyaşı, kıvrımlar veya kabarcıklar olmadan, yani iyi kalite bölümleri sağlamak için dikkatli olun. Biz arka plan optik yoğunluğu düzensiz otomatik işleme aşağıdaki olabilir bulmak çünkü biz, otomatik bir film işlemcisi yerine elle autoradiographic filmler geliştirmek ve bu quantification etkileyebilir.
RCPS için denklemde, biz bir faktör, lambda (λ), bu arteriyel plazma gelen lösin kesir, kalan amino asitler doku protein bozulması elde edilen geri dönüşüm gelir içerir6. WT ve Fmr1 Ko (kırılgan X modeli) C57Bl/6J farelerinde ayrı deneylerde λ değerlendirmiştir ve değerinin 0,603 olduğunu göstermiştir. Λ değeri türler, genetik arka plan veya genetik mutasyonun varlığına bağlı olarak farklılık gösterebilir. Bu nedenle, diğer modellerde protein sentezi denemeleri tasarlarken, doğru bir ölçüm elde edilmeden önce λ değerlendirmesi gerekecektir.
Nörogelişimsel bozuklukların genetik fare modellerindeki çalışmalarımız, bu metodolojinin RCPS 'deki değişiklikleri bu modellerde ortaya koyduğunu ve bazı durumlarda farmakolojik tedavilere yapılan yanıtlarda22,23,25 , 26. aynı zamanda RCPS ölçümü de Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, kırılgan X tremor ataksi sendromu, travmatik beyin hasarı, vb modelleri gibi koşullarda beyinde dejeneratif değişiklikleri izleyebilir düşünülebilir Bu modeller, erken dejeneratif değişiklikler ve muhtemelen de erken müdahalelere yanıtlar izlemek mümkün olabilir. RCPS yöntemi, spesifik beyin değişikliklerini daha fazla incelemek için paralel bölümlerde immunohistokimya ile birlikte kullanılabilir25. Özetle, nicel autoradiographic L-[1-14C]-leucine yöntemi RCPS değerlerinin doğru belirlenmesi için idealdir. Mevcut yöntemlerle in vivo koşullarda doğruluk ve uygulanabilirlik açısından önemli avantajlar sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, ifşa etmek için ilgi çatışması yok.
Acknowledgments
Yazarlar, amino asitler ve filmlerin işlenmesi için fare, Tom burlin Genotipleme için zengyan Xia kabul etmek istiyorum, ve Mei Qin bazı RCPS deneyleri gerçekleştirmek için. Bu araştırma NIMH, ZıA MH00889 Intramural araştırma programı tarafından destekleniyordu. RMS ayrıca bir otizm konuşan doktora sonrası bursu 8679 ve FRAXA doktora sonrası bursu ile desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson Laboratory | 003024 | Fmr1 knockout breeding pairs |
| Anisomycin | Tocris Bioscience | 1290 | |
| Microhematocrit Tubes | Drummond Scientific | 1-000-3200-H | capillary tubes |
| Critoseal Capillary Tube Sealant | Leica Microsystems | 39215003 | sealant putty |
| Glass vial inserts | Agilent | 5183-2089 | used to collect blood samples |
| Digi-Med Blood Pressure Analyzer | Micro-Med Inc. | BPA-400 | blood pressure analyzer |
| Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System | Bayer Breeze | 9570A | glucose meter |
| Gastight syringe | Hamilton Co. | 1710 | tuberculin glass syringe |
| HeatMax HotHands-2 Hand Warmers | HeatMax | Model HH2 | warming pads |
| Heparin Lock Flush Solution | Fresenius Kabi USA, LLC | 504505 | heparin saline |
| Clear animal container | Instech | MTANK/W | animal enclosure |
| Spring tether | Instech | PS62 | catheter tube/rodent attachment |
| Swivel | Instech | 375/25 | hooks to spring tether |
| Swivel arm and mount | Instech | SMCLA | hooks to swivel and animal enclosure |
| Tether button | Instech | VAB62BS/22 | attaches to bottom of spring tether |
| Stainless steel tube | Made in-house | N/A | used to snake catheters through mouse |
| Matrx VIP 3000 | Matrx | 91305430 | isoflurane vaporizer |
| Isoflurane | Stoelting Co. | 50207 | isoflurane/halothane adsorber |
| Clippers | Oster Finisher | Model 59 | |
| Surgical skin hooks | Made in-house (??) | N/A (??) | |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | APP Pharmaceuticals LLC | 918610 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| UNIFY silk surgical sutures | AD Surgical | #S-S618R13 | 6-0 USP, non-absorbable |
| PE-8 polyethylene tubing | SAI Infusion Technologies | PE-8-25 | |
| Syringe | Becton Dickinson and Co. | 309659 | 1cc/mL |
| PE-10 polyethylene tubing | Clay Adams | 427400 | |
| MCID Analysis | Imaging Research Inc. | Version 7.0 | optical density analysis |
| Gelatin-coated slides (75x25mm) | FD Neurotechnologies | PO101 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Super RX-N medical x-ray film | Fuji | 47410-19291 | |
| Hypercassettes (8x10 in) | Amersham Pharmacia Biotech | 11649 | |
| [1-14C]leucine | Moravek | MC404E | |
| Microcentrifuge tube | Sarstedt Aktiengesellschaft & Co. | 72.692.005 | used to deproteinize blood samples |
| Glass pasteur pipette | Wheaton | 357335 | |
| Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | |
| Nitrogen | NIH Supply Center | 6830009737285 | |
| Scintillation fluid | CytoScint | 882453 | |
| Liquid scintilllation counter | Packard Tri-Carb | 2250CA | |
| Amino acid analyzer | Pickering Laboratories | Pinnacle PCX | |
| HPLC unit | Agilent Technologies | 1260 Infinity | include 1260 Bio-Inert Pump |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg | M650 | |
| Sulfosalicylic acid | Sigma-Aldrich | MKBS1634V | 5-sulfosalicylic acid dihydrate |
| Norleucine | Sigma | N8513 | |
| 1.0 N HCl | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| [H3]leucine | Moraevk | MC672 | |
| Falcon tube | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL conical centrifuge tubes |
| Stopwatch | Heuer Microsplit | Model 1000 | 1/100 min |
| Euthanasia Solution | Vet One | H6438 | |
| Northern Light Precision Illuminator | Imaging Research Inc. | Model B95 | fluorescent light box |
| Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 | Nikon | 1442 | CDD camera |
References
- West, A. E., et al. Calcium regulation of neuronal gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).
- Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. Basic Neurochemistry. , 6th ed, Lippincott-Raven. New York. (1999).
- Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265, 1104-1107 (1994).
- Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2. Science. 286, 785-790 (1999).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).
- Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).
- Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).
- Banker, G., Cotman, C. W. Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).
- Frerichs, K. U., et al. Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).
- Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep. The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).
- Nakanishi, H., et al. Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta. The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats. Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).
- Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei. Brain Research. 494, 155-158 (1989).
- Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats. The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).
- Smith, C. B., Yu, W. H. Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment. Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).
- Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).
- Nadel, J., et al. Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis. Brain Research. 1537, 125-131 (2013).
- Sun, Y., et al. Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development. The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).
- Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool. Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).
- Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats. Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).
- Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin. Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).
- Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome. Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).
- Qin, M., et al. Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).
- Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).
- Qin, M., et al. R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034 (2015).
- Qin, M., et al. Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation. ASN Neuro. 6, (2014).
- Smith, C. B., Kang, J. Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).
- Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats. Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).
