Summary
Синтез белка является критическим биологическим процессом для клеток. В головном мозге он необходим для адаптивных изменений. Измерение темпов синтеза белка в нетронутом мозге требует тщательного методологического рассмотрения. Здесь мы представляем количественный авторадиографический метод L-1-14C-leucine для определения региональных показателей синтеза церебрального белка in vivo.
Abstract
Синтез белка необходим для развития и поддержания нейронной функции и участвует в адаптивных изменениях в нервной системе. Кроме того, считается, что дисрегуляция синтеза белка в нервной системе может быть основным фенотипом при некоторых нарушениях развития. Точное измерение темпов синтеза мозгового белка в животных моделях имеет важное значение для понимания этих расстройств. Разработанный мы метод был разработан для изучения бодрствования, ведут себя животные. Это количественный авторадиографический метод, поэтому он может давать ставки во всех регионах мозга одновременно. Метод основан на использовании аминокислоты трассировщика, L-1-14C-leucine, и кинетической модели поведения L-лейцина в головном мозге. Мы выбрали L-1-14C-leucine в качестве трассировщика, потому что это не приводит к посторонним помеченным метаболическим продуктам. Он либо включен в белок, либо быстро метаболизируется, чтобы дать 14CO2, который разбавляется в большом пуле немаркированного CO2 в головном мозге. Метод и модель также позволяют вносить немаркированный лейцин, полученный из протеолиза тканей, в пул прекурсоров тканей для синтеза белка. Метод имеет пространственное разрешение для определения темпов синтеза белка в клеточных и нейропиловых слоях, а также гипоталамических и черепных нервных ядер. Для получения надежных и воспроизводимых количественных данных важно придерживаться процедурных деталей. Здесь мы представляем подробные процедуры количественного авторадиографического l-1-14C-leucine метод для определения региональных показателей синтеза белка in vivo.
Introduction
Синтез белка является важным биологическим процессом, необходимым длядолгосрочных адаптивных изменений в нервной системе 1. Ингибирование синтеза белка блокирует длительное хранение памятикак у беспозвоночных, так и у позвоночных 2. Синтез белка необходим для поддержания поздних фаз некоторых форм долгосрочного потенции (ЛТП) и длительной депрессии (LTD)3, выживаемости нейронов при разработке4,а также для общего поддержания нейрона и его синаптические соединения5. Измерение темпов синтеза белка мозга может быть важным инструментом для изучения адаптивных изменений, а также нейроразвития расстройств и расстройств, связанных с обучением и памятью.
Мы разработали метод количественной оценки темпов синтеза церебрального белка in vivo в бодрствующих животных, который предлагает присущие преимущества по сравнению с другими методами, которые оценивают скорость в ex vivo или in vitro препаратов ткани мозга6. В первую очередь применимость к измерениям в нетронутом мозге у бодрствуем животного. Это ключевое соображение, поскольку оно позволяет измерения с синаптической структуры и функции на месте и без опасений по поводу посмертного эффектов. Кроме того, количественный авторадиографический подход, который мы используем, достигает высокой степени пространственной локализации. В то время как энергия 14C такова, что мы не можем локализовать трассировщик на субклеточном или клеточном уровне, мы можем измерить скорость в слоях клеток и небольших областях мозга, таких как гипоталамические ядра, примерно с разрешением 25 мкм7.
Одна из задач in vivo измерений с радиотизмерителями заключается в том, чтобы гарантировать, что радиомаркировка измеряется в продукте реакции интереса, а не неотреагированы помечены предшественником или других посторонних помечены метаболических продуктов6. Мы выбрали L-1-14C-leucine в качестве аминокислоты трассировщика, потому что она либо включена в белок, либо быстро метаболизируется до 14CO2, которая разбавляется в большом пуле немаркированного CO2 в мозге в результате высокой скорости энергетический метаболизм8. Кроме того, любой 14C не включены в белок существует в первую очередь как свободный -14C-leucine, который в течение 60 минут экспериментального периода, почти полностью очищены от ткани6. Белки затем фиксируются в ткани с формалином, а затем промыть водой, чтобы удалить любые свободные14C-leucine до авторрадиографии.
Другим важным соображением является вопрос о разбавлении специфической активности аминокислотного пула прекурсоров немаркированными аминокислотами, полученными из протеолиза тканей. Мы показали, что у взрослых крыс и мышей, около 40% из резерва лейцина бассейн для синтеза белка в мозге происходит от аминокислот, полученных из белка распада6. Это должно быть включено в расчет региональных показателей синтеза церебрального белка (rCPS) и должно быть подтверждено в исследованиях, в которых эта взаимосвязь может измениться. Теоретическая основа и предположения метода были подробно представлены в другом месте6. В настоящем документе мы сосредоточиваемся на процедурных вопросах применения этой методологии.
Этот метод был использован для определения rCPSу сусликов 9, овец10, ресус обезьян11, крыс12,13,14,15,16 , 17 Лет , 18 лет , 19 лет , 20 , 21, мышь модель туберозного склероза комплекса22, мышь модель хрупкого синдрома X23,24,25,26, хрупкие X перестановки мышей27, и мышиная модель фенилкетонурии28. В этой рукописи мы представляем процедуры измерения rCPS с помощью метода in vivo авторадиографического L-1-14C-leucine. Мы представляем rCPS в областях мозга пряткать мышь управления. Мы также демонстрируем, что in vivo введение анисомицина, ингибитора перевода, отменяет синтез белка в головном мозге.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Все процедуры для животных были одобрены Национальным институтом охраны здоровья животных и используются в соответствии с Национальными институтами здравоохранения Руководящие принципы по уходу и использованию животных.
Обзор протокола представлен на рисунке 1.
1. Хирургически имплантированные катетеры в бедренной вены и артерии для введения трассировщика и сбора приурочен ных железистых образцов крови, соответственно. Полная операция по крайней мере 22 ч до введения трассировщика. Хирургия требует около 1 ч для завершения.
- Сбор необходимых материалов: стерильные хирургические инструменты (хирургические ножницы, микро-ножницы, щипцы, три хирургических кожных крючка), оборудование для изофрурановой анестезии (изофруранизатор, активный газовый мусорщик, герметичная анестезия, анестезия носовой конус), стерильная стадия хирургии, меховые ножницы, 70% этанол, бетадин, стерильная марля, хирургическая лента, коммерческие подогреватели рук, хирургический микроскоп, стерильный хлорид натрия 0,9% (солин), стерильный гепарин 100 единиц USP/mL в 0,9% хлорид натрия (гепаринизованный солевой), стерильные пять 20-сантиметровых полос 6-0 поглощаемых швов, стерильные 25-сантиметровые нити PE-8 и PE-10 полиэтиленовых катетеров с одним концом, вырезанным на 45o,стерильные 1 см шприцы, стерильные 32 калибровочные иглы, каутери, стерильные 15-20 см полые нерябные нероставные неристы стальной стержень (2,5 мм внутри диаметра, 3 мм внешнего диаметра), местная анестезия (бупивакаин и мазь лидокаина) и корпус для животных с установкой поворотного придатка (30 см пружинного троса с кнопкой, поворот, поворот, поворотное крепление и рука, 20 X 13 см прозрачная цилиндрическая контейнер).
- Подготовьте животное к операции.
- Убедитесь, что надлежащие асептические и стерильные методы используются в соответствии с требованиями вашего учреждения.
- Взвесьте животное. Для успешной операции животное должно быть не менее 25 г.
- Поместите животное в запечатанную оргстекла камеры и подключить камеру к изофруран анестезии аппарата. Установите скорость потока до 2,5 л/мин для мужчин и 3,0 л/мин для самок 1,5% изофлуран в O2. После примерно 2 мин, убедитесь, что мышь надлежащим образом успокоительное отсутствие вывода рефлекс с ногой щепотку.
- После успокоительного, удалить мышь из камеры и положить его в лоное положение с лицом внутри конуса носа анестезии. Настройка нос конуса для получения газа из испарителя и вернуть газ в газовый мусорщик. Мусорщик захватит изолюран в угольный фильтр.
- Используйте ножницы для бритья меха между лопатками. Убедитесь в том, чтобы должным образом стерилизовать бритую область, чередуя три раза между бетадином и этанола скрабы.
- Переверните мышь в положение на спине, удерживая лицо в конусе носа. Лента вниз левой ногой на стадии операции и использовать клиперы для бритья меха от левого внутреннего бедра в верхней левой части живота. Убедитесь в том, чтобы должным образом стерилизовать бритую область, чередуя три раза между бетадином и этанола скрабы.
- Сдвиньте активированный коммерчески доступный handwarmer, завернутый в марлю, под мышью. Лента вниз правой ногой на стадии операции.
- Вставьте катетер в левую бедренную вену.
- С помощью хирургического микроскопа, использовать хирургические ножницы, чтобы сделать 1 см разрез из верхней медиальной части левого бедра розово к средней линии, выявление бедренной артерии и вены.
- Уречку свободной кожи с хирургическими крючками кожи для дальнейшего подвергать пузырьки.
- Нанесите стерильные 0,9% хлорида натрия в подверженную области для поддержания адекватной влажности.
- Используйте щипчьидлями, чтобы тупопретировать, разделяя соединительную ткань вокруг небольшой части бедренной артерии и вены. Осторожно, разделите артерию и вену(рисунок 2).
- Используйте щипцы для резьбы одной нити абсорбируемого шва (Strand A) под бедренной веной и артерией в самой боковой точке разреза. Потяните шов на полпути через так концы равны.
- В более проксимальной точке паха, используйте щипцвы, чтобы резьба второй шов (Strand B) только под бедренной вены. Аккуратно завязать половину узла, который будет использоваться для ограничения кровотока.
- В точке между Strand A и Strand B, используйте щипчинки, чтобы резьба третий шов (Strand C) только под бедренной вены. Аккуратно завязать полный узел, который будет использоваться для ограничения кровотока. Будьте осторожны, чтобы не рвать вены.
- Аккуратно буксир на Strand B, чтобы ограничить кровоток. Используйте гемостат, чтобы аккуратно вытащить Strand B для поддержания ограниченного кровотока.
- Вырежьте небольшое отверстие в ограниченной области бедренной вены с микросцинсорами и осторожно вставьте угловой конец трубки PE-8 (ранее покраснел с гепарином сольственным раствором) к Strand B. После вставки, отпустите напряжение Strand B и направляйте катетер дальше по вене. Затяните Strand B вокруг вены, содержащей катетер.
- Используя Strand C, свяжите дополнительный узел вокруг катетера. Убедитесь, что этот узел не захватывает бедренную артерию.
- Аккуратно отойти на шприц баррель частично заполнить трубки с кровью, чтобы убедиться, что катетер был имплантирован должным образом.
- После той же процедуры вставьте катетер PE-10 в левую бедренную артерию.
- Полная хирургическая процедура.
- После того, как обе бедренной вены и артерии катетеры были обеспечены, связать Strand в узел вокруг обоих катетеров.
- Вырезать все лишние швы и удалить кожные крючки. Промыть артериальный катетер гепарина, чтобы предотвратить свертывание. Катеризизировать концы обоих катетеров, чтобы создать уплотнение.
- Поместите мышь в положение лежа и сделать небольшой разрез у основания шеи и применить солин на открытой области.
- Вставьте полый металлический стержень subdermally от разреза шеи к бедренной одиоции. Змея катетеры через полый стержень и из шеи разрез. Удалите полый стержень. Имплантация катетеров subdermally предотвратит мышей от повреждения катетеров.
- Нанесите бупивакаин на стороны раны. Закройте бедренный разрез шовом. Добавить мазь лидокаина над закрытой, зашвеяной раной.
- Змея катетеры через 30-см гибкой полой трубки (весной троса) и шов кнопку пружины троса под кожу. Нанесите бупивакаин на стороны раны. Шов кнопку пружинного троса под кожу. Добавить мазь лидокаина над закрытой, зашвеяной раной.
- Переместите мышь в прозрачный цилиндрический контейнер (20 см в высоту, диаметр 13 см) с поворотным креплением и рукой для размещения животного в период восстановления. Поместите руку теплее под контейнер, чтобы сохранить животное теплым.
- Винт верхней части пружины привязывать к повороту и обеспечить поворот к поворотной руке прилагается к цилиндрической контейнер. Убедитесь, что мышь имеет полный диапазон движения и катетеры могут быть доступны.
- Поместите прорези крышкой, которая не мешает поворотный механизм над корпусом животного. Обратитесь к рисунку 3 для полной настройки.
- Разрешить мыши для восстановления. Рекомендуется не менее 22 ч.
2. Приготовьте раствор L-1-14C'leucine для инъекций и 16% (w/v) 5-сульфосалициловая кислота (SSA) дигидратный раствор для депротеинизации образцов плазмы. В растворs SSA, также включают 0,04 мм норлеуцина и 1 "Ci/mL" Х3леуцина в качестве внутренних стандартов для анализа аминокислот и анализа концентрации трассировщика в кислотно-растворимых фракциях плазмы, соответственно. Храните SSA до двух месяцев при 4 градусах Цельсия.
- Покупка коммерчески доступных L-1-14C'leucine (50-60 мCi/mmol), который продается в качестве раствора в 2% этанола или 0,1 N HCl. Удар сухой известной деятельности трассировщика под нежным потоком азота и воссоздать в растворе стерильных нормальных солевой сделал до концентрации до 100 кг/мл.
3. Администрирование L-1-14C'leucine внутривенно и собирать образцы артериальной крови.
- Соберите необходимые материалы: 18 микротрубок 1,5 мл для депротеиализации образцов плазмы (добавить 70 мл деионизированной воды к каждой трубке), 17 250 мл стеклянных вставок (15 вставок для сбора образцов артериальной крови и 2 вставки для сбора мертвой космической крови, чтобы быть повторно введены. Для ограничения сбора дополнительной и ненужной крови рекомендуется небольшие тонкие стеклянные вставки с коническими днищами, которые позволяют использовать доступное трубчатое прокладка сверхнатантной плазмы), 2 микрокапиллярные трубки (32 X 0,8 мм, для измерения гематокрит), 1 гепарин и литиевое фторид покрытием микроцентрифуг трубки (для предотвращения свертывания и гликолиз, соответственно), hemostats (покрывать советы с тигоном трубки так, что зажимы не повредит PE трубки), монитор глюкозы в крови, преобразующее кровяное давление, 1 мл стерильных шприцев (для соточные смывы) и коммерчески доступный раствор эвтаназии (разбавленный 1:1 в деионизированной воде (для мышей)).
- Убедитесь, что животное находится в нормальном физиологическом состоянии в начале эксперимента.
- Зажим артериальных труб около 2 см от конца и отрезать кончик, создавая отверстие для крови течь. Затем unclamp трубки и собирать мертвую космическую кровь ((c. 30 мл) для сбора любых остаточных сольников и / или крови из предыдущих рисует), и, в отдельной трубке, собирать контрольный образец (около 30 л), образцы гематокрит (около половины объема капиллярной трубки), и глюкозы образец (около 20 л).
- Измерьте гематокрит, подключив один конец гереантом шпаклями и центрифугой в течение 1 мин при 4500 х г. Измерьте отношение объема красных клеток к общему объему крови. Если у животного гематокрит ниже 30%, не продолжайте исследование.
- Используйте коммерчески доступный монитор глюкозы в крови для измерения уровня глюкозы в капле крови.
- Центрифуга контрольный образец в течение 2 мин при 18000 х г для разделения плазмы. Депротеинизация образцов плазмы следующим образом: добавьте 5 л плазмы к 70 л деионизированной воды в микротрубке объемом 1,5 мл, добавьте 25 л из 16% раствора SSA и вихря. Поставить на лед 30 мин перед заморозкой на сухом льду.
- Вернуть мертвую космическую кровь животному через венозную линию, за которой следует гепаринизированный соенный флеш, чтобы предотвратить избыточную кровопотерю.
- Соедините артериальную линию к преобразователе кровяного давления для измерения среднего артериального кровяного давления.
- После взятия проб обязательно перезажмите артериальную линию и промыть линию небольшим (50 мл) объемом гепаринизированного соля.
- Администрирование трассировщик аттернавно и собирать приурочен артериальной крови образцов.
- Используйте Y-разъем, чтобы прикрепить один шприц с трассировщиком (100"Ci/kg) и один шприц с 50 мл стерильного солей, чтобы промыть венозную линию после инъекции трассировщика. Подключите Y-разъем к венозной линии.
- Инициировать исследование, одновременно начиная стоп-часы и инъекционных трассировщика. Промыть венозную линию сольным раствором (ок. 100 мл) сразу после инъекции.
- Сбор образцов крови 1-7 непрерывно в течение первых 2 минут эксперимента таким же образом. После сбора 7-го образца, соберите 30 л мертво-пространственной крови перед каждым оставшимся образцом. Образцы 8-14 собраны по 3, 5, 10, 15, 30, 45 и 60 минут, соответственно.
- Обработка образцов крови сразу после сбора, как было описано для контрольного образца. Если есть задержка, поместите образцы на лед. Тщательно впрыскивать мертвую космическую кровь в артерию через артериальный катетер и заподлицо гепаринским сольником.
- В какой-то момент в ходе эксперимента, обработать три внутренних стандартов, добавив 25 qL 16% SSA, 0,04 мМ норлеуцин, и 1 мCi/mL -3H'leucine до 75 л воды, вихря и место на льду.
- После сбора 14-го образца на 60 мин, впрыснуть около 0,2 мл B-эвтаназии-D в венозной линии, чтобы усыпловать животное. Запишите время смерти.
- Отвиньте животное от поворотного крепления и снимите с вольера животного. Аккуратно удалите мозг, поместите на алюминиевую фольгу и заморозьте на сухом льду. Не замораживайте мозгжижим азотом, так как мозг может треснуть. Храните мозг, образцы и внутренние стандарты при -80 градусов по Цельсию до готовности к обработке. Обработка может быть выполнена в любой момент после этого.
4. Анализ концентраций лейцина и L-1-14слеуцина в образцах плазмы.
- Образцы оттепели и внутренние стандарты на льду, вихре и центрифуге 18 000 х г в течение 5 мин при 2 градусах Цельсия. Супернатантная фракция будет содержать свободный помеченный и немаркированный лейцин.
- Перенесите 40 зл и смягчитель в жидкий флакон и добавьте сцинтилляционный коктейль. Количественная дезинтеграция на мин (ДПМ) 3H и 14C с помощью подсчета жидких сцинтилляций и утоления кривой, предназначенной для одновременного подсчета двойной метки (3 H и 14C).
- Для количественной оценки концентраций плазменного лейцина используйте систему HPLC с колонкой обмена катионов натрия и постколонкой с о-фальдегидом и флюорометрическим обнаружением.
- Установите HPLC на следующие спецификации: фторметр возбуждение 330 нм и выброс 465 нм. Мобильная фаза состоит из элуанта натрия, рН 7,40 и элуанта натрия 5% сульфолана, рН 3,15. Установите скорость буферного потока 0,400 м/мин, а скорость потока инструмента произвобиания - до 0,300 мл/мин. Установите температуру столбца до 48 градусов по Цельсию, а температуру реактора - до 45 градусов по Цельсию.
- Калибровать систему с диапазоном концентраций аминокислот (включая норлеуцин) между 30 и 500 pmol/10mL. Кривая калибровки линейна. Концентрации аминокислот в проверенных образцах инъекций 10 мл находятся в пределах этой калибровочной кривой.
5. Выполните количественную ауторадиографию.
- Подготовьте участки мозга толщиной 20 мкм для ауторадиографии. Секция мозга с помощью криостата при -20 градусах Цельсия.
- Оттепель монтируют серийные участки мозга на слайдах с покрытием из желатина. Воздух сухой.
- Вымойте слайды в пяти изменениях 10% формалина на 30 минут за изменение, а затем непрерывный поток деионизированной воды в течение 1 ч. Обложка слайды свободно с фольгой, чтобы избежать пыли и дайте высохнуть в течение 24 ч.
- Упорядочить слайды в рентгеновской пленке кассеты (кассеты, которые соответствуют 20X25 см маммографии пленки рекомендуется) вместе с наборомиз 14C'метилметакрилат стандартов, которые ранее были откалиброваны против ткани известных 14C концентрации, как описано29. Стандарты могут быть приобретены на коммерческой основе, но гарантируют, что они охватывают диапазон 2-300 мКИ/г ткани и откалиброваны против толщины 20 мкм ткани. Под красным безопасным светом, поместите кусок маммографии пленки, эмульсии стороны вниз, на верхней части разделов.
- Печать кассеты и место в черный мешок изменения и хранить в шкафу в течение 40-45 дней.
- Разрабатывайте пленки в соответствии с указаниями производителя. Примечание: Автоматизированная разработка пленки не рекомендуется, поскольку фон может быть неравномерным и может повлиять на количественную оценку.
6. Анализ изображений.
Примечание: Рекомендуется коммерчески доступная программа для анализа изображений в сочетании с камерой CCD и флуоресцентной световой коробкой с ровным освещением. Относительная оптическая плотность освещенной пленки обнаруживается камерой CCD.
- Постройте калибровочная кривая оптической плотности (OD) v. концентрации 14 C на основе ОД набора калиброванных стандартов на пленке. Приспособите эти данные (включая пустой или фон) к полиномиальному уравнению. Либо второй или третьей степени полиномиального уравнения подходит очень хорошо.
- Для анализа конкретных областей мозга, найти область интереса (ROI) в шести до восьми разделов по сравнению с атласом мозга. Запись OD s в пределах рентабельности инвестиций во всех разделах и, на основе кривой калибровки, вычислить концентрацию ткани 14C в каждом пикселе. Вычислите среднюю концентрацию ткани 14C в рентабельности инвестиций.
7. Вычисление rCPS. Вычислите rCPS в каждой рентабельности инвестиций с помощью следующего уравнения:
В тех случаях, когда ПЗ (T) является средневзвешенная концентрация ткани 14C в рентабельности инвестиций, Cр(т) и Cир(т) являются артериальные концентрации плазмы немаркированных и помечены лейцин во время, т, T это время, что животное умерло ( около 60 мин), и это фракция лейцина в бассейне-прекурсоре тканей, который поступает из плазмы. Оценка З проводится в отдельном эксперименте 6. - была оценена в WT, Fmr1 нокаутом, Tscno/-, и PKU мышей 6,22,25,28. Если эксперимент включает в себя генетические или фармакологические изменения, которые могут повлиять на скорость синтеза белка, деградации или метаболизма лейцина, то следует оценить его в новых условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы показываем репрезентативный эксперимент, демонстрирующий влияние предварительного введения ингибитора синтеза белка на rCPS. Анисомицин в нормальном солевым раствором вводили взрослому мужчине C57/BL6 самцу дикого типа мыши подкожно (100 мг/кг) 30 мин до начала определения rCPS. Эффекты лечения анисомицин по сравнению с транспортным средством лечения животных показывают, что rCPS почти обнаружить в анисомицин-обработанных мыши (Рисунок 4). Эти данные представляют собой подтверждение того, что авторадиографический метод in vivo L-1-14C-leucine измеряет скорость синтеза белка в головном мозге.
Мы представляем фигуру l-1-14C-leucine авторадиограммы на четырех уровнях мозга, чтобы продемонстрировать разрешение метода (Рисунок 5). Иллюстрированные слои клеток в обонятельной луковице(Рисунок 5A и B), гиппокамп (рисунок5C), и мозжечок (Рисунок 5G). Ядра в гипоталамусе(рисунок 5D),понсы (рисунок5E и F), и ствол мозга (рисунок5H) также хорошо видны в авторадиограммах. Мы также показываем количественные региональные показатели синтеза белка в лобной коре (5,88 нмоль/г/мин)(рисунок 6A)и прядиленный гиппокамп (5,35 нмоль/г/мин) (Рисунок 6B) типичного контрольного животного.
Рисунок 1: Схема, представляющая шаги всего протокола rCPS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Изображение обнажённых бедренной артерии и бедренной вены. Прокладывая параллельно друг с другом, бедренная артерия показана над бедренной веной. Бедренная вена также имеет более глубокий красный цвет, чем бедренная артерия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Изображение рекомендуемой установки корпуса животных для эксперимента rCPS. Он использует четкий цилиндрический корпус животных с поворотным придатком, соединенным с пружинным тросом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Репрезентативные изображения с животных, обработанных транспортным средством (A) по сравнению с животным, обработанным анисомицином (100 мг/кг, подкожно) 30 мин до введения трассировщика (B). Темпы синтеза белка пропорциональны уровню темноты на изображении. Анисомицин резко снижает измеренные темпы синтеза белка, что указывает на специфику этого метода. Панель масштаба в правом верхнем углу А составляет 1 мм и применяется к обоим изображениям. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Оцифрованные авторадиограммы от бодрствующих мышей на уровне обонятельной лампы (A, B), гипоталамуса (C, D), понс (E, F), мозжечка (G) и ствола мозга (G, H). Темные области имеют более высокие rCPS. Шкала бара в панели G применяется к панелям A, C, E и G. Авторадиограммы справа (B, D, F и H) увеличенные изображения из областей, обозначенных на изображениях слева, а панель масштаба в панели H применяется к панелям B , D, F, и H. Аббревиативы являются следующими: FrA, лобной ассоциативной коры; OB, обонятельная лампа; АО, переднее обонятельное ядро; Gl, гломерулярный слой; EPl, внешний слой плексиформы; BLA, басолатеральная миндалина; py, пирамидальный слой клетки; dHi, дорзальный гиппокамп; ГД, зубная извилина; MHb, медиальная хабенула; Rt, таламическом ректикулярном ядре; VMH, вентрральное медиальное гипоталамическое ядро; Дуга, ядро аркуата; EW, Эдингер-Вестфальное ядро; R, красное ядро; PN, понтийское ядро; ML, молекулярный слой; GL, гранулированный слой; Pc, слой клетки Purkinje; Cu, клиноятядро ядро; AP, область пострема; 10, ядро дорсального мотора блуждающего; 12, гипоглоссальное ядро. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Оцифрованные авторадиограммы от бодрствующих себя мышью управления на уровне лобной коры (A) и дорсального гиппокампа (B). Темпы синтеза мозгового белка закодированы на изображениях в соответствии с цветовой парой, показанной справа. Панель масштаба в левом нижнем цвете А составляет 1 мм и применяется к обоим изображениям. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы представляем количественный метод определения региональных показателей синтеза церебральных белков (rCPS) in vivo у экспериментальных животных. Этот метод имеет значительные преимущества перед существующими методами: 1. Измерения производятся в бодрствующее поведение животного, поэтому они отражают текущие процессы в функционирующем мозге. 2. Измерения производятся с помощью количественной ауторадиографии, дающей возможность определять RCPS во всех регионах и субрегионах мозга одновременно. 3. Кинетическая модель метода учитывает возможность рециркуляции немаркированных аминокислот, полученных в результате деградации тканевогобелка, и его влияние на пул-предшественник для синтеза белка 6.
Основное ограничение этого метода заключается в том, что он требует много времени и требует больших затрат. В то время как заманчиво использовать более простые и более высокие методы пропускной платы, необходимо признать ограниченность полученных данных.
Из-за сложности измерения rCPS в нетронутой мыши, проблемы с поддержанием нормального физиологического состояния, сбор адекватных образцов крови, и избежать возможно вмешательства условия могут возникнуть. Хирургическая имплантация венозных и артериальных катетеров является сложной задачей. Как и в любой хирургической процедуре, особенно при обработке деликатных сосуд, существует неотъемлемый риск смертности животного. Для нас это редкость (около 1%). В течение последующего периода восстановления 22 ч, иногда (около 4%) животное вытащит катетер. Во время измерения важно, чтобы катетеры были патентными и чтобы животные были в нормальном физиологическом состоянии. По нашему недавнему опыту, артериальная кровь не может быть собрана примерно у 2% животных и около 1% животных имели низкий гематокрит (Зlt; 40%) или низкое артериальное кровяное давление (Злт; 85 мм рт. ст.), что свидетельствует о потере крови во время операции и/или восстановления.
При подготовке секций мозга для ауторадиографии важно обеспечить толщину секции 20 мкм, потому что это толщина секции, к которой были откалиброваны стандарты14Сметилметакрилат. Используйте внимательность для обеспечения хорошего качества разделов, т.е. без слез, складок или пузырьков, так как эти недостатки будут мешать авторадиографическому анализу. Мы разрабатываем авторадиографические пленки вручную, а не в автоматизированном процессоре пленки, потому что мы находим, что фоноптическая плотность может быть неравномерной после автоматической обработки, и это может повлиять на количественную оценку.
В уравнение для rCPS, мы включаем фактор, lambda (я), то есть фракция лейцина, который исходит от артериальной плазмы, остальная часть поступает от переработки аминокислот, полученных от деградации белка ткани6. Мы оценили в отдельных экспериментах на WT и Fmr1 KO (хрупкая модель X) C57Bl/6J мышей и показали, что его значение составляет 0,603. Значение конможет варьироваться в зависимости от вида, генетического происхождения или наличия генетической мутации. Поэтому, если проектирование экспериментов синтеза белка для других моделей, нужно будет оценить , прежде чем точное измерение может быть получено.
Наша работа в генетических моделях мышей нейроразвития расстройств показывает, что эта методология показывает изменения в rCPS в этих моделях, а в некоторых случаях ответы на фармакологические методы лечения22,23,25 , 26. Также можно предположить, что измерение rCPS может также контролировать дегенеративные изменения в мозге в таких условиях, как модели болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, хрупкий синдром атаксии X тремора, черепно-мозговая травма и т.д. эти модели, возможно, можно отслеживать ранние дегенеративные изменения и, возможно, также ответы на ранние вмешательства. Метод rCPS может быть использован вместе с иммуногистохимией в параллельных разделах для дальнейшего изучения конкретных изменений мозга25. Таким образом, количественный авторадиографический метод L-1-14C-leucine идеально подходит для точного определения значений rCPS in vivo. Он предлагает значительные преимущества с точки зрения точности и применимости к условиям in vivo по сравнению с существующими методами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конфликта интересов раскрыть.
Acknowledgments
Авторы хотели бы отметить, Зенгян Ся для генотипирования мышей, Том Burlin для обработки аминокислот и фильмов, и Мэй Цинь для выполнения некоторых из экспериментов rCPS. Это исследование было поддержано Программой интрамуральных исследований NIMH, ЗИА MH00889. RMS также поддерживается аутизмом говорит постдокторской стипендий 8679 и FRAXA постдокторской стипендий.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson Laboratory | 003024 | Fmr1 knockout breeding pairs |
| Anisomycin | Tocris Bioscience | 1290 | |
| Microhematocrit Tubes | Drummond Scientific | 1-000-3200-H | capillary tubes |
| Critoseal Capillary Tube Sealant | Leica Microsystems | 39215003 | sealant putty |
| Glass vial inserts | Agilent | 5183-2089 | used to collect blood samples |
| Digi-Med Blood Pressure Analyzer | Micro-Med Inc. | BPA-400 | blood pressure analyzer |
| Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System | Bayer Breeze | 9570A | glucose meter |
| Gastight syringe | Hamilton Co. | 1710 | tuberculin glass syringe |
| HeatMax HotHands-2 Hand Warmers | HeatMax | Model HH2 | warming pads |
| Heparin Lock Flush Solution | Fresenius Kabi USA, LLC | 504505 | heparin saline |
| Clear animal container | Instech | MTANK/W | animal enclosure |
| Spring tether | Instech | PS62 | catheter tube/rodent attachment |
| Swivel | Instech | 375/25 | hooks to spring tether |
| Swivel arm and mount | Instech | SMCLA | hooks to swivel and animal enclosure |
| Tether button | Instech | VAB62BS/22 | attaches to bottom of spring tether |
| Stainless steel tube | Made in-house | N/A | used to snake catheters through mouse |
| Matrx VIP 3000 | Matrx | 91305430 | isoflurane vaporizer |
| Isoflurane | Stoelting Co. | 50207 | isoflurane/halothane adsorber |
| Clippers | Oster Finisher | Model 59 | |
| Surgical skin hooks | Made in-house (??) | N/A (??) | |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | APP Pharmaceuticals LLC | 918610 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| UNIFY silk surgical sutures | AD Surgical | #S-S618R13 | 6-0 USP, non-absorbable |
| PE-8 polyethylene tubing | SAI Infusion Technologies | PE-8-25 | |
| Syringe | Becton Dickinson and Co. | 309659 | 1cc/mL |
| PE-10 polyethylene tubing | Clay Adams | 427400 | |
| MCID Analysis | Imaging Research Inc. | Version 7.0 | optical density analysis |
| Gelatin-coated slides (75x25mm) | FD Neurotechnologies | PO101 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Super RX-N medical x-ray film | Fuji | 47410-19291 | |
| Hypercassettes (8x10 in) | Amersham Pharmacia Biotech | 11649 | |
| [1-14C]leucine | Moravek | MC404E | |
| Microcentrifuge tube | Sarstedt Aktiengesellschaft & Co. | 72.692.005 | used to deproteinize blood samples |
| Glass pasteur pipette | Wheaton | 357335 | |
| Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | |
| Nitrogen | NIH Supply Center | 6830009737285 | |
| Scintillation fluid | CytoScint | 882453 | |
| Liquid scintilllation counter | Packard Tri-Carb | 2250CA | |
| Amino acid analyzer | Pickering Laboratories | Pinnacle PCX | |
| HPLC unit | Agilent Technologies | 1260 Infinity | include 1260 Bio-Inert Pump |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg | M650 | |
| Sulfosalicylic acid | Sigma-Aldrich | MKBS1634V | 5-sulfosalicylic acid dihydrate |
| Norleucine | Sigma | N8513 | |
| 1.0 N HCl | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| [H3]leucine | Moraevk | MC672 | |
| Falcon tube | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL conical centrifuge tubes |
| Stopwatch | Heuer Microsplit | Model 1000 | 1/100 min |
| Euthanasia Solution | Vet One | H6438 | |
| Northern Light Precision Illuminator | Imaging Research Inc. | Model B95 | fluorescent light box |
| Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 | Nikon | 1442 | CDD camera |
References
- West, A. E., et al. Calcium regulation of neuronal gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).
- Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. Basic Neurochemistry. , 6th ed, Lippincott-Raven. New York. (1999).
- Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265, 1104-1107 (1994).
- Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2. Science. 286, 785-790 (1999).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).
- Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).
- Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).
- Banker, G., Cotman, C. W. Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).
- Frerichs, K. U., et al. Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).
- Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep. The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).
- Nakanishi, H., et al. Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta. The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats. Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).
- Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei. Brain Research. 494, 155-158 (1989).
- Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats. The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).
- Smith, C. B., Yu, W. H. Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment. Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).
- Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).
- Nadel, J., et al. Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis. Brain Research. 1537, 125-131 (2013).
- Sun, Y., et al. Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development. The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).
- Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool. Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).
- Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats. Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).
- Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin. Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).
- Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome. Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).
- Qin, M., et al. Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).
- Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).
- Qin, M., et al. R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034 (2015).
- Qin, M., et al. Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation. ASN Neuro. 6, (2014).
- Smith, C. B., Kang, J. Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).
- Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats. Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).
