Summary
Nous décrivons les méthodes de marquage fluorescent tangentiellement liés à la migration des cellules par électroporation et pour l’imagerie Time-lapse du mouvement cellulaire étiquetées dans une culture de montage plat afin de visualiser la migration cellulaire comportement dans le tectum optique de poussin en développement .
Abstract
Time-lapse imagerie est une méthode puissante pour analyser le comportement de cellules migratrices. Après cellule fluorescente d’étiquetage, le mouvement des cellules marquées en culture peut être enregistré sous microscopie vidéo. Pour l’analyse de la migration cellulaire dans le développement du cerveau, tranche la culture est couramment utilisée pour observer la migration cellulaire parallèle à la section de la tranche, comme la migration de cellules radiales. Cependant, peu d’informations peut être obtenue de la méthode de culture de tranche pour analyser la migration cellulaire perpendiculaire à la section de la tranche, notamment la migration cellulaire tangentielle. Nous présentons ici les protocoles d’imagerie de Time-lapse afin de visualiser la migration tangentielle cellulaire dans le tectum optique de poussin en voie de développement. Une combinaison de cellules étiquetant par électroporation in ovo et une culture de plat-montage ultérieure sur l’insert de culture cellulaire permet une détection des mouvements de cellules migratrices dans le plan horizontal. De plus, notre méthode facilitant la détection de comportement de la cellule individuelle et l’action collective d’un groupe de cellules à long terme. Cette méthode peut potentiellement être appliquée pour détecter la modification séquentielle de la fluorescent-étiquetées microstructure, y compris l’allongement axonale dans le déplacement de tissu ou de cellules neural dans le tissu non neural.
Introduction
L’étude de la migration cellulaire progresse avec la technique avancée d’imagerie live. Après cellule fluorescente d’étiquetage, le mouvement temporel de cellules marquées dans une boîte de Petri ou in vivo peut être enregistré sous microscopie vidéo. Dans l’étude du développement neuronal, les modifications morphologiques de la migration des cellules ou allongeant des axones ont été analysées à l’aide de l’imagerie Time-lapse. Pour l’imagerie efficace, il est essentiel d’appliquer une méthode appropriée pour la préparation d’étiquetage et de tissu cellulaire fluorescent, fondée sur le but de l’expérience et l’analyse. Pour l’analyse de la migration cellulaire dans le développement du cerveau, tranche la culture a été couramment utilisée pour observer la migration cellulaire parallèle à la section de la tranche, comme la cellule radiale migration1,2,3. Le système de culture de tranche est également utilisé pour détecter les tangentielles cell migration4,5, mais ce n’est pas adapté à l’analyse directionnel dans les cas où les cellules dispersent perpendiculaire à la section de la tranche.
Le tectum optique est composé d’une structure multicouche, formée par la migration des cellules radiales et tangentielles durant le développement embryonnaire. Formation de couche tectal dépend essentiellement des migrations radiales des cellules postmitotiques précurseurs neuronaux de la zone ventriculaire, et leur destination finale dans les couches est en corrélation avec leur date de naissance dans la zone ventriculaire6. En ce qui concerne la migration tangentielle, nous avons déjà indiqué deux flux de migrations dans les couches moyennes et superficielles dans un pays en développement tectum optique de poussin. Dans les couches intermédiaires pendant E6-E8, les cellules bipolaires avec un processus long de premier plan et un processus de fin mince migrent sur le dos ou sur le ventre le long de la fasciculus axone des opposantes axones efférents qui exécutent dorso-ventralement7. Après cette migration d’axophilic, les cellules se différencient en neurones multipolaires situés dans les couches profondes. Dans les couches superficielles pendant E7-E14, les cellules migratrices dispersent horizontalement en réformant un processus principaux ramifiés et dispersion dans plusieurs directions8. Après la dispersion de migration, les cellules de ces derniers se différencient finalement en neurones superficiels de morphologies différentes. Dans les deux cas, une culture de plat-Mont est efficace pour observer le mouvement cellulaire parallèle à la surface pial.
Nous présentons ici un protocole pour le Time-lapse d’imagerie afin de visualiser la migration tangentielle cellulaire dans les pays en développement poussin tectum optique7,8. Combinaison de cellule l’étiquetage par électroporation in ovoet une culture de plat-montage ultérieure sur l’insert de culture cellulaire permet la détection des migrateur direction de mouvement et de la migration cellulaire. Cette méthode vise à faciliter la détection des deux comportement de cellules individuelles dans le long terme et l’action collective d’un groupe de cellules dans le plan horizontal.
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Protocol
1. Électroporation In Ovo
- Préparer l’ADN de plasmide expression pour marquage fluorescent à haute concentration. Isoler l’ADN de 200 mL de culture bactérienne par la méthode de lyse alcaline à l’aide de colonnes échangeuses d’anions selon le protocole du fabricant (Table des matières). Mix pCAGGS-EGFP et pCAGGS-mCherryNuc à une concentration finale de 4 µg/µL de chaque.
NOTE : Purification d’ADN plasmidique exempte d’endotoxine peut être préférable pour l’électroporation. - Incuber des oeufs de poulet fertile horizontalement à 38 ° C, humidité relative de 70 %.
- Après 2,5 jours, éliminer 5 mL d’albumine (blanc d’oeuf) depuis le côté pointu de le œuf à l’aide de la seringue de 20 mL avec une aiguille de 18 calibre et sceller le trou de l’aiguille avec du ruban adhésif.
- Couper le dessus de la coquille de l’oeuf avec des ciseaux courbés pour ouvrir un trou de 2 cm de diamètre et de vérifier le stade de développement de l’embryon sous le stéréomicroscope (étape 17 de Hamburger et Hamilton9). Sceller le trou à nouveau avec du ruban adhésif.
Remarque : Cette étape peut être effectuée à tout moment E2.5-E3.0. Étapes, 1.3 et 1.4 abaisser le niveau de l’embryon dans l’oeuf pour éviter un attachement serré de l’embryon en pleine croissance et les vaisseaux sanguins à la coque. - Continuer d’incubation jusqu'à E5.5.
- Avant d’électroporation, préparer 10 µL de l’ADN de plasmide mentionné coloré avec 0,5 µL de Fast Green (25 mg/mL), 10 mL d’autoclave tamponnée au phosphate salin (PBS) contenant de la pénicilline (100 unités/mL) et streptomycine (100 μg/mL) et micropipettes fabriqués à partir tubes capillaires de verre à l’aide d’un processeur d’une micropipette. Couper l’extrémité distale de la micropipette pour faire de la bonne taille de pore selon la quantité d’ADN pour injection.
- Couper la coque étanche avec des ciseaux pour rouvrir un trou de 2,5 cm de diamètre et de définir le œuf stablement sous le microscope stéréo. Ajouter quelques gouttes de PBS dans le œuf. Décoller la membrane liquide allantoïdienne couvrant l’embryon sans hémorragie à l’aide de deux pinces fines. Retirez l’amnios de la tête de l’embryon.
- Tout en tournant la tête avec un microspatula, injecter 0,1-1 μL de l’ADN coloré dans la cavité ventriculaire gauche tectum optique à l’aide d’une micropipette relié à un tube d’aspiration.
Remarque : La quantité d’ADN injecté dépend de l’objectif de l’expérience. Solution concentrée d’ADN devrait couler et fixez le long de la paroi ventriculaire. - Placez une paire d’électrodes de type instrument (électrodes carré 3 mm avec une distance de 7 mm) de sorte que la zone cible de la tectumis optique placé entre (Figure 1étape 1).
Remarque : L’ADN est électroporés sur le côté de l’anode. - Charger un pouls avant de 30 V, 1 ms avec un intervalle de 5 ms et quatre impulsions subséquentes de 6 V, 5 ms avec un intervalle de 10 ms à l’aide du générateur d’impulsions.
Remarque : La condition électronique dépend de la taille et la distance des électrodes. Il devrait être assez fort pour réaliser une transfection efficace, mais il doit être assez modeste pour assurer le développement normal du tissu cible. - Bouchez le trou avec du ruban adhésif et continuer d’incubation. Faire tremper les électrodes dans du PBS pour enlever l’albumine avec une brosse interdentaire dans un plat en plastique. Répétez 1.7-1.11 pour chaque oeuf.
2. plat-Mont Culture sur l’insertion de cellules
- Un jour avant la culture de plat-Mont, préparer l’insert de culture cellulaire enduit. Flotter quelques inserts de culture cellulaire sur l’autoclave eau distillée dans un récipient de culture cellulaire de 10 cm. Chargez une solution de 8 µg/mL laminine et 80 µg/mL poly-L-lysine pour couvrir les inserts et laisser les inserts flottants dans l’incubateur de culture CO2 cellules à 37 ° C pendant la nuit.
Remarque : Le jour suivant, les inserts enduits peuvent être stockés à 4 ° C. - Le jour de la culture à E7.0, enlever la solution de la laminine-poly-L-lysine de l’insert et placer l’insert dans un plat de fond verre (Figure 1étape 2) rempli de 1,1 mL de milieu de culture (milieu de sérum réduit de 60 %, 20 % F12, sérum de veau fœtal de 10 %, 10 % de sérum de poussin, 50 unités/mL de pénicilline, 50 μg/mL de streptomycine). Garder le plat dans un incubateur cellule culture CO2 à 37 ° C.
NOTE : Le support peut être utilisé tout au long de la période de culture pendant trois jours sans changement. - Préparer l’installation de la culture. Définir une unité de chambre humide sur un microscope confocal inversé avec un débit de gaz de 40 % d’O2 et 5 % CO2 (controleur de gaz) à 38 ° C (régulateur de température).
- Couper la tête de l’embryon avec des ciseaux. Pincer la tête avec la pince dans la solution saline équilibrée de la Hanks glacee (HBSS) dans une boîte de Petri de cellule de 6 cm.
- Isoler l’électroporation tectum optique à l’aide de deux pinces fines. Transvaser le tectum avec un compte-gouttes en plastique dans un autre plat rempli de HBSS glacée. Utiliser le plat en verre concave une soucoupe pour le découpage à partir silicone noir.
- Vérifier la position de l’étiquette sous le microscope stéréoscopique de fluorescence. Découper le tissu tectal entourant la zone de marquage avec un couteau de microchirurgie. S’assurer que la direction du tissu dans le tectum (antéro-postérieur, dorsal-ventral).
- Transférer les tissus étiquetés avec un compte-gouttes en plastique à l’insert afin que le côté pia est fixé à l’insert. Poser le tissu tectal dans la direction désirée et enlever les excès HBSS (Figure 1étape 2).
- Répétez 2.4-2.7 afin de préparer les autres tissus sur le même insérer. Placer le plat dans la chambre préchauffée dans le microscope confocal inversé (Figure 1étape 3).
3. Time-lapse imagerie
- Vérifier l’étiquetage fluorescent et concentrer le champ microscopique dans le microscope confocal inversé. Démarrez les unités confocal laser et essayez le balayage confocal pour régler la direction et la position du tissu le long du X et l’axe des ordonnées dans le domaine de l’échantillonnage. Utilisez le 10 X ou 20 X objectif sans huile à immersion.
- Sélectionnez la taille d’analyse (p. ex., 512 x 512 dpi). Décider de l’intervalle et l’étendue totale de l’analyse confocale le long de l’axe z. Prendre un intervalle de 5 à 10 µm pour la gamme de 100 µm. Déterminer l’intervalle de temps de l’imagerie confocale et imagerie durée (p. ex., intervalles de 10 min après 48 h) au total.
Remarque : Pour éviter la phototoxicité de laser, interdire de balayage dans la taille de numérisation élevée avec z-intervalles courts pour la gamme z longue ou avec des intervalles de temps pendant la durée de temps d’imagerie. Par exemple, lorsque vous appliquez une taille de numérisation élevée (par exemple, 1024 x 1024 dpi), diminuer le nombre d’analyses le long de l’axe z. - Ensemble les paramètres de la course à pied confocal programme décrit en 3.2 et commencent d’imagerie.
- Après l’imagerie, combiner les images confocales à différent axe z pour fournir des images de z-pile avec réglage focal à chaque instant.
- Ajouter les z-empiler les images à différent temps-point et construire un Time-lapse film en format AVI.
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Representative Results
La figure 2 montre la migration tangentielle superficielle visualisée dans une culture de plat-Mont à un temps écoulé (0, 9, 18, 27 h) après le début de l’enregistrement. Film 1 est un film Time-lapse des intervalles de 10 min sur une période de 28 h et 50 min. Le cadre est sélectionné pour se concentrer sur les cellules migratrices du coin en bas à gauche marqué de la trame à l’espace sans étiquette (Figure 3 a). Le mouvement de masse des cellules migratrices (GFP ; panneau gauche supérieur, Movie 1) et leurs noyaux (mCherry-Nuc ; panneau droit supérieur) peut être observées avec le film fusionné (panneau inférieur, Movie 1). Directivité de la migration de cellules peut être examinée en mettant l’accent sur les cellules de dispersion du centre marqué dans toutes les directions (film 2, Figure 3 b).
Les images claires du mouvement nucléaire (film 2; mCherry-Nuc, panneau de droite) nous permet de retracer la migration nucléaire cellule de suivi automatique à l’aide d’un Tracker Particle plugin10 d’une application de ImageJ11 de traitement d’image de Fidji (Film 3, Figure 3 b). Les changements temporels des trajectoires de la migration tangentielle peuvent être visualisées pour prouver la migration dispersant dans OMNI-directions.
Comportement de la cellule individuelle avec le changement morphologique séquentiels du processus principaux, les noyaux et les processus peut se manifester avec des images de grossissement supérieure de l’intervalle de 5 min (film 4, Figure 3).
Un autre type de migration tangentielle dans les couches intermédiaires7 peut être visualisé à l’aide d’un protocole similaire (film 5, Figure 3D). Bidirectionnelle migration linéaire le long du faisceau axon exécutant dorsal au bord ventral (haut en bas) est évident7.
Figure 1. Organigramme de protocole. Étape 1 : électroporation in ovo. Etape 2 : Pose des tissus tectal afin que le côté pia est fixé à l’insert. Étape 3 : Microscope inversé à fluorescence avec unité confocal laser. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Visualisation de la migration tangentielle superficielle culture plat-Mont. Les cellules migratrices tangentiellement (GFP ; panneau supérieur) et le noyau (mCherry-Nuc ; panneau inférieur) dans les couches superficielles du tectum optique sont indiqués à 0, 9, 18, 27 h après le début de la culture de E7.0. Les cellules au coin inférieur gauche du cadre sont étiquetés à 0 h (voir la Figure 3 a). Echelle : 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3. Figure schématique illustrant les conditions de montage pour l’imagerie Time-lapse. La forme de la zone de marquage fluorescent (verte), la direction initiale de la migration cellulaire (magenta) et image vidéo (carré noir) ont été illustrés avec un grossissement de l’objectif (obj) et zoom numérique (zoom) dans le champ supérieur, avec jour d’électroporation (EP ) et l’apparition de la culture (culture) dans le domaine de fond. A film 1, (B) film 2 et 3, (C) Movie 4, D film 5. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Film de 1. Visualisation du superficielle migration tangentielle dans une culture de plat-Mont. Mouvement des cellules migratrices tangentiellement (GFP ; panneau gauche supérieur) et leurs noyaux (mCherry-Nuc ; panneau droit supérieur) dans les couches superficielles du tectum optique après l’apparition de la culture de E7.0. L’image fusionnée apparaît dans le panneau inférieur. Les cellules au coin inférieur gauche du cadre sont étiquetés à 0 h (voir la Figure 3 a), et les images de Time-lapse furent capturés pendant 28 h et 50 min barre d’échelle : 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. Faites un clic droit pour télécharger.
Movie 2. Disperser le mouvement des cellules migratrices tangentiellement (GFP ; panneau de gauche) et leurs noyaux (mCherry-Nuc ; panneau droit) depuis le Centre des deux panneaux sont affichés après 48 h (voir la Figure 3 b). Echelle : 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. Faites un clic droit pour télécharger.
Movie 3. Trajectoires de migration tangentielle. Déplacement du noyau cellulaire (le panneau droit du film 2) a été suivi pour visualiser les trajectoires de la migration tangentielle. Barre d’échelle ; 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. Faites un clic droit pour télécharger.
Movie 4. Comportement de cellules individuelles dans un grossissement supérieur. Mouvement des cellules individuelles (GFP ; panneau de gauche) et leurs noyaux (mCherry-Nuc ; panneau de droite) sont indiquées dans un grossissement supérieur plus de 24 h (voir Figure 3). Processus de ramification du processus principaux peuvent être reconnues. Echelle : 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. Faites un clic droit pour télécharger.
Film 5. Migration de couche intermédiaire. Mouvement des cellules tangentiellement migration (GFP ; panneau de gauche) et de leur noyau (mCherry-Nuc ; panneau de droite) dans les couches intermédiaires opposantes sont montrés sur une période de 24 h après le début de la culture du E6.0 (voir Figure 3D). La migration linéaire le long de l’axe dorso-ventral (haut en bas) est remarquable. Echelle : 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. Faites un clic droit pour télécharger.
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Discussion
Le protocole décrit ci-dessus est optimisé pour la détection de la migration cellulaire dans les couches superficielles6,8. Elle est applicable pour la détection de couche intermédiaire migration flux (film 5)6,7, juste en déplaçant le timing de l’électroporation (E5.5 à E4.5) et l’apparition de la culture et en imagerie (E7.0 à E6.0).
La procédure présentée est composée de cellules étiquetant par électroporation in ovo, la culture de plat-Mont et imagerie confocale Time-lapse (Figure 1). Tout d’abord, c’est une condition sine qua non que les conditions de culture doivent être optimisées pour garder le tissu sain et grandissant normalement comme le in vivo. Il est également crucial pour s’assurer que l’orientation du tissu est adaptée pour la détection de la migration cellulaire. À ces fins, nous appliquons une culture plat-Mont sur insert cellulaire, ce qui facilite l’observation de la dispersion des cellules horizontales et fournit un milieu riche en oxygène élevée. Après avoir vérifié l’état de la culture et l’orientation, il est essentiel pour la visualisation, ajuster les conditions contradictoires de marquage fluorescent mieux avec le moins électronique et la photo dommage. Pour l’étiquetage mieux, nous pouvons choisir un vecteur d’expression avec un promoteur efficace et concentrée d’oligonucléotides ADN. Pour atteindre moins de dommages, il est important de modérer l’État électrique de l’électroporation, abaisser la concentration de l’ADN et minimiser la durée totale de l’irradiation laser.
Un avantage du présent protocole à l’aide de la culture de plat-montage sur l’insertion de la cellule, c’est que nous pouvons observer la migration cellulaire tangentielle à long terme. En règle générale, il est difficile de déterminer combien de temps le tissu dans la culture maintient les conditions physiologiques par rapport à celui d’ovo. À tout le moins, migration tangentielle superficielle continue plus 72 h après le début de la culture à E7.0, qui montre la dispersion cellulaire normale semblable à celui d’ovo8. En outre, les tissus frais sont préparé au début de la culture et de l’imagerie pour observer la migration à un stade ultérieur. Il est aussi avantageux que le déplacement de la cellule peut être suivi sur une longue période parce que les cellules demeurent mobiles horizontalement dans les fiches plates superficielles du tectum, qui se trouve à proximité de l’objectif. En utilisant le système confocal facilite également le suivi des déplacements le long de l’axe z de la cellule. En revanche, un inconvénient de cette méthode est que la culture de montage plat ne peut pas toujours être pertinente pour récapituler les autres types de migration tels que les migrations radiale. Lorsque la méthode est appliquée pour observer la migration radiale dans la tranche tectal sur l’insert, l’épaisseur du tissu tectal n’augmente pas aussi rapidement que celui d’ovo. La méthode de culture de tranche dans le gel de collagène peut être préférable de récapituler ce développement de la couche.
Notre méthode permettant l’observation du mouvement horizontal parallèle à l’insert de la culture, il peut potentiellement être appliqué pour la détection de changement séquentiel de la fluorescent-étiquetées microstructure, y compris l’allongement axonale dans le tissu neural ou déplacement de cellules dans le tissu non neural. Par exemple, après marquage commissurales axones dans le développement du tube neural par électroporation, mouvements des axones préalables- et post-passage à niveau sur la plaque de plancher peuvent être visualisées dans la culture de livre ouvert, inciser la plaque de toit. Pourvu que la condition de culture appropriées sur l’insertion de la cellule est disponible pour la reproduction des conditions in vivo , notre méthode fournit une technique efficace pour visualiser les mouvements horizontaux de divers types de cellules et des structures.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par JSPS KAKENHI Grant Number 15K 06740 à Y.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | endotoxin-free plasmid DNA purification kit |
| 20 ml syringe | TERUMO | SS-20ESZ | |
| 18 gauge needle | TERUMO | NN-1838R | |
| Fast Green | Wako | 061-00031 | |
| 100x penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| glass capillary tube | Narishige | G-1 | |
| cell culture insert | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| Laminin | SIGMA | L2020 | coating of culture insert |
| poly-L-Lysine | Peptide Institute | 3075 | coating of culture insert |
| glass bottom dish | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | culture medium |
| F12 | Gibco | 11765-054 | culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 12483 | culture medium |
| chick serum | Gibco | 16110082 | culture medium |
| 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| microsurgical knife | Surgical specialties cooperation | 72-1501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| curved scissors | AS ONE | No.11 | |
| micropipette processor | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| forceps-type electrode | BEX | LF646P3x3 | |
| pulse generator | BEX | CUY21EX | electroporator |
| fluorescence stereoscopic microscope | Leica | MZ16F | |
| inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| gas controller | Tokken | MIGM/OL-2 | |
| temperature controller | Tokai Hit | MI-IBC | |
| laser confocal unit | Olympus | FV300 |
References
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