Summary
Descriviamo i metodi per l'etichettatura fluorescente di tangenzialmente migrazione cellule mediante elettroporazione e per l'imaging di time-lapse del movimento cellulare con etichetta in una cultura di piatto-Monte al fine di visualizzare la migrazione delle cellule comportamento nel tectum ottica di pulcino in via di sviluppo .
Abstract
Time-lapse imaging è un potente metodo per analizzare il comportamento di migrazione delle cellule. Dopo d'etichettatura delle cellule fluorescenti, il movimento delle cellule con etichettate nella cultura può essere registrato sotto video microscopia. Per l'analisi di migrazione delle cellule nel cervello in via di sviluppo, fetta di cultura è comunemente usato per osservare la migrazione cellulare parallela alla sezione fetta, come ad esempio la migrazione cellulare radiale. Tuttavia, limitati informazioni possono essere ottenute dal metodo di cultura slice per analizzare la migrazione cellulare perpendicolare alla sezione fetta, come ad esempio la migrazione cellulare tangenziale. Qui, presentiamo i protocolli per time-lapse di imaging per visualizzare la migrazione cellulare tangenziale nel tectum ottica di pulcino in via di sviluppo. Una combinazione di cella etichettatura da elettroporazione in ovo e una successiva cultura di piatto-Monte sull'inserto di cultura cellulare consente il rilevamento di movimento di migrazione cellulare nel piano orizzontale. Inoltre, il nostro metodo facilita il rilevamento del comportamento delle singole celle e l'azione collettiva di un gruppo di cellule a lungo termine. Questo metodo può essere applicato potenzialmente per rilevare la modifica sequenza della fluorescente-etichetta micro-struttura, compreso l'allungamento assonale nello spostamento dei tessuti o cellule neurale nel tessuto non neurali.
Introduction
Lo studio della migrazione cellulare è proseguito con la tecnica avanzata di imaging dal vivo. Dopo d'etichettatura delle cellule fluorescenti, l'andamento temporale delle cellule con etichettate in una piastra di coltura o in vivo può essere registrato sotto video microscopia. Nello studio dello sviluppo neurale, i cambiamenti morfologici della migrazione di cellule o allungando gli assoni sono stati analizzati usando la formazione immagine di time-lapse. Per l'imaging efficace, è indispensabile applicare un metodo adatto per la preparazione di etichettatura ed il tessuto delle cellule fluorescenti, basata allo scopo dell'esperimento e analisi. Per l'analisi di migrazione delle cellule nel cervello in via di sviluppo, fetta di cultura è stato comunemente utilizzato per osservare la migrazione cellulare parallela alla sezione fetta, come cellula radiale migrazione1,2,3. Il sistema di cultura fetta è usato anche per la rilevazione di cellule tangenziale migrazione4,5, ma non è adatto per analisi direzionale in casi dove le cellule disperdono perpendicolare alla sezione fetta.
Il tectum ottica è composta da una struttura multistrata, formata da migrazione di cellule radiali e tangenziali durante lo sviluppo embrionale. Formazione dello strato tectal dipende in primo luogo radiale migrazione delle cellule postmitotic precursori neuronali dalla zona ventricolare e destinazione finale negli strati correla con la loro data di nascita in zona ventricolare6. Per quanto riguarda la migrazione tangenziale, precedentemente abbiamo segnalato due flussi di migrazioni negli strati medio e superficiale in un tectum ottica di pulcino in via di sviluppo. Negli strati medio durante E6-E8, le cellule bipolari con un processo a lungo leader e un sottile processo finale migrano dorsalmente o ventralmente lungo il fasciculus assone di tectal assoni efferenti che eseguire dorso-ventralmente7. Dopo questa migrazione di axophilic, le cellule si differenziano in neuroni multipolari situati negli strati profondi. Negli strati superficiali durante E7-E14, le cellule migranti disperdono orizzontalmente riformando un processo leader ramificato e dispersione in più direzioni8. Dopo la dispersione di migrazione, le cellule di quest'ultime alla fine differenziano in neuroni superficiali delle varie morfologie. In entrambi i casi, una cultura di piatto-mount è efficiente per osservare il movimento delle cellule parallela alla superficie pial.
Qui, presentiamo un protocollo per time-lapse imaging per visualizzare migrazione tangenziale delle cellule in via di sviluppo pulcino tectum ottica7,8. Combinazione di cella etichettatura da elettroporazione in ovoe una successiva cultura di piatto-Monte sull'inserto di cultura cellulare consente di rilevamento della direzione di movimento e migrazione delle cellule la migrazione. L'obiettivo di questo metodo è quello di facilitare l'individuazione di sia il comportamento delle singole celle a lungo termine e l'azione collettiva di un gruppo di cellule nel piano orizzontale.
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Protocol
1. Elettroporazione In Ovo
- Preparare il DNA del plasmide di espressione per l'etichettatura fluorescente in alta concentrazione. Isolare il DNA da 200 mL di coltura batterica con il metodo di lisi alcalina utilizza colonne di scambio anionico secondo il protocollo del produttore (Tabella materiali). Mix pCAGGS-EGFP e pCAGGS-mCherryNuc ad una concentrazione finale di 4 µ g / µ l ciascuna.
Nota: Privo di endotossina di purificazione del DNA del plasmide può essere preferito per elettroporazione. - Incubare uova di gallina fertile orizzontalmente a 38 ° C a 70% di umidità relativa.
- Dopo 2,5 giorni, eliminare 5 mL di albume (bianco d'uovo) dal lato aguzzo dell'uovo usando la siringa da 20 mL con un ago 18 calibro e sigillare il foro dell'ago con nastro adesivo.
- Tagliare la parte superiore del guscio dell'uovo con forbici curve per aprire un buco di 2 cm di diametro e verificare lo stadio di sviluppo dell'embrione sotto lo stereomicroscopio (fase 17 di Hamburger e Hamilton9). Sigillare il foro ancora con nastro adesivo.
Nota: Questo passaggio può essere eseguito in qualsiasi momento durante e E2.5-3.0. Punti 1.3 e 1.4 abbassare il livello dell'embrione nell'uovo per evitare un stretto attaccamento dell'embrione crescente e i vasi sanguigni al guscio superiore. - Continuare l'incubazione fino a 5,5.
- Prima elettroporazione, preparare 10 µ l dell'accennato il DNA del plasmide colorato con 0,5 µ l di Fast Green (25 mg/mL), 10 mL di tampone fosfato autoclavato salino (PBS) contenente penicillina (100 unità/mL), streptomicina (100 µ g/mL) e Micropipette effettuate in tubi capillari di vetro utilizzando un processore micropipetta. Tagliare la punta distale della micropipetta per rendere una dimensione appropriata del poro a seconda della quantità di DNA per iniezione.
- Tagliare il guscio superiore sigillato con le forbici per riaprire un buco di 2,5 cm di diametro e impostare l'uovo stabilmente sotto il microscopio stereo. Aggiungere poche gocce di PBS nella cellula uovo. Staccare l'allantoico membrana che ricopre l'embrione senza emorragia utilizzando due una pinzetta. Rimuovere l'Amnios dalla testa dell'embrione.
- Mentre si gira la testa con un microspatula, iniettare 0,1-1 μL del DNA colorato nella cavità ventricolare della sinistra tectum ottica utilizzando una micropipetta collegato ad un tubo di aspirazione.
Nota: La quantità di DNA iniettato dipende dallo scopo dell'esperimento. Soluzione concentrata di DNA dovrebbe affondare e allegare lungo la parete ventricolare. - Posizionare una coppia di elettrodi a pinza-tipo (elettrodi quadrati 3 mm con 7 mm di distanza) in modo che l'area di destinazione dell'ottica tectumis collocato tra (Figura 1passaggio 1).
Nota: Il DNA è individulamente al lato anodo. - Caricare un pre-impulso di 30 V, 1 ms con un intervallo di 5 ms e quattro impulsi successivi di 6 V, 5 ms con un intervallo di 10 ms utilizzando il generatore di impulsi.
Nota: La condizione elettronica dipende la dimensione e la distanza degli elettrodi. Dovrebbe essere abbastanza forte per raggiungere transfezione efficiente, ma deve essere abbastanza modesto per assicurare il normale sviluppo del tessuto bersaglio. - Sigillare il foro con del nastro adesivo e continuare l'incubazione. Immergere gli elettrodi in PBS per rimuovere l'albume con un spazzolino interdentale in un piatto di plastica. Ripetere 1.7-1.11 per ogni uovo.
2. piatto-Mount cultura sull'inserto di cella
- Un giorno prima la cultura di Monte piatto, preparare l'inserto di cultura cellulare rivestito. Galleggiare alcuni inserti di cultura cellulare sull'acqua distillata in autoclave in una piastra di coltura delle cellule di 10 cm. Caricare una soluzione di 8 µ g/mL laminina e 80 µ g/mL poli-L-lisina per coprire gli inserti e lasciare gli inserti fatto galleggiare nell'incubatore cella cultura CO2 a 37 ° C durante la notte.
Nota: Il giorno seguente, gli inserti rivestiti possono essere memorizzati a 4 ° C. - Giorno della cultura presso E7.0, rimuovere la soluzione di laminina-poli-L-lisina dall'inserto e posizionare l'inserto in un piatto fondo di vetro (Figura 1passaggio 2) riempito con 1,1 mL di terreno di coltura (media di siero ridotto di 60%, 20% F12, 10% siero bovino fetale, 10 % di siero di pulcino, 50 unità/mL penicillina, 50 μg/mL di streptomicina). Tenere il piatto nell'incubatrice di2 CO di coltura cellulare a 37 ° C.
Nota: Il mezzo può essere utilizzato per tutto il periodo di cultura per tre giorni senza cambiamento. - Preparare l'installazione di cultura. Impostare un'unità di camera umida su un microscopio confocale rovesciato con un flusso di gas di 40% O2 e 5% CO2 (regolatore del gas) a 38 ° C (regolatore di temperatura).
- Tagliare la testa dell'embrione con le forbici. Pizzicare la testa fuori con le pinze nella soluzione salina bilanciata Hanks ghiacciata (HBSS) in una piastra di coltura cellulare di 6 cm.
- Isolare il tectum ottica individulamente utilizzando due una pinzetta. Trasferire il tectum con un contagocce di plastica in un altro piatto riempito con HBSS ghiacciata. Utilizzare il vetro concavo piatto basato con silicone nero come un piattino per il taglio.
- Controllare la posizione di etichettatura sotto il microscopio stereoscopico a fluorescenza. Tagliare il tessuto tectal che circondano l'area d'etichettatura con un coltello microsurgical. Assicurarsi che la direzione del tessuto nel tectum (antero-posteriore, dorso-ventrale).
- Trasferire il tessuto etichettato con un contagocce di plastica l'inserto in modo che il lato di pia è collegato l'inserto. Adagiare il tessuto tectal nella direzione desiderata e rimuovere HBSS in eccesso (Figura 1passaggio 2).
- Ripetere 2.4-2.7 per preparare altri tessuti sullo stesso inserire. Mettere il piatto in aula preriscaldato nel microscopio confocale invertito (Figura 1passaggio 3).
3. Time-lapse Imaging
- Controllare l'etichettatura fluorescente e concentrare il campo microscopico al microscopio confocale invertito. Avviare l'unità laser confocale e provare la scansione confocale per regolare la direzione e la posizione del tessuto lungo gli assi X e y nel campo di campionamento. Utilizzare il 10x o 20 X lente obiettiva senza olio da immersione.
- Selezionare il formato di scansione (ad es., 512x512 dpi). Decidere l'intervallo e la gamma totale della scansione confocale lungo l'asse z. Prendere un intervallo di 5 o 10 µm per l'intervallo di 100 µm. Decidere l'intervallo di tempo della imaging confocale e total imaging durata (ad es., intervalli di 10 min oltre 48 h).
Nota: Per evitare il laser fototossicità, impedire la scansione delle dimensioni di scansione elevata con brevi z-intervalli per il lungo raggio di z, o con brevi intervalli di tempo durante la durata lunga imaging. Ad esempio, quando si applica una dimensione di scansione elevata (ad esempio, 1024 x 1024 dpi), diminuire il numero di scansioni lungo l'asse z. - Insieme i parametri di funzionamento confocale descritto in 3.2 del programma e avviare imaging.
- Dopo l'imaging, combinare le immagini confocale alle differenti dell'asse z per fornire immagini dello stack z con regolazione fine focale in ogni momento.
- Aggiungere le immagini dello stack z al punto di tempo diverso e costruire un time-lapse film in formato AVI.
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Representative Results
La figura 2 Mostra la migrazione tangenziale superficiale visualizzata in una cultura di piatto-Monte a un periodo di tempo (0, 9, 18, 27 h) dopo l'inizio della registrazione. Film 1 è un filmato time-lapse di 10 min-intervalli per un periodo di 28 h e 50 min. La cornice è selezionata per mettere a fuoco sulle cellule migrazione dall'angolo inferiore sinistro con etichetta del telaio allo spazio senza etichetta (Figura 3A). Il movimento di massa delle cellule migrazione (GFP; pannello di sinistra superiore, Movie 1) e i loro nuclei (mCherry-Nuc; pannello superiore destro) possono essere osservati con il film Unito (pannello inferiore, Movie 1). Direzionalità della migrazione delle cellule può essere esaminata focalizzando l'attenzione sulle cellule disperdente dal centro con etichetta per tutte le direzioni (Movie 2, Figura 3B).
Le immagini chiare del movimento nucleare (film 2; mCherry-Nuc, pannello di destra) permette di tracciare la migrazione nucleare delle cellule di inseguimento automatico utilizzando una particella Tracking plugin10 di un'applicazione di ImageJ11 di elaborazione di immagini di Figi (Movie 3, Figura 3B). Cambiamenti temporali delle traiettorie di migrazione tangenziale possono essere visualizzati per dimostrare la migrazione disperdente in omni-direzioni.
Comportamento individuale delle cellule con il cambiamento morfologico sequenza del processo principale, trailing processo e nuclei può essere manifestata con immagini di ingrandimento superiore di 5 min-intervalli (Movie 4, Figura 3).
Un altro tipo di migrazione tangenziale in strati intermedi7 possa essere visualizzato utilizzando un protocollo simile (Movie 5, Figura 3D). La migrazione lineare bidirezionale lungo il fasciculus assone in esecuzione dorsale a ventrale (alto verso il basso) è evidente7.
Figura 1. Diagramma di flusso del protocollo. Passaggio 1: elettroporazione in ovo. Passaggio 2: Posa del tessuto tectal modo che il lato di pia è collegato l'inserto. Passaggio 3: Microscopio a fluorescenza invertito con unità confocale laser. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Visualizzazione della migrazione superficiale tangenziale nella cultura piatto-Monte. Le cellule tangenzialmente migrazione (GFP; pannello superiore) e il nucleo (mCherry-Nuc; pannello inferiore) negli strati superficiali dell'ottica tectum sono mostrati a 0, 9, 18, 27 h dopo l'inizio della cultura da E7.0. Le celle nell'angolo inferiore sinistro del telaio sono etichettate a 0 h (Vedi Figura 3A). Barra della scala: 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Figura schematica che illustra le condizioni di montaggio per l'imaging di time-lapse. La forma di etichettatura fluorescente (verde), direzione iniziale della migrazione cellulare (magenta) e il fotogramma video (quadrato nero) sono stati illustrati con ingrandimento della lente dell'obiettivo (obj) e zoom digitale (zoom) nel campo superiore, con giorno di elettroporazione (EP ) e inizio della coltura (coltura) nel campo inferiore. (A) film 1, (B) Movie 2 e 3, (C) il film 4, (D) film 5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Film 1. Visualizzazione della migrazione superficiale tangenziale in una cultura di piatto-Monte. Movimento delle cellule tangenzialmente migrazione (GFP; pannello di sinistra superiore) e i loro nuclei (mCherry-Nuc; pannello superiore destro) negli strati superficiali dell'ottica tectum dopo l'inizio della cultura da E7.0. L'immagine risultante dalla fusione è mostrato nel riquadro in basso. Le celle nell'angolo inferiore sinistro del telaio sono etichettate a 0 h (Vedi Figura 3A), e il time-lapse immagini sono state catturate oltre 28 h e 50 min barra della scala: 100 µm. Clicca qui per visualizzare questo video. Fare clic destro per scaricare.
Film 2. Disperdendo il movimento delle cellule tangenzialmente migrazione (GFP; pannello di sinistra) e i loro nuclei (mCherry-Nuc; pannello di destra) dal centro di entrambi i pannelli sono indicati oltre 48 h (Vedi Figura 3B). Barra della scala: 100 µm. Clicca qui per visualizzare questo video. Fare clic destro per scaricare.
Film 3. Traiettorie di migrazione tangenziale. Lo spostamento del nucleo della cellula (pannello di destra del film 2) è stato registrato per visualizzare le traiettorie di migrazione tangenziale. Barra della scala; 100 µm. per favore clicca qui per vedere questo video. Fare clic destro per scaricare.
Movie 4. Comportamento delle singole celle a maggiore ingrandimento. Movimento dei loro nuclei (mCherry-Nuc; pannello di destra) e le singole celle (GFP; pannello di sinistra) sono mostrati in maggiore ingrandimento oltre 24 h (Vedi Figura 3). Processo di diramazione del processo principale può essere riconosciuto. Barra della scala: 100 µm. Clicca qui per visualizzare questo video. Fare clic destro per scaricare.
Movie 5. Migrazione di strato intermedio. Movimento delle cellule tangenzialmente migrazione (GFP; pannello di sinistra) e del loro nucleo (mCherry-Nuc; pannello di destra) negli strati medio tectal vengono visualizzati oltre 24 h dopo l'inizio della cultura da E6.0 (Vedi Figura 3D). La migrazione lineare lungo asse dorso-ventrale (alto verso il basso) è notevole. Barra della scala: 100 µm. Clicca qui per visualizzare questo video. Fare clic destro per scaricare.
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Discussion
Il protocollo descritto sopra è ottimizzato per il rilevamento di migrazione cellulare in strati superficiali6,8. È applicabile per la rilevazione di strato intermedio migrazione flussi (film 5)6,7, solo da spostando la tempistica dell'elettroporazione (5,5 a E4.5) e l'inizio della cultura e imaging (E7.0 a E6.0).
La procedura presentata è composto di cellule etichettatura di elettroporazione in ovo, piatto-Monte cultura e formazione immagine confocal time-lapse (Figura 1). Prima di tutto, è un prerequisito che le condizioni della coltura dovrebbero essere ottimizzate per mantenere il tessuto sano e crescente normalmente come in vivo. È anche cruciale garantire che l'orientamento del tessuto è adatto per la rilevazione di migrazione cellulare. Per tali scopi, applichiamo una cultura piatto montaggio inserto di cella, che facilita l'osservazione della dispersione orizzontale delle cellule ed un ricco medio con alto contenuto di ossigeno. Dopo aver verificato la condizione di cultura e l'orientamento, è fondamentale per la visualizzazione regolare le condizioni contrastanti di etichettatura fluorescente meglio con meno elettronica e foto danni. Per l'etichettatura migliore, possiamo scegliere un vettore di espressione con un promotore efficace ed electroporate concentrato del DNA. Per raggiungere il minimo danno, è importante moderare la condizione elettrica dell'elettroporazione, abbassare la concentrazione di DNA e per minimizzare il tempo totale di irradiazione del laser.
Un vantaggio di questo protocollo utilizzando le impostazioni cultura di piatto-Monte sull'inserto cellulare è che si può osservare la migrazione cellulare tangenziale a lungo termine. In genere, è difficile determinare quanto tempo il tessuto nella cultura mantiene le condizioni fisiologiche rispetto a quella in ovo. Perlomeno, migrazione tangenziale superficiale continua oltre 72 h dopo l'inizio della cultura al E7.0, che mostra la normale dispersione cellulare simile a quella in ovo8. Inoltre, tessuto fresco è preparato all'inizio della cultura e della formazione immagine di osservare la migrazione in fasi successive. Inoltre, è utile che lo spostamento delle cellule può essere seguito per un lungo periodo, perché le cellule rimangono muove orizzontalmente nella superficiale Lastre piane di tectum, che si trova vicino la lente dell'obiettivo. Anche utilizzando il sistema confocale facilita il tracciamento cellulari movimento lungo l'asse z. D'altra parte, uno svantaggio di questo metodo è che la cultura di Monte piatto potrebbe non essere sempre pertinente di altri tipi di migrazione quali migrazione radiale di ricapitolare. Quando il metodo viene applicato a osservare radiale migrazione nella fetta tectal sull'inserto, lo spessore del tessuto tectal non aumenta più rapidamente che in ovo. Il metodo di cultura slice nel gel di collagene può essere meglio ricapitolare tale sviluppo di strato.
Poiché il nostro metodo permette l'osservazione del movimento orizzontale parallelo all'inserto cultura, potenzialmente può essere applicato per la rilevazione del cambio sequenza della fluorescente-labeled micro-struttura, compreso l'allungamento assonale nel tessuto neurale o spostamento delle cellule nel tessuto non-neurale. Ad esempio, dopo l'etichettatura assoni commissural nel tubo neurale in via di sviluppo mediante elettroporazione, movimenti degli assoni pre- e post-incrocio sopra la piastra di pavimento possono essere visualizzati nella cultura libro aperto incidendo la lamiera del tetto. Purché la condizione di cultura appropriato sull'inserto cellulare sia disponibile per la riproduzione di condizioni in vivo , il nostro metodo fornisce un'efficace tecnica per visualizzare i movimenti orizzontali di vari tipi di cellule e strutture.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da JSP KAKENHI Grant numero 15K 06740 a Y.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | endotoxin-free plasmid DNA purification kit |
| 20 ml syringe | TERUMO | SS-20ESZ | |
| 18 gauge needle | TERUMO | NN-1838R | |
| Fast Green | Wako | 061-00031 | |
| 100x penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| glass capillary tube | Narishige | G-1 | |
| cell culture insert | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| Laminin | SIGMA | L2020 | coating of culture insert |
| poly-L-Lysine | Peptide Institute | 3075 | coating of culture insert |
| glass bottom dish | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | culture medium |
| F12 | Gibco | 11765-054 | culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 12483 | culture medium |
| chick serum | Gibco | 16110082 | culture medium |
| 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| microsurgical knife | Surgical specialties cooperation | 72-1501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| curved scissors | AS ONE | No.11 | |
| micropipette processor | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| forceps-type electrode | BEX | LF646P3x3 | |
| pulse generator | BEX | CUY21EX | electroporator |
| fluorescence stereoscopic microscope | Leica | MZ16F | |
| inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| gas controller | Tokken | MIGM/OL-2 | |
| temperature controller | Tokai Hit | MI-IBC | |
| laser confocal unit | Olympus | FV300 |
References
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