Summary
형광 라벨 tangentially 마이그레이션에 대 한 방법을 설명 셀 electroporation, 그리고 마이그레이션 시각화 하기 위해 플랫-마운트 문화에서 레이블이 지정 된 셀 이동의 시간 경과 영상 셀 개발 병아리 광섬유 tectum에 동작 .
Abstract
시간 경과 영상 마이그레이션 셀 동작을 분석 하는 강력한 방법입니다. 형광 셀 라벨, 후 비디오 현미경 아래 문화에 레이블이 지정 된 세포의 움직임을 기록할 수 있습니다. 개발 두뇌에 셀 마이그레이션 분석, 대 한 조각 문화는 셀 마이그레이션 방사형 셀 마이그레이션 등의 조각 섹션에 평행 하 게 관찰 하에 주로 사용 됩니다. 그러나, 슬라이스 문화 방법 접선 셀 마이그레이션 등의 조각 섹션에 수직 셀 마이그레이션 분석 하에서 제한 된 정보를 얻을 수 있습니다. 여기, 우리는 시각화 개발 병아리 광섬유 tectum에 접선 셀 마이그레이션 시간 경과 영상에 대 한 프로토콜을 제시. 셀 라벨 electroporation에서 비켜에서 문화와 후속 플랫-마운트 셀 문화 삽입에 의해의 조합 수평 평면에 마이그레이션 세포 운동의 감지 수 있습니다. 또한, 우리의 방법은 개별 셀 동작 및 장기적으로 세포의 그룹의 집단 행동의 탐지를 촉진 한다. 이 방법은 잠재적으로 형광 표시 된 마이크로-구조, axonal 신장 비 신경 조직의 신경 조직 또는 세포 치환 등의 순차적 변화를 감지에 적용할 수 있습니다.
Introduction
세포 이동의 연구 라이브 이미징의 발전 기법으로 진행 되었습니다. 형광 셀 라벨, 후 비디오 현미경 아래 문화 접시 또는 vivo에서 레이블이 지정 된 셀의 시간적 움직임을 기록할 수 있습니다. 신경 개발 연구에서 세포를 마이그레이션하거나 elongating axons의 형태학 변화 되었습니다 분석 했습니다 시간 경과 화상 진 찰을 사용 하 여. 효과적인 이미징에 대 한 형광 셀 라벨 및 조직 준비, 실험 및 분석의 목적에 따라 적당 한 방법을 적용 하는 필수적 이다. 개발 두뇌에 셀 마이그레이션 분석, 대 한 조각 문화는 셀 마이그레이션 방사형 셀 마이그레이션1,2,3등의 조각 섹션에 평행 하 게 관찰 하 일반적으로 사용 되었습니다. 조각 문화 시스템은 접선 셀 마이그레이션4,5, 검색에 사용 하지만 셀 슬라이스 섹션에 수직을 분산 하는 경우에 방향 분석에 적합 하지 않습니다.
광섬유 tectum는 배아 개발 하는 동안 레이디얼 및 접선 셀 마이그레이션에 의해 형성 된 다층 구조의 구성 됩니다. Tectal 계층 형성 된 심 실 영역에서 postmitotic 신경 선구자 세포의 방사형 마이그레이션에 주로 의존 하 고 층에서 그들의 최종 목적지는 심 실 지역6에 그들의 출생 날짜와 상관 관계가. 접선 이동에 관해서는 우리는 이전 마이그레이션 개발 병아리 광섬유 tectum에 중간과 표면 층에서 두 개의 스트림을 보고. E6-E8 중 중간 층에서 긴 주요 프로세스와 얇은 후행 프로세스 양극 세포 dorso ventrally7실행 tectal 원심 성 축 삭의 축 삭 fasciculus 따라 dorsally 또는 ventrally 마이그레이션합니다. 이 axophilic 마이그레이션 후 셀 깊은 층에 있는 다 극 신경 세포로 분화. E7-E14 중 표면 층에서 마이그레이션 셀 가로로 여러 방향8로 분기 주요 프로세스 및 분산형 개혁에 의해 분산. 마이그레이션, 분산 후 후자의 셀 결국 다양 한 형태학의 피상적인 뉴런으로 분화. 두 경우 모두, 평면 산 문화 pial 표면에 병렬 셀 운동 관찰 효율적입니다.
여기, 선물이 접선 셀 마이그레이션 개발 병아리 광섬유 tectum7,8에서 시각화 하 시간 경과 영상에 대 한 프로토콜. 셀 라벨 electroporation에서 비켜에서문화와 후속 플랫-마운트 셀 문화 삽입에 의해 한 마이그레이션 셀 이동 및 마이그레이션 방향 감지가 있습니다. 이 방법의 목표는 장기와 수평 평면에 있는 셀의 그룹의 집단 행동에 두 개별 셀 동작의 탐지를 촉진.
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Protocol
1입니다. 비켜에 Electroporation
- 높은 농도에 형광 라벨에 대 한 식 플라스 미드 DNA를 준비 합니다. 제조 업체의 프로토콜 (자료 테이블)에 따라 음이온 교환 열을 사용 하 여 알칼리 성 세포의 용 해 방법으로 200ml의 세균성 문화에서 DNA를 분리. 각 4 µ g / µ L의 최종 농도에 pCAGGS-mCherryNuc pCAGGS-EGFP 믹스.
참고: 내 무료 플라스 미드 DNA 정화 electroporation에 대 한 선호 있을 수 있습니다. - 가로 70% 상대 습도에서 38 ° C에 비옥한 계란을 품 어.
- 2.5 일 후 18 게이지 바늘 20 mL 주사기를 사용 하 여 계란의 지적된 측면에서 배 젖 (달걀 흰 자 위)의 5 mL을 제거 하 고 테이프와 바늘 구멍을 봉인.
- 곡선가 위 직경에서 2cm 구멍을 열고 stereomicroscope (햄버거와 해밀턴9의 단계 17) 아래 태아의 발달 단계를 확인 하는 달걀 껍질의 상단을 잘라. 다시 테이프로 구멍을 봉인.
참고:이 단계는 E2.5 E3.0 동안 언제 든 지 수행할 수 있습니다. 1.3 및 1.4 단계 상위 셸에 성장 배아와 혈관의 꽉 첨부 파일을 피하기 위해 계란에서 태아의 수준 낮은. - E5.5까지 부 화를 계속 합니다.
- Electroporation, 전에 언급 한 플라스 미드 DNA의 착 색 된 빠른 그린 (25 mg/mL)의 0.5 µ L 10 mL 버퍼링 압력가 인산 염의 염 분 (PBS) 페니실린 (100 단위/mL)와 스 (100 μ g/mL), 및 micropipettes에서 만든 10 µ L를 준비 유리 모 세관 튜브 micropipette 프로세서를 사용 하 여입니다. 주입에 대 한 DNA의 양에 따라 적절 한 크기를 만들기 위해 micropipette의 원심 끝을 잘라.
- 가 위로 다시 구멍 직경에서 2.5 c m 스테레오 현미경 안정적으로 달걀을 설정 하 밀봉된 최고 껍질을 잘라. 달걀으로 PBS의 몇 방울을 추가 합니다. 두 개의 미세 집게를 사용 하 여 출혈 없이 태아를 덮고 allantoic 멤브레인을 벗기다. 태아의 머리에서 있는 amnion를 제거 합니다.
- microspatula와 머리를 선회 하는 동안 주사 0.1-1 μ는 micropipette를 사용 하 여 왼쪽된 눈 tectum의 심 실 구멍으로 색된 DNA의 흡입 관에 연결 된.
참고: DNA 주입 양의 실험의 목적에 따라 달라 집니다. 집중된 DNA 솔루션 싱크 하 고 심 실 벽을 따라 연결 해야 합니다. - 광섬유 tectumis의 대상 영역 (그림 1단계 1) 사이 배치 되도록 forcep 형 전극 (3 m m 평방 전극 7 mm 거리)의 한 쌍을 놓습니다.
참고: DNA는 양극 쪽으로 electroporated. - 30 V의 사전 펄스, 1 ms 5 ms 간격 및 V 6의 4 개의 연속적인 펄스, 펄스 발생기를 사용 하 여 10 ms 간격 5 ms를 부과 합니다.
참고: 전자 상태 크기와 전극의 거리에 따라 달라 집니다. 효율적인 transfection를 달성 하기 위해 충분히 강한 해야 하지만 충분히 겸손 하 게 대상 조직의 정상적인 발전을 보장 해야 합니다. - 테이프로 구멍을 밀봉 하 고 부 화를 계속 합니다. 플라스틱 접시에는 치 간 브러시로 배 젖 제거를 PBS 전극을 담근 다. 1.7-1.11 각 계란에 대 한 반복 합니다.
2. 플랫-마운트 문화에 셀 삽입
- 플랫-마운트 문화 전에 1 일 코팅된 셀 문화 삽입 준비. 10 cm 세포 배양 접시에 압력가 증류수에 셀 문화 삽입 일부 플 로트. 8 µ g/mL laminin의 80 µ g/mL 폴 리-L-리 신 커버를 삽입 하 고 37 ° C에서 셀 문화 CO2 배양 기에서 떠다니는 삽입을 떠나 하룻밤을 솔루션을 로드 합니다.
참고: 다음 날, 코팅된 삽입 저장 될 수 있다 4 ° c.에 - E7.0에서 문화의 날, 삽입에서 laminin-폴 리-L-리 신 솔루션을 제거 하 고 유리 하단 접시에 (그림 12 단계) 문화 매체 (60% 감소 된 혈 청 매체, 20 %F12, 10% 태아 둔감 한 혈 청, 10의 1.1 mL 가득 삽입 장소 % 여 자가 혈 청, 50 단위/mL 페니실린, 50 μ g/mL 스). 37 ° c.에 셀 문화 공동2 인큐베이터에 접시를 유지
참고: 매체는 변화 없이 3 일 동안 문화 기간 동안 사용할 수 있습니다. - 문화 설치를 준비 합니다. 40% O2 , 5% CO2 (가스 컨트롤러) 38 ° C (온도 컨트롤러)에서 가스 흐름을 거꾸로 confocal 현미경에 습기가 챔버 단위를 설정 합니다.
- 가 위로 태아의 머리를 잘라. 차가운 행 크 스 균형 소금물 (HBSS) 6 cm 세포 문화 접시에서에 있는 집게와 함께 밖으로 머리를 꼬집어.
- Electroporated 광섬유 tectum 두 미세 집게를 사용 하 여 격리 합니다. 플라스틱 스 포 이트와 tectum 차가운 HBSS 가득 다른 접시에 전송 합니다. 절단에 대 한 접시로 검은 실리콘 기반 concaved 유리 접시를 사용 합니다.
- 형광 실체 현미경 아래 라벨의 위치를 확인 하십시오. Tectal 조직 지역을 포위 하는 라벨 microsurgical 칼으로 잘라. 있는지 확인 조직의 방향 tectum (앞쪽-후부, 복 부 등)에서.
- 플라스틱 스 포 이트로 레이블이 지정 된 조직 삽입 전송 피아 측 삽입에 연결 되어 있도록. 원하는 방향으로 tectal 조직을 제거 초과 HBSS (그림 12 단계).
- 2.4-2.7 같은 다른 조직 준비 하기 위하여 삽입을 반복 합니다. 거꾸로 confocal 현미경 (그림 13 단계)에서 prewarmed 약 실에 있는 접시를 놓습니다.
3. 시간 경과 영상
- 형광 라벨을 확인 하 고 거꾸로 confocal 현미경 현미경 분야 초점. 레이저 confocal 장치를 시작 하 고 샘플링 confocal 스캔 방향 및 필드에 X와 y 축을 따라 조직의 위치를 조정 하려면 보십시오. 사용 하 여 10 배 또는 침수 기름 없이 20 X 렌즈.
- 스캔 크기를 선택 합니다 (예를 들어, 512 x 512 dpi). 간격 및 z 축 따라 confocal 스캔의 전체 범위를 결정 합니다. 100 µ m 범위에 대 한 5 또는 10 µ m 간격을 가져가 라. Confocal 영상 및 전체 기간 (예: 10 분 간격 이상 48 h) 이미징의 시간 간격을 결정 합니다.
참고: 레이저 phototoxicity을 피하기 위해, 높은 스캔 크기는 긴 z 범위에 대 한 짧은 z 간격 또는 긴 이미징 기간 동안 짧은 시간 간격에 검색 금지 합니다. 예를 들어 높은 스캔 크기 (예: 1024 x 1024 dpi)를 적용할 때 z 축 따라 검사의 수를 감소. - Confocal 실행의 매개 변수에서 설명된 3.2 프로그램 및 이미징 시작 설정 합니다.
- 이미징, 후 모든 시간 지점에서 미세 초점 조정 z 스택 이미지를 제공 하는 다른 z 축에서 confocal 이미지를 결합.
- 다른 시간 지점에서 z-스택 이미지를 추가 하 고 시간 경과 영화 AVI 형태로 구성.
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Representative Results
그림 2 녹음의 개시 후 경과 시간 (0, 9, 18, 27 h)에서 플랫-마운트 문화에 시각화 된 표면 접선 마이그레이션을 보여준다. 영화 1 28 h 50 분 동안 10 분 간격의 시간 경과 영화입니다. 프레임은 레이블 없는 공간 (그림 3A) 프레임의 레이블된 왼쪽 모서리에서 마이그레이션 세포에 초점을 맞추고 선택 됩니다. 마이그레이션 세포 (GFP, 영화 1위 왼쪽된 패널)의 질량 움직임 및 그들의 핵 (mCherry 엔 유씨, 오른쪽 상단 패널) 병합 된 영화 (하단 패널, 영화 1) 관찰 될 수 있다. 셀 이동 방향은 모든 방향 (영화 2, 그림 3B)을 레이블이 지정 된 센터에서 분산 셀에 집중 하 여 시험 될 수 있다.
핵 이동 (영화 2; mCherry-엔 유씨, 오른쪽 패널)의 투명 한 이미지 추적 입자 추적기 플러그인10 피지 이미지 처리 ImageJ11의 응용 프로그램의를 사용 하 여 자동 추적에 의해 세포 핵 이동 수 (영화 3, 그림 3B). 접선 이동의 궤적의 시간적 변화 옴니-방향으로 분산 마이그레이션을 증명 하기 위해 구상 될 수 있다.
개별 셀 동작 과정과 핵 후행 주요 과정의 순차적 형태학 상 변화는 5 분 간격 (영화 4, 그림 3C)의 더 높은 확대 이미지와 함께 각 성 수 있습니다.
중간 레이어7 접선 이동의 또 다른 유형은 유사한 프로토콜 (영화 5, 그림 3D)를 사용 하 여 구상 될 수 있다. 등 쪽 복 부 (위 아래로)를 실행 하는 축 삭 fasciculus 따라 양방향 선형 마이그레이션 분명7이다.
그림 1입니다. 프로토콜 흐름 차트입니다. 1 단계: Electroporation에서 비켜에서. 2 단계: 피아 측 삽입에 연결 되어 있도록 tectal 조직을 누워 있습니다. 3 단계: 레이저 confocal 장치 거꾸로 형광 현미경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 플랫-마운트 문화에 피상적인 접선 이동의 시각화. Tangentially 마이그레이션 셀 (GFP, 상단 패널)와 광섬유 tectum의 표면 층에서 핵 (mCherry 엔 유씨, 하단 패널) 0, 9, 18, 27 h E7.0에서 문화의 개시 후에 표시 됩니다. 프레임의 왼쪽 아래 모서리에 있는 셀 0 h ( 그림 3A참조)에 표시 됩니다. 눈금 막대: 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 시간 경과 영상에 대 한 마운트 상황을 설명 하는 도식 그림. (녹색), 셀 마이그레이션 (마젠타), 및 비디오 프레임 (검은 사각형)의 초기 방향을 electroporation (EP의 하루 상단 필드에 목표 렌즈 (obj)와 디지털 줌 (확대)의 확대와 함께 설명 했다 형광 라벨의 모양 )와 하단 필드에서 문화 (문화)의 발병. (A) 영화 1, (B) 영화 2 및 3, (C) 영화 4, (D) 영화 5. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
영화 1입니다. 플랫-마운트 문화에 피상적인 접선 이동의 시각화. 접선 마이그레이션 셀 (GFP, 상단 왼쪽된 패널)과 E7.0에서 문화의 발병 후 광섬유 tectum의 표면 층에서 그들의 핵 (mCherry 엔 유씨, 오른쪽 상단 패널)의 운동. 병합 된 이미지는 하단 패널에 표시 됩니다. 프레임의 왼쪽 아래 모서리에 있는 셀 0 h 표시 됩니다 ( 그림 3A참조), 그리고 시간 경과 이미지 이상 28 h 및 50 분 눈금 막대 캡처된: 100 µ m. 하시기 바랍니다 여기를 클릭이 비디오를 볼. 다운로드 마우스 오른쪽 단추 클릭.
영화 2입니다. 두 패널의 센터에서 접선 마이그레이션 셀 (GFP, 왼쪽된 패널) 및 그들의 핵 (mCherry 엔 유씨, 오른쪽 패널)의 움직임을 분산 이상 48 h 표시 됩니다 ( 그림 3B참조). 눈금 막대: 100 µ m. 하시기 바랍니다 여기를 클릭이 비디오를 볼. 다운로드 마우스 오른쪽 단추 클릭.
영화 3입니다. 접선 이동의 궤적. 세포 핵 ( 영화 2의 오른쪽 패널)의 변위 시각화 접선 이동의 궤적을 추적 했다. 눈금 막대; 100 µ m. 제발이이 비디오를 보려면 여기를 클릭 합니다. 다운로드 마우스 오른쪽 단추 클릭.
영화 4입니다. 높은 확대에 개별 셀 동작. 개별 셀 (GFP, 왼쪽된 패널) 및 그들의 핵 (mCherry 엔 유씨, 오른쪽 패널)의 움직임은 높은 확대 이상 24 h ( 그림 3C참조)에 표시 됩니다. 주요 프로세스의 분기 과정을 인식할 수 있습니다. 눈금 막대: 100 µ m. 하시기 바랍니다 여기를 클릭이 비디오를 볼. 다운로드 마우스 오른쪽 단추 클릭.
영화 5입니다. 중간 계층 마이그레이션입니다. E6.0에서 문화의 발병 후 24 시간 이상 표시 됩니다 tangentially 마이그레이션 셀 (GFP, 왼쪽된 패널) 및 tectal 중간 층에서 그들의 핵 (mCherry 엔 유씨, 오른쪽 패널)의 운동 ( 그림 3D참조). Dorso 복 부 축 (위에서 아래로) 선형 마이그레이션 현저 하다. 눈금 막대: 100 µ m. 하시기 바랍니다 여기를 클릭이 비디오를 볼. 다운로드 마우스 오른쪽 단추 클릭.
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Discussion
위에서 설명한 프로토콜 표면 레이어6,8셀 마이그레이션 감지 최적화 되어 있습니다. 그것은 이동 electroporation (E4.5에 E5.5)의 타이밍 및 문화의 발병 및 이미징 (E6.0에 E7.0) 그냥 중간 계층 마이그레이션 스트림영화 ( 5)6,7, 탐지를 위해 적용 가능한.
제시 하는 절차는 셀 라벨 electroporation 비켜에서평면 산 문화 및 시간 경과 confocal 영상 (그림 1)에 의해 구성 됩니다. 우선, 그것은 필수 문화 조건 vivo에서로 일반적으로 성장 하 고 건강 한 조직을 유지 최적화 되어야 합니다. 그것은 또한 조직의 방향을 감지 셀 마이그레이션 적합 되도록 중요 한입니다. 이러한 목적을 위해 우리는 셀 삽입, 수평 세포 분산의 관찰을 용이 하 게 하 고 높은 산소 풍부한 매체에 플랫-마운트 문화를 적용. 문화 상태와 방향을 확인 한 후 그것은 더 나은 형광 라벨 적어도 전자와 충돌 조건 조정 및 사진 시각화에 대 한 중요 한 손해. 더 라벨, 우리는 효율적인 모터와 식 벡터를 선택할 수 있습니다 및 electroporate 집중 DNA. 달성을 위한 최소한의 손상을, 그것은 중간은 electroporation의 전기 상태, DNA 농도 낮은 레이저 방사선의 총 시간을 최소화 하는 것이 중요.
셀 삽입에 플랫-마운트 문화를 사용 하 여이 프로토콜의 장점은 우리가 접선 셀 마이그레이션 장기적으로 관찰할 수 있다. 일반적으로, 조직 문화에 그 비켜에비해 생리 적 조건을 유지 하는 기간을 결정 하기가 어렵습니다. 아주 최소한, 피상적인 접선 마이그레이션 계속 비슷한 그 비켜에서8정상적인 세포 분산을 보여 주는 E7.0에 문화의 발병 후 72 h 이상. 또한, 신선한 조직 문화 및 이미징의 시작에 나중 단계에서 마이그레이션 관찰 하 준비가 되어 있습니다. 그것은 또한 유리한 셀 대물 렌즈에 가까운 tectum의 피상적인 플랫 시트에 수평 이동 남아 있기 때문에 셀 변위 오랜 기간 동안 다음 수 있습니다. 추적을 용이 하 게 또한 confocal 시스템을 사용 하 여 z 축 따라 이동 세포. 다른 한편으로,이 방법의 불리는 플랫-마운트 문화 되지 않을 수 있습니다 항상 이동 방사형 마이그레이션 등의 다른 종류를 정리 관련입니다. 메서드가 삽입에 tectal 조각에 방사형 마이그레이션 관찰에 적용 될 때 tectal 직물의 두께로 그 비켜에서으로 급속 하 게 증가 하지 않습니다. 콜라겐 젤에서 슬라이스 문화 메서드 같은 레이어 개발 정리 더 있을 수 있습니다.
이후 우리의 메서드는 수평 운동 문화 삽입을 병렬의 관찰을 사용 하면, 그것은 잠재적으로 적용할 수 형광 표시 된 마이크로-구조, 신경 조직에 axonal 신장 등의 순차적 변화를 감지 또는 비 신경 조직의 세포 치환입니다. 예를 들어 electroporation에 의해 개발 신경 관에서 commissural 축 삭 라벨, 후 바닥 접시 위에 사전 및 사후 건너 축 삭의 움직임 지붕 격판덮개 incising 오픈 책 문화에 구상 될 수 있다. 적절 한 문화 조건에 셀 삽입 된 vivo에서 조건을 복제에 사용할 수 있는, 우리의 메서드는 다양 한 세포 유형 및 구조의 수평 움직임을 시각화 하는 효과적인 기법을 제공 합니다.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
이 작품은 JSP KAKENHI 그랜트 수에 의해 지원 되었다 Y.W.에 15 K 06740
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | endotoxin-free plasmid DNA purification kit |
| 20 ml syringe | TERUMO | SS-20ESZ | |
| 18 gauge needle | TERUMO | NN-1838R | |
| Fast Green | Wako | 061-00031 | |
| 100x penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| glass capillary tube | Narishige | G-1 | |
| cell culture insert | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| Laminin | SIGMA | L2020 | coating of culture insert |
| poly-L-Lysine | Peptide Institute | 3075 | coating of culture insert |
| glass bottom dish | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | culture medium |
| F12 | Gibco | 11765-054 | culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 12483 | culture medium |
| chick serum | Gibco | 16110082 | culture medium |
| 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| microsurgical knife | Surgical specialties cooperation | 72-1501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| curved scissors | AS ONE | No.11 | |
| micropipette processor | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| forceps-type electrode | BEX | LF646P3x3 | |
| pulse generator | BEX | CUY21EX | electroporator |
| fluorescence stereoscopic microscope | Leica | MZ16F | |
| inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| gas controller | Tokken | MIGM/OL-2 | |
| temperature controller | Tokai Hit | MI-IBC | |
| laser confocal unit | Olympus | FV300 |
References
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