Summary
단백질 합성은 세포에 대 한 중요 한 생물학적 과정. 뇌에서는 적응 적 변화에 필요합니다. 그대로 뇌에서 단백질 합성의 속도의 측정은 신중한 방법론고려가 필요합니다. 여기에서 우리는 생체 내에서 대뇌 단백질 합성의 국소 비율의 측정을 위한 L-[1-14 C]-류신 정량적 자가 방사선 측정 방법을 제시한다.
Abstract
단백질 합성 개발 및 신경 기능의 유지 보수에 필요한 하 고 신 경계에 적응 변화에 관여. 더욱이, 신경계에서 단백질 합성의 dysregulation는 몇몇 발달 무질서에 있는 핵심 표현형일지도 모르다 생각됩니다. 동물 모델에서 대뇌 단백질 합성의 속도의 정확한 측정은 이러한 장애를 이해하는 데 중요합니다. 우리가 개발한 방법은 깨어 있는, 행동하는 동물의 연구 결과에 적용될 수 있도록 디자인되었습니다. 그것은 정량적 인 자가 방사선 사진 방법이므로 뇌의 모든 영역에서 동시에 속도를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 추적 아미노산, L-[1-14 C]-류신, 및 뇌에서 L-류신의 행동의 운동 모델의 사용에 기초한다. 우리는 L-[1-14 C]-leucine을 트레이서로 선택했는데, 이는 불필요한 라벨이 붙은 대사 산물로 이어지지 않기 때문입니다. 그것은 단백질로 통합되거나 급속하게 두뇌에 있는 표지되지 않은 CO2의 큰 풀에서 희석되는 14CO2를 산출하기 위하여 물질 대사로 변화됩니다. 상기 방법 및 모델은 또한 단백질 합성을 위한 조직 전구체 풀에 조직 단백질 분해로부터 유래된 표지되지 않은 류신의 기여를 허용한다. 이 방법은 세포와 신경 층뿐만 아니라 시상 하부 및 두개골 신경 핵에서 단백질 합성 속도를 결정하는 공간 해상도를 갖는다. 신뢰할 수 있고 재현 가능한 정량 적 데이터를 얻으려면 절차 세부 사항을 준수하는 것이 중요합니다. 여기에서 우리는 생체 내에서 단백질 합성의 국소 비율의측정을 위한 정량적인 자기 방사선 측정 L-[1-14 C]-leucine 방법의 상세한 절차를 제시합니다.
Introduction
단백질 합성은 신경계에서 장기적인 적응 변화에 필요한 중요한생물학적 과정1. 단백질 합성을 억제하는 것은 무척추 동물과 척추 동물모두에서 장기 기억 저장을 차단2 . 단백질 합성은 장기 적인 potentiation의 어떤 양식의 후기 단계의 유지보수에 필수적이다 (LTP) 장기 우울증 (LTD)3,개발 중 신경 생존4,그리고 뉴런과 그 시냅스 연결5. 뇌 단백질 합성의 속도의 측정 적응 변화 뿐만 아니라 신경 발달 장애 및 학습 및 메모리와 관련 된 장애를 공부 하는 중요 한 도구가 될 수 있습니다.
우리는 생체 내 생체 내 또는 뇌 조직의 시험관 내 제제에서 속도를 추정하는 다른 기술에 비해 내재된 이점을 제공하는 깨어있는동물에서 생체 내 대뇌 단백질 합성의 비율을 정량화하는 방법을 개발했습니다 6. 가장 중요한 것은 깨어있는 동물의 손상되지 않은 뇌의 측정에 대한 적용성입니다. 이것은 시 냅 스 구조와 장소에 사후 mortem 효과 대 한 걱정 없이 측정을 허용 하기 때문에 주요 고려 사항. 또한, 우리가 사용하는 정량적 자기 방사선 접근 방식은 공간 국소화의 높은 수준을 달성한다. 14C의 에너지는 우리가 세포 이하 또는 세포 수준에서 추적자를 현지화할 수 없는 반면, 우리는 세포 층및 시상 하부 핵과 같은작은 두뇌 지구에서 비율을 측정할 수 있습니다, 대략 25 μm 해결책 7.
방사성 추적자를 사용하여 생체 내 측정의 한 가지 과제는 방사성 표지가 반응하지 않은 표지 전구체 또는 기타 외부 표지 된 대사산물 6이 아닌 관심있는 반응의 산물인지 확인하는 것입니다. 우리는 단백질에 통합되거나 14CO2로 빠르게 대사되기 때문에 추적아미노산으로 L-[1-14 C]-leucine을 선택했는데, 이는 높은 비율로 인한 뇌의 라벨이 없는 CO2의 큰 풀에서 희석됩니다. 에너지 대사8. 더욱이, 단백질에 통합되지 않은 임의의 14C는주로 자유 [14 C]-류신으로 존재하며, 이는 60분 동안 실험 기간 동안, 조직6으로부터거의 전적으로 제거된다. 단백질은 그 때 포르말린을 가진 조직에 고정되고 그 후에 자과 방사선 촬영 의 앞에 어떤 자유로운[14C]leucine를 제거하기 위하여 물로 헹구는.
또 다른 중요한 고려 사항은 조직 프로테오분해로부터 유래된 표지되지 않은 아미노산에 의한 전구체 아미노산 풀의 특이적 활성의 희석의 문제이다. 우리는 성인 쥐와 마우스에서, 두뇌에 있는 단백질 종합을 위한 전구체 류신 풀의 대략 40%가 단백질분해에서 파생된 아미노산에서 온다는 것을 보여주었습니다 6. 이것은 대뇌 단백질 합성 (rCPS)의 지역 비율의 계산에 포함되어야 하고 이 관계가 변경될 수 있는 연구 결과에서 확인되어야 합니다. 이론적 기초와 방법의 가정은 다른 곳에서 자세히 제시되었다6. 이 문서에서는 이 방법론의 적용 절차 적 문제에 중점을 둡니다.
이 방법은 지상 다람쥐9,양10,rhesus 원숭이11,쥐12,13,14,15,16에서 rCPS의 결정에 사용되었습니다. , 17세 , 18세 , 19세 , 20개 , 도 21,뇌경화증 복합체(22)의 마우스 모델, 깨지기 쉬운 X 증후군23,24,25,26,깨지기 쉬운 X 전열 마우스(27) 및 페닐케톤뇨리아28의마우스 모델. 이 원고에서는 생체 내 자가 방사선 사진 L-[1-14 C]-류신방법을 사용하여 rCPS의 측정 절차를 제시합니다. 우리는 깨어 있는 대조군 마우스의 두뇌 지구에 있는 rCPS를 제시합니다. 우리는 또한 anisomycin의 생체 내 투여, 번역의 억제제, 뇌의 단백질 합성을 폐지 것을 보여줍니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
참고: 모든 동물 절차는 국립 정신 건강 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 동물의 관리 및 사용에 관한 국립 보건 원 지침에 따라 수행되었습니다.
프로토콜의 개요는 그림1에 표시됩니다.
1. 각각 추적자의 투여 및 시간 적 동맥 혈액 샘플의 수집을위해 대퇴 정맥과 동맥에 카테터를 외과적으로 이식합니다. 트레이서를 투여하기 전에 적어도 22 시간 동안 수술을 완료하십시오. 수술은 완료하는 데 약 1 h가 필요합니다.
- 필요한 재료 수집 : 멸균 수술 기구 (수술 가위, 마이크로 가위, 집게, 세 개의 수술 피부 후크), 이소플루란 마취 장비 (이소플루란 기화기, 활성 가스 청소, 밀봉 마취 챔버, 마취) 코 콘), 멸균 수술 단계, 모피 클리퍼, 70% 에탄올, 베타딘, 멸균 거즈, 수술 용 테이프, 상업용 핸드 워머, 수술 현미경, 멸균 0.9% 염화나트륨 (식염수), 멸균 헤파린 100 USP 단위/mL 0.9% 염화나트륨 (헤파린화) saline), 살균 5 20cm 스트립 6-0 흡수 성 봉합사, 멸균 25cm 가닥 PE-8 및 PE-10 폴리에틸렌 카테터 의 한 끝 컷 45o, 멸균 1 cc 주사기, 멸균 32 게이지 바늘, 소독 장비, 멸균 15-20cm 중공 스테인레스 스틸 로드(내부 직경 2.5mm, 외경 3mm), 국소 마취제(부피바카인 및 리도카인 연고), 스위블 부속품 설정이 있는 동물 인클로저(버튼, 스위블, 스위블 마운트 및 암, 20 X 13cm 클리어 원통형 컨테이너)를 참조하십시오.
- 수술을 위해 동물을 준비하십시오.
- 적절한 무균 및 멸균 기술이 기관에서 요구하는 대로 사용되도록 하십시오.
- 동물의 무게를 측정합니다. 성공적인 수술을 위해서는 동물이 25g 이상이어야 합니다.
- 밀봉 된 플렉시 유리 챔버 안에 동물을 놓고 이소플루란 마취 장치에 챔버를 연결합니다. 수컷의 경우 2.5L/min, O2에서는 1.5%의 여성의 경우 3.0L/min로유량을 설정합니다. 대략 2 분 후에 발가락 핀치로 철수 반사가 없어 마우스가 적절하게 진정되었는지 확인하십시오.
- 일단 진정되면, 챔버에서 마우스를 제거하고 마취 코 콘 내부의 얼굴과 경향이 위치에 누워. 코 콘을 설정하여 기화기에서 가스를 수신하고 가스 제거기로 가스를 반환합니다. 폐품이 숯 필터에 이소플루란을 포획합니다.
- 클리퍼를 사용하여 견갑골 사이에 털을 면도하십시오. 베타딘과 에탄올 스크럽을 세 번 번 갈아 입어 면도 부위를 제대로 소독하십시오.
- 마우스를 코 콘의 얼굴을 유지하면서 척추 위치로 뒤집습니다. 수술 단계에 왼쪽 다리를 테이프로 하고 클리퍼를 사용하여 왼쪽 허벅지에서 왼쪽 위 복부까지 털을 면도합니다. 베타딘과 에탄올 스크럽을 세 번 번 갈아 입어 면도 부위를 제대로 소독하십시오.
- 활성화된 상용 핸드워머를 마우스 아래에 거즈로 감싸십시오. 오른쪽 다리를 수술 단계에 테이프로 내려 보시고 수술 단계에 테이프를 바맞습니다.
- 카테터를 왼쪽 대퇴 정맥에 삽입합니다.
- 외과 현미경의 도움으로, 외과 가위를 사용하여 왼쪽 허벅지의 상부 내측 부분에서 중간선을 향해 rostrally로 1cm 절개를하여 대퇴 동맥과 정맥을 드러냅니다.
- 소포를 더 노출시키기 위하여 외과 피부 후크로 느슨한 피부를 철회하십시오.
- 적절한 수분을 유지하기 위해 노출된 부위에 멸균 0.9% 염화나트륨을 바르고 있습니다.
- 대퇴 동맥과 정맥의 작은 부분 주위에 결합 조직을 분리, 무딘 해부하는 집게를 사용합니다. 조심스럽게 동맥과 정맥을 분리하십시오(그림2).
- 절개의 가장 측면 지점에서 대퇴 정맥과 동맥 모두에서 흡수 성 봉합사 (스트랜드 A)의 한 가닥을 스레드하는 집게를 사용합니다. 봉합사를 중간에 당겨 끝이 고르도록 합니다.
- 사타구니에 더 근접 지점에서, 대퇴 정맥 에서만 두 번째 봉합사 (스트랜드 B)를 스레드하는 집게를 사용합니다. 혈류를 제한하는 데 사용되는 반 매듭을 부드럽게 묶습니다.
- 스트랜드 A와 스트랜드 B 사이의 지점에서, 포셉을 사용하여 대퇴 정맥 에서만 세 번째 봉합사 (스트랜드 C)를 스레드합니다. 혈류를 제한하는 데 사용되는 전체 매듭을 부드럽게 묶습니다. 정맥이 찢어지지 않도록 주의하십시오.
- 가닥 B를 부드럽게 잡아당겨 혈류를 제한합니다. 제한된 혈류를 유지하기 위해 스트랜드 B를 부드럽게 당기기 위해 지혈을 사용하십시오.
- 마이크로시저로 대퇴 정맥의 제한된 영역에 작은 구멍을 잘라 조심스럽게 가닥 B를 향해 PE-8 튜브의 각진 끝을 삽입 (이전에 헤파린 식염수로 플러시) 일단 삽입되면, 스트랜드 B의 장력을 풀어 내고 카테터를 정맥 위로 더 안내하십시오. 카테터를 포함하는 정맥 주위에 스트랜드 B를 조입니다.
- 스트랜드 C를 사용하여 카테터 주위에 매듭을 추가로 묶습니다. 이 매듭이 대퇴 동맥을 포착하지 않도록하십시오.
- 주사기 통을 부드럽게 당겨 튜브를 혈액으로 부분적으로 채워 카테터가 제대로 이식되었는지 확인합니다.
- 동일한 절차에 따라 왼쪽 대퇴 동맥에 PE-10 카테터를 삽입하십시오.
- 수술을 완료하십시오.
- 대퇴 정맥과 동맥 카테터가 모두 확보되면 스트랜드 A를 두 카테터 주위의 매듭으로 묶습니다.
- 여분의 봉합사를 잘라 피부 후크를 제거합니다. 동맥 카테터를 혈소판 식염수로 씻어 응고를 방지합니다. 두 카테터의 끝을 소작하여 씰을 만듭니다.
- 마우스를 경향 된 위치에 놓고 목 의 기저부에서 작은 절개를하고 노출 된 부위에 식염수를 적용하십시오.
- 목 절개에서 대퇴 절개까지 중공 금속 막대를 피하삽입합니다. 카테터를 속이 빈 막대를 통해 목 절개에서 빠져 나오십시오. 속이 빈 막대를 제거합니다. 카테터를 이식하면 마우스가 카테터를 손상시키는 것을 방지할 수 있습니다.
- 상처의 측면에 부피바카인을 바하십시오. 봉합사로 대퇴절개를 닫습니다. 리도카인 연고를 닫고 봉합된 상처 위에 넣습니다.
- 카테터를 30cm 의 유연한 중공 튜브 (스프링 테더)를 통해 뱀을 만들고 피부 아래 스프링 테더의 버튼을 봉합합니다. 상처의 측면에 부피바카인을 바하십시오. 피부 밑의 스프링 테더 버튼을 봉합합니다. 리도카인 연고를 닫고 봉합된 상처 위에 넣습니다.
- 마우스를 투명한 원통형 용기(높이 20cm, 직경 13cm)로 이동하여 회전 마운트와 팔을 사용하여 회복 기간 동안 동물을 수용합니다. 동물을 따뜻하게 유지하기 위해 용기 아래에 핸드 워머를 놓습니다.
- 스프링 테더의 상단을 회전으로 조이고 원통형 용기에 부착된 스위블 암에 스위블을 고정합니다. 마우스의 전체 범위와 카테터에 액세스 할 수 있는지 확인하십시오.
- 동물 인클로저 위에 회전 메커니즘을 방해하지 않는 슬롯 형 뚜껑을 놓습니다. 전체 설정은 그림 3을 참조하십시오.
- 마우스를 복구할 수 있습니다. 적어도 22 시간 권장.
2. L-[1-14C]류신 용액을 주입용으로 준비하고 플라즈마 시료를 탈백하기 위한 5-설포살리실산(SSA) 디하이드레이트 용액을 16% 준비합니다. SSA 용액에서, 또한 각각 0.04 mM norleucine 및1 μCi/mL [H 3]leucine을 아미노산 분석 및 산 수용성 플라즈마 분획내의 트레이서 농도의 분석을 위한 내부 표준으로서 포함한다. SSA를 4°C에서 최대 2개월까지 보관하십시오.
- 시판되는 L-[1-14 C]leucine (50-60 mCi/mmol)을 구입하여 2% 에탄올 또는 0.1 N HCl. 블로우 드라이 질소의 부드러운 스트림 하에서 트레이서의 알려진 활성을 건조시키고 멸균 정상 식염수용액으로 재구성 100 μCi/mL의 농도까지.
3. L-[1-14 C]류신을 정맥 내 로 관리하고 동맥 혈액 샘플을 수집합니다.
- 필요한 재료 수집: 18 1.5 mL 마이크로튜브 플라즈마 샘플 (각 튜브에 탈이온 수 70 mL 추가), 17 250mL 유리 바이알 인서트 (동맥 혈액 샘플 수집을위한 15 인서트 및 죽은 공간 혈액 수집을위한 2 개의 삽입 재주입. 여분의 불필요한 혈액의 수집을 제한하기 위해, 상급 플라즈마의 접근 가능한 파이펫팅을 허용하는 테이퍼 바닥이있는 작고 얇은 유리 바이알 삽입체, 2 개의 미세 모세관 튜브 (32 X 0.8mm, 헤마토크릿 측정용), 1 헤파린 및 리튬 불소 코팅 미세 원심 분리 튜브 (응고 및 당화 를 방지하기 위해 각각), hemostats (클램프가 PE 튜브를 손상시키지 않도록 타이곤 튜브로 팁을 덮으십시오), 혈당 모니터, 혈압 변환기, 1 mL 멸균 주사기 (용 식염수 플러시), 및 상업적으로 이용 가능한 안락사 용액 (탈이온수에서 1:1 희석 (마우스용))
- 실험 시작 시 동물이 정상적인 생리 상태에 있는지 확인하십시오.
- 끝에서 약 2cm 의 동맥 튜브를 고정하고 팁을 잘라 혈액이 흐를 수있는 구멍을 만듭니다. 그런 다음 튜빙을 풀고 죽은 공간 혈액 ((c. 30 mL)을 수집하여 이전 무승부에서 잔류 식염수 및 / 또는 혈액을 수집하고, 별도의 튜브에서 대조군 샘플 (약 30 μL), 헤마토크 샘플 (모세관 부피의 약 절반) 및 포도당을 수집합니다. (약 20 μL).
- 4500 x g에서 1 분 동안 실란트 퍼티와 원심 분리기로 한쪽 끝을 연결하여 혈정을 측정하십시오. 동물이 30 % 미만의 혈전이있는 경우 연구를 계속하지 마십시오.
- 시판되는 혈액 포도당 모니터를 사용하여 혈액 한 방울의 포도당 수준을 측정합니다.
- 18,000 x g에서 2분 동안 원심분리기 제어 샘플을 분리하여 플라즈마를 분리합니다. 다음과 같이 플라즈마 샘플을 채소화: 1.5 mL 마이크로튜브에 70 μL의 탈이온수에 5 μL의 플라즈마를 추가하고 16% SSA 용액 및 와류의 25 μL을 추가합니다. 드라이 아이스에 얼기 전에 30 분 동안 얼음에 놓습니다.
- 정맥 라인을 통해 동물에게 죽은 공간 혈액을 반환, 과잉 혈액 손실을 방지하기 위해 헤파린 식염수 플러시 다음.
- 동맥 라인을 혈압 변환기에 연결하여 평균 동맥 혈압을 측정합니다.
- 샘플을 채취한 후 동맥 라인을 다시 클렌하고 헤파린식 식염수의 작은(50 mL) 부피로 라인을 플러시해야 합니다.
- 트레이서를 정맥 내 투여하고 시간 시간 적 동맥 혈액 샘플을 수집합니다.
- Y 커넥터를 사용하여 트레이서(100μCi/kg)와 50mL 멸균 식염수로 한 주사기를 부착하여 트레이서 주입 후 정맥 라인을 세척합니다. 정맥 선에 Y 커넥터를 연결합니다.
- 스톱 워치를 동시에 시작하고 트레이서를 주입하여 스터디를 시작합니다. 주입 직후 식염수 (c. 100mL)로 정맥 라인을 씻어 내보하십시오.
- 동일한 방식으로 실험의 처음 2분 동안 1-7회 연속으로 혈액 샘플을 수집한다. 7번째 시료를 채취한 후, 남은 각 시료 보다 30 μL 의 죽은 공간 혈액을 채취하였다. 샘플 8-14는 각각 3, 5, 10, 15, 30, 45 및 60분에서 수집된다.
- 수집 직후 혈액 샘플을 처리하고, 대조군 샘플에 대해 기재하였다. 지연이 있는 경우 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 동맥 카테터를 통해 동맥에 죽은 공간 혈액을 조심스럽게 재주입하고 헤파린 식염수로 씻어 내보하십시오.
- 실험 중 어느 시점에서, 25 μL 16% SSA, 0.04 mM norleucine 및 1 mCi/mL[3H]leucine을 75 μL 물, 소용돌이 및 얼음 위에 두어 세 가지 내부 표준을 처리합니다.
- 60분에서 14번째 시료를 채취한 후, 약 0.2 mL의 B-안락사-D를 정맥라인에 주입하여 동물을 안락사시한다. 죽음의 시간을 기록한다.
- 스위블 마운트에서 동물을 풀고 동물 인클로저에서 제거합니다. 조심스럽게 뇌를 제거하고 알루미늄 호일에 놓고 드라이 아이스에 얼립니다. 뇌가 갈라질 수 있기 때문에 액체 질소로 뇌를 동결시키지 마십시오. 브레인, 샘플 및 내부 표준을 처리 준비가 될 때까지 -80°C에서 보관하십시오. 처리는 나중에 언제든지 수행 할 수 있습니다.
4. 혈장 샘플에서 류신 과 L-[1-14C]의 농도를 분석합니다.
- 2 °C에서 5 분 동안 얼음, 소용돌이 및 원심 분리기 18,000 x g에 대한 샘플 및 내부 표준을 해동하십시오. 상급 분획은 자유 표지 및 비표지 류신을 포함합니다.
- 상급제 40 μL을 액체 진미 바이알에 옮기고 신틸레이션 칵테일을 추가합니다. 액체 번지 계수 계수 및 동시 이중 라벨(3H 및 14C)계수를 위해 설계된 담금질 곡선을통해 3H및 14C의분당 붕해(DPM)를 정량화합니다.
- 혈장 류신 농도를 정량화하려면 나트륨 양이온 교환 컬럼이 있는 HPLC 시스템을 사용하고 o-phthaldehyde 및 형광 검출을 사용한 포스트 컬럼 유도체화를 사용합니다.
- HPLC를 다음 사양으로 설정합니다: 330 nm의 형광계 여기 및 465 nm의 방출. 이월상은 용루나트륨, pH 7.40 및 용루나트륨 + 5% 설폴란, pH 3.15로 구성된다. 완충유량 0.400 mL/min 및 파생계 기기 유량을 0.300 mL/min로 설정합니다.
- 30~500pmol/10mL 사이의 다양한 아미노산 농도(놀레우신 포함)로 시스템을 교정합니다. 보정 곡선은 선형입니다. 시험된 10 mL 주입 샘플의 아미노산 농도는 이 교정 곡선의 범위 내에 속합니다.
5. 정량적 자가 방사선 을 수행합니다.
- 자가 방사선 촬영에 대한 두께 20 μm뇌 섹션을 준비합니다. -20 °C에서 저온 극저온에 의해 뇌를 절하.
- 젤라틴 코팅 슬라이드에 직렬 뇌 섹션을 태동합니다. 공기 건조.
- 10% 포르말린을 5번 변경하여 30분 동안 세척한 다음, 1시간 동안 탈이온수의 연속흐름을 따라 미끄럼을 호일로 느슨하게 덮어 먼지를 피하고 24시간 동안 건조시도록 합니다.
- 엑스레이 필름 카세트 (20X25cm 유방 조영술 필름에 맞는 카세트권장)에 슬라이드를 정렬하고[14C]메틸 메타 크릴레이트 표준 세트와 함께 이전에 알려진 14C 농도의 조직에 대해 보정되었습니다. 설명29. 표준은 상업적으로 구입할 수 있지만 조직의 2-300 mCi /g 범위를 커버하고 20 μm 조직 두께에 대해 교정되도록 보장합니다. 빨간 안전 등 아래에서 유방 조영술 필름, 에멀젼 측면을 섹션 위에 놓습니다.
- 카세트를 밀봉하고 검은 색 교환 가방에 넣고 40-45 일 동안 캐비닛에 보관하십시오.
- 제조업체의 지시에 따라 필름을 개발합니다. 참고: 배경이 고르지 않고 정량화에 영향을 줄 수 있으므로 자동 필름 개발은 권장되지 않습니다.
6. 이미지를 분석합니다.
참고: CCD 카메라와 형광등 상자와 함께 이미지 분석을 위한 상용 프로그램을 권장합니다. 조명 필름의 상대 광학 밀도는 CCD 카메라에 의해 감지됩니다.
- 필름 상에서 교정된 표준 세트의 ODs에 기초하여 광학 밀도(OD) v. 조직 14C농도의 교정 곡선을 구성한다. 이러한 데이터(공백 또는 배경 포함)를 다항식 방정식에 맞춥니다. 두 번째 또는 세 번째 다항식 방정식은 매우 잘 맞습니다.
- 특정 뇌 영역을 분석하려면 뇌 지도기준과 비교하여 6~8개의 섹션에서 관심 영역(ROI)을 찾습니다. 모든 섹션에서 ROI 내에서 픽셀의 OD를 기록하고 교정 곡선을 기반으로 각 픽셀에서 조직 14C농도를 계산합니다. ROI에서 평균 조직 14C농도를 계산합니다.
7. rCPS의 계산. 다음 방정식을 통해 각 ROI에서 rCPS를 계산합니다.
여기서 P*(T)는 ROI에서 14C의가중 평균 조직 농도, Cp(t)및 C*p(t)는 당시의 라벨이 부착되지 않은 및 표지된 류신의 동맥 혈장 농도이며, t는 동물이 죽은 시간( 약 60 분), 및 λ는 혈장으로부터 오는 조직 전구체 풀에서 류신의 분율이다. λ의 평가는 별도의 실험 6에서수행된다. λ는 WT, Fmr1 녹아웃, Tsc+/-및 PKU 마우스 6,22,25,28에서평가되었다. 실험이 단백질 합성, 분해 또는 류신의 대사율에 영향을 미칠 수 있는 유전적 또는 약리학적 변화를 수반하는 경우, λ는 새로운 조건하에서 평가되어야 한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
여기서 우리는 rCPS에 대한 단백질 합성 억제제의 사전 투여의 효과를 입증하는 대표적인 실험을 보여준다. 정상 식염수에서 의 아니소마이신은 rCPS 결정의 개시 30분 전에 성인 C57/BL6 남성 야생형 마우스피하(100 mg/kg)를 피하투여하였다. 비무장 대조군 동물에 비해 애니소마이신 처리의 효과는 rCPS가 아니소마이신 처리 마우스에서 거의 검출할 수 없다는 것을 보여준다(도 4). 이들 데이터는 생체 내 자가방사선 측정L-[1-14 C]-류신 방법이 뇌에서 단백질 합성의 비율을 측정한다는 검증을 나타낸다.
우리는 방법의 해상도를 설명하기 위해 뇌의 네 가지 수준에서 L-[1-14C]-leucine자가 라디오 그램의 그림을 제시한다 (그림 5). 도시된 것은 후각 전구내의 세포층(도5A 및 B),해마(도5C),및 소뇌(도 5G)이다. 시상 하부의 핵(그림 5D),폰(그림 5E 및 F),및 뇌 줄기 (그림5H)는또한 자가 방사성 도에서 명확하게 볼 수 있습니다. 우리는 또한 전형적인 대조군 동물의 전두엽 피질(5.88 nmol/g/min)(도6A)및 등쪽 해마(5.35 nmol/g/min)에서 단백질 합성의 정량적 국소 비율을 나타낸다.
도 1: 전체 rCPS 프로토콜의 단계를 나타내는 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 노출된 대퇴 동맥 및 대퇴 정맥의 이미지. 서로 평행하게 누워, 대퇴 동맥은 대퇴 정맥 위에 표시됩니다. 대퇴 정맥은 또한 대퇴 동맥 보다 더 깊은 붉은 색. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: rCPS 실험을 위한 권장 동물 인클로저 설정 이미지. 스프링 밧줄에 연결된 스위블 부속기와 함께 선명한 원통형 동물 인클로저를 활용합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 히서(B)를 투여하기 30분 전에 아니소마이신(100 mg/kg, 피하)으로 처리된 동물과 비교하여 비히클 처리된 동물(A)의 대표적인 이미지. 단백질 합성의 비율은 심상에 있는 암흑의 수준에 비례합니다. Anisomycin은 이 방법의 특이성을 나타내는 단백질 합성의 측정 속도를 크게 감소시킵니다. A의 오른쪽 상단에 있는 축척 막대는 1mm를 나타내며 두 이미지모두에 적용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 후각 전구(A, B), 시상 하부(C, D), 폰(E, F), 소뇌(G) 및 뇌줄기(G, H)의 수준에서 깨어 있는 마우스로부터 디지털화된 자가 라디오그램. 어두운 영역은 rCPS가 더 높습니다. 패널 G의 배율 표시줄은 오른쪽 패널 A, C, E 및 G. 자동 라디오그램(B, D, F 및 H)에 적용되며 왼쪽이미지에 지정된 영역에서 이미지가 확대되고 패널 H의 배율 표시줄이 패널 B에 적용됩니다. , D, F 및 H. 약어는 다음과 같습니다: FrA, 전두엽 협회 피질; OB, 후각 전구; AO, 전방 후각 핵; Gl, 사구체 층; EPl, 외부 플렉시폼 층; BLA, 횡각 편도체; py, 피라미드 세포 층; dHi, 등쪽 해마; DG, 덴테이트 자이러스; MHb, 내측 하베눌라; Rt, 탈라믹 망상 핵; VMH, 복부 내측 시상하부 핵; 아크, 아쿠아테 핵; EW, 에딩거-웨스트팔 핵; R, 적핵; PN, 폰틴 핵; ML, 분자층; GL, 과립 층; PC, 푸르킨제 세포층; Cu, 큐니트 핵; AP, 지역 포스트레마; 도 10, 미주 등쪽 모터 핵; 12, 저형성 핵. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 전두엽 피질(A) 및 등쪽 해마(B)의 수준에서 깨어 있는 행동 제어 마우스로부터 디지털화된 자가 라디오그램. 대뇌 단백질 합성의 비율은 오른쪽에 표시된 색상 막대에 따라 이미지에서 색상 코딩됩니다. A의 왼쪽 하단에 있는 축척 막대는 1mm를 나타내며 두 이미지모두에 적용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
우리는 실험 동물에서 생체 내 대뇌 단백질 합성 (rCPS)의 국소 비율의 측정을위한 정량적 방법을 제시한다. 이 방법은 기존 방법에 비해 상당한 장점이 있습니다 : 1. 측정은 깨어 있는 동물에서 이루어지므로 기능하는 뇌의 지속적인 프로세스를 반영합니다. 2. 측정은 동시에 뇌의 모든 영역과 하위 영역에서 rCPS를 결정할 수있는 능력을 제공하는 양적 자가 방사선 촬영에 의해 이루어집니다. 3. 이 방법의 운동 모델은 조직 단백질 분해에서 파생 된 표지되지 않은 아미노산의 재활용 가능성과 단백질 합성을위한 전구체풀에 미치는 영향을 고려합니다 6.
이 방법의 주요 제한 사항은 시간이 많이 걸리고 까다롭다는 것입니다. 더 간단하고 높은 처리량 방법을 사용하는 것은 유혹적이지만, 얻은 데이터의 한계를 인정해야 합니다.
온전한 마우스에서 rCPS를 측정하는 복잡성 때문에 정상적인 생리 적 상태의 유지 보수, 적절한 혈액 샘플을 수집하고 방해 할 수있는 조건을 피하는 문제가 발생할 수 있습니다. 정맥 및 동맥 카테터의 외과 이식은 도전적입니다. 모든 외과 적 수술과 마찬가지로, 특히 섬세한 혈관 구조의 처리와 마찬가지로 동물의 사망에 대한 내재 된 위험이 있습니다. 우리에게는 드물다 (약 1 %). 계속되는 동안 22 시간 회복 기간, 때때로 (약 4%) 동물이 카테터를 꺼냅니다. 측정 하는 동안 카 테 터는 특허 이며 동물은 정상적인 생리 상태에 있는 것이 중요 하다. 우리의 최근 경험에서, 동맥 혈액은 동물의 약 2 %에서 수집 할 수 없으며 동물의 약 1 %는 낮은 혈취를 가지고 있었다 (< 40%) 또는 낮은 동맥 혈압 (< 85 mm Hg), 수술 및 복구 중 혈액 손실을 제안.
자가 방사선 촬영에 대한 뇌 섹션의 준비에서, 그 섹션 두께[14C]메틸 메타 크릴레이트 표준이 보정 된 섹션 두께이기 때문에 단면 두께가 20 μm인지 확인하는 것이 중요하다. 이러한 결함이 자가 방사선 분석을 방해하기 때문에 눈물, 접기 또는 거품없이 양질의 섹션을 보장하기 위해 주의를 기울이세요. 우리는 배경 광학 밀도가 자동화 된 처리에 따라 고르지 않을 수 있으며, 이것은 정량화에 영향을 미칠 수 있기 때문에 우리는 자동 필름 프로세서보다는 손으로 자기 방사선 필름을 개발한다.
rCPS에 대한 방정식에서, 우리는 인자, 람다 (λ), 즉 동맥 혈장으로부터 오는 류신의 분획을 포함하며, 나머지는 조직 단백질 분해로부터유래된 아미노산의 재활용으로부터 온다 6. 우리는 WT 및 Fmr1 KO (깨지기 쉬운 X 모델) C57Bl/6J 마우스에서 별도의 실험에서 λ를 평가하고 그 값이 0.603임을 보여주었다. λ의 값은 종, 유전 적 배경 또는 유전 돌연변이의 존재에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서 다른 모델에 대한 단백질 합성 실험을 설계하는 경우 정확한 측정을 얻기 전에 λ를 평가해야 합니다.
신경 발달 장애의 유전 마우스 모형에 있는 우리의 일은 이 방법론이 이 모형에 있는 rCPS에있는 변경을 제시하고 어떤 경우에는 약리학 처리에 대한 반응을 22,23,25는 보여줍니다 , 26. 또한 rCPS 측정은 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 연약한 X 떨림 운동 실조 증후군, 외상성 뇌 손상 등의 모델과 같은 조건에서 뇌의 퇴행성 변화를 모니터링 할 수 있다고 생각할 수 있습니다. 이러한 모델, 그것은 초기 퇴행 성 변화를 추적 하 고 아마도 또한 초기 개입에 대 한 응답을 추적 할 수 있습니다. rCPS 방법은 병렬 섹션에서 면역 조직 화학과 함께 사용하여 특정 뇌 변화25를더 검사 할 수 있습니다. 요약하면, 정량적 자가 방사선 측정L-[1-14 C]-류신 방법은 생체 내 rCPS 값의 정확한 측정에 이상적입니다. 기존 방법에 비해 생체 내 조건에 대한 정확성 및 적용성 측면에서 상당한 이점을 제공합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개할 이해상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 생쥐의 게노티핑에 대한 젠젠시아, 아미노산 및 필름의 처리를 위한 톰 벌린, 그리고 일부 rCPS 실험을 수행하기 위한 메이진을 인정하고자 한다. 이 연구는 NIMH, ZIA MH00889의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다. RMS는 또한 자폐증 말하기 박사 후 펠로우십 8679 및 FRAXA 박사 후 펠로우십에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson Laboratory | 003024 | Fmr1 knockout breeding pairs |
| Anisomycin | Tocris Bioscience | 1290 | |
| Microhematocrit Tubes | Drummond Scientific | 1-000-3200-H | capillary tubes |
| Critoseal Capillary Tube Sealant | Leica Microsystems | 39215003 | sealant putty |
| Glass vial inserts | Agilent | 5183-2089 | used to collect blood samples |
| Digi-Med Blood Pressure Analyzer | Micro-Med Inc. | BPA-400 | blood pressure analyzer |
| Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System | Bayer Breeze | 9570A | glucose meter |
| Gastight syringe | Hamilton Co. | 1710 | tuberculin glass syringe |
| HeatMax HotHands-2 Hand Warmers | HeatMax | Model HH2 | warming pads |
| Heparin Lock Flush Solution | Fresenius Kabi USA, LLC | 504505 | heparin saline |
| Clear animal container | Instech | MTANK/W | animal enclosure |
| Spring tether | Instech | PS62 | catheter tube/rodent attachment |
| Swivel | Instech | 375/25 | hooks to spring tether |
| Swivel arm and mount | Instech | SMCLA | hooks to swivel and animal enclosure |
| Tether button | Instech | VAB62BS/22 | attaches to bottom of spring tether |
| Stainless steel tube | Made in-house | N/A | used to snake catheters through mouse |
| Matrx VIP 3000 | Matrx | 91305430 | isoflurane vaporizer |
| Isoflurane | Stoelting Co. | 50207 | isoflurane/halothane adsorber |
| Clippers | Oster Finisher | Model 59 | |
| Surgical skin hooks | Made in-house (??) | N/A (??) | |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | APP Pharmaceuticals LLC | 918610 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| UNIFY silk surgical sutures | AD Surgical | #S-S618R13 | 6-0 USP, non-absorbable |
| PE-8 polyethylene tubing | SAI Infusion Technologies | PE-8-25 | |
| Syringe | Becton Dickinson and Co. | 309659 | 1cc/mL |
| PE-10 polyethylene tubing | Clay Adams | 427400 | |
| MCID Analysis | Imaging Research Inc. | Version 7.0 | optical density analysis |
| Gelatin-coated slides (75x25mm) | FD Neurotechnologies | PO101 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Super RX-N medical x-ray film | Fuji | 47410-19291 | |
| Hypercassettes (8x10 in) | Amersham Pharmacia Biotech | 11649 | |
| [1-14C]leucine | Moravek | MC404E | |
| Microcentrifuge tube | Sarstedt Aktiengesellschaft & Co. | 72.692.005 | used to deproteinize blood samples |
| Glass pasteur pipette | Wheaton | 357335 | |
| Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | |
| Nitrogen | NIH Supply Center | 6830009737285 | |
| Scintillation fluid | CytoScint | 882453 | |
| Liquid scintilllation counter | Packard Tri-Carb | 2250CA | |
| Amino acid analyzer | Pickering Laboratories | Pinnacle PCX | |
| HPLC unit | Agilent Technologies | 1260 Infinity | include 1260 Bio-Inert Pump |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg | M650 | |
| Sulfosalicylic acid | Sigma-Aldrich | MKBS1634V | 5-sulfosalicylic acid dihydrate |
| Norleucine | Sigma | N8513 | |
| 1.0 N HCl | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| [H3]leucine | Moraevk | MC672 | |
| Falcon tube | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL conical centrifuge tubes |
| Stopwatch | Heuer Microsplit | Model 1000 | 1/100 min |
| Euthanasia Solution | Vet One | H6438 | |
| Northern Light Precision Illuminator | Imaging Research Inc. | Model B95 | fluorescent light box |
| Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 | Nikon | 1442 | CDD camera |
References
- West, A. E., et al. Calcium regulation of neuronal gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).
- Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. Basic Neurochemistry. , 6th ed, Lippincott-Raven. New York. (1999).
- Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265, 1104-1107 (1994).
- Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2. Science. 286, 785-790 (1999).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).
- Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).
- Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).
- Banker, G., Cotman, C. W. Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).
- Frerichs, K. U., et al. Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).
- Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep. The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).
- Nakanishi, H., et al. Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta. The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats. Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).
- Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei. Brain Research. 494, 155-158 (1989).
- Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats. The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).
- Smith, C. B., Yu, W. H. Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment. Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).
- Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).
- Nadel, J., et al. Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis. Brain Research. 1537, 125-131 (2013).
- Sun, Y., et al. Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development. The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).
- Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool. Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).
- Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats. Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).
- Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin. Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).
- Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome. Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).
- Qin, M., et al. Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).
- Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).
- Qin, M., et al. R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034 (2015).
- Qin, M., et al. Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation. ASN Neuro. 6, (2014).
- Smith, C. B., Kang, J. Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).
- Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats. Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).
