Summary
我们描述了通过电穿孔荧光标记切向迁移细胞的方法, 以及在扁平支架培养中标记细胞运动的延时成像, 以可视化发展中的小鸡光学顶盖的迁移细胞行为。.
Abstract
延时成像是分析迁移细胞行为的有力方法。荧光细胞标记后, 可在影像显微镜下记录培养中标记细胞的运动。为了分析发育中大脑中的细胞迁移, 切片培养通常用于观察与切片部分平行的细胞迁移, 如径向细胞迁移。但是, 可以从切片区域性方法获得有限信息, 以分析垂直于切片部分的单元迁移, 如切线单元迁移。在这里, 我们提出了延时成像的协议, 用于可视化发展中的小鸡光学顶盖中的切向细胞迁移。通过电穿孔蛋细胞标记的组合以及细胞培养插入物上的随后的扁平安装培养, 可以检测水平平面中的迁移细胞运动。此外, 我们的方法有助于检测单个细胞的行为和一组细胞在长期的集体行动。该方法可用于检测荧光标记微结构的序列变化, 包括非神经组织中神经组织或细胞移位的轴突伸长。
Introduction
随着实时成像技术的进步, 细胞迁移研究也在不断发展。荧光细胞标记后, 在培养皿或体内标记细胞的时间运动可以记录在视频显微镜下。在神经发育研究中, 采用时移成像技术分析了移植细胞或伸长轴突的形态学变化。为了有效的成像, 在实验和分析的目的基础上, 应用合适的荧光细胞标记和组织制备方法是非常必要的。为了分析发育中大脑中的细胞迁移, 切片培养通常用于观察与切片部分平行的细胞迁移, 如径向细胞迁移1、2、3。切片培养系统也用于检测切向细胞迁移4,5, 但它不适合定向分析的情况下, 细胞分散垂直于切片部分。
光学顶盖由在胚胎发育过程中由径向和切向细胞迁移形成的多层结构组成。顶盖层的形成主要依赖于心室区分裂后神经元前体细胞的径向迁移, 其最终终点与心室区6的出生日期相关。对于切向迁移, 我们以前报告了发展中的小鸡光学顶盖中和表层的两个迁移流。在 E6-E8 期间的中层层中, 具有长前导过程和薄尾随过程的双极性细胞迁移背或腹侧沿顶盖传出轴突束运行手背-腹侧7。在 axophilic 迁移后, 细胞分化为位于深层的多极神经元。在 E7-E14 的表层层中, 迁移细胞通过重整分枝前导过程并分散到多个方向8, 水平离散。在分散迁移后, 后体细胞最终分化为各种形态的表面神经元。在这两种情况下, 平板式培养都能有效观察与软脑膜表面平行的细胞运动。
在这里, 我们提出了一个延时成像协议, 用于可视化发展中的小鸡光学顶盖7,8中的切向细胞迁移。在蛋中通过电穿孔将细胞标记结合在一起, 然后在细胞培养插入物上进行扁平安装培养, 可以检测迁移的细胞移动和迁移方向。该方法的目的是促进检测在长期的单个细胞行为和一组细胞在水平平面的集体行动。
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Protocol
1。蛋电穿孔
- 制备高浓度荧光标记的表达质粒 DNA。根据制造商的协议 (材料表), 使用阴离子交换柱的碱性裂解法分离200毫升细菌培养物中的 DNA。混合 pCAGGS-EGFP 和 pCAGGS-mCherryNuc 在最终浓度为4µg/µL 每个。
注: 无内毒素质粒 DNA 纯化可能是电穿孔的首选。 - 在70% 相对湿度下, 在38摄氏度水平下孵化出肥沃的鸡卵。
- 2.5 天后, 使用20毫升注射器与18针, 并用胶带密封针头孔, 从卵子的尖头上消除5毫升蛋白 (蛋清)。
- 用弯曲的剪刀切开蛋壳的顶端, 开一个直径2厘米的洞, 检查体视显微镜下胚胎的发育阶段 (汉堡包和汉密尔顿9的阶段 17)。用胶带封住孔。
注意: 此步骤可在 E2.5 E3.0 期间的任何时间执行。步骤1.3 和1.4 降低卵子中胚胎的水平, 以避免将生长的胚胎和血管紧密附着到顶部壳体上。 - 继续孵育直到 E5.5。
- 在电穿孔前, 准备10µL 所述质粒 DNA 染色与0.5 µL 的快速绿色 (25 毫克/毫升), 10 毫升蒸压磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 含有青霉素 (100 单位/毫升) 和链霉素 (100 微克/毫升), 和微由使用微量吸管处理器的玻璃毛细管管。切断微量吸管的远端尖端, 根据注射的 DNA 量, 使合适的孔隙大小。
- 用剪刀切开密封的顶壳, 重新打开直径2.5 厘米的孔, 并在立体显微镜下稳定地设置鸡蛋。在鸡蛋中加入几滴 PBS。用两个细钳剥离尿囊膜覆盖胚胎而不出血。从胚胎的头部取出羊膜。
- 在用 microspatula 转动头部时, 用微量吸管连接到吸入管, 将彩色 DNA 的 0.1-1 微升注入左侧光学顶盖的心室腔内。
注: 注射的 DNA 量取决于实验的目的。浓缩 DNA 溶液应沿着心室壁下沉和附着。 - 放置一对 forcep 型电极 (3 mm 方形电极, 距离为 7 mm), 使光学 tectumis 的目标区域介于 (图 1、步骤 1) 之间。
注意: DNA 转到阳极侧。 - 使用脉冲发生器将 30 V、1 ms 的预脉冲充电为 5 ms 间隔, 四个后续脉冲为 6 V、5 ms 和 10 ms 间隔。
注: 电子条件取决于电极的尺寸和距离。它应该足够强大, 以实现有效的转染, 但它必须足够谦虚, 以确保目标组织的正常发展。 - 用胶带封住孔, 继续孵育。在 PBS 中浸泡电极, 用塑料碟中的齿间刷去除蛋白。每个鸡蛋重复 1.7-1.11。
2. 单元格插入上的扁平安装培养
- 在平贴培养前的某一天, 准备涂覆细胞培养刀片。在10厘米细胞培养皿中, 在蒸压蒸馏水上漂浮一些细胞培养液。加载8µg/毫升层粘连蛋白和80µg/毫升聚 l-赖氨酸的溶液, 以覆盖插入物, 并将漂浮的插入在细胞培养 CO2孵化器在37摄氏度过夜。
注意: 在第二天, 涂层刀片可以存储在4摄氏度。 - 在 E7.0 的文化之日, 从插入物中除去层粘连蛋白-聚 l-赖氨酸溶液, 将刀片放入玻璃底盘 (图 1、步骤 2), 填充1.1 毫升培养基 (60% 减少血清培养基、20% F12、10% 胎牛血清、10% 小鸡血清, 50 单位/毫升青霉素, 50 微克/毫升链霉素)。保持皿在细胞培养 CO2孵化器在37摄氏度。
注: 培养基可在整个文化期内使用三天, 无变化。 - 准备区域性设置。在 40% O2和 5% CO2 (气体控制器) 的气体流量在38摄氏度 (温度控制器) 的倒置共聚焦显微镜上设置湿润室单位。
- 用剪刀砍掉胚胎的头部。用镊子将头夹在6厘米细胞培养皿中, 放入冰冷的汉克斯平衡盐溶液 (HBSS) 中。
- 使用两个细镊子隔离转光学顶盖。将顶盖与塑料滴管转移到另一盘充满冰冷 HBSS 的盘子里。使用以黑色硅为凹的玻璃盘作为切碟。
- 检查荧光立体显微镜下标签的位置。用显微外科刀切开周围贴标区域的顶盖组织。确保顶盖 (前后方, 背腹) 组织的方向。
- 将带有塑料滴管的标记组织转移到刀片上, 使 pia 侧附着在刀片上。将顶盖组织放置在所需的方向, 并去除多余的 HBSS (图 1, 步骤 2)。
- 重复 2.4-2.7 为了准备在同一插入的其他组织。将盘子放在预热室中的倒置共聚焦显微镜中 (图 1, 步骤 3)。
3. 延时成像
- 检查荧光标记, 并将显微镜聚焦在倒置共聚焦显微镜中。启动激光共聚焦单元, 并尝试采样共焦扫描, 以调整沿 X 和 Y 轴的组织方向和位置。使用10X 或20X 物镜, 无需浸泡油。
- 选择扫描大小 (例如512x512 dpi)。确定沿 z 轴的共焦扫描的间隔和总范围。为100µm 范围采取5或10µm 间隔。确定共聚焦成像的时间间隔和总成像持续时间 (例如, 10 分钟间隔超过48小时)。
注意: 为了避免激光光毒性, 请禁止在高扫描尺寸下扫描, 在长 z 范围内使用短 z 间隔, 或在长成像持续时间内缩短时间间隔。例如, 在应用高扫描大小 (例如1024x1024 dpi) 时, 减少沿 z 轴的扫描次数。 - 设置3.2 中描述的共焦运行程序的参数并开始成像。
- 成像后, 在不同的 z 轴上组合共焦图像, 在每个时间点提供 z 栈图像, 并进行精细焦距调整。
- 在不同的时间点追加 z 堆栈图像, 并以 AVI 格式构建延时电影。
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Representative Results
图 2显示了在记录开始后, 在经过一段时间 (0、9、18、27 h) 的平面安装培养中可视化的表面切向偏移。电影1是一段10分钟的延时电影, 间隔时间为28小时和50分钟。选择该框架的目的是聚焦从帧的左下角到未标记空间的迁移单元格 (图 3A)。迁移细胞 (GFP; 左上面板,电影 1) 及其原子核 (mCherry-Nuc; 右上面板) 的质量运动可以用合并后的影片 (下面板,电影 1) 观察。细胞迁移的方向性可以通过聚焦从标记中心到所有方向的分散细胞来检查 (电影 2,图 3B)。
核运动的清晰图像 (电影 2; mCherry--Nuc, 右面板) 允许我们通过使用粒子跟踪器插件10斐济图像处理应用程序的自动跟踪跟踪细胞核迁移 ImageJ11(电影 3,图 3B)。通过对切向迁移轨迹的时间变化进行可视化, 证明了全方向的分散迁移。
单个细胞行为与前导过程的顺序形态学变化, 尾随过程和原子核可以表现出更高的放大率图像5分钟间隔 (电影 4,图 3C)。
中间层7中的另一种切线迁移可以使用类似的协议 (电影 5、图 3D) 进行可视化。沿轴突束的双向线性偏移 (从上到下) 是明显的7。
图1。协议流程图。步骤 1:蛋中的电穿孔。步骤 2: 铺设顶盖组织, 使 pia 侧附加到插入。步骤 3: 带激光共聚焦单元的倒置荧光显微镜。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图2。平板式培养中表面切向迁移的可视化。从 E7.0 的培养开始, 在光学顶盖的表面层上, 在0、9、18、27 h 的 mCherry 上显示了切向迁移细胞 (GFP; 上部板) 和核 (下面板)。框架左下角的单元格标记为 0 h (参见图 3A)。比例尺: 100 µm.请单击此处查看此图的更大版本.
图3。图解图说明了延时成像的安装条件.荧光标记的形状 (绿色)、细胞迁移的初始方向 (洋红) 和视频帧 (黑色正方形) 以物镜 (obj) 和数字变焦 (变焦) 在上部领域的放大为例进行了说明 (EP) 和在底部字段中的文化 (文化) 的起始。(A) 电影 1, (B)电影 2 和 3, (C)电影 4, (D)电影 5。请点击这里查看这个数字的更大版本.
电影1。平板式培养中表面切向迁移的可视化.从 E7.0 的文化开始后, 在光学顶盖的表层上, 切向迁移细胞 (GFP; 左上板) 及其原子核 (mCherry--Nuc; 右上板) 的运动。合并后的图像显示在下部面板中。框架左下角的单元格标记为 0 h (参见图 3A), 并捕获了28小时和50分钟的延时图像. 比例尺: 100 µm.请点击这里观看视频。右键单击可下载.
电影2。从两个面板的中心将切向迁移细胞 (GFP; 左面板) 及其原子核 (mCherry, 右面板) 的分散运动显示在 48 h 以上(见图 3B)。比例尺: 100 µm.请点击这里查看此视频。右键单击可下载.
电影3。切线迁移的轨迹.对细胞细胞核 (电影 2的右面板) 的位移进行跟踪, 以可视化切线迁移的轨迹。刻度条;100µm.请点击这里查看此视频。右键单击可下载.
电影4。高放大倍率下的单个细胞行为.单个细胞 (GFP; 左面板) 及其原子核 (mCherry, 右面板) 的移动以高于 24 h 的放大倍率显示 (见图 3C)。可识别领先过程的分支过程。比例尺: 100 µm.请点击这里查看此视频。右键单击可下载.
电影5。中间层迁移。顶盖中间层的切向迁移细胞 (GFP; 左面板) 及其细胞核 (mCherry--Nuc; 右面板) 的运动在 E6.0 (见图 3D) 的文化起始后显示超过24小时。沿手背-腹轴 (上到下) 的线性偏移是显著的。比例尺: 100 µm.请点击这里查看此视频。右键单击可下载.
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Discussion
上述协议针对浅层6、8中的细胞迁移进行了优化。它适用于检测中间层迁移流 (电影 5)6,7, 只是通过改变电穿孔的时间 (E5.5 到 E4.5) 和文化和成像的起始 (E7.0 到 E6.0)。
所提出的程序由蛋、扁平安装培养和时移共聚焦成像 (图 1)中的电穿孔的细胞标记组成。首先, 必须对培养条件进行优化, 使组织保持健康, 并在体内正常生长。这也是至关重要的, 以确保组织的方向是适合检测细胞迁移。为此, 我们在细胞插入上应用一种扁平的培养, 这有助于观察水平细胞的分散, 并提供富含高氧的培养基。在保证了培养条件和定位的前提下, 利用最小的电子和照片损伤来调整更好的荧光标签的冲突条件, 是可视化的关键。为了更好的标记, 我们可以选择一个有效的启动子和电击浓缩 DNA 的表达载体。为了达到最小的损伤, 重要的是要适度的电穿孔的电气条件, 降低 DNA 浓度, 并尽量减少激光照射的总时间。
此协议使用单元格插入的扁平安装区域性的优势是, 我们可以观察切线细胞迁移在长期。通常, 很难确定组织在培养中保持生理条件的时间与蛋的比较。至少, 在 E7.0 的培养后, 表面切向迁移持续超过72小时, 这显示了与蛋8类似的正常细胞色散。此外, 新的组织在文化和影像学的开始准备, 以观察迁移在后期阶段。这也是有利的, 细胞置换可以跟随在很长一段时间, 因为细胞保持水平移动在顶盖的表面平坦的板, 这是接近客观透镜。使用共聚焦系统还有助于沿 z 轴跟踪细胞运动。另一方面, 这种方法的缺点是, 平面安装区域性可能并不总是与重述其他类型的迁移 (如径向迁移) 相关。当该方法用于观察顶盖切片上的径向迁移时, 顶盖组织的厚度不会像蛋那样迅速增加。在胶原凝胶中切片培养方法可以更好地概括这种层的发展。
由于我们的方法能够观察平行于培养插入物的水平运动, 因此可用于检测荧光标记微结构的顺序变化, 包括神经组织中的轴突伸长率或非神经组织细胞移位。例如, 通过电穿孔对发展中神经管中的连合轴突进行标记后, 可以在屋顶板切割的开放式培养中直观地显示出底板上的前后轴突运动。如果细胞插入物的适当培养条件可用于在体内繁殖, 我们的方法提供了一种有效的技术来可视化各种细胞类型和结构的水平运动。
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Disclosures
作者声明他们没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
此工作由 jsp KAKENHI 授予编号15K06740 支持 Y.W。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | endotoxin-free plasmid DNA purification kit |
| 20 ml syringe | TERUMO | SS-20ESZ | |
| 18 gauge needle | TERUMO | NN-1838R | |
| Fast Green | Wako | 061-00031 | |
| 100x penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| glass capillary tube | Narishige | G-1 | |
| cell culture insert | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| Laminin | SIGMA | L2020 | coating of culture insert |
| poly-L-Lysine | Peptide Institute | 3075 | coating of culture insert |
| glass bottom dish | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | culture medium |
| F12 | Gibco | 11765-054 | culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 12483 | culture medium |
| chick serum | Gibco | 16110082 | culture medium |
| 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| microsurgical knife | Surgical specialties cooperation | 72-1501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| curved scissors | AS ONE | No.11 | |
| micropipette processor | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| forceps-type electrode | BEX | LF646P3x3 | |
| pulse generator | BEX | CUY21EX | electroporator |
| fluorescence stereoscopic microscope | Leica | MZ16F | |
| inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| gas controller | Tokken | MIGM/OL-2 | |
| temperature controller | Tokai Hit | MI-IBC | |
| laser confocal unit | Olympus | FV300 |
References
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