Summary
Aqui, apresentamos um protocolo integrado que mede subpopulação de monócitos tráfico sob fluxo in vitro pelo uso de marcadores de superfície específicas e microscopia de fluorescência confocal. Este protocolo pode ser usado para explorar etapas sequenciais de recrutamento, bem como perfil de outros subtipos de leucócitos usando outros marcadores de superfície específicos.
Abstract
O recrutamento de monócitos do sangue para os tecidos periféricos alvo é fundamental para o processo inflamatório durante a lesão tecidual, desenvolvimento de tumor e doenças auto-imunes. Isto é facilitado através de um processo de captura de fluxo livre para a superfície luminal das células endoteliais ativadas, seguido de sua migração de adesão e transendothelial (transmigração) no tecido afetado subjacente. No entanto, os mecanismos que suportam o recrutamento preferencial e contexto-dependente de subpopulações de monócitos são ainda não são totalmente conhecidos. Portanto, nós desenvolvemos um método que permite o recrutamento de subpopulações diferentes monócitos para ser visualizado e medido sob fluxo simultaneamente. Este método, baseado na imagem latente confocal lapso de tempo, permite a distinção inequívoca entre monócitos aderentes e transmigra. Aqui, descrevemos como esse método pode ser usado para estudar simultaneamente a cascata de recrutamento de monócitos pro-angiogênico e não-angiogênico in-vitro. Além disso, este método pode ser estendido para estudar as diversas etapas do recrutamento de até três populações de monócitos.
Introduction
Os monócitos constituem um componente fagocítica da imunidade inata que é essencial para o combate de patógenos, limpeza de tecidos danificados, angiogênese e a fisiopatologia de muitas doenças, incluindo câncer,1,2,3 . Os monócitos são células derivadas da medula óssea, compostas de subpopulações heterogêneas que circulam no sangue, mas podem ser recrutadas para o local da inflamação no tecido periférico, através de mecanismos moleculares específicos. As cascatas de recrutamento de monócitos, quanto aos leucócitos em geral, implica diferentes etapas, incluindo captura, rolando, rastejando, prisão, migração de transendothelial (transmigração) e migração através da parede do vaso (membrana basal e mural células)4. Estes passos envolvem principalmente moléculas induzida por inflamação na superfície luminal endotelial como selectinas, ligantes de glicoproteína, quimiocinas, moléculas de adesão intercelular e juncional e seus receptores em leucócitos como selectina ligantes e integrinas. Vias de tráfico através das junções de célula endotelial (paracellular) ou através do corpo de célula endotelial (transcellular) podem ser usadas por leucócitos de atravessar a barreira endotelial5. Enquanto os monócitos historicamente foram documentados a transmigrar através da rota de transcellular, potenciais divergências no seu percurso migratório têm sido propostas como os monócitos já não são considerados uma população celular homogênea. Agora está se tornando claro que a diversidade de monócitos podem ser definidos por cada uma das suas diferenças e semelhanças, com relação a sua distintivo extravasamento cascatas de3,6. Portanto, para inequivocamente discriminar entre subpopulações de monócitos, é crucial Visualizar e processar o fenótipo o comportamento de cada uma dessas subpopulações diferentes durante o recrutamento.
Monócitos do humano, porco, rato e rato foram subdivididos em subpopulações fenotípicas com determinadas funções anexam e comportamentos migratórios específicos7,8,9. Por exemplo, em humanos, monócitos podem ser divididos em três subgrupos com base em sua expressão de superfície de CD14, um co-receptor para lipopolissacarídeo bacteriano e CD16, o receptor de Fc-gama III. Subpopulações de monócitos humanos incluem CD14 clássica+CD16-, intermediário CD14+CD16+ e não-clássica CD14dimCD16 células de+ 6,9. O CD14 clássica+CD16– monócitos foram mostrados para ser inflamatória principalmente considerando que a piscina de CD16+ monócitos coletivamente foram encontrados para apresentar TIE2 expressão e proangiogenic função10. Consistentemente, estimulação de células endoteliais com citocinas inflamatórias, tais como necrose de tumor humano fator α (TNF) ou interleucina (IL-1) beta (inflamação convencional) é suficiente para desencadear o recrutamento completo de CD14 clássica+CD16 monócitos – . No entanto, ações simultâneas de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) A e TNFa (angiogênico orientada por fatores inflamação) são necessárias para provocar a transmigração do CD16+ proangiogenic piscina de monócitos3. Historicamente, o sistema tradicional de Transwell sob condições estáticas, a câmara de fluxo paralelo placa e câmaras de fluxo de µ-slide têm sido utilizados para analisar quantitativamente o recrutamento da população de leucócitos de um em um tempo em vitro11 ,12,13. Enquanto estes protocolos validados, um método mais robusto que permitiu a análise simultânea de várias subpopulações de monócitos seria considerado mais perspicaz. Tais metodologias devem contabilizar várias interações e as diferentes frequências de cada respectiva população e também fornecer uma compreensão mecanicista das semelhanças e especificidades para as cascatas de recrutamento que definem cada monócito subconjunto.
Aqui, apresentamos um método baseado sobre a lapso de tempo por imagens do recrutamento de monócitos sob fluxo que permite que o cascades migratórias de subpopulações diferentes monócitos para ser estudado simultaneamente usando microscopia confocal. Este método integra determinados recursos críticos que imitam a inflamação da célula endotelial, bem como a hemodinâmica de monócitos em vênulas pós-capilares, que circula o principal local de recrutamento de leucócitos em vivo. O método proposto utiliza células endoteliais veia umbilical humana (HUVEC), que são geradas através de um protocolo bem estabelecido de isolamento de cabos de cordão umbilical humanos. Este recurso clínico tem a vantagem de ser facilmente disponível como um subproduto biológico, e também proporcionar um rendimento razoável de células endoteliais, que podem ser isolados da veia umbilical. Também usamos corantes fluorescentes e imunofluorescência para distinguir entre os diferentes componentes celulares e microscopia confocal para definir inequivocamente monócito posicionamento (luminal vs abluminal) ao longo do tempo. O protocolo aqui apresentado foi desenvolvido a medida simultaneamente os níveis de transmigração de subpopulações de monócitos. Além disso, deve notar-se que esta metodologia pode ser estendida para estudar outras subpopulações de leucócitos e processos de recrutamento, pelo uso de diferentes biomarcadores e rotulagem.
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Protocol
Materiais humanos foram usados com o consentimento dos doadores voluntários e de acordo com os suíços comités de ética em pesquisa clínica.
1. isolamento e congelamento do Cordão Umbilical humano veia células endoteliais (HUVEC)
- Adicione 5 mL da solução de revestimento para um balão de T75 (0,1 mg/mL colágeno G e gelatina de 0,2% em tampão fosfato salino PBS pH 7,4) por 30 min a 37 ° C antes de iniciar o isolamento HUVEC.
- Limpe o cabo com PBS, limpe-a com compressas estéreis e colocá-lo em uma estéril 20 cm placa de Petri. Corte as extremidades do cabo com uma tesoura esterilizada.
- Identifica a única grande veia e duas artérias pequenas. Suavemente Insira uma cânula com uma torneira de três vias ligada a ele em veia extremidades nas extremidades do cabo.
- Aperte o cabo e a conexão da cânula firmemente com um comprimento de fio.
- Perfundir o cordão duas vezes com 20 mL de meio RPMI contendo 100 penicilina U/mL, de 100 U/mL Estreptomicina e de 250 ng/mL anfotericina B para lavar as veias do fio. Este processo faz a aparência do cordão mais brancos e mais clara. Esvazie a veia antes da adição de colagenase, recolhendo o RPMI com uma seringa em uma extremidade.
- Perfundir a veia com 12 mL de 1 mg/mL colagenase tipo eu (0,22 µm-filtrada).
- Fechar a torneira na medula termina e incubar o cabo a 37 ° C por 12 min.
- Massageie suavemente o cabo para desanexar células endoteliais do lúmen da veia.
- Tomar 30 mL de RPMI contendo 10% de soro fetal bezerro com uma seringa de 50 mL e conectá-lo a uma extremidade do cordão umbilical.
- Conecte uma seringa vazia de 50 mL para a outra extremidade do cordão umbilical
- Abra a torneira e perfundir a veia de uma ponta, enquanto que coletando reciprocamente do outro lado.
Nota: A suspensão coletada contém células endoteliais. - Centrifugar a suspensão celular a 200 x g por 5 min.
- Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células com 10 mL de meio M199 completo (M199 suplementos contendo 20% FCS, crescimento das células endoteliais 15 µ g/mL, sódio de heparina 100 µ g/mL, 0,5 µM de hidrocortisona, 10 µ g/mL de ácido L-ascórbico, 100 penicilina U/mL, 100 U/mL estreptomicina e 250 ng/mL anfotericina B).
- Remover a solução de revestimento de balão T75 e lave uma vez com PBS.
- Sementes das células colhidos passo 1.13 para o balão de T75 e colocá-lo na incubadora a 37 ° C com 5% de CO2.
- No dia seguinte, lave o balão 3 vezes com o meio M199 completo para remover células vermelhas do sangue residuais e depois mudar o médio a cada 2 dias até a confluência.
- Na confluência de 80-90%, enxágue a monocamada HUVEC uma vez com 5 mL de PBS e separar as células com 5 mL de tripsina 0,05% em 1 mM EDTA a 37 ° C por 5 min. Adicione 4 mL de M199 e 1 mL de FCS para parar a ação da tripsina. Lave o balão para desanexar todos HUVEC.
- Recolha uma alíquota de 50 µ l para ser usado para coloração de VE-caderina, PECAM-1 e gp38 e analisar por citometria de fluxo para verificar a pureza HUVEC.
- Colete o restante do HUVEC da etapa 1.18 em um tubo de 15 mL e centrifugar a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
- Descartar o sobrenadante da etapa 1.19, Ressuspender as células em congelamento solução (FCS contendo 10% de DMSO) com uma densidade de 5 x 105 células/mL em cryotubes e congelar a-80 ° C ou em nitrogênio líquido até o uso.
-
Para verificar a pureza HUVEC:
- Adicione 1 µ l de anticorpo de VE-caderina-FITC anti-humano, 1 µ l de anticorpo de PECAM1-PE anti-humano e 1 µ l de anticorpo de Podoplanin-APC anti-humano a alíquota de 50 µ l de HUVEC coletado na etapa 1.18.
- Incube a temperatura ambiente por 10 min.
- Adicionar 100 µ l de PBS e centrifugar a 400 x g durante 30 s.
- Desprezar o sobrenadante e ressuspender em 100 µ l de PBS. Dados podem agora ser adquiridos por técnicas de citometria de fluxo.
Nota: HUVEC são positivas para VE caderina e PECAM-1 e negativo para Podoplanin.
2. HUVEC descongelação
Nota: Usar HUVEC na passagem baixa para experimentos (máximos 5 passagens).
- Revesti um balão T75 com 1 mL da solução de revestimento, a 37 ° C por 30 min.
- Rapidamente HUVEC de descongelar a 37 ° C por 2 min e ressuspender as células em 10 mL de M199 completa.
- Centrifugar as células a 200 x g em temperatura ambiente por 5 min e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 10 mL de M199 completa.
- Transferi a suspensão de eritrócitos no frasco pré-pintados. Coloque o frasco na incubadora a 37 ° C com 5% de CO2. Altere o meio de cultura celular a cada 2 dias.
3. HUVEC cultura na câmara de 0,4 µ-Slide
- Cinco dias antes de iniciar o experimento de fluxo, pre-revesti as câmaras de um 0,4 µ-slide com 30 µ l de PBS contendo colágeno de 0,1 mg/mL G, gelatina de 0,2% a 37 ° C por 30 min.
- Lave as câmaras com 100 µ l de PBS.
- Separe as células de um HUVEC confluente de 80-90% de um balão T75.
- Enxágue HUVEC com 5 mL de PBS e desanexá-los com 5 mL de tripsina 0,05% a 37 ° C por 5 min.
- Lave e coletar a suspensão de eritrócitos em M199 completa e contar as células pelo método mais conveniente. Centrifugar a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
- Ressuspender as células em 106 células/mL e 30 µ l (30.000 células) por câmara de distribuir.
- Incube as células em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO2 por 1h.
- Adicionar 150 µ l de M199 completa para cada câmara e cultura das células durante 5 dias na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2. Altere o meio em 2 dias.
4. HUVEC mancha para ensaio de recrutamento de monócitos sob fluxo
- Prepare o suporte de rotulagem de M199 e 1 µM de CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetato) e aquecê-lo a 37 ° C por 5 min antes de rotulagem de célula.
- HUVEC lavar duas vezes com meio M199 aquecido a 37 ° C.
- Substituir o medium com 30 µ l de aquecido médio rotulagem contendo 1 µM de CMFDA e coloque dentro da incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 por 10 min.
- Lave uma vez com M199 completa e incube as celulas com M199 completa na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 por 30 min.
Nota: É importante remover todos os vestígios de soro antes da adição da solução de etiquetagem, caso contrário ele pode alterar HUVEC coloração. - Substituir o medium com M199 completa contendo qualquer TNFa humana (500 U/mL) ou uma mistura de TNFa humana (500 U/mL) com a célula humana (1 µ g/mL) para 6 h na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2.
5. isolamento de monócitos humanos Pan e coloração de subpopulações
- Use um casaco de buffy de concentrado de sangue humano, ou 20 mL de sangue humano fresco isolado, coletado no dia do experimento em tubos vacutainer de EDTA.
- Diluir o sangue em PBS-1 mM EDTA (1:1) e suavemente Pipetar 20 mL do sangue diluído em cima a 20 mL de mídia gradiente de densidade. Centrifugar a 400 x g durante 30 min à temperatura ambiente com aceleração lenta e sem freio.
- Recolher a células mononucleares do sangue periférico (PBMC)-camada de plaquetas (entre mídia de gradiente de densidade e camadas de plasma) em um novo tubo de 50 mL contendo 40 mL de PBS - 1 mM EDTA. Top com PBS - 1 mM EDTA até 50 mL.
- Centrifugar a 200 x g em temperatura ambiente por 5 min. descartar o sobrenadante.
- Ressuspender as células com 10 mL de tampão de coloração (PBS - 1 mM EDTA contendo albumina de soro bovino 0,5% BSA).
- Centrifugar a 200 x g em temperatura ambiente por 5 min. descartar o sobrenadante.
- Repita os passos de 5.5 e 5.6.
- Ressuspender as células com 10 mL de tampão de coloração. Tome uma alíquota de 10 µ l para uma contagem de células.
- Populações de PBMC de verificar e contar as células rapidamente com um citômetro de fluxo.
Nota: As populações de linfócitos e monócitos características podem ser observadas (figura 1A). De 50 mL de sangue humano fresco esperar sobre 50-100 x 106 PBMC. -
Para o recrutamento de CD14 + contra CD14-PBMC sob fluxo:
- Lave o pellet três vezes com buffer de fluxo (M199 contendo 0,5% BSA) e ressuspender as células mononucleares no buffer de fluxo em 6 x 106 células / mL.
- Fazer alíquotas de 200 µ l para cada ensaio. Incube a 37 ° C até 20 min antes do ensaio.
- Adicione 5 µ l de anti-CD14-PE e Hoechst 33342 em uma concentração final de 2 µM para cada alíquota. Misturar e incubar a 37 ° C por 10 min.
- Centrifugue a alíquota a 400 x g durante 30 s.
- Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado com 200 µ l de buffer de fluxo.
-
Para o recrutamento de subpopulações de monócitos sob fluxo:
- Isole os monócitos com um kit de isolamento de monócitos pan de acordo com as instruções do fabricante.
Nota: O seguinte protocolo de isolamento é de 50 x 106 células. Pode ser escalado acima ou para baixo, enquanto está dentro as recomendações do fabricante. - Centrifugar a suspensão de PBMC 200 x g em temperatura ambiente por 5 min.
- Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado com 400 µ l de tampão de coloração.
- Adicione 50 µ l de reagente de bloqueio de receptores Fc e 50 µ l de anticorpo Pan monócito cocktail.
- Incube a temperatura ambiente por 10 min.
- Adicione 400 µ l de tampão e 100 µ l de conjugado anticorpo de antimagnético biotina grânulos de coloração. Incube a temperatura ambiente por 15 min.
- Adicionar 2 mL de tampão de coloração e usar uma coluna de MACS LS juntamente com um ímã.
- Coloque a coluna é sobre o ímã e adicionar 1 mL de tampão de coloração. Descarte o escoamento.
- Passar a suspensão PBMC na coluna e coletar o fluxo desobstruído, embora contendo os monócitos pan em um novo tubo de 15 mL.
- Adicione o buffer de coloração para cima até 5 mL.
- Tomar uma alíquota e verificar a qualidade do isolamento de monócitos com um citômetro de fluxo.
- Determine a contagem de monócitos do pan.
Nota: População de monócitos só pode ser observada (figura 1B). - Centrifugue o restante de monócitos da etapa 5.11.11 a 200 x g por 5 min.
- Desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 5 mL de tampão de fluxo (M199 contendo 0,5% BSA).
- Repeti 5.11.13 para 5.11.14 duas vezes para eliminar qualquer vestígio de EDTA.
- Isole os monócitos com um kit de isolamento de monócitos pan de acordo com as instruções do fabricante.
- Fazer suspensão de monócitos no fluxo de buffer (M199 com 0,5% BSA) em 6 x 106 células/mL.
- Fazer alíquotas de 200 µ l de monócitos para cada ensaio de recrutamento.
- Manter a alíquota em 37 ° C na incubadora até 20 minutos antes da injeção.
- Adicione 5 µ l de anticorpo anti-CD16-PE e Hoechst 33342 (final de 2 µM) para cada alíquota.
- Misturar e incubar a 37 ° C por 10 min.
- Centrifugue a alíquota a 400 x g durante 30 s.
- Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado com 250 µ l de buffer de fluxo.
- Adicione 30 µ l de suspensão de monócitos em uma câmara do slide para servir para definir os parâmetros de aquisição em microscópio confocal.
- Manter as alíquotas de suspensão de monócitos da etapa 5.18 a 37 ° C.
Nota: Esta suspensão está pronta para ser injetado no sistema de fluxo.
6. preparação do sistema fluídico
- Assegurar que a incubadora de célula para a imagem, defina a 37 ° C.
Nota: Um diagrama do sistema de fluxo é mostrado na Figura 2. - Montar a parte de tubulação i: inserir um macho do conector Luer para uma extremidade de um pedaço de tubo de silicone (8 cm comprimento e 3 mm de espessura) e ligue a outra extremidade a um conjunto de injeção de Luer em linha. Conecte o conector Luer este último para um pedaço de tubo de silicone (40 cm e 3 mm de espessura) em uma extremidade.
Nota: Opcionalmente, uma torneira de 3 vias, conectada a uma seringa de 5 mL pode ser inserida entre o conjunto de injeção de Luer em linha e o silicone tubulação para remoção de bolha de ar eventual. - Montar a parte do tubo II: conectar uma extremidade de um comprimento de tubo de silicone (1 m de comprimento e 3 mm de espessura) com uma seringa de 20 mL. Inserir um macho do conector Luer para a outra extremidade do tubo.
- Conectar parte I e parte de tubulação II, inserindo os machos de conector Luer para um acoplador de trava Luer fêmea (Figura 2A).
- Colocar a extremidade livre do tubo de silicone no reservatório contendo o buffer de fluxo (M199 + 0,5% BSA) aquecido a 37 ° C.
- Puxe o êmbolo da seringa de 20 mL para encher o tubo com buffer de fluxo.
- Coloque a seringa na bomba e fixá-lo.
- Conjunto da bomba em retirar o modo (em oposição para infundir) e especificar a taxa de fluxo.
- Determine a taxa de fluxo de acordo com o slide IBIDI usado, usando a seguinte fórmula:
Nota: O fator de slide é dependente o slide IBIDI usado para o experimento. Para o µ-slide eu0.4 Luer-lock usada neste exemplo, o fator de slide é 131,6. Para fatores de slide específico, consulte o site de empresa14. A viscosidade de buffer de fluxo é 0.0072 dyn.s/cm2. Tensão de cisalhamento nas vênulas pós-capilares é cerca de 0.5 dyn/cm2. -
Conecte o slide (Figura 2B):
- Prenda o tubo de silicone ao redor o acoplador-fêmea Luer Lock e desconecte os dois machos de conector Luer o acoplador.
- Conectá-los para os reservatórios do slide contendo estimulada HUVEC e encha-o com o meio. Evite bolhas de ar durante esta etapa.
- Tire os grampos e certifique-se de que a conexão não está vazando.
- Coloque a lâmina ao microscópio para a imagem latente de lapso de tempo e comece a bomba.
7. imagem lapso de tempo de recrutamento de monócitos sob fluxo por microscopia Confocal
- Use um objectivo de 40x (ver Tabela de materiais) para a imagem latente.
- Ativar a 405 nm (núcleo de monócitos azul) 488 nm (células endoteliais verdes) e 561 lasers de nm (subconjunto CD16 + vermelho).
- Use a câmara que contém os monócitos para definir os parâmetros de aquisição.
Nota: Para detectar tanto não-transmigra e transmigra monócitos, a pinhole e intensidade de laser 405 nm são definidas altas. Assim, não transmigra os monócitos são ligeiramente visíveis no plano basal. Entretanto somente transmigra monócitos apresentam uma área imaculada ao redor do núcleo correspondente para o novo espaço ocupado por baixo de células endoteliais. - Coloque a câmara para ser adquirida sob o microscópio.
- Escolha 3 campos de pontos de vista num raio de 1 cm para a imagem latente confocal multi-posição.
- Definir o basal e os lados apicais das células endoteliais
- Defina um z-pilha ao intervalo 10 – 12 µm (passo de 0,5 µm). Execute uma aquisição de lapso de tempo cada 1 min.
- Após 3 min da imagem latente, injete 200 µ l de suspensão de monócitos (6 x 106 células/mL) através do orifício de injecção de Luer em linha.
Nota: Rapidamente os monócitos aparecem no plano focal apical, aderir e começar a transmigração (trânsito do apical ao plano basal). - Imagem pelo menos 30 min. Uma vez terminado, parar a imagem e parar o fluxo. Fixe o tubo para desconectá-los a partir do slide.
- Fixe o slide com paraformaldeído 4%, a 4 ° C por 10 min.
- Lave o slide com PBS e armazenar o slide a 4 ° C para posterior análise, se necessário.
8. analisar os dados com ImageJ
- Conte o número de monócitos aderentes totais em cada campo. Determine a contagem de células por mm2.
- Contagem de monócitos transmigra que estão presentes no plano basal por baixo de células endoteliais e identificados pela presença de um buraco negro (no canal verde) ao redor do núcleo.
- Divida a contagem de leucócitos transmigra pelo número total de leucócitos aderentes. A taxa de transmigração é apresentada como uma porcentagem de monócitos aderentes.
- Para ilustração, o apical e basais laterais podem ser mostradas simultaneamente para ilustrar os eventos que ocorrem em cada um desses compartimentos endoteliais.
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Representative Results
Determinando o estado de ativação HUVEC induzida por TNFa
A bio-atividade das citocinas inflamatórias TNFa pode ser variam de acordo com o lote e o repletion do ciclo de congelamento-descongelamento. É importante verificar o status de ativação de HUVEC com tratamento de TNFa. Isso poderia ser realizada pela coloração em paralelo algumas amostras de HUVEC confluente para a indução inflamatória de selectinas, ICAM-1 e VCAM-115,16,17. Uma maneira mais fácil e mais simples para verificar o status de ativação de HUVEC após o tratamento de TNFa é a alteração morfológica exibida por células endoteliais sob estresse inflamatório. Como mostrado na Figura 3, HUVEC alongar após 6-h na presença de TNFa em comparação com células unstimulated. Alongamento semelhante é observado quando HX é estimulados por uma mistura de TNFa e VEGFA. Gravar o status de ativação do HUVEC é importante, pois os resultados finais da transmigração de monócitos dependerá da qualidade da ativação de células endoteliais.
Transmigração de monócito faz uma descontinuação característica em células endoteliais
Para estudar a transmigração de monócitos sob fluxo, usamos a microscopia confocal com células endoteliais coradas em verde com CMFDA e os núcleos de monócitos isolados corados em azul com o corante Hoechst 33342 célula-permeável (Figura 4). A imagem latente confocal de lapso de tempo permitiu a visualização de monócitos no plano apical, onde seu fenótipo pode ser avaliada (Figura 4A-C, suplementar 1 filme). Células migratórias passando por transmigração mudou-se para o espaço intercelular correspondente junções célula-célula, antes que eles desapareceram do avião apical e apareceram no plano basal. As células transmigrated apresentaram um buraco negro em torno do núcleo correspondente para as formas de monócitos. Esta forma mudada constantemente durante a migração de monócitos por baixo de células endoteliais (Figura 4A-C, filmes suplementar 2-3). Este buraco negro dinâmico, feito pelo corpo por baixo das células endoteliais e o posicionamento de monócitos, monócitos permitiu a identificação inequívoca das células transmigra. Quantificação de recrutamento de monócitos, ao longo do tempo mostrou a adesão de monócitos, seguido de transmigração (Figura 4-E). Apesar de leucócitos podem extravasate através de rotas de transcellular e paracellular, só observamos a transmigração de paracellular sob o fluxo com este método. Isto é consistente com nossos anteriores observações3,11,18,19.
Fator angiogênico conduzido a inflamação promove a transmigração de CD16 + monócitos
Usando esse método, analisamos a transmigração da proangiogenic humana versus não-angiogênico monócitos através de uma monocamada endotelial estimulado pelas citocinas inflamatórias TNFa sozinha ou em combinação com o fator angiogênico VEGFA. Proangiogenic humana monócitos podem ser identificados pela expressão de CD16 ou TIE2 na sua superfície. Aqui, o anticorpo anti-CD16-PE foi usado para discriminar entre pro - e não-angiogênico monócitos. Conforme mostrado na Figura 5A-B (filmes suplementar 4-5), a taxa de transmigração de CD16+ monócitos estava baixa quando as células endoteliais foram estimuladas com TNFa apenas. No entanto, esta taxa aumentou quando as células endoteliais foram estimuladas simultaneamente com TNFa e VEGFA (Figura 5Filmes suplementar-E, 6-7). A taxa de transmigração de monócitos não-angiogênico foi similarmente elevada em ambas as condições inflamatórias. Para ambas as subpopulações de células, a transmigração ocorreu exclusivamente através da rota de paracellular. Este método permite, portanto, as aptidões de transmigração de diferentes populações monocítica para ser investigados simultaneamente.
A pureza de monócitos afeta a eficiência de transmigração
As células mononucleares do sangue periférico são compostas de células T, células B, células NK e monócitos. O método de isolamento de monócitos usado aqui exige o esgotamento de outras populações de leucócitos de PBMC. Para entender como a falta de pureza monócito afeta os resultados, usamos PBMCs e manchado por monócitos-pan com um anticorpo anti-CD14-PE antes de realizar o ensaio de recrutamento sob fluxo. Como mostrado na Figura 6, estimulação HUVEC com TNFa ou TNFa + VEGFA induzido a transmigração da população só monócitos. Outros leucócitos é composto por células T, células B e células NK não transmigrar sob TNFa ou TNFa + VEGFA. De fato, tem sido documentado que estes leucócitos precisam de outros sinais de transmigração. Assim, um isolamento ineficiente de monócitos conduzirá a uma subestimação da transmigração de monócitos, como os outros leucócitos poderia ser considerados como monócitos. Isso levaria a um resultado errôneo na transmigração de monócitos, devido a contaminação da população de monócitos com outros leucócitos.
Figura 1: perfil de monócitos isolados por citometria de fluxo. (A) análise da morfologia de PBMC antes de depleção de linfócitos. O tamanho (dispersão direta: FSC) e granularidade (dispersão lateral: SSC) de sangue periférico, células mononucleares foram determinadas por citometria de fluxo. (B) o tamanho e a granularidade de monócitos isolados foram determinadas por citometria de fluxo após a depleção de linfócitos. Um isolamento eficiente de monócitos mostra uma completa depleção da população de linfócitos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: diagrama do sistema fluídico. (A) visão geral esquemática do sistema de perfusão, antes e após a conexão do slide e montagem da bomba de seringa. (B) diagrama do processo de conectar o slide com a tubulação usando grampos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: verificando a ativação eficiente das células endoteliais. A ativação do HUVEC por estímulos inflamatórios foi verificada, analisando a forma de células usando microscopia de contraste de fase. Após 6 horas de tratamento, HUVEC apresentam uma morfologia alongada quando estimulado com TNFa (500 U/mL) ou uma mistura de TNFa (500 U/mL) + VEGFA (1 µ g/mL) em comparação com células unstimulated. Esta alteração morfológica de HUVEC seguindo a estimulação inflamatória é um indicador de fácil de detectar de ativação celular, que deve ser assegurada para o ensaio de fluxo. Barra de escala = 120 µm clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: identificação dos transmigrated monócitos pela microscopia confocal. (A) diagrama de transmigração de monócitos com os pontos de vista esperadas para aviões apicais e basais. Os núcleos de monócitos manchados com Hoechst 33342 são representados em azul, e as formas teóricas de monócitos são representadas com linhas tracejadas em torno dos núcleos. Em vista da basal, os monócitos transmigrated planos são mostrados para ocupar um espaço por baixo da célula endotelial. Este espaço é exibido como um buraco negro em torno do núcleo de monócitos em imagens confocal. (B) localização de um monócito antes e após a transmigração. As vistas ortogonais são mostradas, e a aparência de um buraco negro (delineado com a linha branca tracejada) pode ser observada após a migração de monócitos para o compartimento abluminal endotelial. Uma seta vermelha indica a posição de um monócito antes de transmigração e a seta branca indica a mesma célula depois da transmigração. As vistas ortogonais mostram que o transmigrated monócito é debaixo da célula endotelial. Barra de escala = 40 µm. (C) Time-Lapse sequências de imagem (de 0 a 20 min) de horas extras de recrutamento de monócitos. São mostrados os pontos de vista apicais e basais. As sequências completa podem ser vistas em filmes suplementar 1, 2 e 3. Quadrados vermelhos destacam um monócito transmigrated com um núcleo azul. O buraco negro, correspondente ao corpo plano do monócito debaixo da célula endotelial é delineado por uma linha tracejada amarela. Barra de escala = 40 µm. (D) a quantificação da adesão de monócitos à TNFa-estimulada contra unstimulated HUVEC ao longo do tempo. (E) a quantificação da taxa de transmigração de monócitos ao longo do tempo. N = 3 repetições biológicas. Os dados são apresentados como média ± D.P. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: investigação simultânea da transmigração de subpopulações de monócitos sob fluxo. (A) sequências de imagem de lapso de tempo (de 0 a 20 min) do recrutamento de monócitos proangiogenic (CD16+) e não-angiogênico monócitos ao longo do tempo através de HUVEC TNFa está ativado. Barra de escala = 40 µm; são mostrados os pontos de vista apicais e basais. As sequências completa podem ser vistas em suplementar 4 filme para apical e suplementar 5 filme para vistas basais. (B) a quantificação da transmigração de monócitos humanos proangiogenic (HPMo: CD16 +) e monócitos humanos não-angiogênico (HNMo) através de uma monocamada HUVEC TNFa está ativado. N = 4 repetições biológicas, os dados são apresentados como média ± D.P. * p < 0,05; Teste de Mann-Whitney. (C) Time-Lapse imagem sequências (de 0 a 20 min) do recrutamento de monócitos proangiogenic e não-angiogênico horas extras através de HUVEC TNFa + VEGFA está ativado. Barra de escala = 40 µm; são mostrados os pontos de vista apicais e basais. As sequências completa podem ser vistas no Supplemental filme 6 para apical e suplementar filme 7 para vistas basais. (D) a quantificação da transmigração de monócitos humanos proangiogenic (HPMo: CD16 +) e monócitos humanos não-angiogênico (HNMo: CD16-) através de monocamada HUVEC TNFa + VEGFA está ativado. N = 4 repetições biológicas, os dados são apresentados como média ± D.P. * p < 0,05; Teste de Mann-Whitney. (E) localização de CD16+ monócitos antes (10 min) e depois (15 min) transmigração através de HUVEC TNFa + VEGFA-estimulado. As vistas ortogonais são mostradas. Barra de escala = 40 µm clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Investigação simultânea da transmigração de CD14 + contra CD14 - PBMC sob fluxo. (A) adesão de CD14+contra CD14– PBMC de TNFa ativado HUVEC sob fluxo. (B) adesão de CD14+contra CD14– PBMC de TNFa + VEGFA ativado HUVEC sob fluxo. (C) transmigração taxa (%) de CD14+contra CD14– PBMC através de HUVEC TNFa ativado sob fluxo. (D) transmigração taxa (%) de CD14+contra CD14– PBMC através de HUVEC TNFa + VEGFA ativado sob fluxo. Dados são média ± D.P. N = 4 repetições biológicas. * p < 0,05; Teste de Mann-Whitney. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Suplementar 1 filme: vista no plano apical do recrutamento de pan-monócito sob fluxo. Visão expandida do recrutamento de monócitos pan sob fluxo no plano apical. HUVEC estavam manchadas com CMFDA e os núcleos de monócitos foram viver-manchado com Hoechst 33342. Barra de escala = 50 µm clique aqui para baixar este arquivo.
Suplementar Movie 2: exibição no plano basal do recrutamento de pan-monócito sob fluxo. Visão expandida do recrutamento de monócitos pan sob fluxo no plano basal. HUVEC estavam manchadas com CMFDA e os núcleos de monócitos foram viver-manchado com Hoechst 33342. Barra de escala = 50 µm clique aqui para baixar este arquivo.
Suplementar Movie 3: projeção máxima de z-pilhas de recrutamento pan-monócito sob fluxo. Visão expandida do recrutamento de monócitos pan sob fluxo conforme suplementar filmes 1 e 2. HUVEC estavam manchadas com CMFDA e os núcleos de monócitos foram viver-manchado com Hoechst 33342. Barra de escala = 50 µm clique aqui para baixar este arquivo.
Suplementar Movie 4: vista no plano apical do recrutamento de subpopulações de monócitos para TNFα-ativado HUVEC. Expandiu vista no plano apical da contratação simultânea de subpopulações de monócitos sob fluxo de TNFa ativado HUVEC sob fluxo. HUVEC estavam manchadas com CMFDA e os núcleos de monócitos foram viver-manchado com Hoechst 33342. Subpopulações de monócitos humanos proangiogenic foram identificadas pela expressão superficial de CD16. Barra de escala = 30 µm. clique aqui para baixar este arquivo.
Suplementar filme 5: exibição no plano basal do recrutamento de subpopulações de monócitos para TNFα-ativado HUVEC. Visão expandida, no plano basal, da contratação simultânea de subpopulações de monócitos sob fluxo de TNFa ativado HUVEC sob fluxo. HUVEC estavam manchadas com CMFDA e os núcleos de monócitos foram viver-manchado com Hoechst 33342. A subpopulação de monócitos (HPMo) proangiogenic humana foi identificada pela expressão superficial de CD16. Barra de escala = 30 µm. clique aqui para baixar este arquivo.
Suplementar filme 6: exibição no plano apical do recrutamento de subpopulações de monócitos para TNFα+ HUVEC VEGFA ativado. Visão expandida, no plano apical, da contratação simultânea de subpopulações de monócitos sob fluxo de TNFa + VEGFA ativado HUVEC sob fluxo. HUVEC estavam manchadas com CMFDA e os núcleos de monócitos foram viver-manchado com Hoechst 33342. A subpopulação de monócitos humanos proangiogenic foi identificada pela expressão superficial de CD16. Barra de escala = 30 µm clique aqui para baixar este arquivo.
Suplementar filme 7: vista no plano basal do recrutamento de subpopulações de monócitos para TNFα+ HUVEC VEGFA ativado. Visão expandida, no plano basal, da contratação simultânea de subpopulações de monócitos sob fluxo de TNFa + VEGFA ativado HUVEC sob fluxo. HUVEC estavam manchadas com CMFDA e os núcleos de monócitos foram viver-manchado com Hoechst 33342. A subpopulação de monócitos (HPMo) proangiogenic humana foi identificada pela expressão superficial de CD16. Barra de escala = 30 µm clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Aqui, nós relatamos um método detalhando um estudo de como subpopulações de monócitos transmigrar através da monocamada endotelial inflamada. O método discutido usado microscopia confocal em vez de microscopia de contraste de fase, que também é usada para estudar o recrutamento de monócitos sob fluxo de11,3,19. Uma das principais vantagens do uso de microscopia confocal para a imagem latente de lapso de tempo é a capacidade de discriminar inequivocamente transmigração e forte adesão de monócitos. Embora o método baseado em microscopia de contraste de fase também é robusto, requer perícia a fim de evitar misturar transmigra pilhas e pilhas fortemente aderentes. Neste caso, é preciso estabelecer critérios rigorosos para análise a fim de fazer uma diferença clara entre estes dois Estados de cascata de recrutamento de monócitos. Além disso, também é importante realizar uma análise de ponto de extremidade pela microscopia confocal para confirmar as tendências globais observadas por microscopia de contraste de fase. Assim, o uso direto de microscopia confocal para investigar o recrutamento de monócitos sob fluxo fornece resultados claros sobre o status de transmigração real de monócitos capturados.
Um dos principais gargalos na execução de recrutamento de leucócitos ensaios sob fluxo e usando um microscópio de contraste de fase é o tempo gasto para realizar a análise e localizar células individuais de captura de transmigração através da junção de celular. Automação da análise é possível, mas difícil de realizar devido a semelhanças de contraste de fase entre monócitos rastejando e transmigra. Aqui nós mostramos usando microscopia confocal que transmigração de monócitos foi acompanhada por uma interrupção da coloração no plano basal correspondente à forma dos monócitos transmigrated debaixo HUVEC endothelial da pilha. Este posicionamento foi confirmado pela projeção ortogonal. A transição de localização de monócitos ocorreu exclusivamente entre as junções célula-célula indicativas de uma transmigração de paracellular. Isto é consistente com nossos dados anteriores, que mostraram que sob fluxo in-vitro, monócitos transmigrar exclusivamente através da rota de paracellular com HUVEC3,18. Para complementar o método proposto aqui, é possível usar sem bloqueio de anticorpos contra proteínas juncionais como VE-caderina, compotas ou PECAM1 para imaginar os locais potenciais de transmigração de monócitos (paracellular vs. transcellular). Confirmamos que as formas pretas em torno dos núcleos de monócitos são uma característica robusta de células transmigra e um evento simples que pode ser detectável pelo software. Mesmo que uma célula manual sistema de contagem é demonstrada aqui, a formação de forma preta ao redor do núcleo dos leucócitos é um critério que poderia ser usado para definir a transmigração de leucócitos em análise automatizada, poupando assim muito tempo. Estamos atualmente trabalhando no desenvolvimento de uma aplicação automatizada para tal análise.
Fluorescência e microscopia confocal anteriormente foram utilizados no estudo de recrutamento de leucócitos. No entanto, eles não foram usados para investigar a contratação de subpopulações diferentes simultaneamente. Aqui propomos uma modalidade de usando microscopia confocal para estudar o recrutamento dos subtipos de leucócitos simultaneamente no microambiente da mesma. Mostramos que a microscopia confocal pode ser usada para investigar simultaneamente os comportamentos migratórios de subpopulações diferentes monócito. Por exemplo, nós usamos CD16 expressão para discriminar entre proangiogenic e não-angiogênico monócitos para estudar a capacidade de transmigração das duas subpopulações diferentes contextos inflamatória. Consistente com nossa recente publicação, usando a modalidade de microscopia confocal, mostramos que a taxa de transmigração de CD16+ monócitos foi menor quando a monocamada de células endoteliais foi estimulada somente por TNFa3. No entanto, a combinação de TNFa e VEGFA levou a um aumento na transmigração de monócitos proangiogenic. A taxa de transmigração foi da mesma forma alta para não-angiogênico CD16 monócitos– em ambas as condições inflamatórias. Anteriormente mostramos que monócitos manchando com o anticorpo anti-CD16 não apresentaram qualquer efeito significativo na transmigração, confirmando isto pela análise de monócitos sem rótulo após o ensaio de transmigração, utilizando microscopia confocal3. No entanto, para novos subtipos de leucócitos ou anticorpos usados para marcá-los, o efeito de rotulagem deve ser avaliada. Usando este método, até três diferentes populações de leucócitos podem ser simultaneamente estudou. Isto poderia ser subpopulações que são tipos de células imunes funcionalmente distintos ou similar. Embora o foco aqui é na transmigração de monócitos, outras etapas de sua contratação também podem ser analisadas por este método, incluindo o comportamento da célula antes de transmigração, como a captura e migração direcionalidade. Eventos pós-transmigração como abluminal retenção e transmigração inversa também podem ser investigados por populações diferentes de leucócitos, como uma extensão deste método. Uma limitação é a detecção de pobre da coloração no canal de far-red na imagem latente de lapso de tempo, bem como um transbordamento dos sinais de fluorescência que reduzir a resolução de z-pilha. Isto era principalmente relacionado ao instrumento usado para a imagem latente confocal. O uso de deconvolução imagem eventualmente poderia ajudar a melhorar a qualidade de imagem e permitir a análise das diferentes etapas do recrutamento de leucócitos.
Para estudar o recrutamento de leucócitos em condições óptimas, é importante verificar o status de ativação da monocamada de células endoteliais. Com efeito, uma deficiente ativação de células endoteliais leva a uma redução global na adesão de monócitos e transmigração. Ativação de células endoteliais pode ser verificada através da análise do nível de expressão de moléculas de adesão na superfície de células endoteliais como ICAM1 e VCAM1. O nível destes adesão moléculas devem ser aumentadas em comparação com células endoteliais unstimulated. Se nenhuma mudança for detectável nessas moléculas de adesão endotelial, o culto HUVEC pode ser considerado como não ativado. Avaliação do nível de expressão de moléculas de adesão pode constituir um bom controle quantitativo entre diferentes experiências utilizando o mesmo lote de HUVEC. No entanto, o nível de expressão destas moléculas de adesão também pode variar entre diferente cultura primária de células endoteliais, limitando a consideração de um limite global de ICAM1 ou VCAM1. A mudança na forma de células endoteliais macrovascular como HUVEC também é um bom indicador da sua activação. Esta última mudança no fenótipo permite uma avaliação rápida e qualitativa de ativação HUVEC. No entanto, a análise de moléculas de adesão pode ser uma escolha melhor para células microvasculares que não mostram grande forma-mudança após a ativação com citocinas inflamatórias.
Para estudos mecanicistas, controles negativos relevantes de transmigração de monócito podem ser realizadas utilizando-se anticorpos contra moléculas de adesão endotelial como ICAM1, VCAM1 ou na superfície de leucócitos como função leucócito-associado do antígeno (LFA) -1. O uso de um controle negativo relevante é essencial para tal estudo mecanicista em monócitos como eles expressam receptores de Fc em suas superfícies da célula. A pureza de monócitos após o isolamento também é importante, para evitar a contaminação por outras populações de leucócitos e subestimação da taxa de transmigração de monócitos. Outro parâmetro de crítico é a temperatura, que deve ser definida a 37 ° C, para todos os ensaios, a fim de garantir que todas as observações experimentais são relevantes e traduzir em conformidade ao humano na vivo celular tráfico.
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Disclosures
Os autores têm sem interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos o Dr. Paul Bradfield para manuscrito lendo e feedbacks. A.s. recebeu apoio financeiro do senhor Jules Thorn caridade ultramarinos Trust reg.,
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture Flasks 75 cm2 | TPP | 90076 | Routine culture of isolated HUVEC |
| µ-Slide VI 0.4 | IBIDI | 80606 | |
| Centrifuge Tubes 15 mL | TPP | 191015 | |
| Centrifuge Tubes 50 mL | TPP | 191050 | |
| Collagen G | Biochrom | L 7213 | For coating of cell culture flasks |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | 1393 | For coating of cell culture flasks |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| 3-Way Stopcocks | BIO-RAD | 7328103 | |
| penicillin 10,000 μ/mL streptomycine 10,000 μg/mL fungizone 25 μ/mL | AMIMED | 4-02F00-H | |
| Collagenase type 1 | Worthington | LS004216 | |
| Medium 199 1x avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes | GIBCO | 22340020 | |
| Bovine Albumin Fraction V | ThermoFisher | 15260037 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement, 150 mg | Millipore | 02-102 | |
| Heparin Sodium | Sigma-Aldrich | H3149RT | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H6909 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A 4544 | |
| EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O | APPLICHEM | A2937.0500 | |
| CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC | Miltenyi Biotech | 130-100-713 | AB_2655150 |
| CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-807 | AB_2657280 |
| Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC | Miltenyi Biotech | 130-107-016 | AB_2653263 |
| BD Accuri C6 Plus | BD Bioscience | ||
| µ-Slide I Luer | IBIDI | 80176 | |
| CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | ThermoFisher | C2925 | |
| Recombinant human TNFα | Peprotech | 300-01A | |
| Recombinant human VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
| NE-1000 Programmable Syringe Pump | KF Technology | NE-1000 | |
| Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-519 | AB_2655051 |
| Pan Monocyte Isolation Kit, human | Miltenyi Biotech | 130-096-537 | |
| Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE | Miltenyi Biotech | 130-106-762 | AB_2655403 |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | ThermoFisher | H1399 | |
| Silicone tubing | IBIDI | 10841 | |
| Elbow Luer Connector | IBIDI | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | IBIDI | 10823 | |
| Luer Lock Connector Female | IBIDI | 10825 | |
| In-line Luer Injection Port | IBIDI | 10820 | |
| Ar1 confocal microscope | Nikon | ||
| 40x objective | Nikon | 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm | |
| ImageJ Software | NIH |
References
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