Summary
여기, 우리가 특정 표면 마커 및 공초점 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 흐름 체 외에서 매매 하는 monocyte 부분 모집단을 측정 하는 통합된 프로토콜 제시. 이 프로토콜은 다른 특정 표면 마커를 사용 하 여 다른 백혈구 하위 프로로 뿐만 아니라 순차 모집 단계를 탐험 하 사용할 수 있습니다.
Abstract
타겟된 주변 조직에 혈액에서 monocytes의 모집 조직 부상, 종양 개발 및 자가 면역 질환 염증 과정에 중대 하다. 이것은 그들의 접착 및 transendothelial 마이그레이션 (환생) 뒤에 기본 영향을 받는 조직으로 활성화 된 내 피 세포의 표면에 luminal 무료 흐름에서 캡처의 과정을 통해 촉진 된다. 그러나, monocyte 모집단의 특혜와 맞는 채용을 지 원하는 메커니즘은 아직 완전히 이해. 따라서, 다른 monocyte 모집단 동시에 시각화 하 고 흐름에서 측정의 채용을 허용 하는 방법을 개발 했습니다. 시간 경과 confocal 영상에 따라이 메서드는 부착 및 transmigrated monocytes 사이 명확한 구별에 대 한 수 있습니다. 여기, 우리는이 메서드를 사용 하 수 있습니다 프로 신생 및 비 신생 monocytes 체 외의 모집 캐스케이드를 동시에 공부 하는 방법을 설명 합니다. 또한,이 메서드는 최대 3 개의 monocyte 인구의 신규 모집의 다른 단계를 공부 하 확장할 수 있습니다.
Introduction
Monocytes의 병원 체, 손상 된 조직, 신생, 고 암1,2,3 포함 하 여 많은 질병의 병 태 생리학 정리 싸움을 위해 필수적 이다 타고 난 면역 phagocytic 구성 요소 구성 . Monocytes는 골 수 유래 세포 혈액에 순환 하지만 특정 분자 메커니즘을 통해 주변 조직에 염증의 사이트에 채용 될 수 있는 다른 유형의 모집단의 구성 이다. Monocytes, 백혈구에 관해서는 모집 캐스케이드 일반적으로 다른 단계 캡처, 압 연, 크롤링, 체포, transendothelial 마이그레이션 (환생) 및 혈관 벽 (지하실 멤브레인와 벽화를 통해 마이그레이션 등 연루 셀)4. 다음이 단계는 주로 ligands selectin 같은 백혈구에 풀, 당단백질 ligands, 발산, 세포 및 접합 접착 분자, 그리고 그들의 수용 체와 같은 내 피 luminal 표면에 염증 유발 분자를 포함 그리고 integrins입니다. 밀매 경로 중 하나는 내 피 세포 접합 (paracellular) 나 내 피 세포 체 (transcellular)를 통해 백혈구에 의해 내 피 장벽5를 사용할 수 있습니다. Monocytes transcellular 경로 통해 transmigrate를 역사적으로 문서화 되어, 하는 동안 그들의 철새 통로의 잠재적인 차이점 monocytes 균질 세포 인구 이라고 여겨진다 이상으로 제안 되었습니다. 그것은 이제 분명 monocyte 다양성 각 그들의 차이 공통점에 의해 정의 될 수 있습니다, 그들의 독특한 넘쳐 흐름에 관하여3,6폭포 되고있다. 따라서, monocyte 모집단 사이 차별 명확 하 게 하기 위해 시각화 하는 중요 한 고 형 채용 중이 다른 모집단의 각 동작을 처리.
인간 monocytes, 돼지, 쥐, 마우스 특정 관찰 기능 및 특정 철새 동작7,,89phenotypic 모집단으로 세분화 했다. 예를 들어 인간 monocytes는 CD16, Fc 감마 수용 체 III CD14, 세균성 lipopolysaccharide에 대 한 coreceptor의 그들의 표면 식에 따라 3 개의 하위 집합으로 나눌 수 있습니다. 인간 monocyte 모집단 클래식 CD14 포함+CD16-, CD14 중간+CD16+ 및 비 고전 CD14어둡게CD16+ 세포6,9. 클래식 CD14+CD16- monocytes는 주로 염증 성 표시 했다 반면 CD16 수영장+ monocytes 총칭 TIE2 표현과 proangiogenic 함수10선물을 발견 했다. 일관 되 게, 인간의 종양 괴 사 등 염증 성 cytokines와 내 피 성장 세포 자극 인자 (TNF) α 또는 인터 루 킨 (일리노이-1) 베타 (기존의 염증)은 고전 CD14의 완전 한 신규 모집을 실행 하는 충분 한+CD16 - monocytes입니다. 그러나, 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF)와 TNFα (신생 요소 기반 염증)의 동시 작업은는 CD16의 환생을 자극 하는 데 필요한+ monocytes3의 proangiogenic 풀. 역사적으로, 정적 조건, 병렬 플레이트 흐름 챔버 및 µ-슬라이드 흐름 챔버 전통적인 Transwell 시스템 양적 분석 한 시간에서 시험관에11에 한 백혈구 인구의 모집 하는 데 사용 되었습니다. ,,1213. 이러한 프로토콜을 검증 하는 동안 여러 monocyte 모집단의 동시 분석을 허용 하는 더 강력한 방법 여겨질 것입니다 더 많은 통찰력. 이러한 방법론 여러 상호 작용 및 각 각각의 서로 다른 주파수를 담당 하 고 또한 각 monocyte 정의 하는 모집 계곡에 대 한 유사성과 특이성의 기계적 이해를 제공 해야 합니다. 하위 집합입니다.
여기, 우리 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 동시에 공부 될 다른 monocyte 모집단의 철새 계곡 수 있는 흐름 아래 monocyte 모집의 시간 경과 영상에 따라 방법 제시. 이 방법은 hemodynamics 순환 후 모 세관 venules에 monocytes의 vivo에서 백혈구 신규 모집의 주요 위치 뿐 아니라 내 피 세포 염증, 모방 하는 특정 중요 한 기능을 통합 합니다. 제안 된 방법은 인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVEC), 인간의 탯에서 고립의 잘 설립 된 프로토콜을 통해 생성 되는 사용 합니다. 이 임상 자원 또한 탯 줄 정 맥 으로부터 격리 될 수 있는 내 피 세포의 적당 한 수익률을 제공 하는 반면 생물 학적 부산물로 쉽게 사용할 수 있는 이점이 있다. 우리는 또한 사용 형광 염료와 면역 형광 monocyte 위치 (abluminal 대 luminal) 명확 하 게 정의에 confocal 현미경 검사 법 및 다른 세포질 구성 요소 구분을 시간이 지남에. 여기에 제시 된 프로토콜을 동시에 측정 monocyte 모집단의 환생 레벨 개발 되었습니다. 또한, 그것은 다른 biomarkers 및 라벨의 사용 하 여이 방법론 공부 다른 백혈구 모집단 및 채용 프로세스를 확장할 수 있습니다 주목 해야한다.
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Protocol
인간의 재료 자원 봉사 기증자의 및 임상 연구에 스위스 윤리 위원회에 통지 해준 동의 함께 사용 되었다.
1. 격리와 인간의 탯 줄의 정 맥 내 피 세포 (HUVEC)
- HUVEC 절연을 시작 하기 전에 코팅 솔루션의 5 mL는 T75 플라스 크 (0.1 mg/mL 콜라겐 G 및 인산 버퍼 pH 7.4에서 염 분 PBS에 0.2% 젤라틴) 37 ° C에서 30 분을 추가 합니다.
- PBS 가진 코드를 청소, 살 균 압축으로 닦 고 살 균 20 cm 배양 접시에. 살 균가 위 코드의 끝을 잘라.
- 하나의 큰 정 맥과 두 개의 작은 동맥을 식별 합니다. 부드럽게 코드 끝에 정 맥 사지에 그것에 연결 된 3 방향 자 지와 함께 한 캐 뉼 러를 삽입 합니다.
- 코드 및 정 맥 연결 와이어의 길이와 단단히 조입니다.
- 100 U/mL 페니실린, 100 U/mL 스 250 ng/mL 코드의 혈관을 씻어 암포 B 포함 된 RPMI 매체의 20 mL로 두 번 코드 perfuse 이 프로세스 하얀 하 고 명확 하 게 코드의 모양을 만든다. 한쪽 끝에 주사기는 RPMI 수집 하 여 콜라 추가 하기 전에 정 맥을 비어 있습니다.
- 1 mg/mL 콜라 형식의 12 mL와 함께 정 맥 perfuse 나 (0.22 μ m 필터).
- 닫기 코드에서 자 지 그리고 12 분 동안 37 ° C에서 코드를 품 어.
- 부드럽게 마사지 정 맥 루멘에서 내 피 세포를 분리 하려면 코드.
- 받아 30 mL 50 mL 주사기 10% 태아 종 아리 혈 청에 포함 된 RPMI의 고 탯의 한쪽 끝을 연결 합니다.
- 탯의 다른 쪽 끝에는 빈 50 mL 주사기를 연결
- 자 지를 열고 상호로 다른 쪽 끝에서 수집 하는 동안 한쪽에서 정 맥을 perfuse.
참고: 수집 된 서 스 펜 션 내 피 세포를 포함 되어 있습니다. - 5 분 동안 200 x g 에 세포 현 탁 액이 원심
- 삭제는 상쾌한 고 완전 한 M199 매체 (M199 포함 20 %FCS, 15 µ g/mL 내 피 세포 성장 보조 제, 100 µ g/mL 헤 파 린 나트륨, 0.5 µ M 날린, 10 µ g/m l L-아 스 코르 빈 산, 100 U/mL 페니실린, 100 U/mL의 10 mL와 함께 셀 펠 릿 resuspend 스 고 250 ng/mL 암포 B).
- T75 플라스 크에서 코팅 솔루션을 제거 하 고 PBS로 한 번 씻어.
- 씨 셀 T75 플라스 크에 1.13 단계에서 수집 하 고 5% CO2와 37 ° C에서 인큐베이터에 배치.
- 다음 날, 린스 3 번 잔여 적혈구를 제거 하 여 다음 변경할 매체 합류까지 2 일 마다 완전 한 M199 매체와 플라스 크.
- 80-90% 합류 HUVEC 단층 PBS의 5 mL로 한 번 헹 구 고 M199의 5 분 추가 4 mL과 트립 신 작업을 중지 하는 FCS의 1 mL에 대 한 37 ° C에서 1 mM EDTA에에서 0.05 %trypsin 5 mL로 세포를 분리. 모든 HUVEC를 분리 하려면 플라스 크를 플러시.
- VE cadherin, PECAM-1 및 gp38, 얼룩에 사용할 cytometry HUVEC 순도 확인 하 여 분석을 50 µ L의 약 수를 수집 합니다.
- 실 온에서 5 분 동안 200 x g에서 15 mL 튜브와 원심 분리기에서 1.18 단계에서 HUVEC의 나머지를 수집 합니다.
- 단계 1.19에서에서 상쾌한 삭제 하 고, resuspend cryotubes에서 5 x 105 셀/mL의 조밀도에 솔루션 (10 %DMSO 포함 하는 FCS)에 셀 펠 릿 사용까지-80 ° C에 또는 액체 질소에서를 고정.
-
HUVEC 순수성을 확인:
- HUVEC 1.18 단계에서 수집 된의 50 µ L의 약 수를 반대로 인간 VE cadherin FITC 항 체의 1 µ L, 1 µ L의 반대로 인간 PECAM1 PE 항 체, 및 반대로 인간 Podoplanin APC 항 체의 1 µ L를 추가 합니다.
- 10 분 동안 실내 온도에 품 어.
- 400 x g 30에서 100 µ L의 PBS와 원심 분리기를 추가 s.
- 삭제는 상쾌한 고 PBS의 100 µ L에서 resuspend. 데이터 흐름 cytometry 기술로 이제 인수 수 있습니다.
참고: HUVEC VE cadherin 및 PECAM-1에 대 한 긍정적이 고 부정적인 Podoplanin에 대 한 있습니다.
2. HUVEC 녹 이기
참고: 낮은 통로에 HUVEC를 사용 하 여 실험 (최대 5 구절).
- 30 분 동안 37 ° C에서 코팅 솔루션의 1 mL와 T75 플라스 크 코트.
- 급속 하 게 2 분 동안 37 ° C에서 HUVEC defreeze 하 고 완전 한 M199 10 mL에 셀 resuspend.
- 5 분 동안 실 온에서 200 x g 에서 세포를 원심 및 삭제는 상쾌한.
- 완전 한 M199 10 mL에 셀 펠 릿을 resuspend.
- 미리 코팅된 플라스 크에 세포 현 탁 액을 전송 합니다. 5% CO2와 37 ° C에서 인큐베이터에 플라스 크를 배치 합니다. 세포 배양 매체 매 2 일 변경.
3. HUVEC 문화 0.4 µ 슬라이드 챔버에
- 흐름 실험을 시작 하기 전에 5 일 미리 0.1 mg/mL 콜라겐 G, 30 분 동안 37 ° C에 0.2% 젤라틴을 포함 하는 PBS의 30 µ L로 0.4 µ-슬라이드의 실 코트.
- 100 µ L의 PBS와 챔버 세척.
- T75 플라스 크의 80-90% confluent HUVEC에서 세포를 분리 합니다.
- PBS의 5 mL와 함께 HUVEC를 헹 구 고 5 분 동안 37 ° C에서 0.05 %trypsin 5 mL와 함께 그들을 분리.
- 플러시 및 완전 한 M199에 세포 현 탁 액을 수집 하 고 가장 편리한 방법으로는 셀의 개수. 실 온에서 5 분 동안 200 x g 에서 원심.
- 106 셀/mL에서 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 챔버 당 30 µ L (30000 셀) 배포.
- 1 시간에 5% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 셀을 품 어.
- 각 약 실에 완전 한 M199의 150 µ L을 추가 하 고 37 ° C, 5% CO2배양 기에서 5 일 동안 셀 문화. 매체 매 2 일 변경.
4. HUVEC 흐름 아래 Monocyte 모집 분석 결과 대 한 얼룩
- M199 및 CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)의 1 개의 µ M 라벨 매체를 준비 하 고 셀 라벨 전에 5 분 동안 37 ° C에서 그것을 따뜻하게.
- 37 ° c.에 M199 매체와 두 번 씻어 HUVEC 따뜻하게
- 따뜻하게 라벨 매체를 포함 하는 CMFDA의 1 개의 µ M의 30 µ L 매체를 바꿉니다 고 10 분 동안 37 ° C, 5% CO2 배양 기 합니다.
- 완전 한 M199로 한번 세척 하 고 30 분 동안 37 ° C, 5% CO2 배양 기에서 완전 한 M199 셀을 품 어.
참고: 라벨 솔루션을 추가 하기 전에 혈 청의 모든 흔적을 제거 하는 것이 중요 하다, 그렇지 않으면 그것은 HUVEC 얼룩을 변경할 수 있습니다. - 대체 어느 인간의 TNFα를 포함 완전 한 M199와 매체 (500 U/mL) 또는 인간 TNFα의 혼합 (500 U/mL) 인간의 VEGFA와 (1 µ g/mL) 37 ° C, 5% CO2배양 기에서 6 h에 대 한.
5. 인간의 팬 Monocytes 그리고 모집단의 얼룩의 격리
- 사용 하 여 집중 인간의 피 버 피 코트 또는 EDTA vacutainer 튜브에 실험 당일 수집 갓 고립 된 인간의 혈액의 20 mL.
- PBS-1 mM EDTA (1:1)에 혈액을 희석 하 고 부드럽게 밀도 그라데이션 미디어의 20 mL 위에 희석된 혈액의 20 mL를 플라스틱. 천천히 가속 및 브레이크 없이 실 온에서 30 분 400 x g 에서 원심.
- 주변 혈액 단 세포 (PBMC) 수집-PBS-1 mM EDTA의 40 mL를 포함 하는 새로운 50 mL 튜브에 혈소판 레이어 (밀도 그라데이션 미디어 플라즈마 레이어 사이). 최대 50 mL PBS-1 mM EDTA와 함께 톱.
- 5 분에 대 한 실 온에서 200 x g 에서 원심 분리기는 상쾌한을 삭제 합니다.
- 얼룩 버퍼 (PBS-1 mM EDTA 0.5% 소 혈 청 알 부 민 BSA를 포함)의 10 mL와 함께 셀 펠 릿 resuspend
- 5 분에 대 한 실 온에서 200 x g 에서 원심 분리기는 상쾌한을 삭제 합니다.
- 5.5-5.6 단계 반복 합니다.
- 버퍼를 얼룩이 지기의 10 mL와 함께 셀 펠 릿 resuspend 셀 개수에 대 한 10 µ L의 약 수를 가져가 라.
- PBMC 인구를 확인 하 고 빠르게 교류 cytometer와 셀.
참고: 특성 림프 구 및 monocyte 인구 (그림 1A) 관찰 될 수 있다. 에 대해 기대 하는 신선한 인간의 혈액 50 mL에서 50-100 x 106 PBMC. -
CD14 + 대 CD14-PBMC 흐름에서의 채용에 대 한:
- 세 번 흐름 버퍼와 펠 릿을 세척 (M199 0.5 %BSA 포함)와 resuspend mL 당 6 x 106 세포에 흐름 버퍼에서 단 세포.
- 각 분석 결과 대 한 200 µ L의 aliquots를 확인 합니다. 분석 결과 전에 20 분까지 37 ° C에서 품 어.
- 각 약 수를 안티-CD14-PE와 2 µ M의 최종 농도에 Hoechst 33342 5 µ L를 추가 합니다. 혼합 하 고 10 분 동안 37 ° C에서 품 어.
- 30에 대 한 400 x g 에서 약 수를 원심 s.
- 삭제는 상쾌한 고 흐름 버퍼의 200 µ L와 펠 릿을 resuspend.
-
흐름에서 monocyte 모집단의 채용에 대 한:
- 제조업체 지침에 따라 팬 monocyte 격리 키트 monocytes를 격리 합니다.
참고: 다음 격리 프로토콜 50 x 106 세포입니다. 그것은 확장할 수 있습니다 위 또는 아래로 그것은 제조 업체의 권장 사항을 내로. - 5 분 동안 실 온에서 200 x g 에서 PBMC 정지 원심
- 상쾌한 무시 하 고 버퍼를 얼룩이 지기의 400 µ L와 펠 릿 resuspend.
- Fc 수용 체 차단 약의 50 µ L 팬 Monocyte 항 체 칵테일의 50 µ L를 추가 합니다.
- 10 분 동안 실내 온도에 품 어.
- 버퍼 및 자석 구슬 활용된 반 비오 항 체의 100 µ L를 얼룩이 지기의 400 µ L를 추가 합니다. 15 분 동안 실 온에서 품 어.
- 얼룩 버퍼의 2 개 mL를 추가 하 고 자석으로 결합 맥 LS 열을 사용 하 여.
- 자석에 LS 열을 놓고 버퍼를 얼룩이 지기의 1 mL를 추가 합니다. 흐름을 통해 삭제 합니다.
- 열에서 PBMC 정지를 통과 하 고 새로운 15 mL 튜브에서 팬 monocytes를 포함 하지만 분명 흐름을 수집.
- 5 mL까지 가기로 얼룩 버퍼를 추가 합니다.
- 약 수를가지고 고 교류 cytometer는 monocyte 격리의 품질을 확인 하십시오.
- 팬 monocyte 개수를 결정 합니다.
참고: 만 monocyte 인구 (그림 1B)관찰 될 수 있다. - 5 분 동안 200 x g 에서 5.11.11 단계에서 monocytes의 나머지 원심
- 폐기는 상쾌한.
- 흐름 버퍼의 5 mL에 셀 펠 릿 resuspend (M199 0.5 %BSA 포함).
- 5.11.13에 5.11.14 EDTA의 흔적을 제거 하는 두 번 반복 합니다.
- 제조업체 지침에 따라 팬 monocyte 격리 키트 monocytes를 격리 합니다.
- 흐름에 monocyte 정지를 만들기 6 x 106 셀/mL에 (0.5 %BSA M199) 버퍼.
- 각 모집 분석 결과 대 한 monocytes의 200 µ L의 aliquots를 확인 합니다.
- 주입 하기 전에 20 분까지 인큐베이터에서 37 ° C에는 약 수를 유지.
- 각 약 수를 안티-CD16-PE 항 체와 Hoechst 33342 (최종 2 µ M)의 5 µ L를 추가 합니다.
- 혼합 하 고 10 분 동안 37 ° C에서 품 어.
- 30에 대 한 400 x g 에서 약 수를 원심 s.
- 삭제는 상쾌한 고 흐름 버퍼의 250 µ L와 펠 릿을 resuspend.
- Confocal 현미경에 인수 매개 변수 설정에 대 한 봉사를 슬라이드의 한 챔버에 monocyte 정지 30 µ L를 추가 합니다.
- 37 ° c.에 단계 5.18에서에서 monocyte 서 스 펜 션의 aliquots를 유지
참고: 이 현 탁이 액 흐름 시스템에 주입 될 준비가 되어 있습니다.
6입니다. 유체 시스템의 준비
- 37 ° c.에 설정 하는 영상에 대 한 셀 인큐베이터 확인
참고: 흐름 시스템의 다이어그램은 그림 2에 표시 됩니다. - 1 배관 부 조립 실리콘 튜브 (8 cm 길고 3 밀리미터 두꺼운)의 한쪽 끝에 Luer 커넥터 남성 삽입 하 고 다른 쪽 끝에 선 루어 주입 세트에 연결. 커넥터 연결 합니다 후자 Luer 실리콘 튜브 (40 cm 및 3 밀리미터 두꺼운)의 한쪽 끝에.
참고: 선택적으로, 3-방향 탭 5 mL 주사기에 연결 된 인라인 Luer 주입 세트와 실리콘 최종 공기 거품 제거를 위한 튜브 사이의 삽입할 수 있습니다. - 배관 부 II의 조립: 실리콘 튜브 (1 m 및 두께 3 m m)의 길이의 한쪽 끝에 20 mL 주사기를 연결. 삽입 튜브의 다른 쪽 끝에 Luer 커넥터 남성.
- 연결 부 I와 II 튜브 Luer 커넥터 남성 여성 Luer 잠금 커플러 (그림 2A)을 삽입 하 여 부.
- 포함 하는 37 ° c.에 예 열 흐름 버퍼 (M199 + 0.5 %BSA) 저수지에서 끝낼 실리콘 튜브의 무료
- 흐름 버퍼 튜브를 채우기 위해 20 mL 주사기의 플런저를 당겨.
- 펌프에 주사기를 놓고 그것을 확보 합니다.
- 펌프를 설정에서 철회 모드 (에 반대)으로 하 고 유량을 지정.
- 다음 수식을 사용 하 여 사용 하는 IBIDI 슬라이드에 따르면 흐름 율을 결정 합니다.
참고: 슬라이드 요소는 실험에 사용 되는 IBIDI 슬라이드에 의존 합니다. Μ-슬라이드 나0.4 Luer 잠금이이 예제에서는 슬라이드 요소에에서 사용 되는 131.6. 특정 슬라이드 요소에 대 한 회사 웹사이트14를 참조 하십시오. 흐름 버퍼 점도 0.0072 dyn.s/cm2. 후 모 세관 venules에 전단 응력은 0.5 dyn/cm2에 대해. -
슬라이드 (그림 2B) 연결:
- 여성 Luer 잠금 커플러 주위 실리콘 튜브 클램프 및 커플러에서 두 Luer 커넥터 남성을 분리 합니다.
- 자극의 HUVEC 및 매체와 채우기 포함 된 슬라이드의 저수지에 그들을 연결 합니다. 이 단계 동안 공기 방울을 피하십시오.
- 클램프 해제 하 고 연결 유출 되지 않습니다 확인 하십시오.
- 시간 경과 영상에 대 한 현미경 슬라이드 놓고 펌프를 시작 합니다.
7. Confocal 현미경 검사 법에 의해 흐름 아래 Monocyte 모집 시간 경과 영상
- 40 x 목표를 사용 하 여 참조 테이블의 자료영상에 대 한.
- 활성화는 405 nm (블루 monocyte 핵), 488 nm (녹색 내 피 세포) 및 561 nm (빨간 CD16 + 하위 집합) 레이저.
- 인수 매개 변수를 설정 하는 monocytes를 포함 하는 챔버를 사용 합니다.
참고: 비 transmigrated와 transmigrated monocytes, 감지 하 고 핀 홀 레이저 405 nm의 강도 높은 설정 됩니다. 따라서, 비 transmigrated monocytes 기저 계획에 약간 볼 수 있습니다. 그러나 단지 transmigrated monocytes는 흠 없는 주변 핵 내 피 세포 아래 점유 하는 새로운 공간에 해당 제시. - 현미경 획득 챔버를 놓습니다.
- 다중 위치 confocal 영상에 대 한 1 cm 반지름 안에서 뷰의 3 필드를 선택 합니다.
- 정의 기저와 내 피 세포의 꼭대기 측면
- 10-12 µ m 범위 (0.5 µ m 단계) z-스택을 설정 합니다. 모든 1 분 시간 경과 수집을 실행 합니다.
- 영상의 3 분 후에 선 루어 주입 포트를 통해 monocyte 정지 (6 x 106 셀/mL)의 200 µ L를 주사.
참고: Monocytes 꼭대기 초점면에 표시 하는 급속 하 게 준수 하 고 환생 (기저 계획에는 꼭대기에서 환승)을 시작 합니다. - 적어도 30 분에 대 한 이미지입니다. 완료 되 면, 이미지를 중지 하 고 중단. 슬라이드에서 그들을 분리 튜브 클램프.
- 10 분 동안 4 ° C에서 4 %paraformaldehyde 슬라이드를 수정 합니다.
- PBS와 슬라이드를 세척 하 고 필요한 경우 추가 분석을 위해 4 ° C에서 슬라이드를 저장 합니다.
8. ImageJ와 데이터 분석
- 각 분야에 총 부착 monocytes의 수를 계산 합니다. M m2당 셀 수를 결정 합니다.
- 내 피 세포 아래 기초 계획에 존재 하 고 핵 주위 (녹색 채널)에서 블랙홀의 존재에 의해 확인 된 transmigrated monocytes를 계산 합니다.
- 부착 백혈구의 총 수로 transmigrated 백혈구의 수를 나눕니다. 환생 속도 부착 monocytes의 비율으로 제공 됩니다.
- 이해를 돕기 위해는 꼭대기와 기저 면 수 표시 동시에 내 피이 구획의 각각에서 발생 하는 이벤트를 설명 하기 위해.
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Representative Results
HUVEC 활성화 TNFα에 의해 유도 된의 상태 확인
염증 성 cytokine TNFα의 생물 활동 일괄 처리 및 냉동 녹고 사이클의 반복에 따라 달라질 수 있습니다. 그것은 TNFα 치료와 HUVEC의 활성화 상태를 확인 하는 것이 중요입니다. 이 풀, ICAM-1 및 VCAM-115,16,17의 염증 유도 confluent HUVEC의 일부 샘플 병렬로 얼룩 수행 수 있습니다. TNFα 치료는 염증 스트레스 내 피 세포에 의해 표시 형태 변경 후 HUVEC의 활성화 상태를 확인 하는 쉽고 간단한 방법. 그림 3에서 보듯이 HUVEC unstimulated 세포에 비해 TNFα의 6-h 후 연장. 유사한 신장 HUVECs은 TNFα와 VEGFA의 혼합에 의해 자극 될 때 관찰 된다. HUVEC의 활성화 상태를 기록 하는 것은 중요 monocytes의 환생의 최종 결과 내 피 세포 활성화의 품질에 따라 달라 집니다.
Monocyte 환생 내 피 세포에서 특성 중단 하 게
흐름에서 monocyte 환생을 연구, 우리 CMFDA와 핵 세포 투과성 Hoechst 33342 염료 (그림 4)와 파란색에서 스테인드 격리 monocytes의 녹색으로 얼룩진 내 피 세포 confocal 현미경 검사 법 사용. 시간 경과 confocal 영상 그들의 형 수 꼭대기 비행기에 monocytes의 시각화 (그림 4A-C, 보충 영화 1) 평가 허용. 환생을 겪고 마이그레이션 셀 꼭대기 비행기에서 사라진 기저 면에 등장 하기 전에 해당 셀 접합 하는 세포 공간으로 이동 합니다. Transmigrated 셀 monocyte 도형에 해당 하는 핵 주위 블랙 홀 제시. 이 셰이프는 끊임없이 내 피 세포 (그림 4A-C, 보충 영화 2-3) 아래 monocyte 마이그레이션 동안 변경. 내 피 세포 및 monocyte 위치 아래 monocyte 신체에 의해 만들어진이 동적 블랙홀 transmigrated 셀의 명확한 식별을 위해 허용. 시간이 지남에 monocyte 모집의 정량 monocyte 접착을 환생 (그림 4D-E)에 의해 따라 나타났다. 백혈구는 transcellular와 paracellular 경로 통해 extravasate 수 있습니다, 하지만 우리만이 방법으로 흐름 아래 paracellular 환생을 관찰 수 합니다. 이것은 우리의 이전 관측3,11,,1819일치.
신생 요소 구동 염증 촉진 CD16 + monocytes의 환생
이 메서드를 사용 하 여 우리 내 피 단층 염증 성 cytokine TNFα 혼자 또는 함께 신생 요소 VEGFA에 의해 자극된을 통해 인간의 proangiogenic 대 비 신생 monocytes의 환생을 분석 했다. Proangiogenic 인간 monocytes는 그들의 표면에는 CD16 또는 TIE2 식으로 확인할 수 있습니다. 여기, 안티-CD16-PE 항 체 프로 비-신생 monocytes 사이 차별을 사용 되었다. 그림 5A-B (보충 영화 4-5), CD16의 환생 속도 같이+ monocytes 때 낮은 내 피 세포만 TNFα로 자극 했다. 그러나,이 속도 증가 하면 내 피 세포는 TNFα와 VEGFA (그림 5C-E, 보충 영화 6-7) 동시에 자극 했다. 비 신생 monocytes의 환생 속도 모두 염증 성 조건 하에서 유사 하 게 높았다. 두 셀 부분 모집단에 대 한는 환생 paracellular 경로 통해 독점적으로 발생 했습니다. 따라서이 메서드는 다른 monocytic 인구의 환생 적성에 대 한 동시 조사를 수 있습니다.
Monocytes의 순도 영향을 미치는 환생 효율
주변 혈액 단 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, monocytes의 구성 됩니다. 여기에 사용 하는 monocyte 격리 방법 PBMC에서 다른 백혈구 인구 고갈을 필요 합니다. Monocyte 순도의 부족 결과 미치는 영향을 이해, 우리 PBMCs를 사용 하 고 흐름에서 채용 시험을 수행 하기 전에 안티-CD14-PE 항 체와 팬 monocytes에 대 한 스테인드. 그림 6에서 같이, TNFα 또는 TNFα + VEGFA HUVEC 자극만 monocyte 인구의 환생을 유도 한다. 다른 백혈구 구성 T 세포, B 세포와 NK 세포에 TNFα 또는 TNFα + VEGFA transmigrate 하지 않았다. 실제로, 그것은 이러한 백혈구 환생에 대 한 다른 신호 필요 문서화 되었습니다. 따라서, monocytes의 비효율적인 격리로 다른 백혈구 monocytes로 간주 될 것 이라고 monocyte 환생의 싼을 이어질 것입니다. 이 monocyte 환생, 다른 백혈구와 monocyte 인구의 오염 때문에 잘못 된 결과 이어질 것 이다.
그림 1: cytometry에 의해 격리 된 monocytes의 프로 파일링. 림프 구 고갈 전에 PBMC의 형태 (A) 분석. 크기 (앞으로 분산형: FSC) 및 세분성 (사이드 분산형: SSC) 말 초 혈액의 단 세포 cytometry에 의해 결정 되었다. (B) 크기와 절연된 monocytes의 세분성 림프 구 고갈 후 cytometry에 의해 결정 되었다. Monocytes의 효율적인 절연 림프 구 인구의 완전 한 고갈을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 유체 시스템의 다이어그램. (A) 전과 슬라이드 및 주사기 펌프에 장착 후 살포 시스템의 도식 개요. 튜빙 클램프를 사용 하 여 슬라이드를 연결 하는 프로세스의 (B) 도표. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 내 피 세포의 효율적인 활성화 체크. 염증 성 자극에 의해 HUVEC의 활성화 단계 대조 현미경 검사 법을 사용 하 여 셀 모양을 분석 하 여 확인 했다. 치료의 6 시간 후 HUVEC TNFα로 자극 하면 길쭉한 형태를 제시 (500 U/mL) 또는 TNFα의 혼합 (500 U/mL) + VEGFA (1 µ g/mL) unstimulated 세포에 비해. 염증 성 자극에 따라 HUVEC의 형태학 변화 흐름 분석 결과 대 한 보장 한다 세포 활성화의 검출 하기 쉬운 지표 이다. 눈금 막대 120 µ m = 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: confocal 현미경 검사 법에 의해 transmigrated monocytes의. (A) 꼭대기와 기저 비행기에서 예상 전망과 monocyte 환생의 다이어그램. Hoechst 33342로 얼룩진 monocytes의 핵 파란색으로 그려져 그리고 monocytes의 이론적인 모양 핵 주위에 파선으로 표시 됩니다. 기저 보기에서 transmigrated 플랫 monocytes 내 피 세포 아래 공간을 점유 하는 것 같습니다. 이 공간 confocal 이미지에 monocyte 핵을 둘러싼 검은 구멍으로 나타납니다. (B)의 지 방화는 monocyte 전과 환생 후. 직교 뷰 표시 됩니다, 그리고 내 피 abluminal 구획에 monocyte 마이그레이션 후 (흰색 점선으로 구분 된) 블랙홀의 모습을 관찰할 수 있다. 빨간 화살촉 환생 전에 monocyte 위치 나타내고 흰색 화살표는 환생 후 동일한 셀을 나타냅니다. 직교 뷰 transmigrated monocyte 내 피 세포 아래 표시 됩니다. 눈금 막대 = 40 µ m. (C) 시간 경과 이미지 시퀀스 (0-20 분)에서 monocyte 모집 연장. 꼭대기 및 기저 보기 표시 됩니다. 전체 시퀀스 추가 영화 1, 2, 3에서에서 볼 수 있습니다. 빨간색 사각형 transmigrated monocyte 블루 핵으로 강조 표시합니다. 내 피 세포 아래 monocyte의 평면 몸에 해당 하는 블랙 홀은 황색 파선으로 구분 된. 눈금 막대 = 40 µ m. (D) 대 TNFα 자극에 monocyte 접착의 정량화는 시간이 지남에 따라 HUVEC unstimulated. 시간이 지남에 monocyte 환생 속도의 (E) 정량화 N = 3 생물 복제. 평균 ± 사 우 스 다코타 데이터 제시는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 흐름 아래 monocyte 모집단의 환생의 동시 조사. (A) 시간 경과 이미지 시퀀스 (0-20 분)에서 proangiogenic monocytes의 채용 (CD16+)와 비 신생 monocytes HUVEC TNFα 활성화를 통해 시간이 지남에. 눈금 막대 = 40 µ m; 꼭대기 및 기저 보기 표시 됩니다. 전체 시퀀스에 대 한 보충 영화 4 에서 볼 수 있습니다 꼭대기 기저 플레이 추가 영화 5 . (B) 인간 proangiogenic monocytes의 환생의 정량 (HPMo: CD16 +)와 HUVEC TNFα 활성 단층을 통해 인간의 비 신생 monocytes (HNMo). N = 4 생물 복제, 데이터 평균 ± 사 우 스 다코타도 제공 됩니다 * p < 0.05; 맨-휘트니 테스트 합니다. (C) 시간 경과 이미지 시퀀스 (0-20 분)에서 초과 TNFα + VEGFA 활성화 HUVEC 통해 proangiogenic와 비 신생 monocytes의 채용의. 눈금 막대 = 40 µ m; 꼭대기 및 기저 보기 표시 됩니다. 전체 시퀀스에 대 한 보충 영화 6 에서 볼 수 있습니다 꼭대기와 기저 플레이 추가 영화 7 . Proangiogenic 인간 monocytes의 환생의 (D) 정량 (HPMo: CD16 +)와 인간의 비 신생 monocytes (HNMo: CD16-) HUVEC TNFα + VEGFA 활성 단층을 통해. N = 4 생물 복제, 데이터 평균 ± 사 우 스 다코타도 제공 됩니다 * p < 0.05; 맨-휘트니 테스트 합니다. (E) (10 분) 전에 CD16 지역화+ monocytes (15 분) HUVEC TNFα + VEGFA 자극 통해 환생 후. 직교 뷰 표시 됩니다. 눈금 막대 40 µ m = 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: CD14 + 대 CD14-PBMC 흐름에서의 환생의 동시 조사. (A) 접착 CD14+대 CD14- PBMC 흐름에서 HUVEC TNFα 활성화 하. (B) 접착의 CD14+대 CD14- PBMC 흐름에서 HUVEC TNFα + VEGFA 활성화 하. (C) 환생 CD14의 비율 (%)+대 CD14- PBMC 흐름에서 HUVEC TNFα 활성화를 통해. (D) 환생 CD14의 비율 (%)+대 CD14- PBMC 흐름에서 HUVEC TNFα + VEGFA 활성화를 통해. 데이터는 평균 ± 사 우 스 다코타 N = 4 생물 복제. * p < 0.05; 맨-휘트니 테스트 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 영화 1: 흐름 아래 팬 monocyte 모집의 꼭대기 비행기에서 보기. 팬 monocyte 꼭대기 비행기에서 흐름에서의 채용의 확장 된 보기. HUVEC CMFDA로 얼룩진 했다 그리고 monocytes의 핵 Hoechst 33342 라이브-스테인드. 눈금 막대 50 µ m = 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 영화 2: 흐름 아래 팬 monocyte 모집의 기저 비행기에서 보기. 기초 평면에서 흐름 아래 팬 monocyte의 채용의 확장 된 보기. HUVEC CMFDA로 얼룩진 했다 그리고 monocytes의 핵 Hoechst 33342 라이브-스테인드. 눈금 막대 50 µ m = 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 영화 3: 흐름 아래 팬 monocyte 모집의 z 스택의 최대 투영. 팬 monocyte 보충 영화 1과 2에서와 같이 흐름에서의 채용의 확장 된 보기. HUVEC CMFDA로 얼룩진 했다 그리고 monocytes의 핵 Hoechst 33342 라이브-스테인드. 눈금 막대 50 µ m = 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 영화 4: TNF에 monocyte 모집단의 채용의 꼭대기 평면에서 보기α-활성화 HUVEC. 흐름에서 HUVEC TNFα 활성화 흐름 아래 monocyte 모집단의 동시 채용의 꼭대기 평면에서 보기 확장. HUVEC CMFDA로 얼룩진 했다 그리고 monocytes의 핵 Hoechst 33342 라이브-스테인드. Proangiogenic 인간 monocyte 모집단 CD16의 표면 식으로 확인 되었다. 눈금 막대 = 30 µ m. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 영화 5: TNF에 monocyte 모집단의 채용의 기저 면에 보기α-활성화 HUVEC. 흐름에서 HUVEC TNFα 활성화 흐름 아래 monocyte 모집단의 동시 채용의 기저 평면에서 확장 된 보기. HUVEC CMFDA로 얼룩진 했다 그리고 monocytes의 핵 Hoechst 33342 라이브-스테인드. Proangiogenic 인간 monocyte (HPMo) 부분 모집단 CD16의 표면 식으로 확인 되었다. 눈금 막대 = 30 µ m. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 영화 6: TNF에 monocyte 모집단의 채용의 꼭대기 평면에서 보기α+ VEGFA 활성화 HUVEC. 흐름에서 HUVEC TNFα + VEGFA 활성화 흐름 아래 monocyte 모집단의 동시 채용의 꼭대기 평면에서 확장 된 보기. HUVEC CMFDA로 얼룩진 했다 그리고 monocytes의 핵 Hoechst 33342 라이브-스테인드. Proangiogenic 인간 monocyte 부분 모집단 CD16의 표면 식으로 확인 되었다. 눈금 막대 30 µ m = 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 영화 7: TNF에 monocyte 모집단의 채용의 기저 면에 보기α+ VEGFA 활성화 HUVEC. 흐름에서 HUVEC TNFα + VEGFA 활성화 흐름 아래 monocyte 모집단의 동시 채용의 기저 평면에서 확장 된 보기. HUVEC CMFDA로 얼룩진 했다 그리고 monocytes의 핵 Hoechst 33342 라이브-스테인드. Proangiogenic 인간 monocyte (HPMo) 부분 모집단 CD16의 표면 식으로 확인 되었다. 눈금 막대 30 µ m = 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기, 우리가 어떻게 monocyte 모집단 염증이 내 피 단층을 통해 transmigrate의 연구를 자세히 설명 하는 방법 보고. 토론된 방법 단계 대조 현미경 검사 법, 또한 흐름3,,1119monocyte 모집을 공부 하는 데 사용 되는 대신 confocal 현미경 검사 법을 사용 합니다. 시간 경과 영상에 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여의 주요 장점 중 하나는 환생 및 monocytes의 강한 접착 사이 명확 하 게 구별할 수 있는 능력입니다. 단계 대조 현미경-기반 방법은 강력한도 하지만, 전문을 transmigrated 세포와 강하게 부착 세포를 혼합을 피하기 위해 필요 합니다. 이 경우에, 하나는 monocyte 모집 캐스케이드의이 두 가지 상태 간의 명확한 차이 만들기 위해 분석에 대 한 엄격한 기준을 설정 해야 합니다. 또한, 그것은 또한 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 관찰 된 글로벌 동향 확인 confocal 현미경 검사 법에 의해 끝점 분석을 수행 하는 것이 중요. 따라서, 흐름 아래 monocyte 채용 조사에 confocal 현미경 검사 법의 직접 사용 하 여 캡처된 monocytes의 실제 환생 상태에 명확한 결과를 제공 합니다.
백혈구 신규 모집을 실행에 주요 병목 현상의 한 흐름에서 분석 실험 그리고 단계 대조 현미경을 사용 하 여 분석을 수행 하 고 셀 접합을 통해 환생을 캡처에서 개별 셀을 추적 하려면 보낸 시간입니다. 이러한 분석의 자동화는 가능 하지만 크롤링 및 transmigrated monocytes 사이의 위상 대조 유사성으로 인해 수행 하기 어려운. 여기 우리 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 표시할 monocyte 환생 HUVEC 아래 transmigrated monocytes의 모양에 해당 하는 기초 비행기에 착 색 하는 내 피 세포의 중단에 의해 동행 했다. 이 위치는 직교 투영에 의해 확인 됐다. Monocyte 지역화의 전환-셀 접합 paracellular 환생의 지표 간의 발생 했습니다. 이것은 우리의 이전 데이터를 보여주는 그 흐름에서 생체 외에서, monocytes paracellular 경로 HUVEC3,18를 통해 독점적으로 transmigrate 일치 합니다. 여기, 제안 된 메서드를 보완 하기 위해 monocyte 환생 (transcellular 대 paracellular)의 잠재적인 사이트 포토 VE cadherin, 잼, 또는 PECAM1 같은 접합 단백질에 대하여 항 체-차단 되지 않은 사용 가능 하다. 우리는 monocyte 핵을 둘러싼 검은 모양 transmigrated 셀과 소프트웨어에 의해 감지 될 수 있는 간단한 이벤트의 강력한 특성을 확인 했습니다. 수동 셀 카운트 시스템 여기 설명 된다, 비록 백혈구 핵 주위 검은 모양 형성 자동된 분석, 시간을 많이 절약에 백혈구 환생을 정의 하는 데 사용할 수 있는 기준 이다. 우리는 현재 이러한 분석에 대 한 자동화 된 응용 프로그램 개발에 노력 하 고.
Confocal 현미경 검사 법 그리고 형광 이전 백혈구 신규 모집의 연구에 사용 되었다. 그러나, 그들은 다른 모집단의 채용을 동시에 조사를 사용 했다. 여기 우리 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 동일한 microenvironment에서 동시에 백혈구의 채용을 공부 하는 형식을 제안 합니다. 우리는 다른 monocyte 모집단의 철새 행동을 동시에 조사 하는 confocal 현미경 검사 법을 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 예를 들어, 다른 선 동적인 컨텍스트에서 두 모집단의 환생 용량을 공부 하기 위하여 proangiogenic 및 비 신생 monocytes 사이 차별을 CD16 식을 사용 했습니다. Confocal 현미경 검사 법 양식 적임을 사용 하 여 우리의 최근 게시와 일치 우리 것으로 나타났습니다 CD16의 환생 속도+ monocytes 때 낮은 내 피 세포 단층 TNFα3에 의해서만 자극 했다. 그러나, TNFα와 VEGFA의 조합 proangiogenic monocytes의 환생에서 증가에 지도 했다. 환생 율은 비 신생 CD16 마찬가지로 높은- monocytes 모두 염증 성 조건 하에서. 우리는 이전 표시 monocyte 안티 CD16 항 체와 얼룩, 환생에 어떤 큰 영향 존재 하지 않았다 확인이 레이블이 monocytes의 분석에 의해 환생 분석 결과, confocal 현미경 검사 법3을 사용 하 여. 그러나, 새로운 백혈구 하위 또는 그들을 표시 하는 데 사용 하는 항 체에 대 한 라벨 효과 평가 해야 합니다. 이 메서드를 사용 하 여 백혈구의 3 개의 다른 인구에 게 수 수 동시에 공부 했다. 이 기능적으로 뚜렷한 또는 유사한 면역 세포 유형 모집단 수 있습니다. 여기 초점은 monocyte 환생, 비록 그들의 신규 모집의 다른 단계 또한 셀 동작 환생, 캡처 및 migrational 방향 등을 포함 하 여이 방법으로 분석할 수 있습니다. 또한이 방법의 확장으로 abluminal 보존 등 역 환생 후 환생 이벤트 다른 백혈구 인구 조사 수 있습니다. 한 제한 시간 경과 영상, 형광 신호를 z 스택 해상도의 일부 넘침에 빨강 채널에서 얼룩의 가난한 탐지입니다. 이 주로 confocal 영상에 사용 하는 악기에 관련 되었다. 이미지 deconvolution 사용 하 여 이미지 품질을 개선 하 고 백혈구 신규 모집의 다른 단계의 분석 추가 허용을 결국 도울 수 있었다.
공부 하 고 최적의 조건에서 백혈구 신규 모집, 그것은 내 피 세포 단층의 정품 인증 상태를 확인 하는 것이 중요입니다. 실제로, 내 피 세포의 불충분 한 활성화 monocyte 접착에 환생 글로벌 감소에 지도 한다. 내 피 세포 활성화는 ICAM1 및 VCAM1 같은 내 피 세포 표면에 접착 분자의 식 수준을 분석 하 여 확인할 수 있습니다. Unstimulated 내 피 세포에 비해 이러한 접착 분자를 증가 해야 합니다의 수준. 교양된 HUVEC 여겨질 수 있다 변화 이면이 내 피 접착 분자에서 감지 되지 활성화. 접착 분자의 식 수준 평가 HUVEC의 동일한 일괄 처리를 사용 하 여 다른 실험 사이 좋은 양적 제어를 구성 수 있습니다. 그러나, 이러한 접착 분자의 식 수준 또한 ICAM1 또는 VCAM1의 글로벌 임계값의 고려를 제한 하는 내 피 세포의 다른 주 문화 사이의 달라질 수 있습니다. Macrovascular HUVEC 같은 내 피 세포의 모양에 변화는 또한 그들의 활성화의 좋은 지표. 표현 형이 후자의 변화 HUVEC 활성화의 신속 하 고 질적 평가 수 있습니다. 그러나, 접착 분자의 분석 microvascular 세포와 염증 성 cytokines 활성화 시 주요 모양 변경 표시 되지 않습니다에 대 한 더 나은 선택 수 있습니다.
기계 연구, 관련 부정적인 컨트롤 monocyte 환생의 ICAM1, VCAM1 또는 백혈구 표면 같은 백혈구 기능 관련 된 항 원 (LFA)-1에 내 피 접착 분자에 대하여 항 체를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 관련 부정적인 컨트롤의 사용으로 그들은 그들의 세포 표면에 Fc 수용 체를 표현 monocytes에 같은 기계적 연구에 대 한 필수적입니다. 격리 후 monocytes의 순도 다른 백혈구 인구 및 monocyte 환생의 속도의 과소 하 여 오염을 방지 하기 위해 중요 하다. 또 다른 중요 한 매개 변수 관련 모든 실험 관찰을 확인 하기 위해 모든 분석에 대 한 37 ° C에서 설정 하 고 그에 따라 인간을 vivo에서 세포 밀매 번역 하는 온도 이다.
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Disclosures
저자 아무 경쟁 금융 관심사 있다.
Acknowledgments
우리 감사 박사 폴 Bradfield 원고 읽기 및 피드백. A. S.는 선생님 쥘 가시 자선 해외 신뢰 등록에서 재정 지원을 받은
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture Flasks 75 cm2 | TPP | 90076 | Routine culture of isolated HUVEC |
| µ-Slide VI 0.4 | IBIDI | 80606 | |
| Centrifuge Tubes 15 mL | TPP | 191015 | |
| Centrifuge Tubes 50 mL | TPP | 191050 | |
| Collagen G | Biochrom | L 7213 | For coating of cell culture flasks |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | 1393 | For coating of cell culture flasks |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| 3-Way Stopcocks | BIO-RAD | 7328103 | |
| penicillin 10,000 μ/mL streptomycine 10,000 μg/mL fungizone 25 μ/mL | AMIMED | 4-02F00-H | |
| Collagenase type 1 | Worthington | LS004216 | |
| Medium 199 1x avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes | GIBCO | 22340020 | |
| Bovine Albumin Fraction V | ThermoFisher | 15260037 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement, 150 mg | Millipore | 02-102 | |
| Heparin Sodium | Sigma-Aldrich | H3149RT | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H6909 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A 4544 | |
| EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O | APPLICHEM | A2937.0500 | |
| CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC | Miltenyi Biotech | 130-100-713 | AB_2655150 |
| CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-807 | AB_2657280 |
| Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC | Miltenyi Biotech | 130-107-016 | AB_2653263 |
| BD Accuri C6 Plus | BD Bioscience | ||
| µ-Slide I Luer | IBIDI | 80176 | |
| CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | ThermoFisher | C2925 | |
| Recombinant human TNFα | Peprotech | 300-01A | |
| Recombinant human VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
| NE-1000 Programmable Syringe Pump | KF Technology | NE-1000 | |
| Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-519 | AB_2655051 |
| Pan Monocyte Isolation Kit, human | Miltenyi Biotech | 130-096-537 | |
| Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE | Miltenyi Biotech | 130-106-762 | AB_2655403 |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | ThermoFisher | H1399 | |
| Silicone tubing | IBIDI | 10841 | |
| Elbow Luer Connector | IBIDI | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | IBIDI | 10823 | |
| Luer Lock Connector Female | IBIDI | 10825 | |
| In-line Luer Injection Port | IBIDI | 10820 | |
| Ar1 confocal microscope | Nikon | ||
| 40x objective | Nikon | 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm | |
| ImageJ Software | NIH |
References
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