Summary
Nous présentons par la présente un protocole pour mesurer au chevet de l'activité endotoxine des échantillons de sang entiers humains. L'analyse d'activité d'endotoxine est un essai simple à exécuter et peut être un biomarqueur utile dans les patients gravement malades présentant le sepsis.
Abstract
Lipopolysaccharide, également connu sous le nom d'endotoxine, est un composant fondamental des bactéries gram-négatives et joue un rôle crucial dans le développement de la septicémie et le choc septique. L'identification précoce d'un processus infectieux qui évolue rapidement vers une maladie grave pourrait entraîner un traitement plus rapide et plus intensif, ce qui pourrait mener à de meilleurs résultats pour les patients. L'analyse de l'activité d'endotoxine (EA) peut être utilisée au chevet comme biomarqueur fiable de l'endotoxémie systémique. La détection des niveaux élevés d'activité d'endotoxine a été à plusieurs reprises montrée pour être associée à une sévérité accrue de la maladie dans les patients présentant le sepsis et le choc septique. L'astodonte est rapide et facile à réaliser. En bref, après l'échantillonnage, un aliquot de sang entier est mélangé avec un anticorps anti-endotoxine et avec ajouté LPS. L'activité d'endotoxine est mesurée comme l'éclatement oxydant relatif des neutrophiles apprêtés tel qu'détecté par chemioluminescence. La production de l'assay est exprimée sur une échelle de 0 (absent) à 1 (maximum) et classée comme « faible » (0,4 unité), « intermédiaire » (0,4 à 0,59 unité) ou « élevée » (0,6 unité). La méthodologie détaillée et la justification de la mise en œuvre de l'analyse de l'EE sont indiquées dans ce manuscrit.
Introduction
Le Lipopolysaccharide (LPS), également connu sous le nom d'endotoxine, est un composant clé de la structure membranaire des bactéries Gram-negative (GN). Il représente environ 10% de la paroi cellulaire, étant vital pour l'intégrité de la membrane externe et l'homéostasie. En outre, il est un activateur puissant du système immunitaire inné hôte1,2.
L'exposition in vitro des cellules innées du système immunitaire au LPS entraîne des changements dans l'expression de plusieurs gènes3. L'administration de très petites quantités de LPS chez des volontaires humains en bonne santé déclenche la cascade d'inflammation systémique aigue, tandis que la septicémie et le choc septique peuvent survenir avec des concentrations plus élevées d'endotoxine4,5.
La septicémie est une affection potentiellement mortelle qui, si elle n'est pas rapidement reconnue, peut entraîner une défaillance et la mort de plusieurs organes. Les patients septiques doivent être traités en temps opportun, avec la réanimation agressive, la thérapie antibiotique proportionnelle, le contrôle optimal de source, et les stratégies promptes de soutien d'organe. Le diagnostic de l'étiologie de la septicémie est principalement basé sur la reconnaissance clinique et la détection d'agents pathogènes basée sur la culture6. Cependant, les résultats des cultures microbiennes peuvent prendre jusqu'à 48 h et ne sont pas concluants dans jusqu'à 30% des cas7. L'identification et l'intervention précoces peuvent mener à de meilleurs résultats pour les patients. Chez les patients chez qui la septicémie est soupçonnée, les décisions sont souvent prises sur la base de paramètres physiologiques et biochimiques, sans un signe clair d'endotoxémie.
La mesure de l'activité d'endotoxine (EA) peut être obtenue au moyen d'un test commercial (voir Tableau des matériaux) dans le sang entier. Il peut être employé comme biomarqueur de l'endotoxémie systémique pour la stratification tôtde la sévérité de la maladie, particulièrement dans les patients à risque pour développer le choc septique 8. L'essai a été employé pour guider la thérapie d'hémoperfusion de Polymyxin B dans unessai clinique randomisé randomisé-commandé récemment édité dans les patients présentant le choc septique 9. Chez les patients gravement malades, l'étude MEDIC a montré que les niveaux accrus d'EE étaient associés à un dysfonctionnement multiple des organes, à la durée du séjour de l'unité de soins intensifs (USI) et à la mortalité10.
Différents essais ont été développés pour détecter l'endotoxine. L'essai de Lysate d'amoebocyte de Limulus (LAL), sous forme de gel-caillot, de test turbidimétrique ou chromogénique, a été jusqu'ici le plus fréquemment adopté pour l'estimation de l'endotoxine de sérum. Il est basé sur la capacité de l'endotoxine à induire la coagulation de l'hémolymphe du crabe fer à cheval, Limulus polyphémus. Cependant, cet examen a quelques limites en termes de spécificité. En particulier, il peut également être activé par des produits microbiens autres que l'endotoxine, tels que les composants de la paroi cellulaire fongique, et il peut être inhibé par diverses protéines plasmatiques humaines11.
Au cours de la dernière décennie, la mesure de l'EE a été développée et validée comme biomarqueur de l'endotoxémie circulante. Par rapport au test LAL, eA est plus rapide et plus facile à mettre en œuvre en milieu clinique. En outre, il s'est avéré plus précis que la LAL dans le sang entier, avec une sensibilité et une spécificité accrues, à la fois in vitro et in vivo12.
En dépit de sa mise en œuvre initiale comme outil de diagnostic précoce pour l'identification rapide des bactéries GN comme agents causatifs de sepsis, le niveau d'EE a également été étudié comme biomarqueur de la sévérité de la maladie. Dans ce contexte, il s'est avéré particulièrement utile d'évaluer l'état d'hypoperfusion dû à une maladie critique en cours, comme un choc septique ou un syndrome d'arrêt post-cardiaque13. Plus récemment, depuis le développement de systèmes d'hémopurification, un résultat positif de l'EE a également été proposé comme outil de dépistage pour identifier avec précision les candidats potentiels pour une telle thérapie14. Nous avons récemment mené une étude rétrospective observationnelle sur la prédominance et l'importance clinique des niveaux élevés tôt d'EE dans 107 patients présentant le choc septique. Conformément à d'autres résultats récents, nous avons constaté que l'EE est un marqueur prometteur de la sévérité de la maladie chez les patients présentant le choc septique15.
Le but du présent manuscrit est de décrire la méthode pour effectuer l'analyse de l'EE, soit au chevet du patient ou en laboratoire, et de décrire son utilisation potentielle dans un scénario représentatif de choc septique. Cette technique peut détecter l'activité de LPS en mesurant l'éclatement oxydant amélioré dans les neutrophiles suivant leur amorçage par des complexes d'un anticorps anti-endotoxine et de LPS. L'augmentation de l'éclatement respiratoire est détectée par un chemiluminomètre et la quantité de lumière émise est considérée comme proportionnelle à la quantité d'endotoxine dans l'échantillon de sang. L'analyse nécessite peu de réactifs, prend environ 30 minutes à effectuer et utilise aussi peu que 40 L de sang entier12.
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Protocol
Le protocole est réalisé selon les directives institutionnelles relatives à la manipulation des biospécimens humains et suivant les procédures opérationnelles standard actuelles de notre laboratoire clinique. L'utilisation des données d'évaluation de l'évaluation du travail et de l'information clinique sur les patients testés suit les lignes directrices du comité d'éthique de la recherche humaine de notre établissement.
1. Matériel de laboratoire et contenu de kit d'essais
- Conservez le kit EA à 2'8 oC lorsqu'il n'est pas utilisé.
-
Chaque test d'EA se compose de 5 différents types de tubes; utiliser chacun d'eux pour une partie différente du test (voir la section 2).
- Utilisez le tube #1 (le tube « Control ») pour mesurer l'activité basale de l'éclatement oxydatif non spécifique des neutrophiles du patient en l'absence d'un anticorps spécifique.
- Utilisez #2 de tube (le tube « échantillon ») pour mesurer l'éclatement oxydant en réponse au complexe lPS-anticorps.
- Utilisez le tube #3 (le tube " Max ") pour mesurer l'éclatement oxydatif maximal des neutrophiles du patient en réponse à un excès d'endotoxine.
- Utilisez le tube #4 (le tube « LPS ») comme source d'endotoxine exogène.
- Utilisez le tube #5 (tube Aliquot) pour le stockage du sang.
REMARQUE: Des doublons de tubes #1, #2 et #3 sont fournis pour un total de 8 tubes à utiliser pour chaque échantillon de sang testé (la bouteille de réactif EA et le test de contrôle de la qualité peuvent être utilisés pour tous les tests contenus dans une poche).
- Recueillir des échantillons de sang de patients dans des tubes stériles contenant de l'anticoagulant EDTA. Conservez les échantillons de sang à température ambiante avant d'exécuter le test d'eE.
- Avant de commencer le test, allumez le chemiluminomètre et le shaker de l'incubateur. Réchauffer l'incubateur à la température de 37 oC.
- Idéalement, commencer à traiter l'échantillon dans les 30 minutes de la collecte de sang.
2. Exemple d'activité d'endotoxine
- Préparez les tubes à essai EA pour l'échantillon de sang de chaque patient que vous devez tester. Mettre les tubes dans des grilles à tubes. Retirez ensuite les bouchons.
- À l'aide d'une combipipette, pipette un volume de 1 ml du réactif EA de la bouteille dans des tubes #1 (tube de contrôle), #2 (tube d'échantillon) et #3 (tube Max), chacun en double.
REMARQUE: Pipette sur le côté du tube pour éviter la solution éclaboussures de retour. - Mélanger l'échantillon de sang du patient en inversant doucement le tube de collecte de sang pendant 20 fois. Ensuite, pipette 0,5 ml de sang patient dans le tube #4 (tube LPS max) et le tube #5 (tube Aliquot). Tube de vortex #4 pour 10 s.
- Placez les grilles de tube avec tous les tubes à essai EA dans le shaker de l'incubateur. Fermer le couvercle et couver pendant 10 min à la température de 37oC.
- Ouvrez le couvercle et retirez les grilles de tube du shaker de l'incubateur. #5 de tube de Vortex (tube d'Aliquot). À l'aide d'une pointe stérile, pipette 40 l de sang dans des tubes #1 et #2, en double.
- #4 de tube de Vortex (tube de LPS). En utilisant la même pointe de pipette, pipette 40 'L de sang de #4 tube dans le tube #3 (tube Max), en double.
- Vortex les six tubes à essai finals (#1, #2, #3 et les doublons respectifs), puis les remettre dans leurs racks.
REMARQUE: Assurez-vous que tous les tubes sont vortexés pendant la même quantité de temps. - Remettez les grilles tubulaires dans le shaker d'incubation et fermez le couvercle. Placez le shaker à 100 tr/min, puis commencez le mouvement pendant 14 min.
- Insérez la carte à puce étiquetée EA dans le chemiluminometer et appuyez sur le démarrage. Après l'incubation de 14 min, suivez les instructions affichées sur le chemiluminomètre pour lire les tubes EA dans le bon ordre.
- Vortex doucement chaque tube pendant 10 s avant de le placer sur le porte-échantillon du chemiluminomètre. Ouvrez le tiroir de l'échantillon et placez le tube #1 dans le support de l'échantillon. Ensuite, fermez le tiroir de l'échantillon et attendez la lecture de l'unité de lumière relative (RLU).
- Répétez l'étape 2.10 pour le tube 2 et le tube 3.
- Répétez l'étape 2.10 pour les tubes en double 1, 2 et 3.
REMARQUE: Essayez de vortex tous les tubes pour la même quantité de temps pendant les étapes 2.10-2.12. - Une fois que tous les tubes ont été traités, notez que les résultats de l'EA seront calculés et imprimés automatiquement. Les niveaux sont exprimés en tant qu'unités d'EE et représentent la moyenne des déterminations en double à partir des mêmes échantillons.
- Répétez les étapes 2.2 à 2.13 pour chaque échantillon de sang qui doit être testé.
- Une fois l'essai terminé, entreposez les tubes à essai restants et les réactifs EA à 2 à 8 oC pendant une température pouvant aller jusqu'à 30 jours.
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Representative Results
Un homme de 72 ans a été admis au service des urgences (ED) d'un hôpital urbain universitaire. Quelques jours plus tôt, il s'était présenté à son médecin de soins primaires se plaignant de brûlure à la miction. Une thérapie de court-cours avec la phosphomycine orale a été recommandée. Ses antécédents médicaux ont inclus l'hypertension, le diabète simple de type-2 et l'hyperplasie prostatique bénigne. Ses médicaments comprenaient l'enalapril, l'atorvastatine, la tamsulosine et la metformine.
Dans l'ED, il était léthargique, confus lorsqu'il était réveillé. Sa température était de 39,1 oC, la fréquence cardiaque était de 125 battements par minute, la pression artérielle était de 80/40 mmHg, la fréquence respiratoire était de 20/min, et SpO2 était de 94% dans l'air de la pièce, augmentant à 99% avec 4 L/min d'oxygène à travers une canule nasale. L'examen abdominal était normal, excepté la tendresse suprapubic douce mal localisée. Avec difficulté, un cathéter Foley a été placé. Une faible quantité d'urine purulente de couleur foncée a été drainée.
Un nombre sanguin complet a indiqué un compte de globuleblanc de 18.5 x 103. La créatinine était de 2,7 mg/dl, le glucose était de 250 mg/dl, et le niveau d'acide lactique était de 4,5 mmol/L. L'analyse de gaz sanguin artériel a révélé l'acidose mixte, avec pH 7,23, pCO2 48 mmHg, pO2 88 mmHg, et HCO3- 15 mmol/L.
Un cathéter veineux central a été placé, avec le guidage d'ultrason, dans la veine jugulaire interne droite. Une analyse de gaz sanguin a été obtenue sur le placement de cathéter, révélant une valeur de ScVO2 de 63%. La réanimation agressive de fluide a été promptement commencée avec une perfusion cristalloïde de bolus de 30 mL/kg au-dessus de 30 min. L'infusion de norephinephrine a été également lancée. Le patient a été transféré à l'USI avec un diagnostic de choc septique, provenant probablement d'une infection d'appareil urinaire.
Dans l'USI, au milieu de la collecte des cultures microbiennes et de l'administration d'antibiotiques empiriques, un échantillon de sang entier a été obtenu pour les tests d'évaluation de l'eE. L'analyse a été rapidement effectuée selon le protocole présenté ici.
Afin de calculer les résultats de l'EA, le chemiluminomètre enregistre : la luminescence basale des neutrophiles (L1); luminescence de l'activité des neutrophiles en réponse au LPS dans l'échantillon de sang (L2); l'activité maximale des neutrophiles en réponse à une exposition massive au LPS (L3). Les résultats sont exprimés comme : Activité d'endotoxine (EA) (L2-L1)/(L3-L1). Par conséquent, la valeur d'EA résultante reflète le degré d'éclatement oxydant des neutrophiles du patient en raison de la présence d'endotoxine circulante (L2), normalisée par le plus haut niveau de luminescence qui peut être mesuré dans le même échantillon de sang en réponse à un concentration supra-maximale de LPS (L3). Les deux valeurs sont contrôlées pour la luminescence basale de l'échantillon (L1).
Après environ 30 min, le clinicien a reconnu que 0,75 unité d'EE était le niveau d'activité de l'endotoxine du patient.
Une valeur d'EE inférieure à 0,40 unités d'EE indique un faible niveau d'activité de l'endotoxine, égal à une faible concentration de LPS circulante, ce qui représente un faible risque de progression vers un état de maladie grave. Les résultats entre 0,40 EtA et 0,59 eE indiquent un niveau d'activité intermédiaire de l'endotoxine, ce qui représente un risque élevé pour le développement d'une septicémie sévère et d'un choc septique. Des résultats supérieurs ou supérieurs à 0,60 unité d'EE indiquent un niveau élevé d'activité de l'endotoxine, ce qui représente un risque élevé de choc septique et de mauvais résultats pour les patients (tableau 1).
Le diagnostic du choc septique, probablement dû aux bactéries de GN, a été par conséquent confirmé. Le patient a été également catégorisé comme étant à risque extrêmement élevé, en ligne avec l'évidence des échecs concomitants d'organe et du niveau de lactate. Il a été en outre traité avec la réanimation agressive de volume et le soutien vasoactif. La thérapie d'hémopurification de Polymixin-B a été considérée, pourtant pas mise en oeuvre, due à la réponse tôt convaincante du patient aux fluides et aux vasopressors. Le jour 2, Escherichia coli a été confirmé comme agent causal par des cultures sanguines positives. Avec la thérapie antibiotique appropriée, le patient a récupéré, étant déchargé de l'USI le jour 7. Un deuxième essai d'eE a été exécuté avant décharge d'ICU. Un résultat de 0.2 unités d'EA a indiqué la résolution complète de la cascade biochimique déclenchée par le choc septique.
La figure 1 montre la répartition des valeurs de l'EE mesurées dans un rayon de 24 h dans une population d'échantillons de patients atteints de choc septique.
Figure 1 : Répartition des niveaux d'activité d'endotoxine (EE) mesurés dans un rayon de 24 h à partir de l'début du choc septique dans une population de patients gravement malades (n - 107). Adapté de Bottiroli, et al. avec la permission15. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Unités EA | Niveau d'activité de l'endotoxine |
| lt;0,40 | à faible teneur en |
| 0,40 à 0,59 | intermédiaire |
| 0,60 euro | maximum |
Tableau 1 : Catégories de niveaux d'activité d'endotoxine. EA - Activité d'endotoxine.
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Discussion
Le choc septique est encore aujourd'hui associé à une mortalité aussi élevée que 40%, bien que ce taux varie selon les rapports considérés16. La plupart des experts dans le domaine préconisent la nécessité de nouveaux biomarqueurs et de meilleurs biomarqueurs afin d'aiderles cliniciens à établir un diagnostic précoce, à mieux prendre en charge et à pronostiquer les patients atteints d'un choc septique 6.
L'exécution d'un test d'eE ne nécessite pas de connaissances techniques antérieures ou d'équipement de laboratoire sophistiqué, et n'importe quel fournisseur de soins de santé peut facilement et rapidement apprendre à l'exécuter. L'identification rapide d'un EE circulant élevé pourrait aider à stratifier le risque du patient, déclenchant une approche thérapeutique plus tôt et plus agressive. Inversement, un résultat d'EE de moins de 0,40 unités d'EE pourrait indiquer un faible risque de progression vers une défaillance multi-organes17. L'utilisation des échantillons du patient comme leur propre contrôle est simple, rend ce test plus sensible et une représentation plus précise du véritable taux sanguin de l'endotoxémie.
L'utilisation des complexes LPS-anticorps et des propres neutrophiles du patient protège le test d'EE d'être peut-être inhibé par d'autres facteurs (par exemple les protéines plasmatiques). On ne peut pas en dire autant d'un autre test, comme le test LAL, qui nécessite l'activation d'une cascade de coagulation. Le test LAL fonctionne bien lorsque l'endotoxine n'est pas liée par un récepteur spécifique, mais dans le plasma et le sang entier différentes protéines lient LPS, interférer avec l'essai. En outre, les produits fongiques peuvent déclencher la cascade de coagulation limulus, ce qui rend le test moins spécifique pour les bactéries GN. Pour cette raison, l'EE est supérieure au test LAL encore couramment adopté pour l'évaluation de l'endotoxémie18.
Cependant, pour que le test d'EE soit fiable, il est crucial de suivre méticuleusement les étapes susmentionnées. Le niveau d'endotoxine du spécimen testé est calculé en calculant la chemiluminescence au fil du temps, mesurant les réponses basales (#1 tubulaires) et maximales (#3 de tube) pour le même échantillon de sang comme valeurs de référence. Par conséquent, il est impératif de placer soigneusement les trois tubes dans le bon ordre dans le chemiluminomètre.
L'utilisation des niveaux d'eE dans la pratique clinique ne devrait pas remplacer les tests standard (p. ex. les tests de laboratoire et les cultures sanguines) dans l'étude d'une maladie infectieuse potentielle. Bien que le LPS puisse clairement être associé à la libération des produits de membrane de bactéries de GN, des niveaux élevés d'endotoxémie ont été également rapportés dans le cas des infections dues à d'autres agents19. Il est très bien connu que l'endotoxémie pourrait être due à la translocation des bactéries par la muqueuse intestinale, en particulier chaque fois que l'hypoperfusion tissulaire et la perméabilité accrue barrière intestinale sont susceptibles de se produire20,21. Dans de telles conditions, il est possible de s'attendre à ce que le LPS circulant soit une conséquence, plutôt que la cause, de la septicémie et du choc. Dans ce scénario, l'EE pourrait fournir des informations sur la gravité de la lésion tissulaire en cours, indépendamment de l'étiologie bactérienne15. À l'appui de ce principe, dans une étude récente Grimaldi et coll. ont constaté que l'élévation des niveaux d'eE était associée à la gravité et à la durée du choc à la suite d'un arrêt cardiaque hors hôpital13.
Fait intéressant, Virzô et coll. ont également souligné le rôle potentiel de l'endotoxine (et de sa surveillance) chez les patients atteints du syndrome cardiorénal de type 5, une affection caractérisée par un dysfonctionnement cardiaque et rénal concomitant dans le cadre de différents troubles systémiques. , comme la septicémie23 . L'endotoxine est connue pour induire l'affaiblissement des myocytes cardiaques, bien que le mécanisme pathophysiologique exact soit largement peu clair. D'autre part, l'endotoxémie a été montrée pour induire le dysfonctionnement rénal dû à plusieurs voies des dommages locaux et systémiques, causant des affaiblissements du flux sanguin rénal, du taux de filtration glomerular, et de la fonction tubulaire22.
Toutefois, quelques limites de l'EE doivent être mises en évidence. L'influence d'un traitement antibiotique en cours sur le résultat de l'EE n'est actuellement pas bien établie24. En outre, les preuves suggèrent que dans les patients malades critiques une mesure précoce d'EE de point simple, bien qu'utile, ne prédise pas de façon fiable la mortalité septique de choc, même quand plus de 0.6 unités15. Des évaluations répétées en série pourraient être nécessaires, bien que leur nombre et leur calendrier ne soient pas clairs à l'heure actuelle. D'autres auteurs se sont concentrés sur les fluctuations de l'endotoxémie, en émettant l'hypothèse qu'une variabilité quotidienne accrue pourrait être associée à un degré plus élevé de dysfonctionnement multi-organes25. Enfin, une limitation technique supplémentaire à prendre en considération est l'échelle relative le long de laquelle l'activité de l'endotoxine est mesurée (0 à 1 unité, avec 0,01 incréments détectables minimum). Cela rend les résultats extrêmement élevés inévitablement plateau autour du niveau maximum, ce qui rend les différenciations dans ce sous-groupe de patients (EA -EA -gt; 0,9 unités) plus difficile à étudier.
En conclusion, bien que d'autres études soient nécessaires pour évaluer l'impact potentiel de la surveillance des niveaux d'endotoxine sur les résultats cliniques, l'EE est actuellement disponible en tant que test rapide, simple et sensible, ce qui pourrait faciliter le processus décisionnel de l'USI. cliniques dans les patients septiques malades critiques.
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Disclosures
Estor SpA a couvert le coût de la publication de la revue et des frais de production vidéo. Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Paolo Braganet Lisa Mathiasen, Ph.D., pour leur examen de la méthodologie du protocole d'analyse. Dario Winterton, MD a fourni une aide substantielle pour examiner le manuscrit pour la maîtrise de la langue anglaise.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EAA kit | Spectral Medical Inc. | EAAST-20 | Package with 20 tests + 1 quality control |
| Smart Line TL | Berthold | EAASL | Luminometer |
| Incubator shaker | GRANT | ES-20 | Mini-incubator shaker |
| Vortexer | VWR | 444-2790 | Vortex instrument |
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