Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

فحص نشاط إندوتوكسين للكشف عن بطانة الدم الكاملة في المرضى الذين يعانون من أمراض خطيرة

doi: 10.3791/58507 Published: June 24, 2019

Summary

نقدم بموجب هذا بروتوكول لقياس النشاط الإندوتوكسين لعينات الدم البشرية الكاملة في السرير. اختبار نشاط إندوتوكسين هو اختبار بسيط للأداء وقد يكون علامة حيوية مفيدة في المرضى الذين يعانون من أمراض خطيرة مع الإنتان.

Abstract

Lipopolysaccharide، والمعروف أيضا باسم endotoxin، هو عنصر أساسي من البكتيريا سلبية الغرام ويلعب دورا حاسما في تطوير الإنتان وصدمة الصرف الصحي. وقد يؤدي التحديد المبكر لعملية معدية تتطور بسرعة إلى مرض حرج إلى علاج أسرع وأكثر كثافة، مما قد يؤدي إلى نتائج أفضل للمرضى. يمكن استخدام اختبار نشاط الإندوتوكسين (EA) في جانب السرير كعلامة حيوية موثوق بها لبطانة الرحم الجهازية. وقد ثبت مرارا وتكرارا الكشف عن ارتفاع مستويات النشاط endotoxin أن تكون مرتبطة مع زيادة شدة المرض في المرضى الذين يعانون من الإنتان وصدمة الصرف الصحي. يمكن إجراء الإنقاب بسرعة وسهولة الأداء. لفترة وجيزة، بعد أخذ العينات، يتم خلط aliquot من الدم كله مع الأجسام المضادة للاندوتوكسين ومع LPS المضافة. يتم قياس نشاط Endotoxin كانفجار الأكسدة النسبية من العدلات تستعد كما تم الكشف عنها من قبل chemioluminescence. يتم التعبير عن ناتج التقييم على مقياس من 0 (غائب) إلى 1 (الحد الأقصى) ويصنف على أنه "منخفض" (<0.4 وحدة) أو "متوسط" (0.4-0.59 وحدة) أو "مرتفع" (≥ 0.6 وحدة). وترد في هذه المخطوطة المنهجية التفصيلية والأساس المنطقي لتنفيذ هذا التبيّن.

Introduction

يُيعتبر الليبوبوليساكاريد (LPS)، المعروف أيضًا باسم endotoxin، مكونًا رئيسيًا في بنية غشاء بكتيريا الغرام سلبية (GN). أنها تشكل حوالي 10٪ من جدار الخلية، كونها حيوية لسلامة الغشاء الخارجي والتوازن. وعلاوة على ذلك، بل هو المنشط قوية من الجهاز المناعي الفطري المضيف1،2.

التعرض في المختبر من خلايا الجهاز المناعي الفطرية إلى LPS يؤدي إلى تغييرات في التعبير عن جينات متعددة3. إدارة كميات صغيرة جدا من LPS في المتطوعين الإنسان الأصحاء يؤدي إلى سلسلة من التهاب الجهازية الحادة، في حين أن الإنتان وصدمة الصرف الصحي قد تنشأ مع تركيزات أعلى endotoxin4،5.

الإنتان هو حالة تهدد الحياة والتي، إذا لم يتم التعرف عليها على الفور، يمكن أن يؤدي إلى فشل متعدد الأعضاء والموت. يجب علاج مرضى الصرف الصحي في الوقت المناسب، مع الإنعاش العدواني، والعلاج بالمضادات الحيوية الكافية، والسيطرة المثلى على المصدر، واستراتيجيات دعم الأعضاء الفورية. ويستند تشخيص مسببات الإنتان في المقام الأول على الاعتراف السريري والكشف عن مسببات الأمراض القائمة على الثقافة6. ومع ذلك، قد تستغرق نتائج الثقافات الميكروبية ما يصل إلى 48 ساعة وهي غير حاسمة في ما يصل إلى 30٪ من الحالات7. وقد يؤدي التحديد والتدخل المبكران إلى نتائج أفضل للمرضى. في المرضى الذين يشتبه في الإنتان ، غالبا ما تتخذ القرارات على أساس المعلمات الفسيولوجية والكيميائية الحيوية ، دون علامة واضحة على بطانة الرحم.

قياس نشاط إندوتوكسين (EA) يمكن الحصول عليه او طريق اختبار تجاري (انظر جدولالمواد) في الدم كله. ويمكن استخدامه كعلامة بيولوجية للبطانة السينية الجهازية للتقسيم الطبقي المبكر لشدة المرض، وخاصة في المرضى المعرضين لخطر الإصابة بصدمة الصرف الصحي8. تم استخدام اختبار لتوجيه بوليماكسين B العلاج الهيموبيرفيوجن في تجربة سريرية مزدوجة التعمية التي تم نشرها مؤخرا معشاة التعمية في المرضى الذين يعانون من صدمة الصرف الصحي9. في المرضى الذين يعانون من أمراض خطيرة، وأظهرت الدراسة MEDIC زيادة مستويات EA أن تكون مرتبطة مع خلل الجهاز متعددة، وحدة العناية المركزة (ICU) طول مدة الإقامة، والوفيات10.

وقد وضعت تجارب مختلفة للكشف عن الاندوتوكسين. اختبار ليمولوس الأميبوسيت ليسات (LAL)، إما كاختبار جل جلطة، عكر، أو كروموجينيك، كان حتى الآن الأكثر شيوعا ً المعتمدة لتقدير إندوتوكسين المصل. وهو يقوم على قدرة endotoxin للحث على تخثر الهيمولمفي من سرطان البحر حدوة الحصان ، Limulus polyphemus. ومع ذلك، فإن هذا القول له بعض القيود من حيث الخصوصية. على وجه الخصوص، فإنه يمكن أيضا أن تنشط من قبل المنتجات الميكروبية غير endotoxin، مثل مكونات جدار الخلية الفطرية، ويمكن أن تمنعها مختلف بروتينات البلازما البشرية11.

خلال العقد الماضي تم تطوير قياس EA والتحقق من صحته كعلامة بيولوجية لتدوير بطانة الرحم. بالمقارنة مع اختبار LAL، EA هو أسرع وأسهل لتنفيذ في الإعداد السريري. وعلاوة على ذلك، فقد ثبت أن تكون أكثر دقة من LAL في الدم كله، مع زيادة الحساسية والخصوصية، سواء في المختبر وفي الجسم الحي12.

وعلى الرغم من تنفيذه الأولي كأداة تشخيصية مبكرة للتعرف السريع على بكتيريا GN كعوامل تسببية للإنتان، فقد تمت دراسة مستوى EA أيضًا كعلامة حيوية لشدة المرض. في هذا السياق، وقد ثبت أن تكون مفيدة بشكل خاص لتقييم حالة نقص التسريب بسبب الأمراض الحرجة المستمرة، مثل صدمة الصرف الصحي أو متلازمة ما بعد توقف القلب13. في الآونة الأخيرة، منذ تطوير أنظمة تنقية الهيموتنقية، كما تم اقتراح نتيجة إيجابية EA كأداة فحص لتحديد بدقة المرشحين المحتملين لمثل هذا العلاج14. أجرينا مؤخرا دراسة استعادية مراقبة حول انتشار ودلالة سريرية من مستويات عالية في وقت مبكر من EA في 107 المرضى الذين يعانون من صدمة الصرف الصحي. تمشيا مع النتائج الأخيرة الأخرى، وجدنا أن EA هو علامة واعدة من شدة المرض في المرضى الذين يعانون من صدمة الصرف الصحي15.

الهدف من هذه المخطوطة هو وصف طريقة إجراء الفحص EA، سواء في السرير أو في المختبر، ووصف استخدامه المحتمل في سيناريو تمثيلي لصدمة الصرف الصحي. هذه التقنية يمكن الكشف عن نشاط LPS عن طريق قياس انفجار الأكسدة المعززة في العدلات بعد فتيلة من قبل مجمعات من الأجسام المضادة للاندوتوكسين وLPS. يتم الكشف عن زيادة انفجار الجهاز التنفسي عن طريق مقياس الكيميلومين ويعتبر مقدار الضوء المنبعث متناسبا مع كمية الإندوتوكسين في عينة الدم. يتطلب فحص عدد قليل من الكواشف، ويستغرق حوالي 30 دقيقة لأداء ويستخدم أقل من 40 ميكرولتر من الدم كله12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يتم تنفيذ البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية المتعلقة بمعالجة العينات البيولوجية البشرية واتباع الإجراءات التشغيلية القياسية الحالية لمختبرنا السريري. يتبع استخدام بيانات EA والمعلومات السريرية للمرضى الذين يتم اختبارهم المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحث البشري في مؤسستنا.

1. معدات المختبرات ومحتويات مجموعة الفحص

  1. تخزين مجموعة EA في 2-8 درجة مئوية عندما لا تكون في الاستخدام.
  2. يتكون كل اختبار EA من 5 أنواع مختلفة من الأنابيب؛ استخدام كل واحد لجزء مختلف من الاختبار (انظر القسم 2).
    1. استخدام أنبوب #1 ("التحكم" أنبوب) لقياس النشاط القاعدية من الاندفاع التأكسدي غير محددة من العدلات المريض في غياب جسم مضاد معين.
    2. استخدام أنبوب #2 ("عينة" أنبوب) لقياس انفجار الأكسدة استجابة لمجمع LPS الأجسام المضادة.
    3. استخدام أنبوب #3 ("ماكس" أنبوب) لقياس الاندفاع التأكسدي الأقصى من العدلات المريض استجابة لفائض من endotoxin.
    4. استخدام أنبوب #4 (أنبوب "LPS") كمصدر للإندوتوكسين الخارجية.
    5. استخدام أنبوب #5 ("Aliquot" أنبوب) لتخزين الدم.
      ملاحظة: يتم توفير نسخ مكررة من الأنابيب #1 #2 #3 لما مجموعه 8 أنابيب لاستخدامها في كل عينة من عينات الدم التي يجري اختبارها (يمكن استخدام زجاجة كاشف EA واختبار مراقبة الجودة لجميع الاختبارات الواردة في الحقيبة).
  3. جمع عينات دم المريض في أنابيب معقمة تحتوي على مضادات التخثر EDTA. تخزين عينات الدم في درجة حرارة الغرفة قبل تشغيل اختبار EA.
  4. قبل بدء الاختبار، قم بتشغيل مقياس الكيميلومومتر والحاضنة شاكر. تدفئة الحاضنة إلى درجة حرارة 37 درجة مئوية.
  5. من الناحية المثالية، بدء معالجة العينة في غضون 30 دقيقة من جمع الدم.

2. إندوتوكسين النشاط التبيّن

  1. قم بإعداد أنابيب اختبار EA لعينة دم كل مريض تحتاج إلى اختبارها. وضع الأنابيب في رفوف أنبوب. ثم قم بإزالة القبعات.
  2. باستخدام كومبيبيت، ماصة حجم 1 مل من كاشف EA من زجاجة إلى أنابيب #1 (أنبوب التحكم)، #2 (أنبوب عينة) #3 (أنبوب ماكس)، كل واحد في مكررة.
    ملاحظة: ماصة أسفل الجانب من الأنبوب لتجنب حل الرش مرة أخرى.
  3. اخلط عينة دم المريض عن طريق عكس أنبوب جمع الدم برفق لمدة 20 مرة. ثم، ماصة 0.5 مل من دم المريض في أنبوب #4 (LPS أنبوب ماكس) #5 أنبوب (أنبوب Aliquot). أنبوب دوامة #4 لمدة 10 s.
  4. وضع رفوف أنبوب مع جميع أنابيب اختبار EA في شاكر حاضنة. أغلق الغطاء والحضانة لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
  5. فتح الغطاء وإزالة رفوف أنبوب من شاكر حاضنة. دوامة أنبوب #5 (Aliquot أنبوب). باستخدام طرف معقم، ماصة 40 ميكرولتر من الدم في أنابيب #1 #2، في تكرار.
  6. دوامة أنبوب #4 (LPS أنبوب). باستخدام نفس طرف ماصة، ماصة 40 درجة مئوية من الدم من أنبوب #4 إلى أنبوب #3 (أنبوب ماكس)، في تكرار.
  7. دوامة أنابيب الاختبار النهائي الستة (#1، #2، #3، والتكرارات ذات الصلة)، ثم وضعها مرة أخرى في رفوفها.
    ملاحظة: تأكد من أن جميع الأنابيب هي دوامة لنفس الكمية من الوقت.
  8. وضع رفوف أنبوب مرة أخرى في شاكر الحضانة وإغلاق الغطاء. تعيين شاكر الحضانة في 100 دورة في الدقيقة، ثم بدء الحركة لمدة 14 دقيقة.
  9. إدراج بطاقة رقاقة EA المسمى في مقياس الكيميلومومتر والبدء في الصحافة. بعد الحضانة 14 دقيقة، اتبع التعليمات المعروضة على مقياس الكيميلوم لقراءة أنابيب EA في الترتيب الصحيح.
  10. دوامة بلطف كل أنبوب لمدة 10 s قبل وضعه على حامل عينة من مقياس الكيميلومين. فتح درج عينة ووضع أنبوب #1 في حامل العينة. ثم قم بإغلاق درج العينة وانتظر القراءة وحدة الضوء النسبي (RLU).
  11. كرر الخطوة 2.10 لأنبوب 2 و أنبوب 3.
  12. كرر الخطوة 2.10 للأنابيب المكررة 1 و 2 و 3.
    ملاحظة: حاول تشغيل كافة الأنابيب لنفس المقدار من الوقت أثناء الخطوات 2.10-2.12.
  13. بعد معالجة كافة الأنابيب، لاحظ أنه سيتم حساب نتائج EA وطباعتها تلقائيًا. يتم التعبير عن المستويات كوحدات EA وتمثل متوسط التحديدات المكررة من نفس العينات.
  14. كرر الخطوات من 2.2 إلى 2.13 لكل عينة دم تحتاج إلى اختبار.
  15. بمجرد الانتهاء من الفحص، قم بتخزين أنابيب الاختبار المتبقية وككواش EA عند درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 30 يومًا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وأدخل رجل يبلغ من العمر 72 عاما إلى قسم الطوارئ في مستشفى حضري أكاديمي. وقبل ذلك ببضعة أيام قدم إلى طبيب الرعاية الأولية يشكو من حرق التبول. وأوصى بإجراء علاج قصير مع فوسفومايسين عن طريق الفم. وشمل تاريخه الطبي ارتفاع ضغط الدم، ومرض السكري من النوع 2 غير المعقد، وتضخم البروستاتا الحميد. وشملت أدويته إينالابريل، أتورفاستاتين، تامسولوسين وميتفورمين.

في ED، كان الخمول، الخلط عندما استيقظ. وكانت درجة حرارته 39.1 درجة مئوية، وكان معدل ضربات القلب 125 نبضة في الدقيقة، وكان ضغط الدم 80/40 ملم زئبق، وكان معدل التنفس 20/min، وكان SpO2 94٪ في الهواء الغرفة، ورفع إلى 99٪ مع 4 L / دقيقة الأكسجين من خلال قنية الأنف. كان فحص البطن طبيعيًا، باستثناء الرقة فوق العانة الخفيفة غير المحلية. بصعوبة، تم وضع قسطرة فولي. تم استنزاف كمية منخفضة من البول قيفي داكن اللون.

كشف عدد كامل من الدم عدد الخلايا البيضاء من 18.5 × 103. وكان الكرياتينين 2.7 ملغ /دل، وكان الجلوكوز 250 ملغ / دل، وكان مستوى حمض اللاكتيك 4.5 مليمول / لتر.

تم وضع قسطرة وريدي مركزي، مع توجيه بالموجات فوق الصوتية، في الوريد الوداجي الداخلي الأيمن. تم الحصول على تحليل غاز الدم عند وضع القسطرة، وكشف عن قيمة 63٪ ScVO2. وقد بدأ الإنعاش السائل العدواني على الفور مع ضخ البولوس الكريستالي 30 مل/كغ أكثر من 30 دقيقة. تم نقل المريض إلى وحدة العناية المركزة مع تشخيص صدمة الصرف الصحي، التي يحتمل أن تنشأ من عدوى المسالك البولية.

في وحدة العناية المركزة، وسط جمع الثقافات الميكروبية وإدارة العلاج بالمضادات الحيوية empiric، تم الحصول على عينة دم كاملة لاختبار EA. تم إجراء هذا التقييم بسرعة وفقا للبروتوكول المعروض هنا.

من أجل حساب نتائج EA، يسجل مقياس الكيميلومين: الإنارة القاعدية من العدلات (L1)؛ الإنارة من نشاط العدلات استجابة لLPS في عينة الدم (L2)؛ نشاط العدلات القصوى ردا على التعرض الهائل لLPS (L3). يتم التعبير عن النتائج على النحو السّبأ: نشاط إندوتوكسين (EA) = (L2-L1)/(L3-L1). لذلك، فإن قيمة EA الناتجة تعكس درجة انفجار أكسدة العدلات المريض بسبب وجود تعميم endotoxin (L2)، تطبيع من قبل أعلى مستوى من الإنارة التي يمكن قياسها في نفس عينة الدم استجابة ل التركيز فوق الأقصى من LPS (L3). يتم التحكم في كلتا القيمتين للإنارة القاعدية للعينة (L1).

بعد حوالي 30 دقيقة، اعترف الطبيب 0.75 وحدات EA لتكون مستوى نشاط endotoxin للمريض.

تشير قيمة EA التي تقل عن 0.40 وحدة EA إلى انخفاض مستوى نشاط endotoxin، وهو ما يعادل انخفاض تركيز LPS المتداول، والذي يمثل خطر ًا منخفضًا للتقدم إلى حالة مرض شديد. وتشير النتائج بين 0.40 EA و 0.59 EA وحدات مستوى نشاط endotoxin المتوسطة، مما يمثل خطرا ً كبيراً لتطوير الإنتان الحاد وصدمة الصرف الصحي. وتشير النتائج التي تساوي أو تزيد عن 0.60 وحدة EA إلى ارتفاع مستوى نشاط الإندوتوكسين، مما يمثل خطراً كبيراً لصدمة التفسخ وضعف نتائج المرضى (الجدول1).

ولذلك تم تأكيد تشخيص صدمة الصرف الصحي، على الأرجح بسبب بكتيريا GN. كما تم تصنيف المريض على أنه في خطر كبير للغاية، تمشيا مع الأدلة على فشل الأعضاء المصاحبة ومستوى اللاكتات. وعلاوة على ذلك تم التعامل مع حجم العدوانية الإنعاش والدعم vasoactive. تم النظر في العلاج الهيموتنقية بوليميكسين-B، ولكن لم تنفذ، وذلك بسبب الاستجابة المبكرة مقنعة للمريض للسوائل وvasopressors. في اليوم الثاني، تم تأكيد الإشريكية القولونية كعامل سببي من خلال ثقافات الدم الإيجابية. مع العلاج بالمضادات الحيوية المناسبة، تعافى المريض، وخرج من وحدة العناية المركزة في اليوم 7. وقد أُجري اختبار ثان لـ EA قبل خروج وحدة العناية المركزة. ونتيجة لـ 0.2 وحدة من وحدات EA التي أشارت إلى الدقة الكاملة للسلسلة البيوكيميائية الناجمة عن صدمة التفسخ.

ويبين الشكل 1 توزيع قيم EA التي تقاس في غضون 24 ساعة في عينة من المرضى الذين يعانون من صدمة الصرف الصحي.

Figure 1
الشكل 1: توزيع مستويات نشاط الإندوتوكسين (EA) التي تقاس في غضون 24 ساعة من بداية صدمة الصرف الصحي لبين مجموعة من المرضى الذين يعانون من أمراض خطيرة = 107). تكييفها من Bottiroli، وآخرون مع إذن15. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وحدات EA مستوى نشاط إندوتوكسين
<0.40 منخفضه
0.40 – 0.59 المتوسطه
≥ 0.60 عاليه

الجدول 1: فئات مستويات نشاط الإندوتوكسين. EA = نشاط إندوتوكسين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

صدمة الصرف الصحي لا تزال في الوقت الحاضر المرتبطة بوفيات تصل إلى 40٪، على الرغم من أن هذا المعدل يختلف وفقا للتقارير النظر16. تدعو معظم الخبراء في المجالات إلى الحاجة إلى علامات حيوية جديدة وأفضل من أجل مساعدة الأطباء في التشخيصالمبكر، وتحسين الإدارة، والتنبؤ بالمرضى الذين يعانون من صدمة الصرف الصحي 6.

لا يتطلب إجراء اختبار EA معرفة تقنية سابقة أو معدات مختبرية متطورة، ويمكن لأي مقدم رعاية صحية أن يتعلم بسهولة وسرعة كيفية تشغيله. قد يساعد التحديد الفوري لـ EA عالي الدوران في تصنيف مخاطر المريض، مما يؤدي إلى اتباع نهج علاجي سابق وأكثر عدوانية. وعلى العكس من ذلك، فإن نتيجة EA التي تقل عن 0.40 وحدة EA قد تشير إلى انخفاض خطر التقدم إلى فشل متعدد الأعضاء17. استخدام عينات المريض كسيطرة خاصة بهم هو بسيط، ويجعل هذا الاختبار أكثر حساسية وتمثيل أكثر دقة لمستوى الدم الحقيقي من endotoxemia.

استخدام مجمعات الأجسام المضادة LPS والعدلات المريض نفسه يحمي اختبار EA من أن تمنعها عوامل أخرى (مثل بروتينات البلازما). لا يمكن أن يقال الشيء نفسه لاختبار آخر، مثل اختبار LAL، الذي يتطلب تنشيط تتالي تخثر. اختبار LAL ينفذ بشكل جيد عندما لا تكون ملزمة endotoxin من قبل مستقبلات محددة، ولكن في البلازما والدم كله البروتينات المختلفة ربط LPS، والتدخل في الفحص. وعلاوة على ذلك، قد تؤدي المنتجات الفطرية إلى تتالي تخثر الليولوس، مما يجعل الاختبار أقل تحديداً لبكتيريا GN. لهذا السبب، فإن EA متفوقة على اختبار LAL الذي لا يزال معتمدًا بشكل شائع لتقييم بطانة الرحم18.

ومع ذلك، لكي يكون اختبار EA موثوقًا به، من الأهمية بمكان اتباع الخطوات المذكورة أعلاه بدقة. يتم حساب مستوى الإندوتوكسين للعينة التي يتم اختبارها عن طريق حساب التشيء الكيميائي مع مرور الوقت، وقياس الاستجابات القاعدية (#1 الأنبوبية) والقصوى (أنبوب #3) لنفس عينة الدم مثل القيم المرجعية. ولذلك، فمن الضروري وضع بعناية الأنابيب الثلاثة في الترتيب الصحيح في مقياس الكيميلومين.

ولا ينبغي أن يحل استخدام مستويات القدرة على الاستجابة للإصابة في الممارسة السريرية محل الاختبارات المعيارية (مثل الاختبارات المختبرية وثقافات الدم) في عملية الإصابة بمرض معدي محتمل. على الرغم من أن LPS قد تكون مرتبطة بوضوح مع إطلاق منتجات غشاء البكتيريا GN, كما تم الإبلاغ عن مستويات مرتفعة من بطانة الرحم في حالة العدوى بسبب عوامل أخرى19. ومن المعروف جيدا أن بطانة الرحم قد يكون بسبب نقل البكتيريا من خلال الغشاء المخاطي في الأمعاء، وخاصة كلما نقص الأنسجة وزيادة نفاذية حاجز الأمعاء من المرجح أن تحدث20،21. في ظل هذه الظروف، فمن الممكن أن نتوقع تعميم LPS أن يكون نتيجة، وليس السبب، من الإنتان والصدمة. في هذا السيناريو، يمكن أن توفر EA معلومات حول شدة إصابة الأنسجة المستمرة، بغض النظر عن المسببات البكتيرية15. دعم هذا المبدأ, في دراسة حديثة غريمالدي وآخرون وجدت أن ارتفاع مستويات EA أن تكون مرتبطة مع شدة ومدة الصدمة بعد توقف القلب خارج المستشفى13.

ومن المثير للاهتمام، فيرزي وآخرون أيضا سلط الضوء على الدور المحتمل للإندوتوكسين (ورصدها) في المرضى الذين يعانون من نوع 5 متلازمة القلب الكلى، وهي حالة تتميز بخلل القلب والكلى المصاحبة في وضع اضطرابات الجهازية المختلفة ، مثل الإنتان23 . ومن المعروف أن Endotoxin للحث على ضعف خلايا القلب، على الرغم من أن الآلية المرضية الفسيولوجية الدقيقة غير واضحة إلى حد كبير. من ناحية أخرى ، ثبت أن بطانة الرحم تحفز الخلل الكلوي بسبب عدة مسارات للإصابة المحلية والنظامية ، مما تسبب في ضعف تدفق الدم الكلوي ، ومعدل الترشيح الكبيبي ، والوظيفة الأنبوبية22.

ومع ذلك، يجب تسليط الضوء على بعض القيود على EA. تأثير العلاج بالمضادات الحيوية الجارية على نتيجة EA حاليا ليست راسخة24. وعلاوة على ذلك، تشير الأدلة إلى أنه في المرضى الحرجة قياس EA في وقت مبكر نقطة واحدة، على الرغم من أن مفيدة، لا يتنبأ بشكل موثوق الوفيات صدمة الصرف الصحي، حتى عندما أكبر من 0.6 وحدة15. وقد تكون هناك حاجة إلى تقييمات متكررة متسلسلة، على الرغم من أن عددها وتوقيتها غير واضحين حاليا. وركز مؤلفون آخرون على التقلبات في بطانة الرحم، وافترضوا أن زيادة التغير اليومي قد تكون مرتبطة بدرجة أعلى من الخلل في الأعضاء المتعددة25. وأخيراً، هناك قيد تقني إضافي ينبغي النظر فيه هو المقياس النسبي الذي يقاس به نشاط الإندوتوكسين (0 إلى 1 وحدة، مع زيادة الحد الأدنى للكشف 0.01). وهذا يجعل نتائج عالية للغاية لا محالة الهضبة حول المستوى الأقصى، مما يجعل التمايز في هذه المجموعة الفرعية من المرضى (EA > 0.9 وحدات) أصعب للتحقيق.

وفي الختام، في حين أن هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتقييم الأثر المحتمل لرصد مستويات الإندوتوكسين على النتائج السريرية، فإن EA متاح حالياً كاختبار سريع وبسيط وحساس، مما قد يسهل عملية صنع القرار في وحدة العناية المركزة الأطباء في مرضى التفسخ الحرجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وغطت شركة Estor SpA تكلفة رسوم النشر وإنتاج الفيديو في المجلة. وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنها.

Acknowledgments

نشكر باولو براغانو وليزا ماتياسين، دكتوراه على استعراضمنهجية بروتوكول التقييم. قدم داريو وينترتون، دكتوراه في الطب مساعدة كبيرة في مراجعة المخطوطة لإتقان اللغة الإنجليزية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EAA kit Spectral Medical Inc. EAAST-20 Package with 20 tests + 1 quality control
Smart Line TL Berthold EAASL Luminometer
Incubator shaker GRANT ES-20 Mini-incubator shaker
Vortexer VWR 444-2790 Vortex instrument

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nature Reviews Immunology. 4, (7), 499-511 (2004).
  2. Takeda, K. Evolution and integration of innate immune recognition systems: the Toll-like receptors. Journal of Endotoxin Research. 11, (1), 51-55 (2005).
  3. Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system. Current Opinion in Immunology. 11, (1), 19-22 (1999).
  4. Natanson, C., et al. Endotoxin and tumor necrosis factor challenges in dogs simulate the cardiovascular profile of human septic shock. The Journal of Experimental Medicine. 169, (3), 823-832 (1989).
  5. Suffredini, A. F., et al. The cardiovascular response of normal humans to the administration of endotoxin. The New England Journal of Medicine. 321, (5), 280-287 (1989).
  6. Singer, M., et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA: The Journal of the American Medical Association. 315, (8), 801-810 (2016).
  7. Gupta, S., et al. Culture-Negative Severe Sepsis: Nationwide Trends and Outcomes. Chest. 150, (6), 1251-1259 (2016).
  8. Ikeda, T., Ikeda, K., Suda, S., Ueno, T. Usefulness of the endotoxin activity assay as a biomarker to assess the severity of endotoxemia in critically ill patients. Innate Immunity. 20, (8), 881-887 (2014).
  9. Dellinger, R. P., et al. Effect of Targeted Polymyxin B Hemoperfusion on 28-Day Mortality in Patients With Septic Shock and Elevated Endotoxin Level. The EUPHRATES Randomized Clinical Trial. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 320, (14), 1455-1463 (2018).
  10. Marshall, J. C., et al. Diagnostic and prognostic implications of endotoxemia in critical illness: results of the MEDIC study. The Journal of Infectious Diseases. 190, (3), 527-534 (2004).
  11. Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus; its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica. 19, (1), 186-197 (1968).
  12. Marshall, J. C., et al. Measurement of endotoxin activity in critically ill patients using whole blood neutrophil dependent chemiluminescence. Critical Care. 6, (4), London, England. 342-348 (2002).
  13. Grimaldi, D., et al. High Level of Endotoxemia Following Out-of-Hospital Cardiac Arrest Is Associated With Severity and Duration of Postcardiac Arrest Shock. Critical Care Medicine. 43, (12), 2597-2604 (2015).
  14. Klein, D. J., et al. The EUPHRATES trial (Evaluating the Use of Polymyxin B Hemoperfusion in a Randomized controlled trial of Adults Treated for Endotoxemia and Septic shock): study protocol for a randomized controlled trial. Trials. 15, 218 (2014).
  15. Bottiroli, M., et al. Prevalence and clinical significance of early high Endotoxin Activity in septic shock: An observational study. Journal of Critical Care. 41, 124-129 (2017).
  16. Kaukonen, K. M., Bailey, M., Suzuki, S., Pilcher, D., Bellomo, R. Mortality related to severe sepsis and septic shock among critically ill patients in Australia and New Zealand. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311, (13), 1308-1316 (2014).
  17. Biagioni, E., et al. Endotoxin activity levels as a prediction tool for risk of deterioration in patients with sepsis not admitted to the intensive care unit: a pilot observational study. Journal of Critical Care. 28, (5), 612-617 (2013).
  18. Roth, R. I., Levin, F. C., Levin, J. Optimization of detection of bacterial endotoxin in plasma with the Limulus test. The Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 116, (2), 153-161 (1990).
  19. Yaguchi, A., Yuzawa, J., Klein, D. J., Takeda, M., Harada, T. Combining intermediate levels of the Endotoxin Activity Assay (EA) with other biomarkers in the assessment of patients with sepsis: results of an observational study. Critical Care. 16, (3), London, England. (2012).
  20. Earley, Z. M., et al. Burn Injury Alters the Intestinal Microbiome and Increases Gut Permeability and Bacterial Translocation. PLoS One. 10, (7), (2015).
  21. Munster, A. M., Smith-Meek, M., Dickerson, C., Translocation Winchurch, R. A. Incidental phenomenon or true pathology? Annals of Surgery. 218, (3), 321 (1993).
  22. Clementi, A., Virzì, G. M., Brocca, A., Ronco, C. The Role of Endotoxin in the Setting of Cardiorenal Syndrome Type 5. Cardiorenal Medicine. 7, (4), 276-283 (2017).
  23. Virzì, G. M., et al. Cardiorenal Syndrome Type 5 in Sepsis: Role of Endotoxin. in Cell Death Pathways and Inflammation. Kidney and Blood Pressure Research. 41, (6), 1008-1015 (2016).
  24. Mignon, F., Piagnerelli, M., Van Nuffelen, M., Vincent, J. L. Effect of empiric antibiotic treatment on plasma endotoxin activity in septic patients. Infection. 42, (3), 521-528 (2014).
  25. Klein, D. J., et al. Daily variation in endotoxin levels is associated with increased organ failure in critically ill patients. Shock. 28, (5), 524-529 (2007).
فحص نشاط إندوتوكسين للكشف عن بطانة الدم الكاملة في المرضى الذين يعانون من أمراض خطيرة
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Pinciroli, R., Checchi, S., Bottiroli, M., Monti, G., Casella, G., Fumagalli, R. Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients. J. Vis. Exp. (148), e58507, doi:10.3791/58507 (2019).More

Pinciroli, R., Checchi, S., Bottiroli, M., Monti, G., Casella, G., Fumagalli, R. Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients. J. Vis. Exp. (148), e58507, doi:10.3791/58507 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter