Summary
हम electroporation द्वारा tangentially पलायन कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए तरीकों का वर्णन है, और समय के लिए चूक एक फ्लैट में लेबल सेल आंदोलन की इमेजिंग-संस्कृति के क्रम में विकासशील चिकी ऑप्टिक tectum में सेल व्यवहार पलायन कल्पना के लिए .
Abstract
टाइम-चूक इमेजिंग माइग्रेटिंग सेल व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है । फ्लोरोसेंट सेल लेबलिंग के बाद, संस्कृति में लेबल कोशिकाओं के आंदोलन वीडियो माइक्रोस्कोपी के तहत दर्ज किया जा सकता है । विकासशील मस्तिष्क में कक्ष माइग्रेशन का विश्लेषण करने के लिए, स्लाइस कल्चर का उपयोग सामान्यतः स्लाइस अनुभाग के समानांतर कक्ष माइग्रेशन का पालन करने के लिए किया जाता है, जैसे रेडियल सेल माइग्रेशन. हालांकि, सीमित जानकारी स्लाइस अनुभाग, जैसे स्पर्श कक्ष माइग्रेशन को सीधा कक्ष माइग्रेशन का विश्लेषण करने के लिए स्लाईस कल्चर पद्धति से प्राप्त की जा सकती है । यहां, हम समय के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत-चूक इमेजिंग के लिए विकासशील लड़की ऑप्टिक tectum में स्पर्श सेल प्रवास कल्पना । ovo में electroporation द्वारा सेल लेबलिंग का एक संयोजन और सेल कल्चर डालने पर बाद में फ्लैट माउंट संस्कृति क्षैतिज विमान में पलायन सेल आंदोलन का पता लगाने में सक्षम बनाता है । इसके अलावा, हमारे विधि दोनों व्यक्तिगत सेल व्यवहार और लंबी अवधि में कोशिकाओं के एक समूह की सामूहिक कार्रवाई का पता लगाने की सुविधा । इस विधि संभावित फ्लोरोसेंट के अनुक्रमिक परिवर्तन का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है-सूक्ष्म संरचना, तंत्रिका ऊतक या कोशिका विस्थापन में गैर तंत्रिका ऊतक में axonal बढ़ाव सहित लेबल ।
Introduction
सेल प्रवास के अध्ययन लाइव इमेजिंग की तकनीक को आगे बढ़ाने के साथ प्रगति कर रहा है । फ्लोरोसेंट सेल लेबलिंग के बाद, एक संस्कृति डिश में या vivo में लेबल कोशिकाओं के लौकिक आंदोलन वीडियो माइक्रोस्कोपी के तहत दर्ज किया जा सकता है । तंत्रिका विकास के अध्ययन में, प्रवास कोशिकाओं या लंबी axons के रूपात्मक परिवर्तन समय-चूक इमेजिंग का उपयोग कर विश्लेषण किया गया है । प्रभावी इमेजिंग के लिए, यह फ्लोरोसेंट सेल लेबलिंग और ऊतक तैयारी, प्रयोग और विश्लेषण के उद्देश्य पर आधारित के लिए एक उपयुक्त विधि लागू करने के लिए आवश्यक है । विकासशील मस्तिष्क में कक्ष माइग्रेशन का विश्लेषण करने के लिए, स्लाइस कल्चर का उपयोग सामान्यतः स्लाइस अनुभाग के समानांतर कक्ष माइग्रेशन का अवलोकन करने के लिए किया जाता है, जैसे रेडियल सेल माइग्रेशन1,2,3. स्लाइस संस्कृति प्रणाली भी स्पर्श सेल प्रवास4,5का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन यह उन मामलों में दिशात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं है जहां कोशिकाओं टुकड़ा अनुभाग के लिए सीधा फैलाने ।
ऑप्टिक tectum एक multilayered संरचना से बना है, भ्रूण के विकास के दौरान रेडियल और स्पर्श सेल प्रवास द्वारा गठित । Tectal परत गठन वेंट्रिकुलर क्षेत्र से postmitotic ंयूरॉन अग्रदूत कोशिकाओं के रेडियल प्रवास पर मुख्य रूप से निर्भर करता है, और उनके परतों में अंतिम गंतव्य वेंट्रिकुलर क्षेत्र6में उनके जंम की तारीख के साथ संबद्ध । के रूप में स्पर्श प्रवास के लिए, हम पहले एक विकासशील लड़की ऑप्टिक tectum में मध्य और सतही परतों में प्रवास के दो धाराओं की सूचना दी । E6-E8 के दौरान बीच परतों में, एक लंबे समय अग्रणी प्रक्रिया और एक पतली पीछे की प्रक्रिया के साथ द्विध्रुवी कोशिकाओं को पृष्ठीय या fasciculus tectal efferent कि रन axons-dorso7के axon ventrally साथ ventrally माइग्रेट । इस axophilic प्रवास के बाद, कोशिकाओं multipolar न्यूरॉन्स गहरी परतों में स्थित में अंतर. E7-E14 के दौरान सतही परतों में, माइग्रेट कक्ष क्षैतिज रूप से एक branched अग्रणी प्रक्रिया को सुधारना और कई दिशाओं में स्कैटर द्वारा फैलाएं8। माइग्रेशन फैलाने के बाद, उत्तरार्द्ध कोशिकाएँ अंततः विभिन्न morphologies के सतही न्यूरॉन्स में अंतर करती हैं. दोनों ही मामलों में, एक फ्लैट माउंट संस्कृति pial सतह के लिए सेल आंदोलन समानांतर निरीक्षण करने के लिए कुशल है ।
यहां, हम समय चूक इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद के लिए विकासशील लड़की ऑप्टिक tectum7,8में स्पर्श सेल प्रवास कल्पना । ovo मेंelectroporation द्वारा सेल लेबलिंग का संयोजन, और सेल कल्चर डालने पर बाद में फ्लैट-माउंट कल्चर को माइग्रेट सेल मूवमेंट और माइग्रेशन दिशा का पता लगाने में सक्षम बनाता है । इस विधि के लक्ष्य को लंबे समय में दोनों व्यक्तिगत कोशिका व्यवहार और क्षैतिज विमान में कोशिकाओं के एक समूह की सामूहिक कार्रवाई की खोज की सुविधा है ।
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Protocol
1. Ovo में Electroporation
- उच्च एकाग्रता में फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए अभिव्यक्ति प्लाज्मिड डीएनए तैयार करें । जीवाणु संस्कृति के २०० मिलीलीटर से डीएनए अलग आयनों का उपयोग करके क्षारीय lysis विधि द्वारा निर्माता के प्रोटोकॉल (सामग्री की तालिका) के अनुसार विनिमय कॉलम । मिश्रण pCAGGS-EGFP और pCAGGS-mCherryNuc एक अंतिम एकाग्रता पर 4 µ जी/µ एल प्रत्येक ।
नोट: Endotoxin-मुक्त प्लाज्मिड डीएनए शुद्धि electroporation के लिए पसंद किया जा सकता है । - उपजाऊ चिकन अंडे की मशीन क्षैतिज ३८ ° c में ७०% सापेक्षिक आर्द्रता में ।
- २.५ दिनों के बाद, एक 18 गेज सुई के साथ 20 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर अंडे के नुकीले पक्ष से सफ़ेदी (अंडा सफेद) के 5 मिलीलीटर को खत्म करने और टेप के साथ सुई छेद सील ।
- वक्र कैंची के साथ अंडा खोल के ऊपर कट एक छेद 2 सेमी व्यास में खोलने के लिए और stereomicroscope (हैमबर्गर और हैमिल्टन9के चरण 17) के तहत भ्रूण के विकासात्मक चरण की जांच करें । टेप के साथ फिर से छेद सील ।
नोट: यह कदम ई 2.5 ई 3.0 के दौरान किसी भी समय किया जा सकता है । कदम १.३ और १.४ अंडे में भ्रूण के स्तर को कम करने के लिए बढ़ते भ्रूण और रक्त वाहिकाओं के ऊपर खोल के एक तंग लगाव से बचने के लिए । - जारी रखें ई 5.5 तक गर्मी ।
- electroporation से पहले, वर्णित प्लाज्मिड डीएनए के 10 µ एल तैयार फास्ट ग्रीन के ०.५ µ एल के साथ रंग (25 मिलीग्राम/एमएल), 10 मिलीलीटर के autoclaved फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) पेनिसिलिन युक्त (१०० इकाइयों/एमएल) और streptomycin (१०० μg/एमएल), और से बनाया micropipettes एक micropipette प्रोसेसर का उपयोग कर कांच केशिका ट्यूबों । micropipette के बाहर की नोक में कटौती इंजेक्शन के लिए डीएनए की मात्रा के आधार पर ताकना का एक उचित आकार बनाने के लिए ।
- व्यास में एक छेद २.५ सेमी फिर से खोलना और स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत छुरा सेट करने के लिए कैंची के साथ सील शीर्ष खोल कट । अंडे में पंजाबियों की कुछ बूंदें जोड़ें । दो महीन संदंश का उपयोग कर नकसीर के बिना भ्रूण को कवर allantoic झिल्ली को छील लें । भ्रूण के सिर से amnion को हटा दें ।
- जबकि एक microspatula के साथ सिर मोड़, बाएँ ऑप्टिक tectum एक सक्शन ट्यूब से जुड़े micropipette का उपयोग कर के वेंट्रिकुलर गुहा में रंगीन डीएनए के 0.1-1 μL इंजेक्षन.
नोट: डीएनए इंजेक्शन की मात्रा प्रयोग के उद्देश्य पर निर्भर करता है । केंद्रित डीएनए समाधान सिंक और वेंट्रिकुलर दीवार के साथ संलग्न करना चाहिए । - forcep प्रकार इलेक्ट्रोड की एक जोड़ी प्लेस (7 मिमी दूरी के साथ 3 मिमी वर्ग इलेक्ट्रोड) ताकि ऑप्टिक tectumis के लक्ष्य क्षेत्र के बीच में रखा (चित्रा 1, चरण 1).
नोट: डीएनए anode पक्ष को electroporated है । - एक पूर्व पल्स प्रभारी 30 वी, एक 5 एमएस अंतराल और चार के बाद दालों के साथ 1 ms, एक 10 ms अंतराल के साथ 5 एमएस पल्स जनरेटर का उपयोग कर.
नोट: इलेक्ट्रॉनिक हालत इलेक्ट्रोड के आकार और दूरी पर निर्भर करता है. यह काफी मजबूत करने के लिए कुशल अभिकर्मक प्राप्त होना चाहिए, लेकिन यह पर्याप्त मामूली को लक्ष्य ऊतक के सामांय विकास का आश्वासन देना चाहिए । - टेप के साथ छेद सील और जारी रखने की मशीन । एक प्लास्टिक की डिश में एक दंत ब्रश के साथ सफ़ेदी हटाने के लिए पंजाब में इलेक्ट्रोड सोख । प्रत्येक अंडे के लिए 1.7-1.11 दोहराएँ ।
2. फ्लैट-माउंट संस्कृति पर सेल डालने
- एक दिन पहले फ्लैट माउंट संस्कृति, लेपित सेल संस्कृति डालने के लिए तैयार करते हैं । एक 10-सेमी सेल संस्कृति डिश में autoclaved आसुत जल पर कुछ सेल संस्कृति आवेषण फ्लोट । 8 µ g/ml laminin और ८० µ g/ml पाली-L-lysine का समाधान लोड करने के लिए आवेषण कवर और सेल संस्कृति CO2 मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस में मंगाई आवेषण छोड़ रात भर ।
नोट: अगले दिन पर, लेपित आवेषण 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है । - पर संस्कृति के दिन ई 7.0, डालने से laminin-पाली-एल-lysine समाधान निकालें और एक गिलास नीचे पकवान में डालने जगह (चित्रा 1, चरण 2) संस्कृति माध्यम की १.१ मिलीलीटर (६०% कम सीरम मध्यम, 20% F12, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 10 से भरा) % चिकी सीरम, ५० इकाइयों/एमएल पेनिसिलिन, ५० μg/एमएल streptomycin) । ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेल संस्कृति सह2 मशीन में पकवान रखो ।
नोट: मध्यम परिवर्तन के बिना तीन दिनों के लिए संस्कृति अवधि के दौरान इस्तेमाल किया जा सकता है । - कल्चर सेटअप तैयार करें । ३८ डिग्री सेल्सियस (तापमान नियंत्रक) पर ४०% ओ2 और 5% सह2 (गैस नियंत्रक) के एक गैस प्रवाह के साथ एक औंधा फोकल माइक्रोस्कोप पर एक आर्द्र चैंबर इकाई सेट करें ।
- कैंची से भ्रूण का सिर काट डाला । सिर चुटकी में संदंश के साथ बाहर बर्फ ठंडा हैंक्स ' संतुलित नमक समाधान (HBSS) में एक 6 सेमी सेल संस्कृति डिश ।
- अलग electroporated ऑप्टिक tectum दो महीन संदंश का उपयोग कर । tectum को एक प्लास्टिक ड्रॉपर के साथ एक अन्य डिश में बर्फ से भरे कोल्ड HBSS में ट्रांसफर कर दीजिये । काटने के लिए एक तश्तरी के रूप में काले सिलिकॉन के आधार पर गढ़ा कांच पकवान का प्रयोग करें ।
- प्रतिदीप्ति त्रिविम माइक्रोस्कोप के तहत लेबलिंग की स्थिति की जांच करें । बाहर tectal एक microsurgical चाकू के साथ लेबलिंग क्षेत्र आसपास के ऊतकों में कटौती । tectum (पूर्वकाल-पीछे, पृष्ठीय-ventral) में ऊतक की दिशा सुनिश्चित करें ।
- लेबल वाले ऊतक को प्लास्टिक ड्रॉपर से डालने के लिए स्थानांतरित करें ताकि पिया की ओर सम्मिलित होने के लिए संलग्न हो. इच्छित दिशा में tectal ऊतक रखना और अतिरिक्त HBSS (चित्रा 1, चरण 2) को हटा दें ।
- दोहराने 2.4-2.7 क्रम में एक ही डालने पर अंय ऊतकों को तैयार करने के लिए । उल्टे फोकल माइक्रोस्कोप (चित्रा 1, चरण 3) में गर्म कक्ष में पकवान प्लेस ।.
3. टाइम-चूक इमेजिंग
- फ्लोरोसेंट लेबलिंग की जांच करें और औंधा फोकल माइक्रोस्कोप में सूक्ष्म क्षेत्र ध्यान केंद्रित । लेजर फोकल इकाइयों शुरू और क्षेत्र में एक्स और वाई-अक्ष के साथ ऊतक की दिशा और स्थिति को समायोजित करने के लिए फोकल स्कैन नमूना लेने की कोशिश । विसर्जन तेल के बिना 10x या 20X उद्देश्य लेंस का प्रयोग करें ।
- स्कैनिंग आकार (उदा., 512x512 dpi) का चयन करें । मध्यांतर और z-अक्ष के साथ फोकल स्कैन की कुल रेंज का फैसला । १०० µm श्रेणी के लिए एक 5 या 10 µm अंतराल ले लो । फोकल इमेजिंग और कुल इमेजिंग अवधि के समय अंतराल तय (उदा., 10 मिनट से अधिक ४८ ज) ।
नोट: लेजर phototoxicity से बचने के लिए, लंबी z-श्रेणी के लिए कम z-अंतराल के साथ उच्च स्कैनिंग आकार में स्कैनिंग को प्रतिबंधित करें, या लंबी इमेजिंग अवधि के दौरान कम समय के अंतराल के साथ । उदाहरण के लिए, उच्च स्कैनिंग आकार (उदा., 1024x1024 dpi) लागू करते समय, z-अक्ष के साथ स्कैन की संख्या घटाएं । - ३.२ में वर्णित फोकल चल कार्यक्रम के मापदंडों सेट और इमेजिंग शुरू करते हैं ।
- इमेजिंग के बाद, अलग z-अक्ष पर फोकल छवियों गठबंधन के लिए हर समय बिंदु पर ठीक फोकल समायोजन के साथ z-ढेर छवियों प्रदान करते हैं ।
- अलग समय पर z-ढेर छवियां जोड़ें-बिंदु और AVI प्रारूप में एक समय चूक फिल्म का निर्माण ।
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Representative Results
चित्रा 2 रिकॉर्डिंग की शुरुआत के बाद एक फ्लैट में एक गुजरे समय (0, 9, 18, 27 एच) में एक सपाट माउंट संस्कृति में कल्पना सतही स्पर्श प्रवास दिखाता है । मूवी 1 10 मिनट की एक समय चूक फिल्म है-अंतराल 28 एच और ५० मिनट की अवधि में । फ़्रेम को अनलेबल्ड स्थान (चित्र 3) में फ़्रेम के निचले-बाएँ कोने से लेबल किए गए माइग्रेट कक्षों पर फ़ोकस करने के लिए चयनित किया जाता है. पलायन कोशिकाओं के जन आंदोलन (GFP; ऊपरी बाएँ पैनल, फिल्म 1) और उनके नाभिक (mCherry-Nuc; ऊपरी दाएँ पैनल) विलय फिल्म के साथ मनाया जा सकता है (निचले पैनल, फिल्म 1). सेल माइग्रेशन की दिशात्मकता सभी दिशाओं (फिल्म 2, चित्र 3 बी) के लिए लेबल केंद्र से फैलाने कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करके जांच की जा सकती है ।
परमाणु आंदोलन ( 2फिल्म , mCherry-Nuc, सही पैनल) की स्पष्ट छवियों हमें स्वचालित ट्रैकिंग द्वारा सेल परमाणु प्रवास का पता लगाने के लिए अनुमति देता है एक कण ट्रैकर का उपयोग कर10 ImageJ 11 के एक फिजी छवि प्रसंस्करण आवेदन की (फिल्म 3, चित्र बी) । स्पर्शात्मक प्रवास की गति का लौकिक परिवर्तन ओमनी-दिशाओं में फैलाव प्रवास को सिद्ध करने के लिए दृश्यमान हो सकते हैं ।
अग्रणी प्रक्रिया के क्रमिक रूपात्मक परिवर्तन के साथ व्यक्तिगत सेल व्यवहार, पीछे की प्रक्रिया और नाभिक 5 मिनट के उच्च आवर्धन छवियों के साथ प्रकट किया जा सकता-अंतराल (फिल्म 4, चित्रा 3सी) ।
मध्यम परतों7 में स्पर्श प्रवास का एक अंय प्रकार के एक समान प्रोटोकॉल (मूवी 5, चित्रा 3 डी) का उपयोग कर visualized किया जा सकता है । द्वि-दिशा रेखीय माइग्रेशन axon fasciculus के साथ ventral करने के लिए पृष्ठीय चल (ऊपर से नीचे) स्पष्ट है7.
चित्र 1. प्रोटोकॉल प्रवाह चार्ट । चरण 1: ovo मेंElectroporation । चरण 2: tectal ऊतक बिछाने ताकि पिया पक्ष डालने के लिए संलग्न है । चरण 3: लेजर फोकल इकाई के साथ औंधा फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2. सपाट माउंट संस्कृति में सतही स्पर्श प्रवास के दृश्य । tangentially माइग्रेट कोशिकाओं (GFP; ऊपरी पैनल) और नाभिक (mCherry-Nuc; निचले पैनल) ऑप्टिक tectum की सतही परतों में 0, 9, 18, 27 एच में दिखाया गया है e 7.0 से संस्कृति की शुरुआत के बाद । फ़्रेम के निचले-बाएं कोने पर कक्ष 0 h ( चित्र 3ए देखें) पर लेबल किए गए हैं । स्केल बार: १०० µm । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3. योजनाबद्ध चित्रा समय-चूक इमेजिंग के लिए पर्वत शर्तों illustrating । फ्लोरोसेंट लेबलिंग का आकार (हरा), सेल माइग्रेशन (रानी) की प्रारंभिक दिशा, और वीडियो फ्रेम (काला वर्ग) उद्देश्य लेंस की वृद्धि के साथ सचित्र थे (obj) और ऊपरी क्षेत्र में डिजिटल ज़ूम (ज़ूम), electroporation के दिन के साथ (EP ) और नीचे क्षेत्र में संस्कृति (संस्कृति) की शुरुआत । (A) मूवी 1, (B) मूवी 2 और 3, (C) मूवी 4, (D) मूवी 5. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
फिल्म 1. एक फ्लैट में सतही स्पर्श प्रवास के दृश्य संस्कृति माउंट । tangentially पलायन कोशिकाओं के आंदोलन (GFP; ऊपरी बाएँ पैनल) और उनके नाभिक (mCherry-Nuc; ऊपरी दाएँ पैनल) e 7.0 से संस्कृति की शुरुआत के बाद ऑप्टिक tectum की सतही परतों में. मर्ज की गई छवि निचले फलक में दिखाई गई है । फ़्रेम के निचले-बाएं कोने पर कक्ष 0 ज ( चित्र 3ए देखें) पर लेबल किए गए हैं, और समय-चूक छवियां 28 h और ५० मिनट पर कैप्चर की गईं । स्केल बार: १०० µm । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें ।
फिल्म 2. tangentially पलायन कोशिकाओं के आंदोलन को फैलाने (GFP; बाएँ पैनल) और उनके नाभिक (mCherry-Nuc; सही पैनल) दोनों पैनलों के केंद्र से अधिक ४८ ज दिखाया गया है (देखें चित्र बी). स्केल बार: १०० µm । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें ।
फिल्म 3. स्पर्श प्रवास का पथ । कोशिका नाभिक के विस्थापन ( 2 फिल्म का सही पैनल) को स्पर्श प्रवास की गति कल्पना करने के लिए ट्रैक किया गया था । स्केल बार; १०० µm । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें ।
फिल्म 4. उच्च आवर्धन में व्यक्तिगत सेल व्यवहार । व्यक्तिगत कोशिकाओं के आंदोलन (GFP; बाएँ पैनल) और उनके नाभिक (mCherry-Nuc; दाएँ पैनल) 24 ज पर उच्च आवर्धन में दिखाए जाते हैं ( चित्रा 3सी देखें). अग्रणी प्रक्रिया की शाखाकरण प्रक्रिया को पहचाना जा सकता है । स्केल बार: १०० µm । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें ।
मूवी 5. मध्ये परत प्रवास. tangentially पलायन कोशिकाओं के आंदोलन (GFP; बाएँ पैनल) और उनके नाभिक (mCherry-Nuc; दाएँ फलक) tectal मध्य परतों में दिखाया गया है पर 24 ज से संस्कृति की शुरुआत के बाद ई 6.0 ( चित्रा 3 डीदेखें). dorso साथ रैखिक प्रवासन-ventral धुरी (ऊपर से नीचे) उल्लेखनीय है । स्केल बार: १०० µm । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें ।
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Discussion
प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित सतही परतों6,8में सेल प्रवास का पता लगाने के लिए अनुकूलित है । यह मध्य परत प्रवासन धाराओं ( 5फिल्म )6,7का पता लगाने के लिए लागू है, बस electroporation के समय (ई 5.5 ई 4.5) और संस्कृति और इमेजिंग के शुरू होने से (ई 6.0 e 7.0 के लिए) स्थानांतरण ।
प्रस्तुत प्रक्रिया ovo मेंelectroporation द्वारा सेल लेबलिंग से बना है, फ्लैट-संस्कृति और समय चूक फोकल इमेजिंग (चित्रा 1) माउंट । सबसे पहले, यह एक शर्त है कि संस्कृति की स्थिति को स्वस्थ ऊतक रखने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए और vivo मेंके रूप में आम तौर पर बढ़ रही है । यह भी सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि ऊतक के उंमुखीकरण सेल प्रवास का पता लगाने के लिए उपयुक्त है । इस तरह के प्रयोजनों के लिए, हम सेल डालने पर एक फ्लैट माउंट संस्कृति लागू होते हैं, जो क्षैतिज कोशिका फैलाव के अवलोकन की सुविधा देता है और उच्च ऑक्सीजन के साथ समृद्ध माध्यम की आपूर्ति करता है । संस्कृति की स्थिति और अभिविंयास सुनिश्चित करने के बाद, यह दृश्य के लिए महत्वपूर्ण है के लिए बेहतर फ्लोरोसेंट लेबलिंग की परस्पर विरोधी शर्तों को समायोजित करने के लिए सबसे कम इलेक्ट्रॉनिक और फोटो नुकसान । बेहतर लेबलिंग के लिए, हम एक कुशल प्रमोटर और electroporate केंद्रित डीएनए के साथ एक सदिश अभिव्यक्ति चुन सकते हैं । सबसे कम नुकसान प्राप्त करने के लिए, यह electroporation की बिजली की हालत उदारवादी महत्वपूर्ण है, कम डीएनए एकाग्रता, और लेजर विकिरण के कुल समय को कम ।
इस प्रोटोकॉल का एक लाभ सेल डालने पर फ्लैट माउंट संस्कृति का उपयोग कर रहा है कि हम लंबी अवधि में स्पर्श कक्ष प्रवास का निरीक्षण कर सकते हैं । आम तौर पर, यह कितनी देर तक संस्कृति में ऊतक कि ovo मेंकी तुलना में शारीरिक स्थितियों को बनाए रखता है निर्धारित करने के लिए मुश्किल है । बेहद कम से कम, सतही स्पर्श प्रवास ई 7.0, जो सामांय सेलुलर फैलाव कि ovo8में इसी तरह से पता चलता है पर संस्कृति की शुरुआत के बाद ७२ ज पर जारी है । इसके अलावा, ताजा ऊतक संस्कृति और इमेजिंग के शुरू में बाद के चरणों में प्रवास का पालन करने के लिए तैयार है । यह भी लाभप्रद है कि कोशिका विस्थापन एक लंबी अवधि के बाद किया जा सकता है क्योंकि कोशिकाओं क्षैतिज tectum के सतही फ्लैट शीट में चलती रहती है, जो उद्देश्य लेंस के करीब है । फोकल प्रणाली का उपयोग भी z-अक्ष के साथ सेल आंदोलन पर नज़र रखने की सुविधा । दूसरी ओर, इस विधि का एक नुकसान यह है कि फ्लैट माउंट संस्कृति हमेशा दोहराऊंगा जैसे रेडियल प्रवास के अंय प्रकार के प्रवास के लिए प्रासंगिक नहीं हो सकता है । जब विधि डालने पर tectal स्लाइस में रेडियल प्रवास का पालन करने के लिए लागू किया जाता है, tectal ऊतक की मोटाई के रूप में तेजी से वृद्धि नहीं करता है के रूप में है कि ovo में. स्लाइस कोलेजन जेल में संस्कृति विधि ऐसी परत विकास दोहराऊंगा बेहतर हो सकता है ।
के बाद से हमारे विधि क्षैतिज आंदोलन की संस्कृति डालने के लिए समानांतर का अवलोकन सक्षम बनाता है, यह संभावित फ्लोरोसेंट के अनुक्रमिक परिवर्तन का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है-सूक्ष्म संरचना लेबल, तंत्रिका ऊतक में axonal बढ़ाव सहित या गैर में सेल विस्थापन-तंत्रिका ऊतक । उदाहरण के लिए, electroporation द्वारा विकासशील तंत्रिका ट्यूब में commissural axons लेबलिंग के बाद, पूर्व के आंदोलनों और पद पार axons मंजिल प्लेट पर खुली किताब संस्कृति incising छत की थाली में visualized किया जा सकता है । बशर्ते कि सेल डालने पर उचित संस्कृति की स्थिति vivo स्थितियों में reproducing के लिए उपलब्ध है, हमारे विधि विभिन्न प्रकार के सेल और संरचनाओं के क्षैतिज आंदोलनों को कल्पना करने के लिए एक प्रभावी तकनीक प्रदान करता है ।
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Disclosures
लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।
Acknowledgments
इस काम को JSPS KAKENHI ग्रांट नंबर 15K06740 को सपोर्ट किया गया Y.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | endotoxin-free plasmid DNA purification kit |
| 20 ml syringe | TERUMO | SS-20ESZ | |
| 18 gauge needle | TERUMO | NN-1838R | |
| Fast Green | Wako | 061-00031 | |
| 100x penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| glass capillary tube | Narishige | G-1 | |
| cell culture insert | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| Laminin | SIGMA | L2020 | coating of culture insert |
| poly-L-Lysine | Peptide Institute | 3075 | coating of culture insert |
| glass bottom dish | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | culture medium |
| F12 | Gibco | 11765-054 | culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 12483 | culture medium |
| chick serum | Gibco | 16110082 | culture medium |
| 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| microsurgical knife | Surgical specialties cooperation | 72-1501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| curved scissors | AS ONE | No.11 | |
| micropipette processor | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| forceps-type electrode | BEX | LF646P3x3 | |
| pulse generator | BEX | CUY21EX | electroporator |
| fluorescence stereoscopic microscope | Leica | MZ16F | |
| inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| gas controller | Tokken | MIGM/OL-2 | |
| temperature controller | Tokai Hit | MI-IBC | |
| laser confocal unit | Olympus | FV300 |
References
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