Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Gelijktijdige studie van de aanwerving van monocyt subpopulaties onder stroom In Vitro

Published: November 26, 2018 doi: 10.3791/58509
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 3
1Hematology service, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva, 2Department of Pathology and Immunology, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva, 3Department of Cell Physiology and Metabolism, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva

Summary

Hier presenteren we een geïntegreerde protocol die maatregelen monocyt subpopulatie mensenhandel onder stroom in vitro door gebruik van specifieke oppervlakte markers en confocal fluorescentie microscopie. Dit protocol kan worden gebruikt om te verkennen sequentiële werving stappen ook over andere subtypen van de leukocyten met behulp van andere specifieke oppervlakte markers profile.

Abstract

De aanwerving van monocyten uit het bloed aan gerichte perifere weefsels is kritiek aan het inflammatoire proces tijdens weefsel schade, ontwikkeling van de tumor en auto-immune ziekten. Dit wordt vergemakkelijkt door een proces van vangen van doorstroming op het luminal oppervlak van geactiveerde endotheliale cellen, gevolgd door hun migratie hechting en signaalcomplexen (zielsverhuizing) in het onderliggende aangetast weefsel. De mechanismen die ondersteuning bieden voor de preferentiële en context-afhankelijke werving van monocyt subpopulaties worden echter nog steeds niet volledig begrepen. Daarom hebben wij een methode waarmee de aanwerving van verschillende monocyt subpopulaties gelijktijdig worden gevisualiseerd en gemeten onder stroom ontwikkeld. Deze methode, gebaseerd op time-lapse confocal imaging, voorziet het duidelijke onderscheid tussen aanhangend en transmigrated monocyten. Hier beschrijven we hoe deze methode kan worden gebruikt om gelijktijdig de opeenvolging van de werving van pro-angiogenic en niet-angiogenic monocyten in vitro studie. Bovendien, deze methode kan worden uitgebreid om te bestuderen van de verschillende stappen van de aanwerving van maximaal drie monocyt populaties.

Introduction

Monocyten een fagocytische onderdeel vormen van aangeboren immuniteit dat essentieel is voor de bestrijding van ziekteverwekkers, opruimen van beschadigde weefsels, angiogenese en de pathofysiologie van vele ziekten, waaronder kanker1,2,3 . Monocyten zijn beenmerg-afgeleide cellen samengesteld van heterogene subpopulaties die circuleren in het bloed, maar op de site van ontsteking in perifeer weefsel kunnen worden aangeworven door middel van specifieke moleculaire mechanismen. De aanwerving cascades van monocyten, wat betreft de leukocyten in het algemeen impliceert verschillende stappen waaronder vangen, rollen, kruipen, arrestatie, migratie van signaalcomplexen (zielsverhuizing) en migratie door de vaatwand (kelder membraan en muurschildering cellen)4. Deze maatregelen betreffen voornamelijk ontsteking geïnduceerde moleculen op het endotheel luminal oppervlak zoals selectinen, glycoproteïne liganden chemokines, intercellulaire en regulates celadhesie-moleculen en hun receptoren op leukocyten zoals selectine liganden en integrins. Mensenhandel trajecten via ofwel de endothelial cel kruispunten (paracellular) of via de endothelial cel lichaam (transcellulair) kunnen worden gebruikt door leukocyten te steken van het endotheel barrière-5. Terwijl monocyten zijn historisch gedocumenteerd te transmigrate door de transcellulair-route, hebben mogelijke verschillen in hun trekkende traject voorgesteld als monocyten zijn niet langer beschouwd als een homogene-celpopulatie. Het is nu duidelijk dat monocyt diversiteit kan worden gedefinieerd door elk van hun verschillen en overeenkomsten, met betrekking tot hun kenmerkende extravasation cascades3,6. Daarom, teneinde ondubbelzinnig onderscheid te maken tussen monocyt subpopulaties, is het van cruciaal belang om te visualiseren en fenotype het gedrag van elk van deze verschillende subpopulaties tijdens de aanwerving verwerken.

Monocyten van menselijke, pig, rat en muis waren onderverdeeld in fenotypische subpopulaties met bepaalde waaraan functies en specifieke trekkende gedrag7,8,9. Bijvoorbeeld, bij de mens, kunnen monocyten worden onderverdeeld in drie subgroepen op basis van hun oppervlakte uitdrukking van CD14, een co-receptor voor bacteriële lipopolysaccharide en CD16, de Fc-gamma receptor III. Menselijke monocyt subpopulaties omvatten klassieke CD14+CD16-, middenniveau CD14+CD16+ en niet-klassieke CD14dimCD16+ 6,9cellen. De klassieke CD14+CD16- monocyten bleken te zijn voornamelijk inflammatoire overwegende dat de pool van CD16+ monocyten bleken collectief te presenteren TIE2 meningsuiting en proangiogenic functie10. Consequent, endothelial cel stimulatie met inflammatoire cytokines zoals menselijke tumor necrose factor (TNF) α of Interleukine (IL-1) beta (conventionele ontsteking) is voldoende om te leiden tot de volledige aanwerving van klassieke CD14+CD16 - de monocyten. Gelijktijdige acties van vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) A en TNFα (angiogenic factoren gestuurde ontsteking) zijn echter vereist om te provoceren de transmigratie van de CD16+ proangiogenic pool van monocyten3. In het verleden het traditionele systeem van de Transwell onder statische omstandigheden, de parallelle plaat stroom zaal en de µ-dia stroom kamers zijn gebruikt om het kwantitatief analyseren de aanwerving van een leukocyte bevolking op een tijd in vitro11 ,12,13. Terwijl deze protocollen zijn gevalideerd, een meer robuuste methode waardoor de gelijktijdige analyse van meerdere monocyt subpopulaties zou worden beschouwd als meer inzicht. Dergelijke methodologieën moeten rekening voor meerdere interacties en de verschillende frequenties van elke respectieve bevolking en bieden ook een mechanistische inzicht in de gelijkenissen en de specifieke kenmerken voor de aanwerving cascades die elke monocyt bepalen subset.

Hier presenteren we een methode gebaseerd op de time-lapse beeldvorming van monocyt recruitment onder stroom waarmee de trekkende cascades van verschillende monocyt subpopulaties gelijktijdig worden bestudeerd met behulp van de confocal microscopie. Deze methode integreert bepaalde kritische features die endothelial cel ontsteking, evenals de hemodynamica van circulerende monocyten in post capillaire venules, de hoofdlocatie van leukocyten aanwerving in vivo na te bootsen. De voorgestelde methode maakt gebruik van menselijke navelstreng ader endotheliale cellen (HUVEC), die worden gegenereerd door een goed gangbaar protocol van isolatie van menselijke umbilical koorden. Deze klinische resource heeft het voordeel dat ze gemakkelijk beschikbaar als biologische bijproduct, terwijl ook het verstrekken van een redelijk rendement van endotheliale cellen die geïsoleerd uit de navelstreng ader worden kunnen. Wij ook gebruikt fluorescente kleurstoffen en immunofluorescentie onderscheid maken tussen de verschillende cellulaire componenten, en confocale microscopie ondubbelzinnig definiëren monocyt positionering (luminal vs. abluminal) na verloop van tijd. Het hier gepresenteerde protocol heeft ontwikkeld om tegelijkertijd maatregel de zielsverhuizing niveaus van monocyt subpopulaties. Bovendien moet worden opgemerkt dat deze methode kan worden uitgebreid om te bestuderen van andere leukocyten subpopulaties en recruitment processen door gebruik van verschillende biomerkers en etikettering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Menselijke materialen werden gebruikt met de geïnformeerde toestemming van vrijwillige donoren en in overeenstemming met de Zwitserse ethische comités op klinisch onderzoek.

1. isolatie en invriezen van menselijke navelstreng ader endotheliale cellen (HUVEC)

  1. Voeg 5 mL van coating oplossing in een maatkolf van T75 (0,1 mg/mL collageen G en 0,2% gelatine in fosfaatgebufferde zoutoplossing PBS met een pH van 7,4) gedurende 30 minuten bij 37 ° C voordat de HUVEC isolatie.
  2. Het snoer met PBS reinigen, veeg het met steriele kompressen, en plaatst u deze in een steriele 20 cm petrischaal. Snijd de uiteinden van het koord met een steriele schaar.
  3. Identificeer de één grote ader en de twee kleine slagaders. Zachtjes invoegen een canule met een drie-weg-afsluiter die eraan verbonden zijn in de extremiteiten van de ader aan de uiteinden van het koord.
  4. Draai het snoer en de verbinding van de canule stevig met een lengte van de draad.
  5. Perfuse het snoer tweemaal met 20 mL van RPMI medium met 100 U/mL penicilline, 100 U/mL streptomycine en 250 ng/mL amfotericine B te wassen aan het snoer van aderen. Dit proces maakt de verschijning van het snoer witter en helderder. Leeg de ader vóór collagenase toevoeging door het verzamelen van de RPMI met een spuit aan het ene uiteinde.
  6. De ader met 12 mL 1 mg/mL collagenase soort perfuse ik (0,22 µm-gefilterd).
  7. Sluit de afsluiter op het snoer eindigt en Incubeer bij 37 ° C gedurende 12 minuten aan het snoer.
  8. Zachtjes masseren aan het snoer als u wilt loskoppelen van de endotheliale cellen van de ader lumen.
  9. Neem 30 mL van RPMI met foetaal kalfsserum van 10% met een 50 mL injectiespuit en sluit deze aan één uiteinde van de navelstreng.
  10. Een lege 50 mL-spuit verbinden met het andere uiteinde van de navelstreng
  11. Open de afsluiter en perfuse van de ader van de ene kant terwijl samengebouwd verzamelen vanaf het andere einde.
    Opmerking: De verzamelde schorsing bevat endotheliale cellen.
  12. Centrifugeer deze celsuspensie bij 200 x g gedurende 5 min.
  13. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel met volledige M199 medium (M199 met 20% FCS, 15 µg/mL endothelial celgroei voedingssupplementen, 100 µg/mL heparine natrium, 0,5 µM hydrocortison, 10 µg/mL L-ascorbinezuur, 100 U/mL penicilline, 100 U/mL 10 mL streptomycine en 250 ng/mL amfotericine B).
  14. De coating oplossing uit de maatkolf T75 verwijderen en spoel één keer met PBS.
  15. Zaad de cellen verzameld uit stap 1.13 in de maatkolf van T75 en plaats deze in de incubator bij 37 ° C met 5% CO2.
  16. De volgende dag, spoel de kolf 3 keer met het volledige M199 medium te verwijderen van de resterende rode bloedcellen en wijzig het medium om de 2 dagen tot de samenvloeiing.
  17. Bij 80-90% samenvloeiing, spoel de HUVEC enkelgelaagde eenmaal met 5 mL PBS en loskoppelen van de cellen met 5 mL 0,05% trypsine in 1 mM EDTA bij 37 ° C gedurende 5 min. Voeg 4 mL van M199 en 1 mL FCS om de trypsine actie te stoppen. Spoel de kolf als u wilt loskoppelen van alle HUVEC.
  18. Het verzamelen van een aliquoot deel van 50 µL te worden gebruikt voor de kleuring van VE-cadherine, PECAM-1 en gp38, en te analyseren door stroom cytometry te controleren HUVEC zuiverheid.
  19. De rest van HUVEC verzamelen vanaf stap 1.18 in een tube van 15 mL en centrifuge bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  20. Verwijder het supernatant uit stap 1.19 resuspendeer de pellet van de cel in de bevriezing van de oplossing (FCS met 10% DMSO) bij een dichtheid van 5 x 105 cellen/mL in cryotubes en bevriezen bij-80 ° C of in vloeibare stikstof tot gebruik.
  21. HUVEC zuiverheid te controleren:
    1. Voeg 1 µL van anti-menselijke VE-cadherine-FITC antilichaam, 1 µL van anti-menselijke PECAM1-PE antilichaam en 1 µL van anti-menselijke Podoplanin-APC antilichaam aan de hoeveelheid 50 µL van HUVEC verzameld bij stap 1.18.
    2. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
    3. Voeg 100 µL van PBS en centrifuge bij 400 x g gedurende 30 s.
    4. Verwijder het supernatant en resuspendeer in 100 µL van PBS. Gegevens kunnen nu worden verworven door stroom cytometry technieken.
      Opmerking: HUVEC positief zijn voor VE-cadherine en PECAM-1, en negatief voor de Podoplanin.

2. HUVEC ontdooiing

Opmerking: Gebruik HUVEC bij lage passage voor experimenten (maximaal 5 passages).

  1. Jas een T75 kolf met 1 mL van de oplossing van de coating bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
  2. Snel HUVEC deblokkeren bij 37 ° C gedurende 2 minuten en resuspendeer de cellen in 10 mL van volledige M199.
  3. Centrifugeer de cellen bij 200 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
  4. Resuspendeer de pellet cel in 10 mL van volledige M199.
  5. Spoel de celsuspensie in de kolf van vooraf gecoat. Plaats de kolf in de incubator bij 37 ° C met 5% CO2. Wijzig het kweekmedium cel om de 2 dagen.

3. HUVEC cultuur in 0.4 µ-dia zaal

  1. Vijf dagen voordat het experiment van de doorstroming, jas vooraf de kamers van een 0.4 µ-dia met 30 µL van PBS 0,1 mg/mL collageen G, 0,2% gelatine bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
  2. De kamers met 100 µL van PBS wassen.
  3. Loskoppelen van de cellen van een 80-90% confluente HUVEC van een T75 kolf.
  4. HUVEC met 5 mL PBS afspoelen en los ze met 5 mL 0,05% trypsine bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
  5. Spoelen en verzamelen van de celsuspensie in volledige M199 en de cellen tellen met de meest geschikte methode. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Resuspendeer de pellet cel bij 106 cellen/mL en distribueren van 30 µL (30.000 cellen) per kamer.
  7. Incubeer de cellen in een incubator bij 37 ° C met 5% CO2 voor 1 h.
  8. Voeg 150 µL van volledige M199 aan elke kamer en cultuur van de cellen voor 5 dagen in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2. Wijzig het medium om de 2 dagen.

4. HUVEC kleuring voor monocyt Recruitment Assay onder stroom

  1. Bereiden de labeling drager dan ook gemaakt van M199 en 1 µM van CMFDA (5-chloromethylfluorescein DIACETAAT) en warm het bij 37 ° C gedurende 5 minuten voordat het labelen van de cel.
  2. Wassen HUVEC twee keer met M199 medium opgewarmd bij 37 ° C.
  3. Vervangen van het medium met 30 µL van verwarmde labeling medium met 1 µM van CMFDA en plaats in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 10 minuten.
  4. Een keer wassen met volledige M199 en Incubeer de cellen met volledige M199 in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 30 minuten.
    Opmerking: Het is belangrijk om alle sporen van serum vóór toevoeging van de labeling oplossing te verwijderen, anders het kan veranderen HUVEC kleuring.
  5. Vervangen van het medium met volledige M199 met beide menselijke TNFα (500 U/mL) of een combinatie van menselijke TNFα (500 U/mL) met menselijke VEGFA (1 µg/mL) gedurende 6 uur in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2.

5. isolatie van menselijke Pan monocyten en vlekken van subpopulaties

  1. Een buffy coat van geconcentreerde menselijk bloed, óf gebruiken 20 mL vers geïsoleerd menselijk bloed, verzameld op de dag van het experiment in EDTA vacutainer buizen.
  2. Verdun het bloed in PBS-1 mM EDTA (1:1) en Pipetteer voorzichtig 20 mL van de verdunde bloed op de top van de 20 mL van de kleurovergang media dichtheid. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met langzame acceleratie en zonder rem.
  3. Verzamelen van de perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC)-bloedplaatjes laag (tussen dichtheid kleurovergang media en plasma lagen) in een nieuwe tube van 50 mL met 40 mL PBS - 1 mM EDTA. Top tot 50 mL met PBS - 1 mM EDTA.
  4. Centrifugeer bij 200 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Verwijder het supernatant.
  5. Resuspendeer de pellet cel met 10 mL kleuring buffer (PBS - 1 mM EDTA met 0,5% bovien serumalbumine BSA).
  6. Centrifugeer bij 200 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Verwijder het supernatant.
  7. Herhaal stap 5.5 en 5.6.
  8. Resuspendeer de pellet cel met 10 mL buffer kleuring. Neem een aliquoot deel van 10 µL voor een cel tellen.
  9. Controleer PBMC populaties en cellen snel met een stroom-cytometer tellen.
    Opmerking: De karakteristieke lymfocyt en monocyt populaties kunnen worden waargenomen (figuur 1A). Van 50 mL vers bloed verwachten over 50-100 x 106 PBMC.
  10. Voor de aanwerving van CD14 + versus CD14-PBMC onder stroom:
    1. Wassen van de pellet driemaal met stroom buffer (M199 met 0,5% BSA) en resuspendeer de mononucleaire cellen in stroom buffer op 6 x 106 cellen per mL.
    2. Zorg aliquots van 200 µL voor elke assay. Incubeer bij 37 ° C tot 20 min voor de bepaling.
    3. 5 µL van anti-CD14-PE en Hoechst 33342 op een eindconcentratie van 2 µM aan elk aliquot toevoegen. Meng en Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
    4. Centrifugeer het afgepipetteerde deel bij 400 x g gedurende 30 s.
    5. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet met 200 µL van stroom buffer.
  11. Voor de aanwerving van monocyt subpopulaties onder stroom:
    1. Isoleren monocyten met een pan monocyt isolatie kit volgens de instructies van de fabrikant.
      Opmerking: Het volgende protocol van de isolatie is voor 50 x 106 cellen. Het kan worden geschaald omhoog of omlaag zolang het binnen de aanbevelingen van de fabrikant.
    2. Centrifugeer de PBMC schorsing bij 200 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
    3. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet met 400 µL van kleuring van de buffer.
    4. Voeg 50 µL van Fc-receptor blokkerende reagens en 50 µL van Pan monocyt antilichaam cocktail.
    5. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
    6. Voeg 400 µL van kleuring buffer en 100 µL van magnetische kralen geconjugeerd anti-Biotine antilichaam. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
    7. Voeg toe 2 mL kleuring buffer en een kolom van de MACS LS in combinatie met een magneet te gebruiken.
    8. Plaats van de kolom van LS op de magneet en voeg 1 mL buffer kleuring. Gooi de doorstroming.
    9. Passeren de PBMC schorsing in de kolom en verzamel de duidelijke stroom al die pan monocyten in een nieuwe tube van 15 mL bevatten.
    10. Voeg de kleuring buffer naar boven tot 5 mL.
    11. Doe een aliquoot gedeelte en de kwaliteit van de monocyt isolatie met een cytometer van de stroom.
    12. Bepaal de pan monocyt telling.
      Opmerking: Alleen monocyt bevolking kan worden waargenomen (figuur 1B).
    13. Centrifugeer het restant van de monocyten uit stap 5.11.11 bij 200 x g gedurende 5 min.
    14. Verwijder het supernatant.
    15. Resuspendeer de pellet cel in 5 mL stroom buffer (M199 met 0,5% BSA).
    16. Herhaal de 5.11.13 aan de 5.11.14 tweemaal te elimineren elk spoor van EDTA.
  12. Maak monocyt schorsing in stroom (M199 met 0,5% BSA) bij 6 x 106 cellen/mL buffer.
  13. Zorg aliquots van 200 µL van monocyten voor elke aanwerving assay.
  14. Houd het afgepipetteerde deel bij 37 ° C in de incubator tot 20 min vóór injectie.
  15. 5 µL van anti-CD16-PE antilichaam en Hoechst 33342 (laatste 2 µM) aan elk aliquot toevoegen.
  16. Meng en Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
  17. Centrifugeer het afgepipetteerde deel bij 400 x g gedurende 30 s.
  18. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet met 250 µL van stroom buffer.
  19. Voeg 30 µL van de monocyt schorsing in één kamer van de dia om te dienen voor het instellen van de parameters van de overname op de confocal microscoop.
  20. De aliquots van monocyt schorsing behoeden voor stap 5.18 bij 37 ° C.
    Opmerking: Deze opschorting is klaar om te worden geïnjecteerd in de stroomsysteem.

6. bereiding van het Fluidic systeem

  1. Zorgen dat de cel incubator voor de imaging ingesteld op 37 ° C.
    Opmerking: Een diagram van de stroomsysteem is afgebeeld in Figuur 2.
  2. Monteren van de buis-deel I: invoegen een Luer connector male naar één uiteinde van een stuk van silicone slangen (8 cm lang en 3 mm dik) en sluit het andere uiteinde op een in-line Luer injectie set. De laatste Luer aansluiting verbinden met een stuk van Siliconen slang (40 cm en 3 mm dik) aan het ene uiteinde.
    Opmerking: Optioneel, kan een 3-weg kraan aangesloten op een 5 mL-spuit worden ingevoegd tussen de in-line Luer injectie set en het silicone slangen voor eventuele lucht zeepbel verwijdering.
  3. Monteren van de buis-deel II: een 20 mL spuit verbinden met één uiteinde van een lengte van silicone slangen (1 m lang en 3 mm dik). Plaats een Luer connector male naar het andere uiteinde van de buis.
  4. Verbinding maken met deel I en deel II buizen door het invoegen van de Luer aansluiting mannetjes om een Luer lock vrouwelijk (figuur 2A).
  5. Zet het vrije uiteinde van de slang silicone in het reservoir met de stroom buffer (M199 + 0.5% BSA) opgewarmd bij 37 ° C.
  6. Trek op de zuiger van de spuit van 20 mL te vullen van de buis met stroom buffer.
  7. Plaats de injectiespuit op de pomp en veilig.
  8. Instellen van de pomp in trekken modus (als tegenstelling tot Infundeer) en geef het debiet.
  9. Het bepalen van de stroomsnelheid volgens de IBIDI-dia met behulp van de volgende formule gebruikt:
    Equation
    Opmerking: De dia factor is afhankelijk van de dia van de IBIDI voor het experiment gebruikt. Voor de µ-dia ik0.4 Luer lock gebruikt in dit voorbeeld wordt de dia factor is 131.6. Zie voor specifieke dia de factoren, het bedrijf website14. De viscositeit van de buffer stroom is 0.0072 dyn.s/cm2. Shear stress op de post capillaire venules is ongeveer 0,5 dyn/cm2.
  10. Sluit de dia (figuur 2B):
    1. De silicone slangen rond het vrouwelijk Luer Lock klem en de twee Luer aansluiting mannetjes verbreken het voorste koppelingsvlak.
    2. De reservoirs van de dia met gestimuleerd HUVEC en opvulling met medium moet aansluiten. Luchtbellen vermijden tijdens deze stap.
    3. Opstijgen van de klemmen en ervoor te zorgen dat de verbinding niet lekt.
  11. Plaats de dia onder de Microscoop voor time-lapse beeldvorming en start van de pomp.

7. time-lapse beeldvorming van monocyt Recruitment onder stroom door confocale microscopie

  1. Gebruik van een 40 x doelstelling (Zie Tabel of Materials) voor imaging.
  2. Activeren van de 405 nm (blauw monocyt kernen), 488 nm (groen endotheliale cellen) en 561 nm (rood CD16 + subset) lasers.
  3. Gebruik de kamer waarin de monocyten als u wilt instellen van de parameters van de overname.
    Opmerking: Het gaatje en de intensiteit van de laser 405 nm, zijn voor het detecteren van zowel niet-transmigrated en transmigrated monocyten, hoog ingesteld. Dus, niet-transmigrated monocyten zijn licht zichtbaar in het basale plan. Echter enige transmigrated monocyten presenteren een onbevlekt gebied rond de kern die overeenkomt met de nieuwe ruimte die wordt ingenomen onder endotheliale cellen.
  4. Plaats de kamer aan te schaffen onder de Microscoop.
  5. Kies 3 velden gedachtewisseling binnen straal van 1 cm voor multi-positie confocal imaging.
  6. Definiëren van de basale en de apicale zijde van endotheliale cellen
  7. Het instellen van een z-stack op de 10 – 12 µm bereik (0,5 µm stap). Stormloop een time-lapse aanwinst om 1 min.
  8. Na 3 min voor imaging, injecteren 200 µL van monocyt schorsing (6 x 106 cellen/mL) via de in-line Luer injectie poort.
    Opmerking: Snel monocyten verschijnen in de apicale brandvlak, houden en starten van transmigratie (transit van de apicale aan het basale plan).
  9. Afbeelding voor minstens 30 min. Zodra gebeëindigd, stoppen met imaging en stoppen van de stroom. Klem de buis om hen te verbreken van de dia.
  10. Het herstellen van de dia met de 4% paraformaldehyde bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
  11. Wassen van de dia met PBS en sla de dia bij 4 ° C voor verdere analyse indien nodig.

8. het analyseren van de gegevens met ImageJ

  1. Het aantal totale aanhangend monocyten in elk veld. Het bepalen van het aantal cellen per mm2.
  2. Rekenen transmigrated monocyten die aanwezig in het basale plan onder endotheliale cellen en geïdentificeerd door de aanwezigheid van een zwart gat (in het groene kanaal) rond de kern zijn.
  3. Verdeel de graaf van transmigrated leukocyten door het totale aantal aanhangend leukocyten. De transmigratie tarief wordt gepresenteerd als een percentage van aanhangend monocyten.
  4. Ter illustratie, kunnen het apicale en de basale partners worden aangetoond gelijktijdig ter illustratie van de gebeurtenissen in elk van deze endothelial compartimenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vaststelling van de staat van de activering van de HUVEC veroorzaakt door TNFα

De bio-activiteit van de inflammatoire cytokine TNFα kan worden afhankelijk van de partij en de herverpakking van bevriezen-ontdooien cyclus. Het is belangrijk om te controleren van de status van de activering van HUVEC met TNFα behandeling. Dit kon worden uitgevoerd door kleuring parallel enkele monsters van confluente HUVEC voor de inflammatoire inductie van selectinen, ICAM-1 en VCAM-115,16,17. Een gemakkelijker en eenvoudiger manier om te controleren van de status van de activering van HUVEC na TNFα behandeling is de morfologische verandering weergegeven door endotheliale cellen onder inflammatoire stress. Zoals blijkt uit Figuur 3, elongate HUVEC na 6 uur in aanwezigheid van TNFα ten opzichte van ongestimuleerde cellen. Soortgelijke rek wordt waargenomen wanneer HUVECs worden gestimuleerd door een mix van TNFα en VEGFA. Opnemen van de status van de activering van de HUVEC is belangrijk omdat de eindresultaten van de transmigratie van monocyten van de kwaliteit van endothelial cel activatie afhangen zal.

Monocyt transmigratie maakt een karakteristiek stopzetting in de endotheliale cellen

Studeren monocyt transmigratie onder stroom, gebruikten we confocale microscopie met endotheliale cellen gekleurd in groen met CMFDA en de kernen van geïsoleerde monocyten gekleurd in blauw met de cel-permeabele Hoechst 33342 kleurstof (Figuur 4). De time-lapse confocal beeldvorming toegestaan de visualisatie van monocyten in de apicale vliegtuig, waar hun fenotype kon worden beoordeeld (figuur 4A-C, aanvullende film 1). Migreren cellen ondergaan van transmigratie verhuisde naar de intercellulaire ruimte overeenkomt met cel-cel kruispunten voordat ze uit het apicale vliegtuig verdwenen en in de basale vlak verscheen. De transmigrated cellen gepresenteerd een zwart gat rond de kern die overeenkomen met de shapes monocyt. Deze shape voortdurend gewijzigd tijdens monocyt migratie onder endotheliale cellen (figuur 4A-C, aanvullende films 2-3). Dit dynamische zwarte gat gemaakt door het lichaam monocyt onder de endotheliale cellen, en de monocyt positionering, toegestaan voor de ondubbelzinnige identificatie van transmigrated cellen. Kwantificatie van monocyt werving na verloop van tijd bleek monocyt hechting gevolgd door transmigratie (Figuur 4 d-E). Hoewel leukocyten door zowel de transcellulair als de paracellular routes extravasate kunnen, kon alleen zien we de paracellular transmigratie onder stroom met deze methode. Dit is in overeenstemming met onze eerdere waarnemingen3,11,18,19.

Angiogenic factor gedreven ontsteking bevordert de transmigratie van CD16 + monocyten

We geanalyseerd met behulp van deze methode, de transmigratie van menselijke proangiogenic versus de monocyten van de niet-angiogenic via een endothelial enkelgelaagde gestimuleerd door de inflammatoire cytokine TNFα alleen of in combinatie met de angiogenic factor VEGFA. Menselijke proangiogenic monocyten kunnen worden geïdentificeerd door de uitdrukking van CD16 of TIE2 op hun oppervlak. Hier werd de anti-CD16-PE antilichaam gebruikt te discrimineren tussen pro - en niet-angiogenic monocyten. Zoals aangegeven in figuur 5A-B (aanvullende films 4-5), de transmigratie tarief van CD16+ monocyten was laag wanneer endotheliale cellen werden gestimuleerd met TNFα alleen. Echter dit percentage verhoogd wanneer endotheliale cellen tegelijk werden gestimuleerd met TNFα en VEGFA (figuur 5C-E, aanvullende films 6-7). Het tarief van de transmigratie van niet-angiogenic monocyten was ook hoog onder beide inflammatoire voorwaarden. De transmigratie voorgedaan voor beide cel subpopulaties, uitsluitend via de paracellular-route. Deze methode daarom voorziet de zielsverhuizing aptitudes van verschillende monocytic bevolking tegelijkertijd worden onderzocht.

De zuiverheid van monocyten is van invloed op de efficiëntie van transmigratie

De perifere bloed mononucleaire cellen zijn samengesteld uit de T-cellen, monocyten, B-cellen en NK-cellen. De hier gebruikte methode voor de isolatie van monocyt vereist de uitputting van de andere leukocyten populaties van PBMC. Om te begrijpen hoe het gebrek aan monocyt zuiverheid van invloed is op de resultaten, we PBMCs gebruikt en gekleurd voor pan-monocyten met een anti-CD14-PE-antilichaam voor het uitvoeren van de bepaling van de recruitment onder stroom. Zoals aangegeven in Figuur 6, geïnduceerde HUVEC stimulatie met TNFα of TNFα + VEGFA de transmigratie van alleen de monocyt bevolking. De andere leukocyten samengesteld van T-cellen, B-cellen en NK cellen niet onder TNFα of TNFα + VEGFA transmigrate. Het is inderdaad gedocumenteerd dat deze leukocyten andere signalen voor transmigratie moeten. Dus, een inefficiënte Isolatievan monocyten zal leiden tot een onderschatting van de monocyt zielsverhuizing, zoals de andere leukocyten als monocyten zou worden geteld. Dit zou leiden tot een foutief resultaat op monocyt zielsverhuizing, als gevolg van de besmetting van monocyt bevolking met andere leukocyten.

Figure 1
Figuur 1: profilering van geïsoleerde monocyten door stroom cytometry. (A) analyse van de morfologie van PBMC voordat lymfocyt uitputting. De grootte (forward scatter: FSC) en granulariteit (kant scatter: SSC) van perifere bloed mononucleaire cellen door stroom cytometry werden bepaald. (B) de grootte en de granulariteit van geïsoleerde monocyten werden bepaald door stroom cytometry na uitputting van de lymfocyt. Een efficiënte isolatie van monocyten toont een volledige uitputting van de lymfocyten bevolking. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Diagram van het fluidic systeem. (A) schematisch overzicht van de perfusie-systeem vóór en na de aansluiting van de glijbaan en montage op de spuitpomp. (B)-Diagram van het proces van het verbinden van de dia met de buis met behulp van klemmen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: controle van de efficiënte activering van endotheliale cellen. De activering van HUVEC door inflammatoire stimuli werd gecontroleerd door het analyseren van de vorm van de cel met fase contrast microscopie. Na 6 uur behandeling, HUVEC presenteren een langwerpige morfologie wanneer gestimuleerd met TNFα (500 U/mL) of een combinatie van TNFα (500 U/mL) + VEGFA (1 µg/mL) ten opzichte van ongestimuleerde cellen. Deze morfologische verandering van HUVEC na de inflammatoire stimulatie is gemakkelijk-aan-detect indicatie van de activering van de cel, die voor de bepaling van de stroom moet worden gewaarborgd. Schaal bar = 120 µm Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: identificatie van de transmigrated monocyten door confocale microscopie. (A)-Diagram van de monocyt zielsverhuizing met de verwachte uitzicht op apicale en basale vliegtuigen. De kernen van monocyten gekleurd met Hoechst 33342 zijn afgebeeld in het blauw, en de theoretische vormen van monocyten zijn afgebeeld met stippellijnen rond de kernen. In de basale weergave, worden de transmigrated plat monocyten te bezetten een ruimte onder endothelial cel weergegeven. Deze ruimte wordt weergegeven als een zwart gat rond de kern monocyt op confocal beelden. (B) lokalisatie van een monocyt vóór en na de zielsverhuizing. De orthogonale weergaven worden weergegeven, en het uiterlijk van een zwart gat (afgebakend met de witte onderbroken lijn) kan worden waargenomen na monocyt migratie naar het endotheel abluminal compartiment. Een rode pijl geeft de positie van een monocyt voordat zielsverhuizing en de witte pijlpunt geeft dezelfde cel na transmigratie. De orthogonale weergaven tonen aan dat de transmigrated monocyt onder de endothelial cel. Schaal bar = 40 µm. (C) Time-lapse beeldsequenties (van 0 tot 20 min) monocyt werving overuren. De apicale en basale weergaven worden weergegeven. De volledige sequenties kunnen worden gezien in aanvullende films 1, 2 en 3. Rode vierkantjes Markeer een transmigrated monocyt met een blauwe kern. Het zwarte gat dat overeenkomt met het plat lichaam van de monocyt onder de endothelial cel is afgebakend door een gele stippellijn. Schaal bar = 40 µm. (D) kwantificering van monocyt hechting op TNFα-gestimuleerd versus ongestimuleerde HUVEC na verloop van tijd. (E) kwantificering van monocyt transmigratie tarief na verloop van tijd. N = 3 biologische replicatieonderzoeken. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± S.D. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: gelijktijdige onderzoek van de transmigratie van monocyt subpopulaties onder stroom. (A) Time-lapse beeldsequenties (van 0 tot 20 min) van de aanwerving van proangiogenic monocyten (CD16+) en niet-angiogenic na verloop van tijd door HUVEC TNFα-geactiveerde monocyten. Schaal bar = 40 µm; de apicale en basale weergaven worden weergegeven. De volledige sequenties kunnen worden gezien in aanvullende film 4 voor apicale en aanvullende film 5 voor basale weergaven. (B) kwantificatie van de transmigratie van menselijke proangiogenic monocyten (HPMo: CD16 +) en niet-angiogenic van menselijke monocyten (HNMo) door een enkelgelaagde TNFα-geactiveerde HUVEC. N = 4 biologische replicaten, gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± S.D. * p < 0.05; Mann-Whitney test. (C) Time-lapse afbeelding sequenties (van 0 tot 20 min) van de aanwerving van proangiogenic en niet-angiogenic monocyten overuren door TNFα + VEGFA-geactiveerde HUVEC. Schaal bar = 40 µm; de apicale en basale weergaven worden weergegeven. De volledige sequenties kunnen worden gezien in aanvullende film 6 voor apicale en aanvullende film 7 voor basale weergaven. (D) kwantificatie van de transmigratie van menselijke proangiogenic monocyten (HPMo: CD16 +) en niet-angiogenic van menselijke monocyten (HNMo: CD16-) via TNFα + VEGFA-geactiveerde HUVEC enkelgelaagde. N = 4 biologische replicaten, gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± S.D. * p < 0.05; Mann-Whitney test. (E)+ -lokalisatie van CD16 monocyten vóór (10 min) en na (15 min) transmigratie door HUVEC TNFα + VEGFA-gestimuleerd. De orthogonale weergaven worden weergegeven. Schaal bar = 40 µm Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: Gelijktijdig onderzoek naar de transmigratie van CD14 + versus CD14 - PBMC onder stroom. (A) hechting van CD14+versus CD14- PBMC aan TNFα-geactiveerde HUVEC onder stroom. (B) hechting van CD14+versus CD14- PBMC aan TNFα + VEGFA-geactiveerde HUVEC onder stroom. (C) transmigratie maximalehartslag (%) van CD14+versus CD14- PBMC via TNFα-geactiveerde HUVEC onder stroom. (D) transmigratie maximalehartslag (%) van CD14+versus CD14- PBMC via TNFα + VEGFA-geactiveerde HUVEC onder stroom. Gegevens zijn gemiddelde ± S.D. N = 4 biologische replicatieonderzoeken. * p < 0.05; Mann-Whitney test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende film 1: uitzicht op het apicale vliegtuig van pan-monocyt recruitment onder stroom. Uitgebreide weergave van de aanwerving van pan monocyt onder stroom op het apicale vliegtuig. HUVEC werden gekleurd met CMFDA en de kernen van monocyten waren live-gekleurd met Hoechst 33342. Schaal bar = 50 µm Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Movie 2: uitzicht op de basale vliegtuig van pan-monocyt recruitment onder stroom. Uitgebreide weergave van de aanwerving van pan monocyt onder stroom op de basale vliegtuig. HUVEC werden gekleurd met CMFDA en de kernen van monocyten waren live-gekleurd met Hoechst 33342. Schaal bar = 50 µm Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Movie 3: maximale projectie van z-stacks van pan-monocyt recruitment onder stroom. Uitgebreide weergave van de aanwerving van pan monocyt onder stroom zoals in aanvullende films 1 en 2. HUVEC werden gekleurd met CMFDA en de kernen van monocyten waren live-gekleurd met Hoechst 33342. Schaal bar = 50 µm Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende film 4: uitzicht op het apicale vliegtuig van de aanwerving van monocyt subpopulaties aan TNFα-geactiveerd HUVEC. Uitgebreide weergave op het apicale vliegtuig van de gelijktijdige aanwerving van monocyt subpopulaties onder stroom aan TNFα-geactiveerde HUVEC onder stroom. HUVEC werden gekleurd met CMFDA en de kernen van monocyten waren live-gekleurd met Hoechst 33342. Menselijke proangiogenic monocyt subpopulaties werden geïdentificeerd door de oppervlakte uitdrukking van CD16. Schaal bar = 30 µm. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende film 5: uitzicht op de basale vliegtuig van de aanwerving van monocyt subpopulaties aan TNFα-geactiveerd HUVEC. Uitgebreide weergave, op de basale vliegtuig, van de gelijktijdige aanwerving van monocyt subpopulaties onder stroom aan TNFα-geactiveerde HUVEC onder stroom. HUVEC werden gekleurd met CMFDA en de kernen van monocyten waren live-gekleurd met Hoechst 33342. De menselijke proangiogenic monocyt (HPMo) subpopulatie werd ontdekt door de oppervlakte uitdrukking van CD16. Schaal bar = 30 µm. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Movie 6: uitzicht op het apicale vliegtuig van de aanwerving van monocyt subpopulaties aan TNFα+ VEGFA-geactiveerde HUVEC. Uitgebreide weergave, op het apicale vlak, van de gelijktijdige aanwerving van monocyt subpopulaties onder stroom aan TNFα + VEGFA-geactiveerde HUVEC onder stroom. HUVEC werden gekleurd met CMFDA en de kernen van monocyten waren live-gekleurd met Hoechst 33342. De menselijke proangiogenic monocyt subpopulatie werd ontdekt door de oppervlakte uitdrukking van CD16. Schaal bar = 30 µm Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende film 7: uitzicht op de basale vliegtuig van de aanwerving van monocyt subpopulaties aan TNFα+ VEGFA-geactiveerde HUVEC. Uitgebreide weergave, op de basale vliegtuig, van de gelijktijdige aanwerving van monocyt subpopulaties onder stroom aan TNFα + VEGFA-geactiveerde HUVEC onder stroom. HUVEC werden gekleurd met CMFDA en de kernen van monocyten waren live-gekleurd met Hoechst 33342. De menselijke proangiogenic monocyt (HPMo) subpopulatie werd ontdekt door de oppervlakte uitdrukking van CD16. Schaal bar = 30 µm Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Wij rapporteren hier, een methode die een studie van hoe monocyt subpopulaties via de ontstoken endothelial enkelgelaagde transmigrate detaillering. De besproken methode gebruikt confocale microscopie in plaats van fase contrast microscopie, die ook wordt gebruikt om te studeren monocyt recruitment onder stroom3,11,19. Een groot voordeel van het gebruik van de confocal microscopie voor time-lapse beeldvorming is de mogelijkheid om ondubbelzinnig onderscheid te maken tussen de zielsverhuizing en sterke hechting van monocyten. Hoewel de fase contrast microscopie gebaseerde methode ook robuuste is, vereist het expertise om te voorkomen dat het vermengen van transmigrated cellen en sterk Adherente cellen. In dit geval moet men om strikte criteria voor de beoordeling zodat een duidelijk verschil tussen deze twee landen van de monocyt werving cascade. Daarnaast is het ook belangrijk voor het uitvoeren van een analyse van het eindpunt door confocale microscopie om te bevestigen de wereldwijde trends waargenomen door de fase contrast-microscopie. Het directe gebruik van confocale microscopie te onderzoeken monocyt recruitment onder stroom biedt dus duidelijke resultaten op de werkelijke transmigratie status van gevangengenomen monocyten.

Een van de grote knelpunten bij de uitvoering van de leukocyten werving testen onder stroom en met behulp van een Microscoop fase contrast is de tijd die voor de analyses uit te voeren en het bijhouden van afzonderlijke cellen van opname naar transmigratie door de kruising van de cel. Automatisering van een dergelijke analyse is mogelijk maar moeilijk uit te voeren als gevolg van fase contrast gelijkenissen tussen verkennen en transmigrated monocyten. Hier laten we zien met behulp van de confocal microscopie dat monocyt transmigratie ging gepaard met een stopzetting van endothelial cel vlekken in het basale vlak overeenkomt met de vorm van de transmigrated monocyten onder HUVEC. Deze positie werd bevestigd door de orthogonale projectie. De overgang van monocyt lokalisatie heeft plaatsgevonden uitsluitend tussen cel kruispunten indicatief voor een paracellular transmigratie. Dit is in overeenstemming met onze eerdere gegevens, waaruit bleek dat onder stroom in vitro monocyten transmigrate uitsluitend via paracellular route met HUVEC3,18. Ter aanvulling van de voorgestelde methode hier, is het mogelijk om te gebruiken niet-blokkerende antilichamen tegen regulates proteïnen zoals VE-cadherine, jam of PECAM1 om de foto van de potentiële locaties van monocyt transmigratie (paracellular vs. transcellulair). Wij hebben bevestigd dat zwarte vormen rond de monocyt-kernen zijn robuuste kenmerkend voor transmigrated cellen en een eenvoudige gebeurtenis die opgespoord door software worden kan. Hoewel een handmatige cel tellen systeem is hier gedemonstreerd, is de vorming van de zwarte vorm rond de kern van de leukocyten een criterium dat kan worden gebruikt voor het definiëren van leukocyten transmigratie in geautomatiseerde analyse, waardoor het opslaan van een heleboel tijd. Wij werken momenteel aan een geautomatiseerde toepassing ontwikkelen voor een dergelijke analyse.

Fluorescentie en confocale microscopie werden voorheen gebruikt in de studie van leukocyten werving. Ze waren echter niet gewend aan het onderzoeken van de aanwerving van verschillende subpopulaties gelijktijdig. Hier stellen wij een modaliteit van het gebruik van de confocal microscopie te bestuderen van de aanwerving van leukocyten subtypen gelijktijdig in de dezelfde communicatie. We laten zien dat confocale microscopie kan worden gebruikt om te onderzoeken gelijktijdig de trekkende gedragingen van verschillende monocyt subpopulaties. Zo hebben we CD16 expressie te discrimineren tussen proangiogenic en niet-angiogenic monocyten te bestuderen van de capaciteit van de transmigratie van de twee subpopulaties in verschillende inflammatoire contexten gebruikt. Overeenstemming is met onze recente publicatie, door gebruik te maken van de modaliteit van de confocal microscopie, wij hebben aangetoond dat de snelheid van de transmigratie van CD16+ monocyten was lager wanneer de endothelial cel enkelgelaagde werd gestimuleerd alleen door TNFα3. Echter de combinatie van TNFα en VEGFA geleid tot een toename van de transmigratie van proangiogenic monocyten. Het tarief van de transmigratie was ook hoog voor niet-angiogenic CD16- monocyten onder beide inflammatoire voorwaarden. Wij hebben eerder aangetoond dat monocyt kleuring met het anti-CD16 antilichaam niet presenteren significant effect op de zielsverhuizing, bevestigt dit door de analyse van labelloze monocyten na de zielsverhuizing assay, met behulp van de confocal microscopie3. Voor nieuwe leukocyte subtypen of antilichamen, gebruikt ter gelegenheid van hen, moet het labeling effect echter worden beoordeeld. Met behulp van deze methode, kunnen tot drie verschillende populaties van leukocyten gelijktijdig bestudeerd worden. Dit zou subpopulaties die functioneel gescheiden of soortgelijke immuun celtypes. Weliswaar de nadruk ligt hier op monocyt zielsverhuizing, kunnen ook andere stappen van hun aanwerving door deze methode, met inbegrip van cel gedrag voordat zielsverhuizing, zoals voor het vastleggen en migrational directionaliteit worden geanalyseerd. Na transmigratie evenementen zoals abluminal retentie- en omgekeerde transmigratie kunnen ook worden onderzocht voor verschillende leukocyten populaties, als verlengstuk van deze methode. Een beperking is de slechte opsporing van de kleuring in het far-red kanaal in time-lapse imaging, evenals sommige surplusclaim van de fluorescentie-signalen die de z-stack resolutie reduceert. Dit was vooral gerelateerd aan het instrument gebruikt voor confocal imaging. Het gebruik van beeld deconvolutie kan uiteindelijk bijdragen tot verbetering van de kwaliteit van de afbeelding en toestaan verdere analyse van de verschillende stappen van de leukocyten aanwerving.

Studeren leukocyte recruitment onder optimale omstandigheden, is het belangrijk om te controleren van de status van de activering van de enkelgelaagde endothelial cel. Inderdaad, een gebrekkige activering van endotheliale cellen leidt tot een wereldwijde vermindering van monocyt hechting en transmigratie. Endothelial cel activatie kan worden gecontroleerd door het analyseren van het niveau van de expressie van celadhesie-moleculen op endothelial celoppervlak zoals ICAM1 en VCAM1. Het niveau van deze hechting moleculen moeten worden verhoogd ten opzichte van ongestimuleerde endotheliale cellen. Als geen verandering in deze endothelial celadhesie-moleculen worden opgespoord is, de gekweekte HUVEC kan worden beschouwd als niet geactiveerd. Beoordeling van het niveau van de expressie van celadhesie-moleculen kan vormen een goede kwantitatieve controle tussen verschillende experimenten met de dezelfde batch van HUVEC. Het niveau van de expressie van deze celadhesie-moleculen kan echter ook verschillen tussen verschillende primaire cultuur van endotheliale cellen beperking van de behandeling van een wereldwijde drempel van ICAM1 of VCAM1. De verandering in de vorm van de endotheliale cellen van de macrovascular zoals HUVEC is ook een goede indicator van hun activering. Deze laatste wijziging in fenotype kan een snelle en kwalitatieve evaluatie van de activering van de HUVEC. De analyse van celadhesie-moleculen kunnen echter een betere keuze voor microvasculaire cellen die grote vormverandering na activatie met inflammatoire cytokines niet weergeven.

Voor mechanistische studies, kunnen relevante negatieve controles van de monocyt zielsverhuizing worden uitgevoerd met behulp van antilichamen tegen endothelial celadhesie-moleculen zoals ICAM1, VCAM1 of op leukocyten oppervlak zoals Leukocyte functie-geassocieerde antigeen (LFA) -1. Het gebruik van een relevante negatieve controle is essentieel voor dergelijke mechanistische studie in monocyten omdat ze express Fc-receptoren op hun cel oppervlakken. De zuiverheid van monocyten na isolatie is ook belangrijk, om te voorkomen dat besmetting met andere populaties leukocyten en een onderschatting van het tarief van de monocyt zielsverhuizing. Een andere belangrijke parameter is de temperatuur, die moet worden ingesteld bij 37 ° C gedurende alle de testen om ervoor te zorgen dat alle experimentele waarnemingen zijn relevant en vertalen dienovereenkomstig aan menselijke in vivo cel mensenhandel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Wij danken Dr. Paul Bradfield voor manuscript lezen en feedback. A. S. kreeg financiële steun van de Sir Jules Thorn charitatieve overzeese vertrouwen Reg.,

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Culture Flasks 75 cm2 TPP 90076 Routine culture of isolated HUVEC
µ-Slide VI 0.4 IBIDI 80606
Centrifuge Tubes 15 mL TPP 191015
Centrifuge Tubes 50 mL TPP 191050
Collagen G Biochrom L 7213 For coating of cell culture flasks
Gelatin Sigma-Aldrich 1393 For coating of cell culture flasks
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) Sigma-Aldrich D8537
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) Sigma-Aldrich D8662
RPMI-1640 Medium Sigma-Aldrich R8758
3-Way Stopcocks BIO-RAD 7328103
penicillin 10,000 μ/mL streptomycine 10,000 μg/mL fungizone 25 μ/mL AMIMED 4-02F00-H
Collagenase type 1 Worthington LS004216
Medium 199 1x avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes GIBCO 22340020
Bovine Albumin Fraction V ThermoFisher 15260037
Endothelial Cell Growth Supplement, 150 mg Millipore 02-102
Heparin Sodium Sigma-Aldrich H3149RT
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H6909
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich A 4544
EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O APPLICHEM A2937.0500
CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC Miltenyi Biotech 130-100-713 AB_2655150
CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE Miltenyi Biotech 130-110-807 AB_2657280
Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC Miltenyi Biotech 130-107-016 AB_2653263
BD Accuri C6 Plus BD Bioscience
µ-Slide I Luer IBIDI 80176
CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) ThermoFisher C2925
Recombinant human TNFα Peprotech 300-01A
Recombinant human VEGFA Peprotech 100-20
NE-1000 Programmable Syringe Pump KF Technology NE-1000
Ficoll Paque Plus GE Healthcare 17-1440-02
Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE Miltenyi Biotech 130-110-519 AB_2655051
Pan Monocyte Isolation Kit, human Miltenyi Biotech 130-096-537
Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE Miltenyi Biotech 130-106-762 AB_2655403
LS columns Miltenyi Biotech 130-042-401
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotech 130-090-976
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate ThermoFisher H1399
Silicone tubing IBIDI 10841
Elbow Luer Connector IBIDI 10802
Female Luer Lock Coupler IBIDI 10823
Luer Lock Connector Female IBIDI 10825
In-line Luer Injection Port IBIDI 10820
Ar1 confocal microscope Nikon
40x objective Nikon 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm
ImageJ Software NIH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Auffray, C., Sieweke, M. H., Geissmann, F. Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells. Annual Review of Immunology. 27 (1), 669-692 (2009).
  2. De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C., Naldini, L. Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 9 (6), 789-795 (2003).
  3. Sidibe, A., et al. Angiogenic factor-driven inflammation promotes extravasation of human proangiogenic monocytes to tumours. Nature Communications. 9 (1), 355 (2018).
  4. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Review Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
  5. Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte Migration into Inflamed Tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
  6. Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33 (3), 375-386 (2010).
  7. Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity. 19 (1), 71-82 (2003).
  8. Chamorro, S., et al. In vitro differentiation of porcine blood CD163− and CD163+ monocytes into functional dendritic cells. Immunobiology. 209 (1-2), 57-65 (2004).
  9. Passlick, B., Flieger, D., Ziegler-Heitbrock, H. Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood. Blood. 74 (7), (1989).
  10. Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
  11. Bradfield, P. F., et al. JAM-C regulates unidirectional monocyte transendothelial migration in inflammation. Blood. 110 (7), 2545-2555 (2007).
  12. Schenkel, A. R., Mamdouh, Z., Muller, W. A. Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation. Nature Immunology. 5 (4), 393-400 (2004).
  13. Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Kinetics of the different steps during neutrophil migration through cultured endothelial monolayers treated with tumour necrosis factor-alpha. Journal Vascular Research. 36 (6), 477-485 (1999).
  14. ibidi GmbH. Shear Stress and Shear Rates for ibidi µ-Slides - Based on Numerical Calculations. , (2014).
  15. Yang, L., Froio, R. M., Sciuto, T. E., Dvorak, A. M., Alon, R., Luscinskas, F. W. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
  16. Yang, C. -R., Hsieh, S. -L., Ho, F. -M., Lin, W. -W. Decoy receptor 3 increases monocyte adhesion to endothelial cells via NF-kappa B-dependent up-regulation of intercellular adhesion molecule-1, VCAM-1, and IL-8 expression. Journal of Immunology. 174 (3), Baltimore, Md. 1647-1656 (2005).
  17. Wong, D., Dorovini-Zis, K. Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture. Microvascular Research. 49 (3), 325-339 (1995).
  18. Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
  19. Bradfield, P. F., et al. Divergent JAM-C Expression Accelerates Monocyte-Derived Cell Exit from Atherosclerotic Plaques. PLoS One. 11 (7), e0159679 (2016).

Tags

Immunologie en infecties probleem 141 leukocyten mensenhandel monocyt werving ontsteking timelapse imaging confocal microscopie hechting zielsverhuizing monocyt subpopulaties chemokines integrins celadhesie-moleculen
Gelijktijdige studie van de aanwerving van monocyt subpopulaties onder stroom In Vitro
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ropraz, P., Imhof, B. A., Matthes,… More

Ropraz, P., Imhof, B. A., Matthes, T., Wehrle-Haller, B., Sidibé, A. Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro. J. Vis. Exp. (141), e58509, doi:10.3791/58509 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter