Summary
Här presenterar vi ett integrerat protokoll som mäter monocyt subpopulation människohandel under flöde in vitro-användning av specifika yta markörer och confocal fluorescensmikroskopi. Detta protokoll kan användas för att utforska sekventiell rekrytering steg samt för att profilera andra leukocyt subtyper med andra specifika yta markörer.
Abstract
Rekrytering av monocyter från blodet till riktade perifera vävnader är kritisk till den inflammatoriska processen vid vävnadsskada, tumörutveckling och autoimmuna sjukdomar. Detta underlättas genom en process av fånga från fritt flöde på luminala ytan av aktiverade endotelceller, följt av deras vidhäftning och transendothelial migration (själavandring) i den underliggande drabbade vävnaden. Dock är de mekanismer som stöder förmånliga och innehållsberoende rekrytering av monocyt subpopulationer fortfarande inte helt klarlagt. Därför har vi utvecklat en metod som möjliggör rekrytering av olika monocyt subpopulations samtidigt visualiseras och mätt enligt flöde. Denna metod, baserad på time-lapse confocal imaging, möjliggör entydig distinktionen mellan vidhäftande och livslopp monocyter. Här beskriver vi hur denna metod kan användas för att samtidigt studera rekrytering kaskad av proangiogena och icke-angiogena monocyter in vitro. Denna metod kan dessutom utökas för att studera de olika stegen i rekrytering av upp till tre monocyt populationer.
Introduction
Monocyter utgör beståndsdel fagocytos av den medfödda immuniteten som är väsentliga för att bekämpa patogener, städa upp skadade vävnader, angiogenes och patofysiologin för många sjukdomar inklusive cancer1,2,3 . Monocyter är benmärgen-derived celler består av heterogena subpopulations som cirkulerar i blodet men kan rekryteras till platsen för inflammationen i perifer vävnad genom specifika molekylära mekanismer. Rekrytering kaskader av monocyter, när det gäller leukocyter i allmänhet ifrågasätter olika steg inklusive capture, rullande, kryper, gripande, transendothelial migration (själavandring) och migration genom kärlväggen (basalmembranet och väggmålning celler)4. Dessa steg omfattar huvudsakligen inflammation-inducerad molekyler på endotelceller luminala ytan såsom selectins, glykoprotein ligander, chemokiner, intercellulära och Junktional adhesionsmolekyler och deras receptorer på leukocyter såsom selektin ligander och integriner. Människohandel vägar genom antingen endotelceller korsningar (paracellular) eller genom endothelial cellen kroppen (transcellular) kan användas av leukocyter för att korsa den endoteliala barriär5. Samtidigt monocyter har historiskt dokumenterats för att transmigrate genom transcellular rutten, har potentiella skillnader i deras flyttande väg föreslagits som monocyter betraktas inte längre ett homogent cell befolkningen. Det blir nu tydligt att monocyt mångfald kan definieras av varje deras skillnader och likheter, med avseende på deras särskiljande extravasering kaskader3,6. Därför för att otvetydigt diskriminera mellan monocyt subpopulations, är det avgörande att visualisera och fenotyp beteendet hos var och en av dessa olika subpopulations under rekrytering bearbeta.
Monocyter från mänskliga, gris, råtta och mus var uppdelat i fenotypisk subpopulationer med vissa tillskrivs funktioner och specifika flyttande beteenden7,8,9. Till exempel i människor, kan monocyter delas in i tre undergrupper baserat på deras yta uttryck för CD14, en coreceptor för bakteriell lipopolysackarid och CD16, Fc-gamma receptorn III. Mänskliga monocyt subpopulations inkluderar klassisk CD14+CD16-, mellanliggande CD14+CD16+ och icke-klassisk CD14dimCD16+ celler6,9. Den klassiska CD14+CD16– monocyter visade sig vara främst inflammatoriska medan poolen av CD16+ monocyter befanns kollektivt presenterar TIE2 uttryck och proangiogenic funktion10. Konsekvent, endotelceller stimulering med inflammatoriska cytokiner såsom mänskliga tumör nekros faktor (TNF)-α eller interleukin (IL-1) beta (konventionella inflammation) är tillräcklig för att utlösa komplett rekrytering av klassiskt CD14+CD16 – monocyter. Samtidiga handlingar av vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) A och TNFα (angiogena faktorer-driven inflammation) krävs dock att provocera transmigrationen av CD16+ proangiogenic pool av monocyter3. Historiskt, traditionella Transwell systemet under statiska förhållanden, parallellt plattan flöde kammaren och µ-slide flöde kamrarna har använts för att kvantitativt analysera rekrytering av en leukocyt befolkningen på en tid in vitro-11 ,12,13. Medan dessa protokoll har validerats, skulle en mer robust metod som tillät den samtidig analysen av flera monocyt subpopulations anses mer insiktsfulla. Sådana metoder måste redogöra för flera interaktioner och de olika frekvenserna av varje respektive befolkningen och även ge en mekanistisk förståelse av likheter och särdrag för rekrytering kaskader som definierar varje monocyt delmängd.
Här presenterar vi en metod baserad på den time-lapse avbildning av monocyt rekrytering under flöde vilket gör de flyttande kaskader av olika monocyt subpopulations studeras samtidigt med hjälp av konfokalmikroskopi. Den här metoden integrerar vissa kritiska funktioner som efterliknar endotelceller inflammation, liksom hemodynamiken av cirkulerande monocyter i efter kapillär venoler, leukocyt rekrytering invivo huvudsakliga lokalisering. Den föreslagna metoden använder mänskliga navel ven endotelceller (HUVEC), som genereras genom en väletablerad protokoll av isolering från mänskliga navelsträngar. Denna kliniska resurs har fördelen att vara lätt tillgängliga som biologiska biprodukt, samtidigt också ge en rimlig avkastning av endotelceller som kan isoleras från navelsträngen venen. Vi använde också fluorescerande färgämnen och immunofluorescens för att skilja mellan olika cellulära komponenter och konfokalmikroskopi att entydigt definiera monocyt positionering (luminala vs. abluminal) över tid. Det protokoll som presenteras här har utvecklats att samtidigt mäta själavandring nivåerna av monocyt subpopulations. Det bör dessutom noteras att denna metod kan utvidgas för att studera andra leukocyter subpopulationer och rekryteringsprocesser genom användning av olika biomarkörer och märkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mänskligt material användes med informerat samtycke av frivilliga donatorer och i enlighet med schweizisk etikkommittéerna på klinisk forskning.
1. isolering och frysning av mänskliga Umbilical ven endotelceller (HUVEC)
- Tillsätt 5 mL av beläggning lösning till en T75-kolv (0,1 mg/mL kollagen G och 0,2% gelatin i fosfatbuffrad saltlösning PBS vid pH 7,4) under 30 minuter vid 37 ° C innan den inleder HUVEC isolering.
- Rengör i sladden med PBS, torka med sterila kompresser och placera den i en steril 20 cm petriskål. Klipp ändarna på sladden med steril sax.
- Identifiera den enda stor ven och de två små artärerna. Sätt försiktigt in en kanyl med en tre-vägs Avstängningskranen bifogas det till ven extremiteter cord ändar.
- Dra åt sladden och kanyl anslutningen ordentligt med en längd på wire.
- BEGJUTA sladden två gånger med 20 mL av RPMI medium som innehåller 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin och 250 ng/mL amfotericin B att tvätta sladdens vener. Denna process gör utseendet på sladden vitare och tydligare. Töm venen innan kollagenas tillägg genom att samla RPMI med en spruta i ena änden.
- BEGJUTA venen med 12 mL av 1 mg/mL kollagenas typ jag (0,22 µm-filtrerad).
- Stäng Avstängningskranen på sladden slutar och inkubera i sladden vid 37 ° C i 12 min.
- Massera varsamt i sladden för att lossa endotelceller från ven lumen.
- Ta 30 mL av RPMI innehållande 10% fetalt kalvserum med en 50 mL spruta och Anslut den till ena änden av navelsträngen.
- Ansluta en tom 50 mL sprutan till andra änden av navelsträngen
- Öppna Avstängningskranen och BEGJUTA venen från ena änden samtidigt reciprocally samla från den andra änden.
Obs: De insamlade suspensionen innehåller endotelceller. - Centrifugera denna cellsuspension vid 200 x g i 5 min.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten med komplett M199 medium (M199 innehållande 20% FCS, 15 µg/mL endotelcellstillväxt kosttillskott, 100 µg/mL heparin natrium, 0,5 µM hydrokortison, 10 µg/mL L-askorbinsyra, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL 10 mL streptomycin och 250 ng/mL amfotericin B).
- Ta bort beläggningen lösningen från T75 kolven och skölj en gång med PBS.
- Utsäde cellerna samlas in från steg 1.13 i T75 kolven och placera den i inkubatorn vid 37 ° C med 5% CO2.
- Nästa dag, skölj kolven 3 gånger med komplett M199 medlet att ta bort kvarvarande röda blodkroppar och ändrar sedan mediet varannan dag tills sammanflödet.
- 80 – 90% confluence, skölj den HUVEC enskiktslager en gång med 5 mL PBS och lossa cellerna med 5 mL 0,05% trypsin i 1 mM EDTA vid 37 ° C i 5 min. Lägg 4 mL M199 och 1 mL av FCS att stoppa åtgärden trypsin. Skölj kolven för att lossa alla HUVEC.
- Samla en alikvot av 50 µL användas för färgning av VE-cadherin, PECAM-1 och gp38 och analysera genom flödescytometri att kontrollera HUVEC renhet.
- Samla in resten av HUVEC från steg 1.18 i en 15 mL rör och centrifugera vid 200 x g under 5 minuter i rumstemperatur.
- Kassera supernatanten från steg 1,19, Återsuspendera cellpelleten i frysning lösning (FCS som innehåller 10% DMSO) med en täthet på 5 x 105 celler/mL i frysrör och frysa vid-80 ° C eller i flytande kväve tills användning.
-
Kontrollera HUVEC renhet:
- Lägga till 1 µL anti-humant VE-cadherin-FITC-antikropp, 1 µL anti-humant PECAM1-PE antikropp och 1 µL anti-humant Podoplanin-APC antikropp i alikvoten av 50 µL av HUVEC samlas in vid steg 1.18.
- Odla i rumstemperatur i 10 min.
- Tillsätt 100 µL av PBS och centrifugera vid 400 x g i 30 s.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera i 100 µL av PBS. Data kan nu förvärvas av flöde flödescytometri tekniker.
Obs: HUVEC är positivt för VE-cadherin och PECAM-1, och negativt för Podoplanin.
2. HUVEC avfrostning
Obs: Använda HUVEC på låg passage för experiment (maximalt 5 passager).
- Coat en T75 kolv med 1 mL av lösningen beläggning vid 37 ° C i 30 min.
- Snabbt defreeze HUVEC vid 37 ° C i 2 min och resuspendera cellerna i 10 mL av komplett M199.
- Centrifugera cellerna vid 200 x g i rumstemperatur i 5 min och kasta bort supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten i 10 mL av komplett M199.
- Överföra cellsuspensionen i förväg belagda kolven. Placera kolven i inkubatorn vid 37 ° C med 5% CO2. Ändra cellodlingsmedium varannan dag.
3. HUVEC kultur i 0.4 µ-Slide kammare
- Fem dagar innan du börjar flödet experimentet, coat pre avdelningar med en 0.4 µ-bild med 30 µL av PBS som innehåller 0,1 mg/mL kollagen G, 0,2% gelatin vid 37 ° C i 30 min.
- Tvätta kamrarna med 100 µL av PBS.
- Lossa cellerna från en 80-90% konfluenta HUVEC av en T75 kolv.
- Skölj HUVEC med 5 mL PBS och lossa dem med 5 mL 0,05% trypsin vid 37 ° C i 5 min.
- Spola och samla cellsuspensionen i komplett M199 räkna cellerna av den mest bekväma metoden. Centrifugera vid 200 x g under 5 minuter i rumstemperatur.
- Omsuspendera cellpelleten på 106 celler/mL och fördela 30 µL (30.000 celler) per kammare.
- Inkubera cellerna i en inkubator vid 37 ° C med 5% CO2 för 1 h.
- Tillsätt 150 µL komplett M199 i varje kammare och odla cellerna under 5 dagar i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2. Ändra mediet varannan dag.
4. HUVEC färgning för monocyt rekrytering Assay Under flöde
- Förbereda märkning mediet av M199 och 1 µM av CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetat) och värma det vid 37 ° C i 5 min innan cellen märkning.
- Tvätta HUVEC två gånger med M199 medium värmas vid 37 ° C.
- Ersätta mediet med 30 µL av värmde märkning medium innehållande 1 µM av CMFDA och placera i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2 i 10 min.
- Tvätta en gång med komplett M199 och inkubera cellerna med komplett M199 i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2 i 30 min.
Obs: Det är viktigt att ta bort alla spår av serum före tillsats av märkning lösningen, annars kan det förändra HUVEC färgning. - Ersätta mediet med komplett M199 innehållande antingen humant TNFα (500 U/mL) eller en blandning av humant TNFα (500 U/mL) med mänskliga VEGFA (1 µg/mL) för 6 h i en inkubator på 37 ° C och 5% CO2.
5. isolering av mänskliga Pan monocyter och färgning av subpopulationer
- Använd antingen en buffy coat av koncentrerad humanblod eller 20 mL av nymalen isolerade humanblod, samlas på dagen för experimentet i EDTA vacutainer rör.
- Späd blodet i PBS-1 mM EDTA (1:1) och Pipettera försiktigt 20 mL av det utspädda blodet ovanpå de 20 mL av täthet lutning media. Centrifugera vid 400 x g i 30 min i rumstemperatur med långsam acceleration och utan broms.
- Samla de perifera mononukleära blodkroppar (PBMC)-trombocyter lager (mellan täthet lutning media och plasma lager) in i en ny 50 mL tub som innehåller 40 mL PBS - 1 mM EDTA. Top upp till 50 mL med PBS - 1 mM EDTA.
- Centrifugera vid 200 x g i rumstemperatur i 5 min. Tag bort supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten med 10 mL färgning buffert (PBS - 1 mM EDTA innehållande 0,5% bovint serumalbumin BSA).
- Centrifugera vid 200 x g i rumstemperatur i 5 min. Tag bort supernatanten.
- Upprepa steg 5.5 och 5.6.
- Återsuspendera cellpelleten med 10 mL färgning buffert. Ta en alikvot av 10 µL för en celltal.
- Kontrollera PBMC populationer och räkna celler snabbt med en flödescytometer.
Obs: De karakteristiska lymfocyter och monocyt populationerna kan observeras (figur 1A). Från 50 mL av färskt blod förvänta sig om 50-100 x 106 PBMC. -
För rekrytering av CD14 + kontra CD14-PBMC under flöde:
- Tvätta pelleten tre gånger med flöde buffert (M199 innehållande 0,5% BSA) och resuspendera mononukleära cellerna i flödet buffert på 6 x 106 celler per mL.
- Gör alikvoter av 200 µL för varje analys. Inkubera vid 37 ° C tills 20 min före analysen.
- Tillsätt 5 µL anti-CD14-PE och Hoechst 33342 med en slutlig koncentration på 2 µM till varje delprov. Blanda och inkubera vid 37 ° C i 10 min.
- Centrifugera alikvoten vid 400 x g i 30 s.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten med 200 µL flöde buffert.
-
För rekrytering av monocyt subpopulations under flöde:
- Isolera monocyter med ett pan monocyt isolering kit enligt tillverkarens anvisningar.
Obs: Följande isolering protokoll är för 50 x 106 celler. Det kan skalas upp eller ner så länge det är inom tillverkarens rekommendationer. - Centrifugera PBMC suspensionen vid 200 x g i rumstemperatur i 5 min.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten med 400 µL av färgning buffert.
- Tillsätt 50 µL Fc-receptor-blockerande reagens och 50 µL Pan monocyt antikroppar cocktail.
- Odla i rumstemperatur i 10 min.
- Tillsätt 400 µL av färgning buffert och 100 µL av magnetiska pärlor konjugerad anti biotin antikropp. Odla i rumstemperatur i 15 min.
- Tillsätt 2 mL av färgning buffert och använda en Mac LS kolumn tillsammans med en magnet.
- Placera kolumnen LS på magneten och tillsätt 1 mL färgning buffert. Kassera genomflöde.
- Passera PBMC suspensionen i kolumnen och samla klart flödet men som innehåller pan monocyter i en ny 15 mL tub.
- Lägg till färgning bufferten till toppen upp till 5 mL.
- Ta en alikvot och kontrollera kvaliteten på monocyt isolering med en flödescytometer.
- Bestämma antalet pan monocyt.
Obs: Endast monocyt befolkning kan observeras (figur 1B). - Centrifugera resten av monocyter från steg 5.11.11 vid 200 x g i 5 min.
- Kassera supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten i 5 mL flöde buffert (M199 innehållande 0,5% BSA).
- Upprepa 5.11.13 till 5.11.14 två gånger för att eliminera spår av EDTA.
- Isolera monocyter med ett pan monocyt isolering kit enligt tillverkarens anvisningar.
- Gör monocyt suspension i flöde buffert (M199 med 0,5% BSA) på 6 x 106 celler/mL.
- Gör alikvoter av 200 µL av monocyter för varje rekrytering assay.
- Hålla alikvoten vid 37 ° C i inkubatorn tills 20 min före injektion.
- Tillsätt 5 µL anti-CD16-PE antikropp och Hoechst 33342 (2 µM slutlig) till varje delprov.
- Blanda och inkubera vid 37 ° C i 10 min.
- Centrifugera alikvoten vid 400 x g i 30 s.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten med 250 µL av flöde buffert.
- Tillsätt 30 µL av monocyt suspensionen i en kammare av bilden till serven för ställa in parametrarna för förvärv på mikroskopet confocal.
- Hålla alikvoter av monocyt suspension från steg 5,18 vid 37 ° C.
Obs: Denna suspension är redo att injiceras i systemets flöde.
6. beredning av det Fluidic systemet
- Se till att cell inkubatorn för bildtagning på 37 ° C.
Obs: Ett diagram över systemets flöde visas i figur 2. - Montera slangen del I: infoga en Luer-kontakt hane till ena änden av en bit av silikon slangar (8 cm lång och 3 mm tjock) och Anslut den andra änden till en i-line Luer injektion. Anslut den sistnämnda luerfattningen till en bit av silikon slangar (40 cm och 3 mm tjock) i ena änden.
Obs: Alternativt kan en 3-vägs tryck ansluten till en 5 mL doseringsspruta infogas mellan i-line Luer injektion uppsättningen och silikon slangar för eventuell luft bubbla avlägsnas. - Montera den slang del II: ansluta en 20 mL spruta till ena änden av en längd av silikon slangar (1 m lång och 3 mm tjock). Infoga en Luer-kontakt hane till andra änden av slangen.
- Anslut del I och del II slangen genom att infoga Luer connector hanarna till en kvinnlig Luer lock Camlock (figur 2A).
- Sätta den fria änden av silikon slangar i behållaren som innehåller flöde bufferten (M199 + 0,5% BSA) värmde vid 37 ° C.
- Dra kolven 20 mL sprutan till Fyll slangen med flöde buffert.
- Placera sprutan på pumpen och säkra den.
- Ställa in pumpen i återkalla läge (i motsats till ingjuta) och ange flödet.
- Bestämma flödet enligt IBIDI bilden används med hjälp av följande formel:
Obs: Bilden faktorn är beroende av den IBIDI bilden används för experimentet. För µ-bilden jag0,4 luerlock används i det här exemplet, den bild faktorn är 131,6. För viss bild faktorer, se de företag webbplats14. Flöde buffert viskositeten är 0.0072 dyn.s/cm2. Skjuvspänning vid de efter kapillär venoler handlar om 0,5 dyn/cm2. -
Anslut i bilden (figur 2B):
- Klämma silikon slangar runt kvinnliga Luer lås kopplingen och koppla de två Luer connector hanarna från fästet.
- Anslut dem till behållarna i bilden som innehåller stimulerad HUVEC och fyll med medium. Undvika luftbubblor under detta steg.
- Ta bort klämmorna och säkerställa att anslutningen inte läcker.
- Placera bilden under lupp för time-lapse imaging och starta pumpen.
7. time-lapse avbildning av monocyt rekrytering Under flöde av konfokalmikroskopi
- Använda ett 40 x-objektiv (se Tabell för material) för avbildning.
- Aktivera 405 nm (blå monocyt kärnor), 488 nm (gröna endotelceller) och 561 nm (röd CD16 + delmängd) lasrar.
- Använd den kammare som innehåller de monocyter för att ange parametrarna förvärv.
Obs: För att upptäcka både icke-livslopp och livslopp monocyter, sätts av pinhole och intensiteten av den laser 405 nm högt. Icke-livslopp monocyter är således något synligt i basal planen. Emellertid endast livslopp monocyter presenterar en ofärgade området runt atomkärnan motsvarar det nya utrymme som upptas under endotelceller. - Plats i kammaren att förvärvas under mikroskopet.
- Välj 3 fält inom 1 cm radie för multi-position confocal avbildning.
- Definiera den basala och apikala sidorna av endotelceller
- Ange en z-stack till intervallet 10 – 12 µm (0,5 µm steg). Kör en time-lapse förvärv varje 1 min.
- Efter 3 min Imaging, injicera 200 µL monocyt suspension (6 x 106 celler/mL) genom hamnen i linje Luer injektion.
Obs: Snabbt monocyter visas i apikala fokalplanet, följa och starta själavandring (transitering från den apikala basala planen). - Bild för minst 30 min. En gång färdig, stoppa imaging och stoppa flödet. Klämma slangen för att koppla bort dem från bilden.
- Fixa bilden med 4% PARAFORMALDEHYD vid 4 ° C i 10 min.
- Tvätta i bilden med PBS och lagra bilden vid 4 ° C för vidare analys om det behövs.
8. analysera Data med ImageJ
- Räkna antalet totala vidhäftande monocyter i varje fält. Avgöra celltalet per mm2.
- Räkna livslopp monocyter som är närvarande i basal planen under endotelceller och identifierade av närvaron av ett svart hål (i den gröna kanalen) runt kärnan.
- Dela upp räkningen av livslopp leukocyter av det totala antalet vidhäftande leukocyter. Själavandring priset presenteras som en procentandel av vidhäftande monocyter.
- För illustration, kan den apikala och basala sidorna visas samtidigt att illustrera de händelser som inträffar i varje av dessa endotelceller fack.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bestämning av HUVEC aktivering inducerade av TNFα
Bio-aktiviteten av den inflammatorisk cytokin TNFα kan vara variera enligt partiet och tillskott av frysning-upptining cykel. Det är viktigt att kontrollera aktiveringsstatus för HUVEC med TNFα-behandling. Detta kan utföras genom färgning parallellt några prover av konfluenta HUVEC för inflammatoriska induktion av selectins, ICAM-1 och VCAM-115,16,17. En lättare och enklare väg till check aktiveringen ställningen av HUVEC efter TNFα behandling är den morfologiska förändring som visas av endotelceller under inflammatorisk stress. I figur 3visas elongate HUVEC efter 6-h i närvaro av TNFα jämfört med ostimulerade celler. Liknande töjning observeras när HUVECs stimuleras av en blandning av TNFα och VEGFA. Inspelning aktiveringen ställningen av HUVEC är viktigt eftersom de slutliga resultaten av transmigrationen av monocyter kommer att bero på kvaliteten på endotelceller aktivering.
Monocyt själavandring gör en karakteristisk utsättning i endotelceller
För att studera monocyt själavandring under flöde, använde vi konfokalmikroskopi med endotelceller färgade i grönt med CMFDA och atomkärnor av isolerade monocyter färgade i blått med cell-permeable Hoechst 33342 färgämnet (figur 4). Time-lapse confocal bildtagning tillåtna visualisering av monocyter på apikala planet, där deras fenotyp skulle kunna bedömas (figur 4A-C, kompletterande film 1). Migrera celler som genomgår själavandring flyttade till intercellulära utrymmet motsvarande cell cell korsningar innan de försvann från apikala planet och dök upp i basal planet. Transmigrated cellerna presenteras ett svart hål runt kärnan motsvarande monocyt formerna. Denna form ständigt förändrats under monocyt migration under endotelceller (figur 4A-C, kompletterande filmer 2-3). Detta dynamiska svarta hål som gjorts av monocyt kroppen under endotelceller, och monocyt positionering, tillåtet för entydig identifiering av livslopp celler. Kvantitering av monocyt rekrytering över tiden visade monocyt vidhäftning följt av själavandring (figur 4 d-E). Även om leukocyter kan extravasate genom både transcellular och paracellular vägar, kunde vi bara konstatera det paracellular själavandring under flöde med denna metod. Detta är förenligt med våra tidigare iakttagelser3,11,18,19.
Angiogena faktorn driven inflammation främjar transmigrationen av CD16 + monocyter
Genom att använda denna metod, analyserade vi transmigrationen av mänskliga proangiogenic kontra icke-angiogena monocyter genom en endothelial enskiktslager stimuleras av den inflammatorisk cytokin TNFα ensamt eller i kombination med den angiogena faktorn VEGFA. Mänskliga proangiogenic monocyter kan identifieras genom ett uttryck för CD16 eller TIE2 på deras yta. Här användes anti-CD16-PE antikropp att diskriminera mellan pro - och icke-angiogena monocyter. Som visas i figur 5A-B (kompletterande filmer 4-5), andelen själavandring CD16+ monocyter var låg när endotelceller stimuleras med TNFα endast. Denna räntesats ökade dock när endotelceller stimuleras samtidigt med TNFα och VEGFA (figur 5 c-E, kompletterande filmer 6-7). Själavandring var icke-angiogena monocyter lika hög under både inflammatoriska tillstånd. För båda cell subpopulations inträffade själavandring uteslutande genom paracellular rutten. Denna metod möjliggör därför de själavandring anlag för olika monocytic populationer att undersökas samtidigt.
Renhet av monocyter påverkar själavandring effektivitet
De perifera mononukleära blodcellerna består av T-celler, B-celler, NK-celler och monocyter. Metoden monocyt isolering används här kräver utarmning av de andra leukocyt populationerna från PBMC. För att förstå hur avsaknaden av monocyt renhetsgrad påverkar resultatet, vi använde PBMC och färgas för pan-monocyter med en anti-CD14-PE-antikropp innan du utför rekrytering analysen under flöde. I figur 6visas HUVEC stimulering med TNFα eller TNFα + VEGFA inducerad av transmigration av endast monocyt befolkningen. De andra leukocyter består av T-celler, B-celler och NK-celler transmigrate inte under TNFα eller TNFα + VEGFA. Faktiskt, det har dokumenterats att dessa leukocyter behöver andra signaler för själavandring. Således kommer att en ineffektiv isolering av monocyter leda till en underskattning av monocyt själavandring, som de andra leukocyter skulle räknas som monocyter. Detta skulle leda till ett felaktigt resultat på monocyt själavandring, på grund av kontaminering av monocyt befolkningen med andra leukocyter.
Figur 1: profilering av isolerade monocyter av flödescytometri. (A) analys av PBMC morfologi innan lymfocyter utarmning. Storlek (framåt scatter: FSC) och kornighet (side scatter: SSC) av perifera mononukleära blodceller bestämdes av flödescytometri. (B) storlek och granularitet av isolerade monocyter bestämdes av flödescytometri efter lymfocyter utarmning. En effektiv isolering av monocyter visar en komplett uttömning av lymfocyter befolkningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Diagram över systemets fluidic. (A) Schematisk översikt av perfusion systemet före och efter anslutning av bild- och montering på sprutpumpen. (B) Diagram över processen med att ansluta bilden med slangen med klämmor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Kontrollera effektiv aktivering av endotelceller. Aktivering av HUVEC av inflammatoriska stimuli var kontrolleras genom att analysera cell formen med fas kontrast mikroskopi. Efter 6 timmars behandling, HUVEC presenterar en långsträckt morfologi när stimuleras med TNFα (500 U/mL) eller en blandning av TNFα (500 U/mL) + VEGFA (1 µg/mL) jämfört med ostimulerade celler. Denna morfologiska förändring av HUVEC efter inflammatorisk stimulering är lätt att identifiera indikator av cellaktivering, som bör säkerställas för flöde analysen. Skalstapeln = 120 µm vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: identifiering av de transmigrated monocyter av konfokalmikroskopi. (A) Diagram över monocyt själavandring med förväntade åsikter på apikala och basala planes. Atomkärnor av monocyter färgas med Hoechst 33342 är avbildad i blått och teoretiska formerna av monocyter skildras med streckade linjer runt kärnorna. Basala anser visas de transmigrated platt monocyter att ockupera en utrymmet under endotelceller. Detta utrymme visas som ett svart hål kring monocyt kärnan på confocal bilder. (B) lokalisering av en monocyt före och efter själavandring. De ortogonala visningar visas, och uppkomsten av ett svart hål (avgränsad med den vita streckade linjen) kan observeras efter monocyt migrering till den endothelial abluminal facket. En röd pilspets anger positionen för en monocyt innan själavandring och vita pilspetsen visar samma cell efter själavandring. Ortogonala åsikter visar att den transmigrated monocyt under endothelial cellen. Skalstapeln = 40 µm. (C) Time-lapse bildsekvenser (från 0 till 20 min) monocyt rekrytering övertid. Den apikala och basala vyer visas. Den fullständiga sekvenser kan ses i kompletterande filmer 1, 2 och 3. Röda fyrkanter belysa en transmigrated monocyt med en blå kärna. Det svarta hålet motsvarar platt kroppen av monocyt under endothelial cellen avgränsas av en streckad gul linje. Skalstapeln = 40 µm. (D) kvantifiering av monocyt vidhäftning till TNFα-stimulerade kontra ostimulerade HUVEC över tid. (E) kvantifiering av monocyt själavandring takt över tid. N = 3 biologiska replikat. Data presenteras som medelvärde ± S.D. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: samtidig undersökning av transmigrationen av monocyt subpopulations under flöde. (A) Time-lapse bildsekvenser (från 0 till 20 min) av rekrytering av proangiogenic monocyter (CD16+) och icke-angiogena monocyter med tiden genom TNFα-aktiverade HUVEC. Skalstapeln = 40 µm; den apikala och basala vyer visas. Den fullständiga sekvenser kan ses i kompletterande Movie 4 för apikala och kompletterande Movie 5 för basal visningar. (B) kvantitering av transmigrationen av mänskliga proangiogenic monocyter (HPMo: CD16 +) och människans icke-angiogena monocyter (HNMo) genom en TNFα-aktiverad HUVEC enskiktslager. N = 4 biologiska replikat, data presenteras som medelvärde ± S.D. * p < 0,05; Mann-Whitney test. (C), Time-lapse bild sekvenser (från 0 till 20 min) av rekrytering av proangiogenic och icke-angiogena monocyter övertid genom TNFα + VEGFA-aktiverade HUVEC. Skalstapeln = 40 µm; den apikala och basala vyer visas. Den fullständiga sekvenser kan ses i kompletterande film 6 för apikala och kompletterande film 7 för basal visningar. (D) kvantitering av transmigrationen av mänskliga proangiogenic monocyter (HPMo: CD16 +) och människans icke-angiogena monocyter (HNMo: CD16-) genom TNFα + VEGFA-aktiverat HUVEC enskiktslager. N = 4 biologiska replikat, data presenteras som medelvärde ± S.D. * p < 0,05; Mann-Whitney test. (E) lokalisering av CD16+ monocyter innan (10 min) och efter (15 min) själavandring genom TNFα + VEGFA-stimulerad HUVEC. De ortogonala visningar visas. Skalstapeln = 40 µm vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6: Samtidig undersökning av transmigrationen av CD14 + kontra CD14 - PBMC under flöde. (A) vidhäftning av CD14+kontra CD14– PBMC till TNFα-aktiverad HUVEC under flöde. (B) vidhäftning av CD14+kontra CD14– PBMC till TNFα + VEGFA-aktiverat HUVEC under flöde. (C) Transmigration Betygsätt (%) av CD14+kontra CD14– PBMC genom TNFα-aktiverad HUVEC under flöde. (D) Transmigration Betygsätt (%) av CD14+kontra CD14– PBMC genom TNFα + VEGFA-aktiverat HUVEC under flöde. Data är medelvärde ± S.D. N = 4 biologiska replikat. * p < 0,05; Mann-Whitney test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande film 1: Visa på apikala planet av pan-monocyt rekrytering under flöde. Expanderad vy av rekrytering av pan monocyt under flöde vid apikala planet. HUVEC var fläckade CMFDA atomkärnor av monocyter var live-färgas med Hoechst 33342. Skalstapeln = 50 µm vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande Movie 2: Visa på basal planet av pan-monocyt rekrytering under flöde. Expanderad vy av rekrytering av pan monocyt under flöde vid basal planet. HUVEC var fläckade CMFDA atomkärnor av monocyter var live-färgas med Hoechst 33342. Skalstapeln = 50 µm vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande film 3: Maximal projektion av z-högar av pan-monocyt rekrytering under flöde. Expanderad vy av rekrytering av pan monocyt under flöde som visas i kompletterande filmer 1 och 2. HUVEC var fläckade CMFDA atomkärnor av monocyter var live-färgas med Hoechst 33342. Skalstapeln = 50 µm vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande Movie 4: Visa på apikala planet av rekrytering av monocyt subpopulations till TNFα-aktiverad HUVEC. Expanderade Visa på apikala planet av samtidiga rekrytering av monocyt subpopulations under flöde till TNFα-aktiverad HUVEC under flöde. HUVEC var fläckade CMFDA atomkärnor av monocyter var live-färgas med Hoechst 33342. Mänskliga proangiogenic monocyt subpopulations identifierades av det ytan uttrycket av CD16. Skalstapeln = 30 µm. vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande Movie 5: Visa på basal planet av rekrytering av monocyt subpopulations till TNFα-aktiverad HUVEC. Utökade vyn, på basal planet, den samtidiga rekryteringen av monocyt subpopulations under flöde till TNFα-aktiverad HUVEC under flöde. HUVEC var fläckade CMFDA atomkärnor av monocyter var live-färgas med Hoechst 33342. Den mänskliga proangiogenic monocyt (HPMo) subpopulationen identifierades av surface uttrycket av CD16. Skalstapeln = 30 µm. vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande film 6: Visa på apikala planet av rekrytering av monocyt subpopulations till TNFα+ VEGFA-aktiverade HUVEC. Utökade vyn, på apikala planet, den samtidiga rekryteringen av monocyt subpopulations under flöde till TNFα + VEGFA-aktiverat HUVEC under flöde. HUVEC var fläckade CMFDA atomkärnor av monocyter var live-färgas med Hoechst 33342. Den mänskliga proangiogenic monocyt subpopulationen identifierades av surface uttrycket av CD16. Skalstapeln = 30 µm vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande film 7: Visa på basal planet av rekrytering av monocyt subpopulations till TNFα+ VEGFA-aktiverade HUVEC. Utökade vyn, på basal planet, den samtidiga rekryteringen av monocyt subpopulations under flöde till TNFα + VEGFA-aktiverat HUVEC under flöde. HUVEC var fläckade CMFDA atomkärnor av monocyter var live-färgas med Hoechst 33342. Den mänskliga proangiogenic monocyt (HPMo) subpopulationen identifierades av surface uttrycket av CD16. Skalstapeln = 30 µm vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi rapporterar här, en metod som beskriver en studie av hur monocyt subpopulations transmigrate genom den inflammerade endothelial enskiktslager. Den diskuterade metoden används konfokalmikroskopi istället för faskontrast mikroskopi, som också används för att studera monocyt rekrytering under flöde3,11,19. En stor fördel med att använda konfokalmikroskopi för time-lapse imaging är förmågan att entydigt diskriminerar mellan själavandring och stark vidhäftning av monocyter. Även faskontrast mikroskopi-baserade metoden är också robust, kräver det expertis för att undvika sammanblandning livslopp och starkt vidhäftande celler. I det här fallet, måste upprätta strikta kriterier för analys för att göra en tydlig skillnad mellan dessa två stater i monocyt rekrytering kaskad. Dessutom är det också viktigt att utföra en endpoint analys av konfokalmikroskopi för att bekräfta de globala trender som observerats av faskontrast microscopyen. Därför ger direkt användning av konfokalmikroskopi att undersöka monocyt rekrytering under flöde tydliga resultat på faktiska själavandring status av fångade monocyter.
En av de stora flaskhalsarna i verkställande leukocyt rekrytering analyser under flöde och använder ett faskontrastmikroskop är tid som används för att utföra analysen och spåra enskilda celler från fångst till själavandring genom cell-cell korsningen. Automatisering av en sådan analys är möjligt men svårt att utföra faskontrast likheter mellan krypande och livslopp monocyter. Här visar vi genom att använda konfokalmikroskopi att monocyt själavandring åtföljdes av en utsättning av endotelceller färgning i basal planet motsvarar formen på de transmigrated monocyter under HUVEC. Denna placering bekräftades av den rätvinkliga projektionen. Övergången av monocyt lokalisering skedde uteslutande mellan cell-cell korsningar vittnar om en paracellular själavandring. Detta är förenligt med våra tidigare data, som visade att under flöde in vitro monocyter transmigrate uteslutande genom paracellular rutt med HUVEC3,18. För att komplettera den metod som föreslås här, är det möjligt att använda icke-blockerande antikroppar mot Junktional proteiner som VE-cadherin, sylt eller PECAM1 för att föreställa potentiella platser för monocyt själavandring (paracellular vs transcellular). Vi har bekräftat att svart formerna kring monocyt atomkärnor är en robust kännetecknar livslopp celler och en enkel händelse som kan upptäckas av programvara. Även om en manuell cell räknar systemet demonstreras här, är svart formen bildas runt leukocyt kärnan ett kriterium som kunde användas för att definiera leukocyt själavandring i automatiserad analys, vilket sparar mycket tid. Vi arbetar för närvarande på att utveckla ett automatiserat program för sådan analys.
Fluorescens och konfokalmikroskopi användes tidigare i studien av leukocyt rekrytering. De användes dock inte att undersöka rekrytering av olika subpopulations samtidigt. Här föreslår vi en modalitet att använda konfokalmikroskopi för att studera rekryteringen av leukocyt subtyper samtidigt i den samma mikromiljö. Vi visar att konfokalmikroskopi kan användas för att undersöka samtidigt flyttande beteenden av olika monocyt subpopulations. Som exempel har vi använt CD16 uttryck för att diskriminera mellan proangiogenic och icke-angiogena monocyter för att studera två subpopulationsna i olika inflammatoriska sammanhang själavandring kapacitet. Överensstämmer med vår senaste publikation, med hjälp av konfokalmikroskopi modalitet, vi har visat att andelen själavandring CD16+ monocyter var lägre när den endotelceller enskiktslager stimulerades endast av TNFα3. Men lett kombinationen av TNFα och VEGFA till en ökning av transmigration av proangiogenic monocyter. Själavandring var likaså hög för icke-angiogena CD16– monocyter under både inflammatoriska tillstånd. Vi har tidigare visat att monocyt färgning med anti-CD16 antikroppen inte kan uppvisa någon signifikant effekt på själavandring, bekräfta detta genom analys av omärkta monocyter efter själavandring analysen, med konfokalmikroskopi3. Dock för nya leukocyt undertyper eller antikroppar används för att markera dem, behöver märkning effekten bedömas. Med den här metoden, kan upp till tre olika populationer av leukocyter samtidigt studeras. Detta kan vara subpopulations som är funktionellt distinkta eller liknande immun celltyper. Även om fokus ligger på monocyt själavandring, kan andra stegen i sin rekrytering också analyseras genom denna metod, inklusive cell beteende före själavandring, såsom tillfångatagande, och migrational riktningen. Efter själavandring evenemang såsom abluminal lagring och omvänd själavandring kan också undersökas för olika leukocyt befolkningar, som en förlängning av denna metod. En begränsning är dålig detektering av färgningen i den mån kanalen i time-lapse imaging, samt vissa överhörningen av fluorescens signalerar att minskar z-stack upplösningen. Detta berodde främst på de instrument som används för confocal avbildning. Användningen av bild deconvolution kunde så småningom bidra till att förbättra bildkvaliteten och möjliggöra ytterligare analys av de olika stegen i leukocyt rekrytering.
För att studera leukocyt rekrytering under optimala förhållanden, är det viktigt att kontrollera aktiveringsstatus för den endotelceller enskiktslager. Faktiskt leder en bristfällig aktivering av endotelceller till en global minskning av monocyt adhesion och migration. Endotelcell aktivering kan kontrolleras genom att analysera nivån uttryck av adhesionsmolekyler på endotelceller yta såsom ICAM1 och VCAM1. Nivån på dessa vidhäftning molekyler måste ökas jämfört med ostimulerade endotelceller. Om ingen förändring är detekterbara i dessa endotelceller adhesionsmolekyler, den odlade HUVEC kan betraktas som inte aktiveras. Bedömningen uttryck av adhesionsmolekyler kan utgöra en god kvantitativ kontroll mellan olika experiment med samma parti av HUVEC. Dock kan uttryck dessa adhesionsmolekyler också variera mellan olika primära kultur av endotelceller att begränsa beaktandet av en global tröskel på ICAM1 eller VCAM1. Förändringen i form av makrovaskulära endothelial celler såsom HUVEC är också en bra indikator på deras aktivering. Denna senare förändring i fenotyp tillåter en snabb och kvalitativ bedömning av HUVEC aktivering. Analysen av adhesionsmolekyler kan dock vara ett bättre val för mikrovaskulära celler som inte visar större form-förändringar vid aktivering med inflammatoriska cytokiner.
För mekanistiska studier, kan relevanta negativa kontroller av monocyt själavandring utföras med hjälp av antikroppar mot endotelceller adhesionsmolekyler såsom ICAM1, VCAM1 eller på leukocyt yta såsom leukocyt funktion-associerade Antigen (LFA) nr -1. Användning av en relevant negativ kontroll är viktigt för sådan mekanistisk studie i monocyter som de uttrycker Fc-receptorer på sin cellytan. Renhet av monocyter efter isolering är också viktigt för att undvika kontaminering av andra leukocyt populationer och en underskattning av andelen monocyt själavandring. En annan viktig parameter är temperaturen, som måste anges vid 37 ° C för alla analyserna för att säkerställa alla experimentella observationer är relevanta och översätta följaktligen till mänskliga i vivo cell människohandel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Paul Bradfield för manuskriptet läsning och återkopplingar. A. S. fick ekonomiskt stöd från Sir Jules Thorn välgörande utomeuropeiska Trust Reg.,
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture Flasks 75 cm2 | TPP | 90076 | Routine culture of isolated HUVEC |
| µ-Slide VI 0.4 | IBIDI | 80606 | |
| Centrifuge Tubes 15 mL | TPP | 191015 | |
| Centrifuge Tubes 50 mL | TPP | 191050 | |
| Collagen G | Biochrom | L 7213 | For coating of cell culture flasks |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | 1393 | For coating of cell culture flasks |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| 3-Way Stopcocks | BIO-RAD | 7328103 | |
| penicillin 10,000 μ/mL streptomycine 10,000 μg/mL fungizone 25 μ/mL | AMIMED | 4-02F00-H | |
| Collagenase type 1 | Worthington | LS004216 | |
| Medium 199 1x avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes | GIBCO | 22340020 | |
| Bovine Albumin Fraction V | ThermoFisher | 15260037 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement, 150 mg | Millipore | 02-102 | |
| Heparin Sodium | Sigma-Aldrich | H3149RT | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H6909 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A 4544 | |
| EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O | APPLICHEM | A2937.0500 | |
| CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC | Miltenyi Biotech | 130-100-713 | AB_2655150 |
| CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-807 | AB_2657280 |
| Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC | Miltenyi Biotech | 130-107-016 | AB_2653263 |
| BD Accuri C6 Plus | BD Bioscience | ||
| µ-Slide I Luer | IBIDI | 80176 | |
| CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | ThermoFisher | C2925 | |
| Recombinant human TNFα | Peprotech | 300-01A | |
| Recombinant human VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
| NE-1000 Programmable Syringe Pump | KF Technology | NE-1000 | |
| Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-519 | AB_2655051 |
| Pan Monocyte Isolation Kit, human | Miltenyi Biotech | 130-096-537 | |
| Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE | Miltenyi Biotech | 130-106-762 | AB_2655403 |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | ThermoFisher | H1399 | |
| Silicone tubing | IBIDI | 10841 | |
| Elbow Luer Connector | IBIDI | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | IBIDI | 10823 | |
| Luer Lock Connector Female | IBIDI | 10825 | |
| In-line Luer Injection Port | IBIDI | 10820 | |
| Ar1 confocal microscope | Nikon | ||
| 40x objective | Nikon | 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm | |
| ImageJ Software | NIH |
References
- Auffray, C., Sieweke, M. H., Geissmann, F. Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells. Annual Review of Immunology. 27 (1), 669-692 (2009).
- De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C., Naldini, L. Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 9 (6), 789-795 (2003).
- Sidibe, A., et al. Angiogenic factor-driven inflammation promotes extravasation of human proangiogenic monocytes to tumours. Nature Communications. 9 (1), 355 (2018).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Review Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte Migration into Inflamed Tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33 (3), 375-386 (2010).
- Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity. 19 (1), 71-82 (2003).
- Chamorro, S., et al. In vitro differentiation of porcine blood CD163− and CD163+ monocytes into functional dendritic cells. Immunobiology. 209 (1-2), 57-65 (2004).
- Passlick, B., Flieger, D., Ziegler-Heitbrock, H. Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood. Blood. 74 (7), (1989).
- Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
- Bradfield, P. F., et al. JAM-C regulates unidirectional monocyte transendothelial migration in inflammation. Blood. 110 (7), 2545-2555 (2007).
- Schenkel, A. R., Mamdouh, Z., Muller, W. A. Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation. Nature Immunology. 5 (4), 393-400 (2004).
- Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Kinetics of the different steps during neutrophil migration through cultured endothelial monolayers treated with tumour necrosis factor-alpha. Journal Vascular Research. 36 (6), 477-485 (1999).
- ibidi GmbH. Shear Stress and Shear Rates for ibidi µ-Slides - Based on Numerical Calculations. , (2014).
- Yang, L., Froio, R. M., Sciuto, T. E., Dvorak, A. M., Alon, R., Luscinskas, F. W. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
- Yang, C. -R., Hsieh, S. -L., Ho, F. -M., Lin, W. -W. Decoy receptor 3 increases monocyte adhesion to endothelial cells via NF-kappa B-dependent up-regulation of intercellular adhesion molecule-1, VCAM-1, and IL-8 expression. Journal of Immunology. 174 (3), Baltimore, Md. 1647-1656 (2005).
- Wong, D., Dorovini-Zis, K. Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture. Microvascular Research. 49 (3), 325-339 (1995).
- Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
- Bradfield, P. F., et al. Divergent JAM-C Expression Accelerates Monocyte-Derived Cell Exit from Atherosclerotic Plaques. PLoS One. 11 (7), e0159679 (2016).
