Summary
Мы описываем методы для люминесцентные маркировки вскользь мигрирующих клеток путем электропорации и для покадровой изображений меткой ячейки движения в квартиру гора культуры для того, чтобы визуализировать миграции клеток поведение в развивающихся куриных оптические tectum .
Abstract
Промежуток времени изображений является мощный метод для анализа миграции поведение клеток. После люминесцентные клеток маркировки движение помеченных клеток в культуре может быть записан под видео микроскопии. Для анализа миграции клеток развивающегося мозга, ломтик культуры обычно используется для наблюдать миграции клеток параллельно срез секции, например радиальные клеток миграции. Однако ограниченную информацию можно получить из метода slice культуры для анализа миграции клеток, перпендикулярно срез секции, такие как тангенциальная клеток миграции. Здесь мы представляем протоколы для покадровой изображений визуализировать тангенциальная клеток миграции в развивающихся куриных оптические tectum. Сочетание клетки маркировки электропорации в ovo и последующие культуры плоским гора на вкладыше культуры клеток позволяет обнаружение перенос клеточного движения в горизонтальной плоскости. Кроме того наш метод облегчает обнаружение как поведение отдельной клетки, так и коллективных действий группы клеток в долгосрочной перспективе. Этот метод потенциально может применяться для обнаружения последовательные изменения люминесцентные меченых микро-структуры, включая аксональное удлинение в нейронной ткани или клетки перемещения в не нервной ткани.
Introduction
Изучение миграции клеток развивается с развивающейся техникой живых изображений. После люминесцентные клеток маркировки височной движение помеченных клеток в культуре блюдо или в естественных условиях может быть записан под видео микроскопии. В изучении нейронных развития морфологические изменения миграции клеток или удлинения аксоны были проанализированы с использованием промежуток времени визуализации. Для эффективной обработки изображений, важно, чтобы применить подходящий метод подготовки люминесцентные клеток тканей и маркировки, основанные на Цель эксперимента и анализ. Для анализа миграции клеток развивающегося мозга, ломтик культуры часто используются для наблюдать миграции клеток параллельно срез секции, например радиальные клеток миграции1,2,3. Срез культуры система также используется для обнаружения тангенциальная клеток миграции4,5, но это не подходит для направления анализа в тех случаях, где клетки разогнать перпендикулярный срез секции.
Оптоволоконный tectum состоит из многослойной структуры, образованные радиального и тангециального клеток миграции во время эмбрионального развития. Формирование тектальный слоя зависит главным образом от радиального миграции клеток-постмитотических нейрональных предшественников из желудочков зоны, и их конечного назначения в слоях коррелирует с даты их рождения в Вентрикулярная зона6. Что касается тангенциальная миграции мы сообщалось ранее двух потоков миграции в средних и поверхностных слоев в развивающихся куриных оптические tectum. В средних слоях во время E6-E8 биполярный клетки с давно ведущих процесс и тонкие завершающие процесс миграции дорзально или вентрально вдоль аксона fasciculus тектальный эфферентной аксонов, использующих dorso вентрально7. После этого axophilic миграции клетки дифференцироваться в многополярном нейроны, расположенные в глубоких слоях. В поверхностных слоях во время E7-E14 мигрирующих клеток расходятся горизонтально путем реформирования разветвленной ведущих процесс и разброс в несколько направлений8. После диспергирования миграции, последний клетки в конечном итоге дифференцироваться в поверхностных нейроны различных морфологии. В обоих случаях с плоским гора культура эффективно соблюдать клеточного движения параллельно сетчаточных поверхности.
Здесь мы представляем собой протокол для покадровой imaging для визуализации тангенциальная клеток миграции в оптические tectum развивающихся куриных,7,,8. Сочетание клетки маркировки электропорации в ovo, и последующие культуры с плоским гора на вкладыше культуры клеток позволяет обнаружение перенос направления движения и миграции клеток. Цель этого метода является для облегчения обнаружения поведения как отдельной ячейки в долгосрочной перспективе и коллективных действий группы клеток в горизонтальной плоскости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Электропорация в Ovo
- Подготовьте выражение плазмидной ДНК люминесцентные маркировки в высокой концентрации. Изолируйте ДНК от 200 мл бактериальной культуры щелочного литического методом с использованием Анионообменная столбцы по данным производителя протокол (Таблица материалов). Смесь pCAGGS-EGFP и pCAGGS-mCherryNuc в конечной концентрации 4 мкг/мкл каждого.
Примечание: Бесплатно эндотоксина плазмида ДНК очистки может быть предпочтительным для электропорации. - Инкубируйте плодородные куриные яйца горизонтально на 38 ° C в 70% относительной влажности.
- После 2,5 дня ликвидировать 5 мл белка (белок) со стороны указал яйцо с помощью 20 мл шприц с иглой 18 калибр и запечатать отверстие иглы с лентой.
- Вырежьте в верхней части скорлупы яиц с изогнутые ножницы, чтобы открыть отверстие 2 см в диаметре и проверить стадии развития эмбриона под стереомикроскопом (этап 17 гамбургер и Хэмилтон9). Запечатать отверстие снова с лентой.
Примечание: Этот шаг можно выполнить в любое время во время E2.5-E3.0. Шаги, 1.3 и 1.4 снизить уровень эмбриона в яйцо, чтобы избежать жесткой приверженности верхней оболочки растущий эмбрион и кровеносных сосудов. - Продолжать инкубации до E5.5.
- Перед электропорация Подготовьте 10 мкл упомянутых плазмида ДНК цветные с 0.5 мкл быстро Грин (25 мг/мл), 10 мл газобетона фосфата буфер солевой (PBS) содержащие пенициллин (100 единиц/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл) и micropipettes из стеклянные капиллярные трубки с помощью микропипеткой процессора. Вырежьте дистального наконечника микропипеткой сделать соответствующий размер поры в зависимости от количества ДНК для инъекций.
- Вырежьте запечатанных верхней оболочки с ножницами, чтобы открыть отверстия 2,5 см в диаметре и задать яйцо стабильно под стерео Микроскоп. Добавьте несколько капель PBS в яйцеклетку. Отделите allantoic мембраны, охватывающих эмбриона без кровоизлияния, используя две прекрасные щипцами. Удалите из головы эмбриона амнион.
- При повороте головы с microspatula, придать 0,1-1 мкл цветные ДНК в полость желудочков левой оптические tectum, используя микропипеткой подключен к всасывающую трубу.
Примечание: Количество ДНК вводят зависит от цели эксперимента. Концентрированный раствор ДНК следует раковина и прикрепить вдоль стены желудочков. - Место пара forcep тип электродов (квадратный электродов 3 мм с расстоянием 7 мм), так что целевой области оптоволоконных tectumis помещен между (рис. 1Шаг 1).
Примечание: ДНК-electroporated в сторону анода. - Оплата до пульс 30 V, 1 мс с интервалом в 5 мс и четырех последующих импульсов 6 V, 5 мс с интервалом в 10 мс, с помощью генератора импульсов.
Примечание: Электронные состояния зависит от размера и расстояния электродов. Она должна быть достаточно сильны, чтобы добиться эффективного трансфекции, но она должна быть достаточно скромный, чтобы обеспечить нормальное развитие ткани-мишени. - Запечатать отверстие с лентой и продолжить инкубации. Смочите электроды в PBS для удаления белка с Интердентальные щетки в пластиковую посуду. 1.7-1.11 повторите для каждого яйца.
2. квартира гора культура на Вставка ячеек
- Один день перед плоским гора культуры, подготовьте Вставка культуры клеток с покрытием. Поплавок культуры вставки некоторые ячейки на газобетона дистиллированной воды в блюдо культуры клеток 10-см. Загрузите решение 8 мкг/мл Ламинин и 80 мкг/мл поли L-Лизин для покрытия вставок и оставить плавали вставок в инкубатор культуры CO2 клетки при 37 ° C на ночь.
Примечание: На следующий день, покрытые вставок могут храниться при 4 ° C. - День культуры в E7.0 удалить раствор Ламинин поли L-лизин из вставки и место вставки в стекла дно блюдо (рис. 1Шаг 2) заполнены с 1,1 мл питательной среды (60% сокращение сыворотке средний, 20% F12, 10% плода бычьим сывороточным, 10 % куриных сыворотки, 50 единиц/мл пенициллин, 50 мкг/мл стрептомицина). Держите блюдо в ячейку культуры CO2 инкубатора 37 ° c.
Примечание: Носитель может использоваться на протяжении всего периода культуры за три дня без изменений. - Подготовка установки культуры. Задайте единицу влажной камере на Перевернутый Конфокальный микроскоп с газового потока 40% O2 и 5% CO2 (Газ контроллер) в 38 ° C (контроллер температуры).
- Вырежьте голове эмбриона с ножницами. Щепотку голову с щипцами в ледяной Hanks сбалансированного солевого раствора (HBSS) в блюдо культуры клеток 6-см.
- Изолируйте electroporated оптические tectum, используя две прекрасные щипцами. Перенесите tectum с пластиковые капельницы в другое блюдо, наполненный ледяной HBSS. Используйте кривыми стеклянную посуду, основанный с Черный кремний как блюдце для резки.
- Проверьте положение маркировки под стереоскопическим микроскопом флуоресценции. Вырежьте тектальный ткани, окружающие области маркировки микрохирургическое ножом. Убедитесь, что направление ткани в tectum (передняя кзади, спинной вентральной).
- Приклеенные этикетку ткани с пластиковые капельницы можно передать insert чтобы сторона Пиа прилагается к вставка. Положите тектальный ткани в нужном направлении и удалите избыток HBSS (рис. 1Шаг 2).
- Повторите, вставить 2,4-2,7 с целью подготовки других тканей на то же самое. Поместите блюдо в зале подогретую в Перевернутый Конфокальный микроскоп (рис. 1Шаг 3).
3. промежуток времени изображений
- Проверьте люминесцентные маркировки и сосредоточиться микроскопическом поле в Перевернутый конфокального микроскопа. Запустите лазерного конфокального единиц и попробуйте выборки конфокальный сканирования настроить положение ткани вдоль X и y в области и направление. Используйте 10 X или 20 X объектив без погружения нефти.
- Выберите размер сканирования (например, 512 x 512 точек на дюйм). Решите, интервал и полный диапазон конфокальный сканирования вдоль оси z. Возьмите 5 или 10 мкм интервал диапазона 100 мкм. Определить интервал времени конфокальная томография и общей визуализации продолжительности (например, интервалы более 48 ч 10 мин).
Примечание: Чтобы избежать Фототоксичность лазер, запретить сканирование в высокий размер сканирования с короткими z интервалами для долгого z диапазона, или короткие интервалы времени во время долго изображений продолжительность. Например при применении высокий размер сканирования (например, 1024 x 1024 точек на дюйм), уменьшите количество сканов вдоль оси z. - Набор параметров конфокальный работает программа описана в 3.2 и начать изображений.
- После обработки изображений, объединяйте конфокальный изображения на различных z-axis предоставлять z стек изображений с тонкой регулировки фокуса в каждый момент времени.
- Добавление z стек изображений в другой момент времени и построить покадровой фильм в формате AVI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 2 показывает Визуализация поверхностного тангенциальная миграции в культуре с плоским гора в прошедшее время (0, 9, 18, 27 h) после начала записи. Фильм 1 — промежуток времени фильм 10 мин-интервалов в течение 28 ч 50 мин. Рамка, выбранная для фокусировки на мигрирующих клеток от помечены левого нижнего угла кадра в неподписанном пространство (рис. 3A). Массовое движение мигрирующих клеток (GFP; верхней левой панели, фильм 1) и их ядра (mCherry КНУ; верхней правой панели) может наблюдаться с Объединенной кино (Нижняя панель, фильм 1). Направленность миграции клеток может рассматриваться, сосредоточив внимание на диспергирования клетки от центра метками во всех направлениях (фильм 2, рис. 3B).
Четкие изображения ядерной движения (фильм 2; mCherry КНУ, правая панель) позволяет нам отслеживать ядерный миграции клеток путем автоматического отслеживания с помощью частицы Tracker плагин10 обработки приложение ImageJ11 изображений Фиджи (Фильм 3, рис. 3B). Временные изменения траекторий касательной миграции могут быть визуализированы доказать диспергирования миграции в omni направлениях.
Поведение отдельных клеток с последовательным морфологические изменения ведущих процесса, сопровождения процесса и ядер может проявляться с выше увеличение изображения 5 мин-интервалов (фильм 4, рис. 3 c).
Другой тип тангенциальная миграции в среднем слои7 могут быть визуализированы с помощью аналогичный протокол (фильм 5, рис. 3D). Двунаправленный линейной миграции вдоль аксона fasciculus работает спинной вентральный (сверху вниз) является очевидным7.
Рисунок 1. Протокол схема. Шаг 1: электропорация в ovo. Шаг 2: Прокладка тектальный ткани таким образом, чтобы сторона Пиа прилагается к вставка. Шаг 3: Перевернутый флуоресцентный микроскоп с лазерного конфокального блока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Визуализация поверхностных тангенциальная миграции в квартиру гора культуры. Вскользь мигрирующих клеток (GFP; верхней панели) и ядра (mCherry КНУ; нижней панели) в поверхностных слоях оптические tectum указаны на 0, 9, 18, 27 ч после начала культуры от E7.0. Клетки в левом нижнем углу кадра помечены в 0 ч (см. Рисунок 3А). Линейки: 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Схематический рисунок, иллюстрирующие горе условия для покадровой изображений. Форма люминесцентные маркировки (зеленый), начальное направление миграции клеток (пурпурный), и кадр видео (черный квадрат) были иллюстрированный с увеличением объектива (obj) и цифровое масштабирование (зум) в верхнем поле, с днем электропорации (EP ) и возникновения культуры (культуры) в нижней области. (А) фильм 1, (B) фильм 2 и 3, (C) фильм 4, (D) фильм 5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Фильм 1. Визуализация поверхностных тангенциальная миграции в квартиру гора культуры. Движение касательной мигрирующих клеток (GFP; верхней левой панели) и их ядра (mCherry КНУ; верхней правой панели) в поверхностных слоях оптические tectum после начала культуры от E7.0. Объединенное изображение отображается в нижней панели. Клетки в левом нижнем углу кадра помечены в 0 ч (см. рис. 3а), и промежуток времени изображения были захвачены в плен свыше 28 ч 50 мин шкалы бар: 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь для просмотра этого видео. Щелкните правой кнопкой мыши скачать.
Фильм 2. Диспергирование движение касательной мигрирующих клеток (GFP; левой панели) и их ядра (mCherry КНУ; правой панели) от центра обеих групп отображаются более 48 ч (см. рисунок 3B). Линейки: 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь для просмотра этого видео. Щелкните правой кнопкой мыши скачать.
Фильм 3. Траекторий касательной миграции. Перемещение клеточного ядра (правая панель фильм 2) было считано для визуализации траекторий касательной миграции. Линейки шкалы; 100 µm. пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. Щелкните правой кнопкой мыши скачать.
Фильм 4. Поведение отдельных клеток в увеличение. Движения отдельных клеток (GFP; левой панели) и их ядра (mCherry КНУ; справа) показаны увеличение более 24 часов (см. рис. 3 c). Ветвления процесса ведущих процесса может быть признано. Линейки: 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь для просмотра этого видео. Щелкните правой кнопкой мыши скачать.
Фильм 5. Средний слой миграции. Движение касательной мигрирующих клеток (GFP; левой панели) и их ядра (mCherry КНУ; правой панели) в средних слоях тектальный показано более 24 ч после начала культуры с E6.0 (см. рис. 3D). Примечательна линейной миграции вдоль оси dorso вентральный (сверху вниз). Линейки: 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь для просмотра этого видео. Щелкните правой кнопкой мыши скачать.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанные выше протокол оптимизирован для обнаружения миграции клеток в поверхностных слоях6,8. Это применимо для обнаружения среднего уровня миграции потоков (фильм 5)6,7, просто перенос сроков электропорации (E5.5 E4.5) и начала культуры и изображений (E7.0 E6.0).
Представлена процедура состоит из клеток маркировки электропорации в ovo, плоским гора культуры и time-lapse конфокальная томография (рис. 1). Во-первых это условие, что в условиях культуры должны быть оптимизированы сохранить ткани, здоровым и растущей обычно как в естественных условиях. Важно также обеспечить, что ориентация ткани подходит для обнаружения миграции клеток. Для таких целей мы применяем культуры с плоским гора на вставить ячейки, которая облегчает наблюдение горизонтальных ячеек дисперсии и поставляет богатой среды с высокой кислородом. После обеспечения культуры состояния и ориентации, важно для визуализации для регулировки противоречивые условия лучше люминесцентные маркировки с наименее электронных и фото убытков. Для улучшения маркировки, мы можем выбрать вектора выражения с эффективным пропагандистом и electroporate сосредоточены ДНК. Для достижения наименьший ущерб, важно для умеренного электрические состояние электропорация, снижения концентрации ДНК и свести к минимуму общее время лазерного облучения.
Преимуществом этого протокола, с помощью культуры с плоским гора на вставки ячейки является, что мы можем наблюдать тангенциальная клеток миграции в долгосрочной перспективе. Как правило трудно определить, как долго ткани в культуре поддерживает физиологические условия по сравнению с что в ovo. По крайней мере поверхностные тангенциальная миграции продолжается более 72 ч после начала культуры в E7.0, который показывает нормальной клеточной дисперсии, похоже что в ovo8. Кроме того свежие ткани готовится в начале культуры и изображений соблюдать миграции на более поздних этапах. Это также выгодно перемещения ячейки могут следовать в течение долгого потому что клетки остаются движущихся горизонтально в поверхностных плоские листы tectum, который находится недалеко от объектива. С помощью конфокальной системы также облегчает отслеживание ячейки движения вдоль оси z. С другой стороны недостатком этого метода является, что квартира гора культуры не всегда могут иметь отношение к повторить другие виды миграции как радиальная миграция. Когда соблюдать радиальная миграция в тектальный слайс Вставка применяется метод, толщина тектальный ткани не увеличивается как быстро, как это в ovo. Метод slice культуры в гель коллагена может быть лучше, чтобы напомнить такого уровня развития.
Так как наш метод позволяет наблюдения параллельно культуры вставка горизонтального движения, может потенциально применяться для обнаружения последовательных изменений люминесцентные меченых микро-структуры, включая аксональное удлинение в нервной ткани или смещение ячейки в не нервной ткани. Например после маркировки спаечном аксоны в развивающихся нервной трубки, электропорация, движения до и после пересечения аксоны над напольной плиты могут быть визуализированы в культуре открытой книги, промо плиты крыши. Условии, что соответствующие культуры условие вставки ячейки доступны для воспроизведения в vivo условий, наш метод обеспечивает эффективный метод для визуализации горизонтальные движения различных типов клеток и структур.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана JSP-страницы KAKENHI Грант номер 15K 06740 для Y.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | endotoxin-free plasmid DNA purification kit |
| 20 ml syringe | TERUMO | SS-20ESZ | |
| 18 gauge needle | TERUMO | NN-1838R | |
| Fast Green | Wako | 061-00031 | |
| 100x penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| glass capillary tube | Narishige | G-1 | |
| cell culture insert | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| Laminin | SIGMA | L2020 | coating of culture insert |
| poly-L-Lysine | Peptide Institute | 3075 | coating of culture insert |
| glass bottom dish | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | culture medium |
| F12 | Gibco | 11765-054 | culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 12483 | culture medium |
| chick serum | Gibco | 16110082 | culture medium |
| 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| microsurgical knife | Surgical specialties cooperation | 72-1501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| curved scissors | AS ONE | No.11 | |
| micropipette processor | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| forceps-type electrode | BEX | LF646P3x3 | |
| pulse generator | BEX | CUY21EX | electroporator |
| fluorescence stereoscopic microscope | Leica | MZ16F | |
| inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| gas controller | Tokken | MIGM/OL-2 | |
| temperature controller | Tokai Hit | MI-IBC | |
| laser confocal unit | Olympus | FV300 |
References
- Marín, O., Rubenstein, J. L. R. Cell migration in the forebrain. Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).
- Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time imaging. Cerebral Cortex. 13, 607-611 (2003).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 23, 9996-10001 (2003).
- Martini, F. J., et al. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136, 41-50 (2009).
- Polleux, F., Whitford, K. L., Dijkhuizen, P. A., Vitalis, T., Ghosh, A. Control of cortical interneuron migration by neurotrophins and PI3-kinase signaling. Development. 129, 3147-3160 (2002).
- Watanabe, Y., Yaginuma, H. Tangential cell migration during layer formation of chick optic tectum. Development, Growth and Differentiation. 57, 539-543 (2015).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. NRP1-mediated Sema3A signals coordinate laminar formation in the developing chick optic tectum. Development. 141, 3572-3582 (2014).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. Dispersing movement of neuronal tangential migration in superficial layers of the developing chick optic tectum. Developmental Biology. 437, 131-139 (2018).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Cordelières, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLOS One. 8, e81266 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
